BR112021014046A2 - Método para determinar hemoglobina a glicada (hba1c) em uma amostra, kit, uso do kit, sistemas de diagnóstico para determinar a hemoglobina a glicada (hba1c) em uma amostra adaptada e para determinar a hemoglobina a glicada (hbac1) em uma amostra e uso do sistema de diagnóstico - Google Patents
Método para determinar hemoglobina a glicada (hba1c) em uma amostra, kit, uso do kit, sistemas de diagnóstico para determinar a hemoglobina a glicada (hba1c) em uma amostra adaptada e para determinar a hemoglobina a glicada (hbac1) em uma amostra e uso do sistema de diagnóstico Download PDFInfo
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Abstract
método para determinar hemoglobina a glicada (hba1c) em uma amostra, kit, uso do kit, sistemas de diagnóstico para determinar a hemoglobina a glicada (hba1c) em uma amostra adaptada e para determinar a hemoglobina a glicada (hbac1) em uma amostra e uso do sistema de diagnóstico. a presente invenção refere-se a um método para determinar hemoglobina a glicada (hba1c) intacta por espectrometria de massa (ms), um kit e um sistema de diagnóstico adaptado para realizar o método.
Description
“MÉTODO PARA DETERMINAR HEMOGLOBINA A GLICADA (HBA1C) EM UMA AMOSTRA, KIT, USO DO KIT, SISTEMAS DE DIAGNÓSTICO PARA DETERMINAR A HEMOGLOBINA A GLICADA (HBA1C) EM UMA
AMOSTRA ADAPTADA E PARA DETERMINAR A HEMOGLOBINA A GLICADA (HBAC1) EM UMA AMOSTRA E USO DO SISTEMA DE DIAGNÓSTICO”
[0001] A presente invenção refere-se a um método para determinar moléculas de hemoglobina A glicada (HbA1c) intacta por espectrometria de massa (MS), um kit e um sistema de diagnóstico adaptado para realizar o método.
[0002] O controle deficiente dos níveis circulantes de glicose no sangue é um indicador de diabetes. A glicose no sangue pode se ligar em um processo estatístico não enzimático aos resíduos de lisina de polipeptídeos, levando assim a polipeptídeos glicados. No caso da hemoglobina A (HbA), ocorre uma reação entre a glicose e o N-terminal da cadeia β. A cadeia β da hemoglobina A glicada resultante foi designada como HbA1c.
[0003] HbA1c é a principal espécie de hemoglobina glicada no sangue humano. O abrangente Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) forneceu evidências de que complicações, tais como retinopatia, nefropatia e neuropatia, estão diretamente relacionadas ao grau de hiperglicemia em pacientes com diabetes insulinodependente (IDDM) e mostrou que a medição de HbA1c em sangue é uma excelente ferramenta para monitoramento a longo prazo do estado glicêmico de pacientes com diabetes (Nathan et al., N. Engl. J.
Med 329 (1993) 977-986; Santiago, J.V., Diabetes 42 (1993) 1549-1554; Benjamin, J. e Sacks, D.B., Clin. Chem. 40 (1994) 683-687; e Goldstein D. et al., Clin. Chem 40 (1994) 1637-1640). O estudo DCCT também demonstrou claramente a necessidade de medição confiável e reprodutível de HbA1c e HbA0 – a hemoglobina não glicada, respectivamente.
[0004] Existem vários métodos diferentes para determinar a hemoglobina glicada, nomeadamente métodos físico-químicos, incluindo cromatografia e/ou espectrometria de massa (MS), métodos químicos e métodos imunológicos. Um método de referência para a medição de HbA1c em sangue humano que foi aprovado pela Federação Internacional de Química Clínica e Medicina Laboratorial (IFCC) compreende a clivagem enzimática da hemoglobina em peptídeos pela enzima endoproteinase Glu-C por um período de 18-20 horas e subsequentemente a separação e quantificação de hexapeptídeos N-terminais glicados e não glicados da cadeia β por HPLC e espectrometria de massa de ionização por eletropulverização ou em uma abordagem bi-dimensional usando HPLC e eletroforese capilar com detecção UV (Jeppsson et al., Clin. Chem. Lab. Med. 40 (2002), 78-89).
[0005] Os métodos que envolvem a digestão enzimática da hemoglobina A, no entanto, geralmente requerem uma incubação durante a noite, a fim de obter uma quantidade suficiente de produtos de clivagem e, portanto, sinais de medição estáveis. Além disso, uma separação de misturas de peptídeos complexos, incluindo componentes de matriz com cromatografia convencional, é necessária antes de submeter a amostra à detecção por MS.
Esses métodos são, portanto, demorados e de uso limitado para medições de alto rendimento de amostras de pacientes.
[0006] Várias tentativas de determinar hemoglobinas glicadas por MS usando moléculas de hemoglobina intacta foram descritas. De acordo com Roberts et al. (Clin. Chem. 43 (1997), 771-778), as amostras de sangue total foram diluídas 50 vezes com água, depois diluídas ainda com um solvente desnaturante ácido compreendendo ácido fórmico e acetonitrila e diretamente introduzidas na fonte de eletropulverização de um espectrômetro de massa operado no modo de íon positivo. Os espectros resultantes foram processados para determinar a porcentagem de hemoglobina glicada na amostra.
[0007] Biroccio et al. (Anal. Biochem. 336 (2005), 279-288) divulgam um método para a análise de hemoglobina glicada e glutationilada intacta por MS de tempo de vôo por ionização de dessorção a laser assistida por matriz. Para tanto, as amostras foram preparadas pelo método da camada sanduíche em uma matriz de ácido sinapínico composta por acetonitrila e ácido trifluoroacético.
[0008] Davison et al. (Clin. Chem. Lab. Med. 46 (2008), 1230- 1238) descrevem MS de ionização por eletropulverização para a medição de hemoglobinas fetais glicadas e acetiladas. As amostras de sangue foram diluídas em um solvente desnaturante ácido compreendendo ácido fórmico e acetonitrila.
Após lavagem com esferas de troca catiônica para remover Na e K, as amostras foram introduzidas diretamente na fonte de eletropulverização de um espectrômetro de massa operado no modo de íon positivo.
[0009] Uma determinação de hemoglobinas glicadas e acetiladas no sangue do cordão umbilical por MS de tempo de voo é descrita por Dupont et al. (Anal. Chem. 83 (2011), 5245-5252). As amostras foram preparadas diluindo o sangue do cordão umbilical com água e adicionando uma mistura contendo acetonitrila, água e ácido fórmico. A solução final foi tratada com uma resina de troca catiônica antes da injeção no espectrômetro de massa. As análises foram realizadas em um MS de tempo de vôo de aceleração ortogonal quadrupolar usando uma fonte de ionização por eletropulverização trabalhando em modo positivo e W-Optics.
[00010] Hattan et al. (J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (2016), 532- 541) descrevem a análise e determinação quantitativa de hemoglobina glicada por MS de tempo de vôo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz.
Amostras de sangue total foram diluídas em água e centrifugadas. O sobrenadante foi misturado com ácido sinapínico e manchado em um alvo MALDI. Os espectros de massa foram gerados em modo linear de íons positivos em um espectrômetro de massa MALDI-TOF.
[00011] Os métodos acima estão, no entanto, associados a desvantagens, uma vez que não forneceram resultados satisfatórios e reproduzíveis. Em particular, um alto coeficiente de variação foi observado ao testar repetidamente uma determinada amostra. Assim, há uma necessidade de fornecer um método rápido e confiável para determinar HbA1c por MS.
[00012] Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a um método para determinar moléculas de hemoglobina A glicada (HbA1c) intacta em uma amostra, em que o método compreende: (a) fornecer uma amostra compreendendo moléculas de hemoglobina A (HbA), em particular moléculas de HbA intacta, (b) enriquecer moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, na referida amostra, e (c) submeter a amostra compreendendo moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, a uma análise por espectrometria de massa (MS), em que a quantidade ou concentração de moléculas de HbA1c na amostra é determinada.
[00013] Um segundo aspecto da presente invenção refere-se a um kit, compreendendo: (i) meios de enriquecimento para enriquecer moléculas de HbA1c glicada intacta, em particular compreendendo uma fase sólida tendo uma superfície hidrofóbica para ligação seletiva de moléculas de HbA1c glicada intacta, (ii) um meio de ligação de fase sólida substancialmente neutro para uso na diluição de uma amostra de sangue total hemolisado e na ligação de constituintes da amostra à fase sólida (i) e (iii) um meio de eluição compreendendo um solvente orgânico miscível em água, tal como acetonitrila, particularmente em uma quantidade de cerca de 20% a cerca de 60% (v/v), em particular em uma quantidade de cerca de 50% (v/v) para uso na eluição de componentes de amostra dos meios de enriquecimento (i).
