CN115184526A - 一种基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器及其应用,其中,少量细胞蛋白质组学反应器包括毛细管、从上至下间隔设置在毛细管内的混合离子交换填料和反向填料,所述混合离子交换填料的上端设置有第一筛板、所述混合离子交换填料与反向填料之间设置有第二筛板,所述反向填料的下端设置有第三筛板。本发明提供的少量细胞蛋白质组学反应器适用于500个细胞以下或50纳克蛋白以下的样品前处理,可直接连接在分析柱前面,在梯度模式下上样到质谱进行检测分析,减少人为手动操作,更加省时省力,且不易损失样品,蛋白鉴别效果好,灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及定性和定量蛋白质组学技术领域,特别涉及一种基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器及其应用。
背景技术
针对500个细胞或50纳克蛋白以下的样品前处理方法报道的不多。Mol.Cell.Proteomics 2011,10,M110.000679公开了一种稀有细胞蛋白质组反应器(RareCell Proteomic Reactor,RCPR),其基于强阳离子交换树脂(Strong Cation Exchange,SCX)毛细管整体柱,实现了蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解以及多肽的强阳离子交换分级,从5000和50000个人胚干细胞中分别鉴定到409和2281个蛋白质。
Anal.Chem.2019,91(16),10395–10400公开了一种在Eppendorf低吸附离心管中进行溶液内酶解的方法,配合在线的毛细管反相柱脱盐,从1000个U2OS骨肉瘤细胞中分别鉴定到829个蛋白质。
Anal.Chem.2020,92(7),5554–5560公开了通过使用移液枪枪头代替普通离心管的滤膜辅助的样品制备(Filter-Aided Sample Preparation),减少了样品损失,分别从100和1000个MCF-7细胞中分别鉴定到了1 895和3 069个蛋白质。
Nat.Commun.9(2018)1e10公开了通过使用液滴纳流控装置处理~10到~140个HeLa细胞,配合使用细内径色谱柱和低流速,使用高灵敏度的质谱Orbitrap FusionLumos,检测到~1500到~3000个蛋白。
现有技术的缺点是针对少量细胞的处理过程中样品损失大,结果不好,或者需要使用液滴纳流控装置,设备昂贵,操作复杂,大多数实验室不具备条件。另外,现在技术均是离线操作的,需要耗时的样品转移和上样操作,同时也会造成样品损失。
因此,现有技术还有待于改进和发展以便广泛应用。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器及其应用,旨在解决现有少量细胞蛋白质组学反应器用于蛋白质前处理时样品损失大、操作门槛太高,需要专门的纳流控仪器设备的问题。
本发明的技术方案如下:
一种基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器,其中,包括毛细管、从上至下间隔设置在毛细管内的混合离子交换填料和反向填料,所述混合离子交换填料的上端设置有第一筛板、所述混合离子交换填料与反向填料之间设置有第二筛板,所述反向填料的下端设置有第三筛板。
所述基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器,其中,所述混合离子交换填料由强阳离子交换填料SCX和强阴离子交换填料SAX组成。
所述基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器,其中,所述混合离子交换填料中,强阳离子交换填料SCX和强阴离子交换填料SAX的质量比为10:1-1:10。
所述基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器,其中,所述反向填料为C18反向填料。
一种基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器在细胞样品的蛋白质鉴定和定量蛋白质组学的应用。
所述的应用,其中,将所述少量细胞蛋白质组学反应器用于生物样本中样品的前处理。
所述的应用,其中,包括步骤:
将细胞样品经裂解液裂解并酸化后,将裂解产物加到预先活化好的少量细胞蛋白质组学反应器中,通过施加压力使蛋白质富集到混合离子交换填料上;
使用含有机溶剂的溶液或者纯有机溶剂清洗掉结合到反向填料上的表面活性剂,依次加入相应的试剂和酶,完成蛋白质的还原、烷基化和酶解;
使用盐溶液将生成的多肽从混合离子交换填料转移到反向填料上,除盐后,完成细胞样品的前处理。
所述的应用,其中,所述含有机溶剂的溶液选自含有乙腈和/或甲醇的柠檬酸钾水溶液;和/或,所述纯有机溶剂为乙腈和/或甲醇。
所述的应用,其中,所述盐溶液为氯化钠盐溶液。
有益效果:本发明提供的基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器可直接连接在分析柱前面,在梯度模式下上样到质谱进行检测分析,减少人为手动操作和样品损失,并节省上样时间;且本发明中的离子交换部分的填料由原来的单一模式的自制强阳离子交换整体柱填料改成了混合离子交换填料,以减少前处理过程中因pH变化等原因造成的样品损失,且便于质控和推广应用;并且本发明在混合离子交换填料下方增加了反相填料(直径3微米等尺寸)用于在线除盐,而之前的方案需要额外的13个盐梯度转移样品到分析柱的操作,费时费力,且损失大量样品,蛋白鉴定结果差。
附图说明
图1为本发明一种基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器的结构示意图。
图2为本发明一种基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器的使用状态图。
图3为本发明少量细胞蛋白质组学反应器与分析柱的连接示意图。
图4为本发明少量细胞蛋白质组学反应器(3筛板-混合模式的RCPR)与2筛板-混合模式的RCPR用于蛋白质前处理时的对比结果图,其中,A为柱状图对比结果,B为2筛板-混合模式的RCPR用于蛋白质前处理的结果,C为3筛板-混合模式的RCPR用于蛋白质前处理的结果。
图5为本发明少量细胞蛋白质组学反应器(3筛板-混合模式的RCPR)处理不同个数293T细胞的结果图,其中,A为处理不同个数293T细胞的柱状图对比结果,B为处理10个293T细胞的结果,C为处理100个293T细胞的结果,D为处理500个293T细胞的结果。
具体实施方式
本发明提供一种基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器及其应用,为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确,以下对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
请参阅图1,图1为本发明提供的基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器结构示意图,如图所示,其包括毛细管10、从上至下间隔设置在毛细管10内的混合离子交换填料20和反向填料30,所述混合离子交换填料20的上端设置有第一筛板21、所述混合离子交换填料20与反向填料30之间设置有第二筛板22,所述反向填料30的下端设置有第三筛板23。
本实施例提供的基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器适用于大约500个细胞以下或50纳克蛋白以下的样品前处理,本发明蛋白质组学反应器可直接连接在分析柱前面,在梯度模式下上样到质谱进行检测分析,减少人为手动操作;且本实施例中的离子交换部分的填料由原来的单一模式的自制强阳离子交换整体柱填料改成了混合离子交换填料,以减少前处理过程中因pH变化等原因造成的样品损失,且便于质控和推广应用;并且本实施例在混合离子交换填料下方增加了反相填料(直径3微米等尺寸)用于在线除盐,而之前的方案需要额外的13个盐梯度转移样品到分析柱的操作,费时费力,且损失大量样品,蛋白鉴别结果差。因此,本发明提供的蛋白质组学反应器用于生物样品前处理时,更加省时省力,且不易损失样品,蛋白鉴定效果好,灵敏度高。
在一些实施方式中,所述混合离子交换填料由强阳离子交换填料SCX和强阴离子交换填料SAX组成。具体来讲,在本实施例中,基于强阳离子交换填料SCX的蛋白质预富集方法的原理为:在酸性条件下大部分蛋白质的等电点因大于溶液pH值而带正电荷,从而被强阳离子交换填料表面的SCX基团所富集;而基于强阴离子交换填料SAX的蛋白质预富集方法的原理:在碱性条件下大部分蛋白质的等电点小于溶液pH值而带负电荷,从而被强阴离子交换填料表面的SAX基团所富集。本实施例使用由强阳离子交换填料SCX和强阴离子交换填料SAX组成的混合离子交换填料后,即便预处理过程中pH变化时,SCX填料上损失的蛋白会被SAX填料吸附,SAX填料上损失的蛋白会被SCX填料吸附,进而减少了前处理过程中因pH变化等原因造成的样品损失,且便于质控和推广应用。