[00014] O kit é particularmente adequado para uso em um método conforme descrito acima.
[00015] Em um terceiro aspecto da invenção, é fornecido um sistema de diagnóstico que é adaptado para realizar o método descrito acima. O sistema de diagnóstico deve ser usado principalmente em conjunto com o kit descrito acima.
[00016] A presente invenção permite a determinação rápida e confiável de moléculas de HbA1c glicada intacta e opcionalmente de moléculas de HbA0 intacta não glicada em uma amostra por MS.
[00017] A palavra "compreender", e variações como "compreende" e "compreendendo", serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.
[00018] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um(a)" e "o(a)" incluem os respectivos termos também no plural, a menos que o conteúdo indique claramente o contrário.
[00019] Porcentagens, concentrações, quantidades e outros dados numéricos podem ser expressos ou apresentados neste documento em um formato de "faixa". Deve ser entendido que tal formato de faixa é usado meramente por conveniência e brevidade e, portanto, deve ser interpretado de forma flexível para incluir não apenas os valores numéricos explicitamente citados como os limites da faixa, mas também para incluir todos os valores numéricos individuais ou subfaixas englobadas dentro dessa faixa, como se cada valor numérico e subfaixa fosse explicitamente recitado. A título de ilustração, um faixa numérico de "4% a 20%" deve ser interpretado para incluir não apenas os valores explicitamente recitados de 4% a 20%, mas também para incluir valores individuais e subfaixas dentro da faixa indicada. Assim, incluídos nesta faixa numérica estão valores individuais, tais como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ...
18, 19, 20% e subfaixas, tais como de 4-10%, 5-15%, 10-20%, etc. Este mesmo princípio se aplica a faixas que recitam valores mínimos ou máximos. Além disso, tal interpretação deve ser aplicada independentemente da amplitude da faixa ou das características descritas.
[00020] O termo "cerca de", quando usado em conexão com um valor numérico, pretende abranger valores numéricos dentro de uma faixa tendo um limite inferior que é 5% menor do que o valor numérico indicado e tendo um limite superior que é 5% maior do que o valor numérico indicado.
[00021] O termo “Espectrometria de Massa” (“Espec. de Massa” ou “MS”) refere-se a uma tecnologia analítica usada para identificar compostos por sua massa. A MS é um método de filtragem, detecção e medição de íons com base em sua razão massa-carga, ou "m/z". A tecnologia MS geralmente inclui (1) ionizar os compostos para formar compostos carregados; e (2) detectar o peso molecular dos compostos carregados e calcular uma razão massa-carga.
Os compostos podem ser ionizados e detectados por quaisquer meios adequados. Um "espectrômetro de massa" geralmente inclui um ionizador e um detector de íons. Em geral, uma ou mais moléculas de interesse são ionizadas e os íons são subsequentemente introduzidos em um instrumento espectrográfico de massa onde, devido a uma combinação de campos magnéticos e elétricos, os íons seguem um caminho no espaço que depende da massa ("m") e carga ("z"). O termo "ionização" ou "ionizar" refere-se ao processo de gerar um íon analito tendo uma carga elétrica líquida igual a uma ou mais unidades de elétrons. Os íons negativos são aqueles que têm uma carga líquida negativa de uma ou mais unidades de elétrons, enquanto os íons positivos são aqueles que têm uma carga líquida positiva de uma ou mais unidades de elétrons. O método de MS pode ser realizado em "modo de íon negativo", em que íons negativos são gerados e detectados, ou em "modo de íon positivo", em que íons positivos são gerados e detectados.
[00022] MS de "Tempo de voo" (TOF) é um método em que a razão massa-carga de um íon é determinada por meio de uma medição de tempo de voo. Os íons são acelerados por um campo elétrico de força conhecida. A velocidade do íon depende da razão massa-carga. O tempo para que o íon alcance um detector a uma distância conhecida é medido. Com base nesta medição, o íon pode ser identificado.
[00023] A maioria dos fluxos de trabalho de amostra em MS incluem adicionalmente etapas de preparação e/ou enriquecimento de amostra, em que, por exemplo, o(s) analito(s) de interesse são separados a partir da matriz, por exemplo, constituintes da amostra diferentes do analito, usando, por exemplo, cromatografia gasosa ou líquida. Normalmente, para a medição da espectrometria de massa, as seguintes três etapas são realizadas:
[00024] (1.) uma amostra compreendendo um analito de interesse é ionizada, geralmente por formação de aduto com cátions, frequentemente por protonação para cátions. A fonte de ionização inclui, mas não está limitada a, ionização por eletropulverização (ESI) e ionização química a pressão atmosférica (APCI).
[00025] (2.) os íons são classificados e separados de acordo com sua massa e carga. A espectrometria de mobilidade iônica de forma de onda assimétrica de alto campo (FAIMS) pode ser usada como filtro de íons.
[00026] (3.) os íons separados são então detectados, por exemplo, no modo de reação múltipla (MRM), e os resultados são exibidos em um gráfico.
[00027] O termo "ionização por eletropulverização" ou "ESI" refere- se a métodos nos quais uma solução é passada ao longo de um pequeno tubo capilar, ao final do qual é aplicado um alto potencial elétrico positivo ou negativo.
A solução que chega ao fim do tubo é vaporizada (nebulizada) em um jato ou pulverizador de gotículas muito pequenas de solução em vapor de solvente. Esta névoa de gotículas flui através de uma câmara de evaporação, que é ligeiramente aquecida para evitar a condensação e evaporar o solvente. À medida que as gotículas ficam menores, a densidade da carga elétrica da superfície aumenta até o momento em que a repulsão natural entre as cargas semelhantes faz com que íons e também moléculas neutras sejam liberados.
[00028] O termo "ionização química à pressão atmosférica" ou "APCI," refere-se a métodos de espectrometria de massa que são semelhantes a ESI; entretanto, APCI produz íons por reações íon-molécula que ocorrem dentro de um plasma à pressão atmosférica. O plasma é mantido por uma descarga elétrica entre o capilar de pulverização e um contra-eletrodo. Em seguida, os íons são normalmente extraídos para o analisador de massa pelo uso de um conjunto de estágios de skimmer com bombeamento diferencial. Um contrafluxo de gás N2 seco e pré-aquecido pode ser usado para melhorar a remoção do solvente. A ionização de fase gasosa em APCI pode ser mais eficaz do que ESI para analisar entidades menos polares.
[00029] "Modo de reação múltipla" ou "MRM" é um modo de detecção para um instrumento MS no qual um íon precursor e um ou mais íons de fragmento são seletivamente detectados.
[00030] Como um espectrômetro de massa separa e detecta íons de massas ligeiramente diferentes, ele distingue facilmente diferentes isótopos de um determinado elemento. A espectrometria de massa é, portanto, um método importante para a determinação precisa da massa e caracterização de analitos, incluindo, mas não se limitando a, analitos de baixo peso molecular, peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Suas aplicações incluem a identificação de proteínas e suas modificações pós-traducionais, a elucidação de complexos proteicos, suas subunidades e interações funcionais, bem como a medição global de proteínas em proteômica. A sequenciação de novo de peptídeos ou proteínas por espectrometria de massa pode normalmente ser realizada sem conhecimento prévio da sequência de aminoácidos.
[00031] A determinação de espectrometria de massa pode ser combinada com métodos analíticos adicionais, incluindo métodos cromatográficos, tais como cromatografia gasosa (GC), cromatografia líquida (LC), particularmente HPLC, e/ou técnicas de separação baseadas em mobilidade iônica.
[00032] No contexto da presente divulgação, os termos "analito", "molécula de analito" ou "analito(s) de interesse" são usados indistintamente, referindo-se às espécies químicas a serem analisadas por meio de espectrometria de massa. As espécies químicas adequadas para serem analisadas por meio de espectrometria de massa, ou seja, analitos, podem ser qualquer tipo de molécula presente em um organismo vivo, incluindo, mas não se limitando a, ácido nucleico (por exemplo, DNA, mRNA, miRNA, rRNA etc.), aminoácidos, peptídeos, proteínas (por exemplo, receptor de superfície celular, proteína citosólica, etc.), metabólitos ou hormônios (por exemplo, testosterona, estrogênio, estradiol, etc.), ácidos graxos, lipídios, carboidratos, esteróides, cetosteróides, secosteróides (por exemplo, vitamina D), moléculas características de uma determinada modificação de outra molécula (por exemplo, frações de açúcar ou resíduos de fosforila em proteínas, resíduos de metila no DNA genômico) ou uma substância que foi internalizada pelo organismo (por exemplo, fármacos terapêuticos, drogas de abuso, toxinas, etc.) ou um metabólito de tal substância. Tal analito pode servir como um biomarcador. No contexto da presente invenção, o termo "biomarcador" refere- se a uma substância dentro de um sistema biológico que é usada como um indicador de um estado biológico do referido sistema.
[00033] Os analitos podem estar presentes em uma amostra de interesse, por exemplo, uma amostra biológica ou clínica. O termo "amostra" ou "amostra de interesse" é usado de forma intercambiável neste documento, referindo-se a uma parte ou pedaço de um tecido, órgão ou indivíduo, sendo normalmente menor do que tal tecido, órgão ou indivíduo, destinado a representar a totalidade do tecido, órgão ou indivíduo. Após a análise, uma amostra fornece informações sobre o estado do tecido ou o estado de saúde ou doença de um órgão ou indivíduo. Exemplos de amostras incluem, mas não estão limitados a, amostras de fluidos, tais como sangue, soro, plasma, fluido sinovial, fluido espinhal, urina, saliva e fluido linfático, ou amostras sólidas, tais como manchas de sangue secas e extratos de tecido. Outros exemplos de amostras são culturas de células ou culturas de tecidos.
[00034] No contexto da presente divulgação, a amostra pode ser derivada de um "indivíduo" ou "paciente". Normalmente, o paciente é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos, como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos).
[00035] Antes de ser analisada por espectrometria de massa, uma amostra pode ser pré-tratada de maneira específica para amostra e/ou analito. No contexto da presente divulgação, o termo "pré-tratamento" refere-se a quaisquer medidas necessárias para permitir a análise subsequente de um analito desejado por meio de Espectrometria de Massa. As medidas de pré- tratamento normalmente incluem, mas não estão limitadas a, eluição de amostras sólidas (por exemplo, eluição de manchas de sangue seco), adição de reagente hemolisante (HR) a amostras de sangue total e adição de reagentes enzimáticos a amostras de urina. Também, a adição de padrões internos (ISTD) é considerada como pré-tratamento da amostra.
[00036] O termo “reagente de hemólise” (HR) refere-se a reagentes que lisam as células presentes em uma amostra. No contexto desta invenção, os reagentes de hemólise referem-se, em particular, a reagentes que lisam as células presentes em uma amostra de sangue, incluindo mas não se limitando a, eritrócitos presentes nas amostras de sangue total. Um reagente de hemólise bem conhecido é a água (H2O), por exemplo, água desionizada ou destilada.
Outros exemplos de reagentes de hemólise incluem, mas não estão limitados a, líquidos com alta osmolaridade (por exemplo, ureia a 8M), líquidos iônicos e diferentes detergentes.
[00037] Normalmente, um padrão interno (ISTD) é uma quantidade conhecida de uma substância que exibe propriedades semelhantes às do analito de interesse quando submetida ao fluxo de trabalho de detecção por espectrometria de massa (ou seja, incluindo qualquer pré-tratamento, enriquecimento e etapa de detecção real). Embora o ISTD exiba propriedades semelhantes às do analito de interesse, ele ainda é claramente distinguível do analito de interesse. Exemplificado, durante a separação cromatográfica, tal como cromatografia gasosa ou líquida, o ISTD tem aproximadamente o mesmo tempo de retenção que o analito de interesse da amostra. Assim, tanto o analito quanto o ISTD entram no espectrômetro de massa ao mesmo tempo. O ISTD, no entanto, exibe uma massa molecular diferente do analito de interesse da amostra. Isso permite uma distinção da espectrometria de massa entre íons do ISTD e íons do analito por meio de suas diferentes razões massa/carga (m/z).
Ambos estão sujeitos à fragmentação e fornecem íons filhos. Esses íons filhos podem ser distinguidos por meio de suas razões m/z entre si e dos respectivos íons parentais. Consequentemente, uma determinação separada e quantificação dos sinais do ISTD e do analito podem ser realizadas. Uma vez que o ISTD foi adicionado em quantidades conhecidas, a intensidade do sinal do analito da amostra pode ser atribuída a uma quantidade quantitativa específica do analito.
Assim, a adição de um ISTD permite uma comparação relativa da quantidade de analito detectado e permite a identificação e quantificação inequívoca do(s) analito(s) de interesse presente(s) na amostra quando o(s) analito(s) atinge(m) o espectrômetro de massa. Normalmente, mas não necessariamente, o ISTD é uma variante marcada isotopicamente (compreendendo, por exemplo, marcador 2H, 13C e/ou 15N etc.) do analito de interesse.
[00038] Além do pré-tratamento, a amostra também pode ser submetida a uma ou mais etapas de enriquecimento, nas quais a amostra é submetida a um ou mais "métodos de enriquecimento" ou "fluxos de trabalho de enriquecimento". Métodos de enriquecimento bem conhecidos incluem, mas não estão limitados a, precipitação química, o uso de uma fase sólida e métodos cromatográficos.
[00039] A precipitação química refere-se à adição de componentes químicos à amostra, que fazem com que certos constituintes da amostra participem. Exemplificado, um método de precipitação bem conhecido é a adição de acetonitrila à amostra.
[00040] Fases sólidas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, cartuchos de Extração de Fase Sólida (SPE) e esferas. O termo "esfera" refere-se a partículas esféricas não magnéticas, magnéticas ou paramagnéticas.
As esferas podem ser revestidas de forma diferente para serem específicas para o analito de interesse. O revestimento pode ser diferente dependendo do uso pretendido, ou seja, da molécula de captura pretendida. É bem conhecido pelo técnico no assunto qual revestimento é adequado para qual analito. As esferas podem ser feitas de vários materiais diferentes. As esferas podem ter vários tamanhos e compreender uma superfície com ou sem poros.
[00041] O termo "cromatografia" refere-se a um processo no qual uma mistura química transportada por um líquido ou gás é separada em componentes como um resultado da distribuição diferencial das entidades químicas conforme elas fluem ao redor ou sobre uma fase líquida ou sólida estacionária.
[00042] O termo "cromatografia líquida" ou "LC" refere-se a um processo de retardo seletivo de um ou mais componentes de uma solução de fluido à medida que o fluido se infiltra uniformemente através de uma coluna de uma substância finamente dividida, ou através de passagens capilares. O retardo resulta da distribuição dos componentes da mistura entre uma ou mais fases estacionárias e o fluido bruto, (ou seja, fase móvel), conforme esse fluido se move em relação à(s) fase(s) estacionária(s). Métodos nos quais a fase estacionária é mais polar do que a fase móvel (por exemplo, tolueno como a fase móvel, sílica como a fase estacionária) são denominados cromatografia líquida de fase normal (NPLC), e métodos nos quais a fase estacionária é menos polar do que a fase móvel fase (por exemplo, mistura de água-metanol como a fase móvel e C18 (octadecilsilila) como a fase estacionária) são denominados cromatografia líquida de fase reversa (RPLC).
[00043] "Cromatografia líquida de alta eficiência" ou "HPLC" refere- se a um método de cromatografia líquida no qual o grau de separação é aumentado forçando a fase móvel sob pressão através de uma fase estacionária, normalmente uma coluna densamente compactada. Normalmente, a coluna é preenchida com uma fase estacionária composta de partículas de formato irregular ou esférico, uma camada monolítica porosa ou uma membrana porosa.
A HPLC é historicamente dividida em duas subclasses diferentes com base nas polaridades das fases móvel e estacionária, ou seja, NP-HPLC e RP-HPLC.
[00044] Micro LC refere-se a um método de HPLC usando uma coluna tendo um diâmetro interno de coluna estreito, normalmente abaixo de 1 mm, por exemplo, cerca de 0,5 mm. "Cromatografia líquida de ultra eficiência" ou "UHPLC" refere-se a um método de HPLC usando uma pressão de 120 MPa (17.405 lbf/in2), ou cerca de 1200 atmosferas.
[00045] LC rápido refere-se a um método de LC usando uma coluna com um diâmetro interno como mencionado acima, com um comprimento curto <2 cm, por exemplo, 1 cm, aplicando uma taxa de fluxo como mencionado acima e com uma pressão como mencionado acima (Micro LC, UHPLC). O protocolo rápido de LC rápido inclui uma etapa de captura/lavagem/eluição usando uma única coluna analítica e realiza LC em um tempo muito curto <1 min.
[00046] Outros metódos de LC bem conhecidos incluem cromatografia de interação hidrofílica (HIC), LC por exclusão de tamanho, LC de troca iônica e LC de afinidade.