在一些实施方式中,所述混合离子交换填料中,强阳离子交换填料SCX和强阴离子交换填料SAX的质量比为10:1-1:10。作为举例,如可以是10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、10:2、9:2、8:2、6:2、5:2、3:2、1:2、10:3、8:3、7:3、5:3、4:3、2:3、1:3、9:4、7:4、5:4、3:4、1:4、9:5、8:5、7:5、6:5、4:5、3:5、2:5、1:5、7:6、5:6、1:6、10:7、9:7、8:7、6:7、5:7、4:7、3:7、2:7、1:7、9:8、7:8、5:8、3:8、1:8、10:9、8:9、7:9、5:9、4:9、2:9、1:9、9:10、7:10、3:10或1:10。
在一些实施方式中,所述反向填料为C18反向填料。在本实施例中,采用所述C18反向填料用于在线除盐,具有省时省力,且不易损失样品的效果;而现有技术需要额外的13个盐梯度转移样品到分析柱的操作,费时费力,且损失大量样品,蛋白鉴别结果差。
在一些实施方式中,本发明为了防止填料损失以及隔开混合离子交换填料和反向填料,共制作了三个筛板,在混合离子交换填料和反向填料的两端各设置一个筛板,并在混合离子交换填料和反向填料之间设置了一个筛板。
在一些实施方式中,还提供一种基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器在细胞样品或其他类型的微量蛋白样品的蛋白质鉴定和定量蛋白质组学的应用。
在一些实施方式中,还提供一种基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器的应用,将所述少量细胞蛋白质组学反应器用于生物样本中样品的前处理,其具体包括步骤:
将细胞样品经裂解液裂解并酸化后,将裂解产物加到预先活化好的少量细胞蛋白质组学反应器中,通过施加压力使蛋白质富集到混合离子交换填料上;
使用含有机溶剂的溶液或者纯有机溶剂清洗掉结合到反向填料上的表面活性剂,依次加入相应的试剂和酶,完成蛋白质的还原、烷基化和酶解;
使用盐溶液将生成的多肽从混合离子交换填料转移到反向填料上,除盐后,完成细胞样品的前处理。
在本实施例中,所述含有机溶剂的溶液选自含有乙腈和/或甲醇的柠檬酸钾水溶液;所述纯有机溶剂为乙腈和甲醇的一种或两种。所述盐溶液为氯化钠盐溶液。
本实施例的基本方案是将混合离子交换填料和反相填料装填进常用的毛细管内,并制作3个筛板隔开混合离子交换填料和反相填料以防止填料损失和串混。在本实施例中,蛋白先吸附在混合离子交换填料上,进行样品前处理的各项化学反应和除杂操作,之后转移到反相填料上进行除盐,之后将整个毛细管连接到色谱柱前端,在梯度下直接上样至质谱。
下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明:
实施例1
提供一种少量细胞蛋白质组学反应器,其包括毛细管、从上至下间隔设置在毛细管内的混合离子交换填料和反向填料,所述混合离子交换填料的上端设置有第一筛板、所述混合离子交换填料与反向填料之间设置有第二筛板,所述反向填料的下端设置有第三筛板,所述混合离子交换填料由强阳离子交换填料SCX和强阴离子交换填料SAX组成,所述反向填料为C18反向填料。
将本实施例中少量细胞蛋白质组学反应器用于生物样本中样品的前处理,其具体包括步骤:
如图2-3所示,将100个细胞样本裂解后,直接通过施加压力上样至本发明的基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器上,蛋白先吸附在混合离子交换填料上,完成样品预富集,之后分别用质量比为20%的乙腈和纯乙腈冲洗以去除杂质;
接着使用三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)对蛋白进行还原烷基化,用碘乙酰胺(iodacetamide)对蛋白中打开的二硫键乙酰化,用胰蛋白酶(trypsin)将蛋白酶解为多肽后,使用500mM浓度的氯化钠盐溶液(pH 10)将多肽转移到反相填料上,之后使用0.1%FA冲洗除盐,样品前处理部分完成;