[00047] A separação de LC pode ser LC de canal único ou LC de múltiplos canais, compreendendo uma pluralidade de canais de LC dispostos em paralelo. Em LC, os analitos podem ser separados de acordo com a sua polaridade ou valor log P, tamanho ou afinidade, como é geralmente conhecido pelo técnico no assunto.
[00048] No contexto da presente divulgação, o termo "primeiro processo de enriquecimento", "primeira etapa de enriquecimento" ou "primeiro fluxo de trabalho de enriquecimento" refere-se a um processo de enriquecimento que ocorre após o pré-tratamento da amostra e fornece uma amostra que compreende um analito enriquecido em relação à amostra inicial.
[00049] No contexto da presente divulgação, o termo "segundo processo de enriquecimento", "segunda etapa de enriquecimento" ou "segundo fluxo de trabalho de enriquecimento" refere-se a um processo de enriquecimento que ocorre após o pré-tratamento e o primeiro processo de enriquecimento da amostra e fornece uma amostra compreendendo um analito enriquecido em relação à amostra inicial e à amostra após o primeiro processo de enriquecimento.
[00050] Um "kit" é qualquer artigo de manufatura (por exemplo, uma embalagem ou recipiente) compreendendo pelo menos um reagente, por exemplo, um medicamento para o tratamento de um distúrbio ou uma sonda para detectar especificamente um analito da presente invenção. O kit é preferencialmente promovido, distribuído ou vendido como uma unidade para realizar o método da presente invenção. Normalmente, um kit pode compreender ainda meios de transporte sendo compartimentados para receber em confinamento fechado um ou mais meios de recipientes, tais como frascos, tubos e similares. Em particular, um recipiente pode compreender um dos elementos separados a serem usados no método do primeiro aspecto. Os kits podem compreender ainda um ou mais outros recipientes compreendendo outros materiais, incluindo, mas não se limitando a, tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de uso. Um marcador pode estar presente no recipiente para indicar que a composição usada para uma terapia específica ou aplicação não terapêutica, e pode também indicar orientações para uso in vivo ou in vitro, tais como aqueles descritos acima. O kit também pode incluir um código de programa de computador fornecido em um meio de armazenamento de dados ou dispositivo, tal como um meio de armazenamento óptico (por exemplo, um CD) ou diretamente em um computador ou dispositivo de processamento de dados. Além disso, o kit pode compreender quantidades padrão para os biomarcadores, conforme descrito em outro lugar neste documento, para fins de calibração.
[00051] O termo “bula” é usado para referir-se a instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia de combinação, contraindicações e/ou advertências relativas ao uso de tais produtos terapêuticos.
[00052] Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a um método para determinar moléculas de hemoglobina A glicada (HbA1c) intacta em uma amostra, compreendendo: (a) fornecer uma amostra compreendendo moléculas de hemoglobina A (HbA), em particular moléculas de hemoglobina A (HbA) intacta, (b) enriquecer as moléculas de hemoglobina A, em particular as moléculas das cadeias α e/ou cadeia β, na referida amostra, e (c) submeter a amostra compreendendo moléculas de hemoglobina A intacta, em particular as moléculas da cadeia α e/ou da cadeia β, a uma análise por espectrometria de massa (MS) em que a quantidade ou concentração de HbA1c na amostra é determinada.
[00053] Desse modo, a quantidade ou concentração de HbA1c, em particular a quantidade relativa de HbA1c, ou seja, a razão de moléculas de HbA1c glicada para moléculas de HbA0 não glicada ou para moléculas de HbA no total, em uma amostra, pode ser determinada. O método é altamente preciso e pode fornecer um coeficiente de variação (CV) de 2,5% ou menos, mais particularmente de 2,0% ou menos ao determinar repetidamente a quantidade de HbA1c, a razão de HbA1c/HbA ou a razão HbA1c/HbA0 em um amostra fornecida.
[00054] De acordo com a etapa (a), é fornecida uma amostra compreendendo moléculas de hemoglobina. A amostra é, de preferência, uma amostra de sangue total hemolisado, particularmente uma amostra de sangue total humano hemolisado, por exemplo derivada a partir de um paciente cujo sangue deve ser testado para a quantidade de hemoglobina glicosilada A. A hemólise é particularmente realizada através da diluição com água (H2O), por exemplo, água desionizada ou destilada, em particular em uma razão de amostra:água de cerca de 1:2 a cerca de 1:20, por exemplo, de cerca de 1:5, cerca de 1:10 ou, em particular, cerca de 1:9 (v/v). A amostra pode ser hemolisada por um tempo menor do que cerca de 30 min, menos do que cerca de 10 min, menos do que cerca de 5 min ou mesmo menos do que cerca de 2 min. Em modalidades particulares, a amostra é hemolisada por um tempo de cerca de 10 a cerca de 60 segundos.
[00055] Em modalidades particulares, a hemólise é realizada misturando amostra e água, em particular por vórtice da amostra e água. Em particular, a amostra e a água são misturadas, em particular agitadas em vórtice, durante 1 a 60 segundos, em particular durante 5 a 30 segundos, em particular durante 10 segundos.
[00056] Durante a hemólise, a amostra pode ser mantida a uma temperatura de 20 °C a 30 °C, em particular a 22-25 °C, em particular à temperatura ambiente.
[00057] Em modalidades particulares, a hemólise da amostra é realizada misturando a amostra com água em uma razão de 1:9 por vórtice por 10 segundos à temperatura ambiente.
[00058] Em modalidades particulares, a amostra obtida na etapa (a) é submetida a um fluxo de trabalho de enriquecimento, ou seja, a etapa de enriquecimento (b) que compreende enriquecer moléculas de hemoglobina A intacta, em particular as moléculas das cadeias α e/ou β, na amostra. A etapa de enriquecimento aumenta a quantidade relativa de moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de moléculas de hemoglobina A, versus outros constituintes da amostra antes de submeter a amostra à análise por MS.
[00059] Em modalidades particulares, a etapa de enriquecimento (b) compreende um enriquecimento de moléculas da cadeia β de hemoglobina A intacta versus da cadeia α de hemoglobina A, particularmente por pelo menos um fator de cerca de 2, por pelo menos um fator de cerca de 5, ou por pelo menos um fator de cerca de 10, e/ou um enriquecimento de moléculas da cadeia β de hemoglobina A intacta versus moléculas de albumina, particularmente por pelo menos um fator de cerca de 2, por pelo menos um fator de cerca de 5, ou por pelo menos um fator de cerca de 10.
[00060] A etapa de enriquecimento (b) pode incluir um ou mais métodos de enriquecimento, em particular uma primeira e/ou uma segunda etapa de enriquecimento. Os métodos de enriquecimento são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, métodos de enriquecimento químico, incluindo, mas não se limitando a, precipitação química e métodos de enriquecimento usando fases sólidas, incluindo, mas não se limitando a, métodos de extração de fase sólida, fluxos de trabalho com esferas e métodos cromatográficos (por exemplo, cromatografia gasosa ou líquida). Por conseguinte, em modalidades particulares, a etapa de enriquecimento (b) compreende um ou mais métodos de enriquecimento selecionados a partir do grupo que consiste em precipitação química, métodos que usam métodos de extração em fase sólida, fluxos de trabalho com esfera e métodos cromatográficos.
[00061] Nas modalidades, a etapa de enriquecimento (b) compreende um ou dois métodos de enriquecimento, ou seja, compreende a etapa de enriquecimento (b) (i) e/ou etapa de enriquecimento (b) (ii). Em modalidades, nas quais o método compreende a etapa de enriquecimento (b) (i) e a etapa de enriquecimento (b) (ii), a etapa de enriquecimento (b) (i) é realizada antes da etapa de enriquecimento (b) (ii).
[00062] Em modalidades, a etapa de enriquecimento (b) (i)
compreende uma etapa de separação ligada/livre que compreende a adição de uma fase sólida carregando grupos seletivos de analito à amostra pré-tratada. A fase sólida pode ser composta por partículas sólidas ou por uma fase sólida não particular, por exemplo, uma superfície revestida dentro de um recipiente ou poço. Em modalidades particulares, a fase sólida é composta por partículas magnéticas ou paramagnéticas, em particular partículas com um núcleo magnético ou paramagnético. Em modalidades, o referido núcleo magnético ou paramagnético compreende um óxido de metal e/ou um carboneto de metal. Em uma modalidade especialmente particular, o núcleo compreende Fe3O4.
[00063] A superfície da fase sólida, em particular, as esferas magnéticas ou paramagnéticas, pode ser uma superfície hidrofóbica, em particular compreendendo grupos orgânicos hidrofóbicos, tais como grupos alquila C3-C18, mais particularmente grupos alquila C4. Além disso, a superfície hidrofóbica da fase sólida, em particular a superfície das esferas magnéticas ou paramagnéticas, compreende poros. O tamanho do poro pode estar na faixa de 1 nm a 200 nm, em particular menos do que cerca de 100 nm, em particular menos do que cerca de 10 nm. Superfícies hidrofóbicas adequadas podem, por exemplo, ser encontradas em "The HPLC Expert: Possibilities and Limitations of Modern High Performance Liquid Chromatography” DOI:10.1002/9783527677610.
[00064] Em modalidades, a etapa de enriquecimento (b) compreende uma primeira etapa de enriquecimento (b) (i), usando esferas magnéticas ou paramagnéticas. Em modalidades, a primeira etapa de enriquecimento (b) (i) compreende a adição de esferas magnéticas ou paramagnéticas carregando grupos para a ligação seletiva de moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, presentes na amostra. Em modalidades, a adição das esferas magnéticas compreende agitação ou mistura. Segue-se um período de incubação predefinido para capturar as moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A. Em modalidades, o fluxo de trabalho compreende uma etapa de lavagem (W1) após a incubação com as esferas magnéticas. Dependendo do(s) analito(s), uma ou mais etapas de lavagem adicionais (W2) são realizadas. Uma etapa de lavagem (W1, W2) compreende uma série de etapas incluindo separação de esfera magnética por uma unidade de manuseio de esfera magnética que compreende ímãs ou eletroímãs, aspiração de líquido, adição de um tampão de lavagem, ressuspensão das esferas magnéticas, outra etapa de separação de esfera magnética e outra aspiração do líquido. Além disso, as etapas de lavagem podem diferir em termos do tipo de solvente (água/orgânico/sal/pH), além do volume e número ou combinação de ciclos de lavagem. É bem conhecido pelo técnico no assunto como escolher os respectivos parâmetros. A última etapa de lavagem (W1, W2) é seguida pela adição de um reagente de eluição seguido pela ressuspensão das esferas magnéticas e um período de incubação predefinido para liberar o(s) analito(s) de interesse das esferas magnéticas. As esferas magnéticas livres de ligação são então separadas e o sobrenadante contendo moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, é capturado.
[00065] Em modalidades particulares, o contato da amostra compreendendo moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, com a fase sólida ocorre a um pH substancialmente neutro, por exemplo, a um pH de cerca de 5 a cerca de 7, particularmente a um pH de cerca de 6. Para este propósito, uma amostra, por exemplo, uma amostra de sangue total hemolisado, pode ser diluída em um meio de ligação de fase sólida. O tampão é, de preferência, um tampão que não compreende íons Na + ou K+, por exemplo, um tampão que compreende íons amônio mono-, di- ou trissubstituídos. O ânion é, de preferência, um ânion carboxilato, tal como formato. Um tampão especialmente preferido é formato de amônio, por exemplo, um tampão formato de amônio de pH 6.
[00066] A eluição seletiva dos constituintes ligados da fase sólida pode ser realizada ao colocar a fase sólida carregada em contato com os constituintes da amostra com um meio de eluição compreendendo um solvente orgânico miscível em água, por exemplo, um solvente aprótico, tal como acetonitrila, em uma quantidade de 20 a 60% (v/v), em particular em uma quantidade de cerca de 20, 30, 40 ou 50% (v/v). O pH do meio de eluição e os constituintes da porção aquosa do meio de eluição podem ser os mesmos que os descritos para o meio de ligação de fase sólida.
[00067] Alternativamente ou adicionalmente, a etapa de enriquecimento (b) pode compreender uma segunda etapa de enriquecimento (b) (ii). Na segunda etapa de enriquecimento (b) (ii), as moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, são ainda enriquecidas na amostra. Em modalidades particulares, a etapa de enriquecimento (b) (ii) compreende uma etapa cromatográfica, em que os constituintes individuais da amostra são separados uns dos outros. Em particular, na segunda etapa de enriquecimento (b) (ii), as cadeias α e β de hemoglobina A são separadas uma da outra. Em modalidades, a segunda etapa de enriquecimento (b) (ii) pode ser realizada subsequentemente à primeira etapa de enriquecimento (b) (i), conforme descrito em detalhes acima.
[00068] Em modalidades, a separação cromatográfica é cromatografia gasosa ou líquida. Estas técnicas são geralmente conhecidas do técnico no assunto. Nas modalidades, a cromatografia líquida é selecionada a partir do grupo que consiste em HPLC, LC rápida, micro-LC, injeção em fluxo e captura e eluição. Em modalidades particulares, a separação cromatográfica compreende o uso de uma única coluna cromática ou o uso de duas ou mais colunas cromáticas. Em modalidades particulares, nas quais duas ou mais colunas cromáticas são usadas, as colunas são posicionadas a jusante uma da outra, ou seja, uma segunda coluna é posicionada a jusante de uma primeira coluna e uma terceira coluna opcional é posicionada a jusante da segunda coluna, etc. Em modalidades nas quais duas ou mais colunas são usadas, essas colunas podem ser idênticas ou podem diferir umas das outras dependendo da função desejada. É bem conhecido pelo técnico no assunto escolher as colunas corretas e configurá-las.
[00069] Nas modalidades, a amostra obtida após a hemólise na etapa (a) ou na primeira etapa de enriquecimento (b) (i) é transferida para uma estação LC ou é transferida para a estação LC após uma etapa de diluição pela adição de um líquido de diluição. Também podem ser usados diferentes procedimentos/reagentes de eluição, alterando, por exemplo, o tipo de solventes (água/orgânico/sal/pH) e o volume. Os vários parâmetros são bem conhecidos pelo técnico no assunto e facilmente escolhidos.
[00070] Em certas modalidades, a etapa de enriquecimento (b) compreende uma primeira etapa de enriquecimento (b) (i) e uma segunda etapa de enriquecimento (b) (ii), na qual a segunda etapa de enriquecimento (b) (ii) é realizada após a primeira etapa de enriquecimento (b) (i). Em modalidades particulares, a primeira etapa de enriquecimento (b) (i) compreende fluxo de trabalho com esfera, conforme descrito em detalhes acima, e a segunda etapa de enriquecimento (b) (ii) compreende cromatografia líquida, em particular selecionada a partir do grupo que consiste em HPLC, LC rápida, micro-LC, injeção de fluxo e/ou captura e eluição.
[00071] De acordo com a presente invenção, a etapa (c) do método da presente invenção compreende uma análise de moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, ou seja, uma análise de moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, que não foram submetidas à digestão com uma protease,
tal como tripsina ou Glu-C.
[00072] A análise de acordo com a etapa (c) é realizada por MS.
Em princípio, diferentes procedimentos de análise por MS podem ser usados.
De preferência, o procedimento de análise por MS compreende uma análise por MS de tempo de voo (TOF), particularmente uma análise por MS de TOF MS (Q) de quadrupolo. Além disso, é preferido que a análise por MS seja realizada no modo positivo e/ou uma integração de sinal de vários estados de carga da molécula da cadeia β de hemoglobina A intacta, particularmente incluindo estados de carga de M+17H a M+13H.
[00073] O método da invenção compreende uma determinação quantitativa de HbA1c na amostra. Em particular, é determinada a quantidade relativa de moléculas de HbA1c glicada para moléculas de HbA0 não glicada ou para moléculas de HbA no total. Em uma modalidade especialmente preferida, esta quantidade relativa é determinada com um coeficiente de variação (CV) de 2,5% ou menos, particularmente de 2,0% ou menos.
[00074] Em uma modalidade especialmente preferida, o método da invenção compreende um fluxo de trabalho como segue: (a) hemolisar uma amostra de sangue total, por exemplo, por diluição com H2O, (b) enriquecer moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e β de hemoglobina A, na amostra hemolisada gerada na etapa (a), ao colocar a amostra em contato com uma fase sólida, particularmente composta por partículas magnéticas ou paramagnéticas, tendo uma superfície hidrofóbica sob condições nas quais as moléculas da cadeia β de hemoglobina A intacta se ligam à fase sólida, e eluir seletivamente as moléculas ligadas da fase sólida carregada, e (c) submeter a amostra da etapa (b) compreendendo moléculas da cadeia β de hemoglobina A intacta a uma análise por MS-TOF em que a quantidade ou concentração de HbA1c na amostra é determinada.
[00075] Em modalidades particulares, este fluxo de trabalho permite a análise de alto rendimento de mais de 100 amostras por hora.