最后,带有处理好多肽的蛋白质组学反应器直接用二通连接在分析柱前面,在梯度模式下上样到质谱进行检测分析,结果如图4中A和C所示,总共鉴定到3183个蛋白,3次重复中共鉴定蛋白的个数为1756个,占比为55%。
对比例1
提供一种少量细胞蛋白质组学反应器,其包括毛细管、从上至下间隔设置在毛细管内的混合离子交换填料和反向填料,所述混合离子交换填料的上端设置有第一筛板、所述反向填料的下端设置有第二筛板,所述混合离子交换填料由强阳离子交换填料SCX和强阴离子交换填料SAX组成,所述反向填料为C18反向填料。
将本实施例中少量细胞蛋白质组学反应器用于生物样本中样品的前处理,其具体包括步骤:
如图2-3所示,将100个细胞样本裂解后,直接通过施加压力上样至本发明的基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器上,蛋白先吸附在混合离子交换填料上,完成样品预富集,之后分别用质量比为20%的乙腈和纯乙腈冲洗以去除杂质;
接着使用三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)对蛋白进行还原烷基化,用碘乙酰胺(iodacetamide)对蛋白中打开的二硫键乙酰化,用胰蛋白酶(trypsin)将蛋白酶解为多肽后,使用500mM浓度的氯化钠盐溶液(pH 10)将多肽转移到反相填料上,之后使用0.1%FA冲洗除盐,样品前处理部分完成;
最后,带有处理好多肽的蛋白质组学反应器直接用二通连接在分析柱前面,在梯度模式下上样到质谱进行检测分析,结果如图4中A和B所示。
对比图4中的数据可以发现,实施例1中在混合离子交换填料和反向填料之间增加的筛板,避免了反相填料进入混合离子交换填料中,也因此避免了蛋白直接吸附到反相填料,因洗脱不完全造成的损失,因此误差大大减少,重现性也显著提高。
实施例2
提供一种少量细胞蛋白质组学反应器,其包括毛细管、从上至下间隔设置在毛细管内的混合离子交换填料和反向填料,所述混合离子交换填料的上端设置有第一筛板、所述混合离子交换填料与反向填料之间设置有第二筛板,所述反向填料的下端设置有第三筛板,所述混合离子交换填料由强阳离子交换填料SCX和强阴离子交换填料SAX组成,所述反向填料为C18反向填料。
将本实施例中少量细胞蛋白质组学反应器用于生物样本中样品的前处理,其具体包括步骤:
将10个293T细胞样本裂解后,直接通过施加压力上样至本发明的基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器上,蛋白先吸附在混合离子交换填料上,完成样品预富集,之后分别用质量比为20%的乙腈和纯乙腈冲洗以去除杂质;
接着使用三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)对蛋白进行还原烷基化,用碘乙酰胺(iodacetamide)对蛋白中打开的二硫键乙酰化,用胰蛋白酶(trypsin)将蛋白酶解为多肽后,使用500mM浓度的氯化钠盐溶液(pH 10)将多肽转移到反相填料上,之后使用0.1%FA冲洗除盐,样品前处理部分完成;
最后,带有处理好多肽的蛋白质组学反应器直接用二通连接在分析柱前面,在梯度模式下上样到质谱进行检测分析,结果如图5所示,总共鉴定到3838个蛋白,3次重复中共鉴定蛋白的个数为452个,占比为28%。
实施例3
提供一种少量细胞蛋白质组学反应器,其包括毛细管、从上至下间隔设置在毛细管内的混合离子交换填料和反向填料,所述混合离子交换填料的上端设置有第一筛板、所述混合离子交换填料与反向填料之间设置有第二筛板,所述反向填料的下端设置有第三筛板,所述混合离子交换填料由强阳离子交换填料SCX和强阴离子交换填料SAX组成,所述反向填料为C18反向填料。
将本实施例中少量细胞蛋白质组学反应器用于生物样本中样品的前处理,其具体包括步骤:
将50个293T细胞裂解后,直接通过施加压力上样至本发明的基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器上,蛋白先吸附在混合离子交换填料上,完成样品预富集,之后分别用质量比为20%的乙腈和纯乙腈冲洗以去除杂质;
接着使用三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)对蛋白进行还原烷基化,用碘乙酰胺(iodacetamide)对蛋白中打开的二硫键乙酰化,用胰蛋白酶(trypsin)将蛋白酶解为多肽后,使用500mM浓度的氯化钠盐溶液(pH 10)将多肽转移到反相填料上,之后使用0.1%FA冲洗除盐,样品前处理部分完成;