[00076] Em uma modalidade especialmente preferida, o método da invenção compreende um fluxo de trabalho como segue: (a) hemolisar uma amostra de sangue total, por exemplo, por diluição com H2O, (b) enriquecer moléculas de hemoglobina A intacta, em particular da cadeia β de hemoglobina A, na amostra hemolisada gerada na etapa (a), ao submeter a amostra a cromatografia líquida, em particular a HPLC ou LC rápida, sob condições nas quais as moléculas da cadeia β de hemoglobina A intacta se ligam à fase sólida, e eluir seletivamente as moléculas ligadas da fase sólida carregada, e (c) submeter a amostra da etapa (b) compreendendo moléculas de hemoglobina A intacta a uma análise por MS-TOF em que a quantidade ou concentração de HbA1c na amostra é determinada.
[00077] Em modalidades particulares, este fluxo de trabalho permite a separação específica das cadeias α e β de hemoglobina A.
[00078] Em uma modalidade especialmente preferida, o método da invenção compreende um fluxo de trabalho como segue: (a) hemolisar uma amostra de sangue total, por exemplo, por diluição com H2O, (b) (i) enriquecer moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e β de hemoglobina A, na amostra hemolisada gerada na etapa (a), ao colocar a amostra em contato com uma fase sólida, particularmente composta por partículas magnéticas ou paramagnéticas, tendo uma superfície hidrofóbica sob condições nas quais as moléculas da cadeia β de hemoglobina A intacta se ligam à fase sólida, e eluir seletivamente as moléculas ligadas da fase sólida carregada, e (ii) enriquecer adicionalmente moléculas de hemoglobina A intacta, em particular da cadeia β de hemoglobina A, na amostra hemolisada gerada na etapa (b) (i) ao submeter a amostra a cromatografia líquida, em particular a HPLC ou LC rápida, sob condições nas quais as moléculas da cadeia β de hemoglobina A intacta se ligam à fase sólida, e eluir seletivamente as moléculas ligadas da fase sólida carregada, e (c) submeter a amostra da etapa (b) compreendendo moléculas de hemoglobina A intacta a uma análise por MS-TOF em que a quantidade ou concentração de HbA1c na amostra é determinada.
[00079] Em outras modalidades do primeiro aspecto, o método de determinar a hemoglobina A glicada (HbA1c) em uma amostra compreende a etapa adicional de adicionar um padrão interno à amostra (ISTD). O padrão interno é, de preferência, uma molécula de HbA1c marcada isotopicamente. Em modalidades, o ISTD marcado isotopicamente compreende pelo menos um marcador 2H, 13C e/ou 15N.
[00080] Um segundo aspecto da presente invenção refere-se a um kit, compreendendo: (i) meios de enriquecimento para enriquecer moléculas de HbA1c glicada intacta, em particular uma fase sólida com uma superfície hidrofóbica para ligação seletiva de moléculas de HbA1c glicada intacta, (ii) um meio de ligação de fase sólida substancialmente neutro para uso na diluição de uma amostra de sangue total hemolisado e na ligação de constituintes da amostra à fase sólida (i), e (iii) um meio de eluição compreendendo um solvente orgânico miscível em água, tal como uma acetonitrila, particularmente em uma quantidade de 20 a 60% (v/v), em particular em uma quantidade de cerca de 20, 30, 40 ou 50% (v/v) para uso na eluição de componentes da amostra dos meios de enriquecimento (i).
[00081] No que diz respeito a modalidades particulares do segundo aspecto da presente invenção, é feita referência a todas as modalidades descritas acima em detalhes no contexto do primeiro aspecto.
[00082] Nas modalidades, o kit compreende (i) uma fase sólida, por exemplo, partículas, tais como partículas tendo uma superfície hidrofobicamente modificada, (ii) um meio de ligação de fase sólida substancialmente neutro, por exemplo, um tampão sem íons Na+ e K+, para uso na diluição de uma amostra de sangue total hemolisado e na ligação de constituintes da amostra à fase sólida (i), e (iii) um tampão de meio compreendendo um solvente orgânico miscível em água, tal como uma acetonitrila, em uma quantidade de 20 a 60% (v/v), em particularmente em uma quantidade de cerca de 20, 30, 40 ou 50% (v/v) para uso na eluição de componentes da amostra da fase sólida (i).
[00083] Em modalidades, o kit compreende meios de enriquecimento adaptados para realizarem pelo menos uma etapa de enriquecimento, em particular uma etapa de separação ligada/livre e/ou uma etapa cromatográfica. Em modalidades, os meios de enriquecimento compreendem uma fase sólida que pode ser composta de partículas sólidas, por exemplo, partículas magnéticas ou paramagnéticas, ou de uma fase sólida não específica.
[00084] Em modalidades particulares, a fase sólida carrega grupos para a ligação seletiva de moléculas de hemoglobina A intacta, em particular as moléculas da cadeia α e/ou β de hemoglobina A, por exemplo, grupos orgânicos hidrofóbicos. Em outras modalidades particulares, os meios de enriquecimento podem compreender uma coluna cromatográfica, em particular uma coluna cromatográfica para realizar uma etapa cromatográfica.
[00085] Em modalidades, o meio de eluição opcionalmente compreendido no kit compreende uma solução aquosa compreendendo um solvente orgânico miscível em água, em particular acetonitrila (ACN). O solvente orgânico miscível em água, em particular a ACN, está presente em uma quantidade de cerca de 20 a 60% (v/v), em particular em uma quantidade de cerca de 20, 30, 40 ou 50% (v/v).
[00086] O kit pode ser fornecido como um pacote único compreendendo recipientes dos componentes individuais ou como um conjunto de vários pacotes, cada um compreendendo um recipiente dos componentes individuais.
[00087] Em modalidades, o kit compreende ainda uma bula. Nas modalidades, a bula compreende informações sobre as indicações, uso, desempenho e/ou avisos relativos ao kit.
[00088] Um terceiro aspecto da presente invenção é um sistema de diagnóstico adaptado para determinar a HbA1c glicada em uma amostra; em particular realizando o método conforme descrito acima.
[00089] Em modalidades particulares, o sistema de diagnóstico compreende: (i) pelo menos uma estação para a preparação de amostras compreendendo moléculas de HbA1c intacta, em particular em que a preparação compreende uma hemólise de uma amostra de sangue total, (ii) pelo menos uma estação de enriquecimento adaptada para enriquecer seletivamente as moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, a partir da amostra, e (iii) pelo menos uma estação adaptada para a análise de moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, por espectrometria de massa (MS), e determinação da quantidade ou concentração de HbAc1 na amostra.
[00090] No que diz respeito a modalidades particulares do terceiro aspecto da presente invenção, é feita referência a todas as modalidades descritas acima em detalhes no contexto com o primeiro e segundo aspectos.
[00091] Em modalidades particulares, o sistema de diagnóstico é adaptado para permitir um alto rendimento de amostras, em particular para permitir um rendimento de até 100 amostras/hora ou mais. Por exemplo, um sistema conforme descrito em WO 2017/103180, incorporado neste documento por referência, pode ser usado.
[00092] Em modalidades particulares, o sistema de diagnóstico compreende pelo menos uma estação para preparação de amostras de acesso aleatório e pelo menos uma estação para o enriquecimento das moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, antes da análise por MS.
[00093] Em modalidades, tal sistema de diagnóstico compreende uma estação de preparação de amostras para a preparação automática de amostras compreendendo moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A. Em modalidades particulares, a referida estação compreende uma seção para hemolisar uma ou mais amostras.
[00094] Em modalidades, o referido sistema de diagnóstico compreende ainda uma estação de enriquecimento. A referida estação de enriquecimento compreende uma seção para colocar uma ou mais amostras após a hemólise em contato com meios de enriquecimento, em particular com uma fase sólida, em particular partículas magnéticas ou paramagnéticas.
Adicionalmente ou alternativamente, a estação de enriquecimento compreende uma seção cromatográfica, em particular uma seção LC. Em modalidades, a seção LC compreende um ou mais canais LC. Em modalidades, nas quais a seção LC compreende mais de um canal LC, os canais podem ser dispostos em paralelo.
[00095] Em modalidades, o sistema de diagnóstico compreende pelo menos uma interface entre as diferentes seções e estações para inserir as amostras previamente preparadas na seção ou estação subsequente.
[00096] Em modalidades, o sistema de diagnóstico compreende ainda um controlador que pode ser programado para atribuir amostras para preparação de amostras predefinidas e fluxos de trabalho de enriquecimento, cada uma compreendendo uma sequência predefinida das etapas de preparação e enriquecimento de amostras e exigindo um tempo predefinido para a conclusão.
[00097] Em modalidades particulares, o controlador planeja uma sequência de entrada do canal de estação de enriquecimento para inserir as amostras preparadas que permite que moléculas da cadeia ß de HbA intacta de diferentes canais de estação de enriquecimento eluam em uma sequência de saída do eluato não sobreposta com base nos tempos de eluição esperados.