最后,带有处理好多肽的蛋白质组学反应器直接用二通连接在分析柱前面,在梯度模式下上样到质谱进行检测分析,结果如图5所示,总共鉴定到1632个蛋白,3次重复中共鉴定蛋白的个数为2225个,占比为58%。
实施例4
提供一种少量细胞蛋白质组学反应器,其包括毛细管、从上至下间隔设置在毛细管内的混合离子交换填料和反向填料,所述混合离子交换填料的上端设置有第一筛板、所述混合离子交换填料与反向填料之间设置有第二筛板,所述反向填料的下端设置有第三筛板,所述混合离子交换填料由强阳离子交换填料SCX和强阴离子交换填料SAX组成,所述反向填料为C18反向填料。
将本实施例中少量细胞蛋白质组学反应器用于生物样本中样品的前处理,其具体包括步骤:
将500个293T细胞裂解后,直接通过施加压力上样至本发明的基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器上,蛋白先吸附在混合离子交换填料上,完成样品预富集,之后分别用质量比为20%的乙腈和纯乙腈冲洗以去除杂质;
接着使用三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)对蛋白进行还原烷基化,用碘乙酰胺(iodacetamide)对蛋白中打开的二硫键乙酰化,用胰蛋白酶(trypsin)将蛋白酶解为多肽后,使用500mM浓度的氯化钠盐溶液(pH 10)将多肽转移到反相填料上,之后使用0.1%FA冲洗除盐,样品前处理部分完成;
最后,带有处理好多肽的蛋白质组学反应器直接用二通连接在分析柱前面,在梯度模式下上样到质谱进行检测分析,结果如图5所示,总共鉴定到4671个蛋白,3次重复中共鉴定蛋白的个数为3191个,占比为68%。
从图5中结果可以看出,本发明提供的少量细胞蛋白质组学反应器可适用于500个细胞以下的样品前处理方法,并且能够高灵敏度地检测到细胞中的蛋白质。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (9)
1.一种基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器,其特征在于,包括毛细管、从上至下间隔设置在毛细管内的混合离子交换填料和反向填料,所述混合离子交换填料的上端设置有第一筛板、所述混合离子交换填料与反向填料之间设置有第二筛板,所述反向填料的下端设置有第三筛板。
2.根据权利要求1所述基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器,其特征在于,所述混合离子交换填料由强阳离子交换填料SCX和强阴离子交换填料SAX组成。
3.根据权利要求2所述基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器,其特征在于,所述混合离子交换填料中,强阳离子交换填料SCX和强阴离子交换填料SAX的质量比为10:1-1:10。
4.根据权利要求1所述基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器,其特征在于,所述反向填料为C18反向填料。
5.一种如权利要求1-4任一基于混合模式填料的少量细胞蛋白质组学反应器在细胞样品的蛋白质鉴定和定量蛋白质组学的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,将所述少量细胞蛋白质组学反应器用于生物样本中样品的前处理。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,包括步骤:
将细胞样品经裂解液裂解并酸化后,将裂解产物加到预先活化好的少量细胞蛋白质组学反应器中,通过施加压力使蛋白质富集到混合离子交换填料上;
使用含有机溶剂的溶液或者纯有机溶剂清洗掉结合到反向填料上的表面活性剂,依次加入相应的试剂和酶,完成蛋白质的还原、烷基化和酶解;
使用盐溶液将生成的多肽从混合离子交换填料转移到反向填料上,除盐后,完成细胞样品的前处理。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述含有机溶剂的溶液选自含有乙腈和/或甲醇的柠檬酸钾水溶液;和/或,所述纯有机溶剂为乙腈和/或甲醇。
9.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述盐溶液为氯化钠盐溶液。
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