[00098] Em modalidades, o controlador define e inicia uma sequência de início da preparação de amostras que gera uma sequência de saída das amostras preparadas fora da estação de preparação de amostras que corresponde à sequência de entrada do canal de estação de enriquecimento de modo que, quando a preparação de uma amostra for concluída, o canal de estação de enriquecimento atribuído também esteja disponível e a amostra preparada possa ser inserida no canal de estação de enriquecimento atribuído, antes da preparação de outra amostra ser concluída ou antes da próxima amostra preparada chegar à interface de preparação/enriquecimento de amostras.
[00099] Em modalidades, o controlador define um período de referência para o tempo apropriado de fluxos de trabalho. Isso torna possível coordenar as seguintes etapas de processamento: (1) iniciar a preparação de no máximo uma amostra por período de referência com possivelmente um ou mais períodos de referência entre amostras consecutivas na sequência de início da preparação de amostras; e/ou (2) preparação completa de no máximo uma amostra por período de referência com possivelmente um ou mais períodos de referência entre amostras preparadas consecutivas da sequência de saída de amostras preparadas; e/ou (3) inserir uma amostra preparada por período de referência em um dos canais de estação de enriquecimento com possivelmente um ou mais períodos de referência entre entradas consecutivas do canal de estação de enriquecimento; e/ou (4) emitir um eluato de estação de enriquecimento por período de referência com possivelmente um ou mais períodos de referência entre eluatos consecutivos da estação de enriquecimento.
[000100] Além disso, a presente invenção refere-se aos seguintes itens.
[000101] 1. Método para determinar hemoglobina A glicada (HbA1c) em uma amostra, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma amostra compreendendo moléculas de hemoglobina A (HbA), em particular moléculas de hemoglobina A (HbA) intacta, (b) enriquecer moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, na referida amostra, e (c) submeter a amostra compreendendo moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, a uma análise por espectrometria de massa (MS), em que a quantidade ou concentração de moléculas de HbA1c na amostra é determinada.
[000102] 2. Método, de acordo com o item 1, caracterizado pela amostra na etapa (a) ser uma amostra de sangue total hemolisado, particularmente uma amostra de sangue total humano hemolisado.
[000103] 3. Método, de acordo com o item 1 ou 2, caracterizado pela amostra na etapa (a) ser hemolisada usando água (H2O), em particular em uma razão de amostra:água de 1:2 a 1:20 (v/v), tal como em uma razão de cerca de 1:5 a cerca de 1:10, ou em uma razão de cerca de 1:5, 1:6,
1:7, 1:8, 1:9 ou 1:10 (v/v).
[000104] 4. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 3, caracterizado pela amostra ser hemolisada por um período de tempo inferior a cerca de 30 min, inferior a cerca de 10 min, inferior a cerca de 5 min, ou inferior a cerca de 2 min, em particular por um período de tempo de cerca de 10 a cerca de 60 seg.
[000105] 5. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 4, caracterizado pela etapa de enriquecimento (b) compreender uma primeira etapa de enriquecimento (em particular uma etapa de separação ligada/livre) (b) (i), em particular compreendendo colocar a amostra em contato com uma fase sólida tendo uma superfície para a ligação seletiva de hemoglobina A intacta, em particular as cadeias α e β de hemoglobina A, sob condições nas quais a hemoglobina A intacta, em particular as cadeias α e β de hemoglobina A, se ligam à fase sólida, e eluir seletivamente a hemoglobina A ligada, em particular as cadeias α e/ou β de hemoglobina A, da fase sólida.
[000106] 6. Método, de acordo com o item 5, caracterizado pela fase sólida compreender uma superfície hidrofóbica.
[000107] 7. Método, de acordo com o item 5 ou 6, caracterizado por, na etapa (b) (i), a amostra ser colocada em contato com a fase sólida a um pH de cerca de 5 a cerca de 7, particularmente a um pH de cerca de
6.
[000108] 8. Método, de acordo com qualquer um dos itens 5 a 7, caracterizado por, na etapa (b) (i), a amostra ser colocada em contato com a fase sólida na presença de um tampão, em particular na presença de formato de amônio.
[000109] 9. Método, de acordo com qualquer um dos itens 5 a 8, caracterizado pela fase sólida ser composta de partículas, em particular partículas magnéticas ou paramagnéticas, em particular partículas tendo um núcleo magnético ou paramagnético compreendendo um óxido de metal e/ou um carboneto de metal, em particular Fe3O4.
[000110] 10. Método, de acordo com qualquer um dos itens 5 a 9, caracterizado pela superfície hidrofóbica da fase sólida compreender grupos C3-C18 alquila, particularmente grupos C4 alquila.
[000111] 11. Método, de acordo com qualquer um dos itens 5 a 10, caracterizado pela superfície hidrofóbica da fase sólida compreender poros com um tamanho de poro inferior a cerca de 100 nm, em particular inferior a cerca de 10 nm.
[000112] 12. Método, de acordo com qualquer um dos itens 5 a 11, caracterizado por, na etapa de enriquecimento (b) (i), as moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e β de hemoglobina A, serem enriquecidas por eluição seletiva da fase sólida, particularmente na presença de 20% a 60% (v/v) de acetonitrila, mais particularmente na presença de cerca de 50% (v/v) de acetonitrila.
[000113] 13. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 12, caracterizado pela etapa de enriquecimento (b) compreender uma segunda etapa de enriquecimento (b) (ii), em particular uma etapa cromatográfica (b) (ii), em particular cromatografia líquida (LC), em particular selecionado a partir do grupo que consiste em HPLC, micro-LC e LC rápida, da amostra.
[000114] 14. Método, de acordo com qualquer um dos itens 5 a 13, caracterizado pela etapa de enriquecimento (b) compreender uma etapa de separação ligada/livre (b) (i) e uma etapa cromatográfica (b) (ii).
[000115] 15. Método, de acordo com qualquer um dos itens 13 a 14, caracterizado por, na etapa de enriquecimento cromatográfica (b) (ii), as moléculas da cadeia β de hemoglobina A intacta serem enriquecidas versus as moléculas da cadeia α de hemoglobina A, particularmente por pelo menos um fator de 10, e/ou moléculas da cadeia β de hemoglobina A intacta serem enriquecidas versus as moléculas de albumina, particularmente por pelo menos um fator de 10.
[000116] 16. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 15, caracterizado pela etapa (c) compreender uma análise de moléculas da cadeia β de hemoglobina A intacta, em particular em que as moléculas da cadeia β de hemoglobina A intacta não foram submetidas à digestão por uma protease, tal como tripsina ou Glu-C.
[000117] 17. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 16, caracterizado pela etapa (c) compreender uma análise por MS de tempo de voo (TOF), em particular uma análise por MS de TOF (Q) de quadrupolo de moléculas da cadeia β de hemoglobina A intacta.
[000118] 18. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 16, caracterizado pela determinação da quantidade de HbA1c na amostra compreender a integração do sinal de vários estados carregados de moléculas da cadeia β de hemoglobina A intacta, particularmente incluindo os estados carregados M+17H a M+13H.
[000119] 19. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 18, caracterizado pela razão de hemoglobina A glicada (HbA1c) para hemoglobina A não glicada (HbA0) ou hemoglobina A total (HbA) ser determinada.
[000120] 20. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 19, caracterizado pela razão ser determinada com um coeficiente de variação (CV) de 2,5% ou menos, particularmente de 2,0% ou menos.
[000121] 21. Kit, caracterizado por compreender: (i) meios de enriquecimento para enriquecer moléculas de HbA1c glicada intacta, em particular compreendendo uma fase sólida tendo uma superfície hidrofóbica para ligação seletiva de moléculas de HbA1c glicada intacta, (ii) um meio de ligação de fase sólida substancialmente neutro para uso na diluição de uma amostra de sangue total hemolisado e na ligação de constituintes da amostra à fase sólida (i), e (iii) um meio de eluição compreendendo um solvente orgânico miscível em água, tal como um acetonitrila, particularmente em uma quantidade de 50% (v/v) para uso na eluição de componentes da amostra dos meios de enriquecimento (i).
[000122] 22. Uso do kit, conforme definido no item 21, caracterizado por ser em um método, conforme definido em qualquer um dos itens 1 a 20.
[000123] 23. Sistema de diagnóstico para determinar a hemoglobina A glicada (HbA1c) em uma amostra adaptada, caracterizado por ser para realizar o método, conforme definido em qualquer um dos itens 1 a 20.
[000124] 24. Sistema de diagnóstico para determinar a hemoglobina A glicada (HbAc1) em uma amostra, caracterizado por compreender: (i) pelo menos uma estação para a preparação de amostras compreendendo moléculas de HbA1c intacta, em que a preparação compreende hemólise de uma amostra de sangue total, (ii) pelo menos uma estação de enriquecimento adaptada para enriquecer seletivamente as moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, a partir da amostra, e (iii) pelo menos uma estação adaptada para a análise de moléculas de hemoglobina A intacta, em particular da cadeia β de hemoglobina A, por espectrometria de massa (MS) e a determinação da quantidade ou concentração de HbAc1 na amostra.
[000125] 25. Uso do sistema de diagnóstico, conforme definido no item 23 ou 24, caracterizado por ser no método, conforme definido em qualquer um dos itens 1 a 20.
[000126] A seguir, a presente invenção é explicada em mais detalhes pelos Exemplos.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 DETERMINAÇÃO DE HBA1C INTACTA EM SANGUE TOTAL
[000127] Três amostras de sangue total de 100 µL foram diluídas, cada uma com 400 µL de água desionizada, e misturadas por vórtice por 10 s até que soluções claras fossem obtidas. Em seguida, cada um dos hemolisados foi diluído 20 vezes em um tampão diferente com um pH de 2, 6 ou 10, respectivamente.
[000128] Três lotes de esferas magnéticas hidrofóbicas (cada 100 µL) foram equilibrados por mistura com 900 µL de cada um dos três tampões diferentes, conforme indicado acima. Posteriormente, 900 µL de sobrenadante foram descartados e as esferas equilibradas recuperadas.
[000129] Três amostras de hemolisados de sangue total de 900 µL (já diluídas em três tampões diferentes, conforme indicado acima) foram adicionadas ao respectivo lote de esferas equilibradas a fim de obter esferas carregadas. Em seguida, as misturas foram agitadas a 37 °C e 1200 rpm durante 15 min.
[000130] Das esferas carregadas, uma série de várias frações para LC-MS foi coletada da seguinte forma.
[000131] Primeiro, 900 µL de sobrenadante foram coletados de cada lote de esferas carregadas. 100 µL desta "fração de 0%" foram diluídos dez vezes pela adição de 900 µL de ácido fórmico a 0,1% (v/v) (eluente A) para LC- MS. As esferas foram retidas para coletar frações adicionais.
[000132] Em seguida, uma "fração de 10%" foi coletada pela adição de 700 µL do respectivo tampão e 200 µL de acetonitrila a 50% (v/v) (ACN) a cada lote de esferas. As misturas foram agitadas a 37 °C a 1200 rpm durante 1 min.
[000133] 900 µL da “fração de 10%” foram coletados. 100 µL foram subsequentemente diluídos por dez vezes em 0,1% (v/v) de ácido fórmico para LC-MS.
[000134] Posteriormente, este procedimento foi repetido analogamente para cada lote de esferas carregadas com tampões contendo concentrações crescentes de 20% (v/v), 30% (v/v) e 40% (v/v) de ACN a fim de se obter uma “fração de 20%”, uma “fração de 30%” e uma “fração de 40%”.
[000135] As frações resultantes, a fração de 0%, a fração de 10%, a fração de 20%, a fração de 30% e a fração de 40% de cada lote de esferas carregadas foram submetidas à análise por LC-MS.
[000136] As medições de LC-MS foram realizadas em um dispositivo Waters Synapt G2-Si HDMS QuanTof. Um sistema de tampão formato de amônio e parâmetros de fonte otimizados foram usados para medições de proteína intacta. A transmissão de íons foi otimizada para eliminar o ruído químico sem fragmentação de HbA1c. Uma coluna C4 foi usada para dessalinização e separação das cadeias α e β. Foi usada uma integração manual e de software-sinal de estados de carga (M+17H a M+13H).
[000137] Na Figura 1, o espectro LC-MS de um hemolisado sem pré-enriquecimento é mostrado (1: albumina; 2: cadeia α de HbA; 3: cadeia β de HbA).
[000138] A Figura 2 mostra a análise por LC-MS da fração de 0%, da fração de 10%, da fração de 20%, da fração de 30% e da fração de 40% de um lote de esferas carregadas (tampão de pH 6) demonstrando a separação de cadeias de HbA de albumina abundante.
[000139] A Figura 3 mostra os resultados de uma purificação à base de esferas de hemolisados de sangue total demonstrando um coeficiente de variação (CV) das razões de HbA1c (com Glc)/HbA0 (sem Glc) de 1,56% e
1,74%, respectivamente, ao testar 10 replicados de uma amostra, analisando os diferentes estados de carga das proteínas.
Claims (13)
1. MÉTODO PARA DETERMINAR HEMOGLOBINA A GLICADA (HBA1C) EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma amostra compreendendo moléculas de hemoglobina A (HbA), (b) enriquecer moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, na referida amostra, e (c) submeter a amostra compreendendo moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, a uma análise por espectrometria de massa (MS), em que a quantidade ou concentração de moléculas de HbA1c na amostra é determinada.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela amostra na etapa (a) ser uma amostra de sangue total hemolisado, particularmente uma amostra de sangue total humano hemolisado.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela etapa de enriquecimento (b) compreender uma primeira etapa de enriquecimento (b)(i), em particular compreendendo colocar a amostra em contato com uma fase sólida, em particular com uma fase sólida tendo uma superfície para a ligação seletiva da molécula de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, sob condições nas quais a hemoglobina A intacta se liga à fase sólida, e eluir seletivamente os fragmentos ligados da fase sólida.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela etapa de enriquecimento (b) compreender uma segunda etapa de enriquecimento (b)(ii), em particular compreendendo submeter a amostra hemolisada gerada na etapa (a) ou a amostra enriquecida gerada na etapa de enriquecimento (b)(i) a uma etapa de enriquecimento cromatográfica, em particular a cromatografia líquida, em particular a HPLC ou LC rápida, sob condições nas quais as moléculas de hemoglobina A intacta, em particular da cadeia β de hemoglobina A, são enriquecidas.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por, na etapa de enriquecimento (b)(ii), moléculas da cadeia β de hemoglobina A intacta serem enriquecidas contra moléculas da cadeia α de hemoglobina A, particularmente por pelo menos um fator de 10, e/ou as moléculas da cadeia β hemoglobina A intacta serem enriquecidas em relação às moléculas de albumina, particularmente por pelo menos um fator de 10.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela etapa (c) compreender uma análise da molécula de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, em particular em que a molécula de hemoglobina A intacta, em particular, das cadeias α e/ou β da hemoglobina A, não foram submetidas à digestão por uma protease, tal como tripsina ou Glu-C.
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela razão de hemoglobina A glicada (HbA1c) para hemoglobina A não glicada (HbA0) ou hemoglobina A total (HbA) ser determinada.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela razão ser determinada com um coeficiente de variação (CV) de 2,5% ou menos, particularmente de 2,0% ou menos.
9. KIT, caracterizado por compreender (i) meios de enriquecimento para enriquecer moléculas de HbA1c glicada intacta, em particular compreendendo uma fase sólida tendo uma superfície hidrofóbica para ligação seletiva de moléculas de HbA1c glicada intacta, (ii) um meio de ligação de fase sólida substancialmente neutro para uso na diluição de uma amostra de sangue total hemolisado e na ligação de constituintes da amostra à fase sólida (i) e (iii) um meio de eluição compreendendo um solvente orgânico miscível em água, tal como acetonitrila, particularmente em uma quantidade de cerca de 50% (v/v), para uso na eluição de componentes da amostra dos meios de enriquecimento (i).
10. USO DO KIT, conforme definido na reivindicação 9, caracterizado por ser para um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
11. SISTEMA DE DIAGNÓSTICO PARA DETERMINAR A HEMOGLOBINA A GLICADA (HBA1C) EM UMA AMOSTRA ADAPTADA, caracterizado por ser para realizar o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
12. SISTEMA DE DIAGNÓSTICO PARA DETERMINAR A HEMOGLOBINA A GLICADA (HBAC1) EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender (i) pelo menos uma estação para a preparação de amostras compreendendo moléculas de HbA1c intacta, em que a preparação compreende hemólise de uma amostra de sangue total, (ii) opcionalmente, pelo menos uma estação de enriquecimento adaptada para enriquecer seletivamente a molécula de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, a partir da amostra, e (iii) pelo menos uma estação adaptada para a análise de moléculas de hemoglobina A intacta, em particular das cadeias α e/ou β de hemoglobina A, por espectrometria de massa (MS), e determinação da quantidade ou concentração de HbAc1 na amostra.
13. USO DO SISTEMA DE DIAGNÓSTICO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 12, caracterizado por ser para o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
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