KR20210117267A - 원형 단백질 수준의 LC-MS 기반 HbA1c 측정을 위한 자동 샘플 워크플로우 - Google Patents

Abstract

본 발명은 질량 분석법(MS)으로 원형 당화 헤모글로빈A(HbA1c)를 측정하는 방법, 키트 및 상기 방법을 실시하기 적합한 진단 시스템에 관한 것이다.

Description

원형 단백질 수준의 LC-MS 기반 HbA1c 측정을 위한 자동 샘플 워크플로우

본 발명은 질량 분석법(MS)으로 원형 당화 헤모글로빈A(HbA1c) 분자들을 측정하는 방법, 키트 및 상기 방법을 실시하기 적합한 진단 시스템에 관한 것이다.

순환하는 혈당 수치의 조절 실패는 당뇨병의 지표이다. 혈당은 비-효소적 통계 과정에서 폴리펩티드의 리신 잔기들에 부착되어 당화 폴리펩티드로 이어질 수 있다. 헤모글로빈A(HbA)의 경우, 포도당 및 β-사슬의 N-말단 사이에서 반응이 발생한다. 결과로서 생성된 당화 헤모글로빈A β-사슬은 HbA1c로 지정되었다.

HbA1c는 인간 혈액의 주요 당화 헤모글로빈 종이다. 포괄적인 당뇨병 통제 및 합병증 시험(DCCT)은 합병증, 예컨대 망막병증, 신장병 및 신경병증이 인슐린-의존성 당뇨병(IDDM) 환자의 고혈당 정도와 직접적으로 관련이 있다는 증거를 제공했으며, 혈액 내 HbA1c의 측정은 당뇨병 환자의 혈당 상태를 장기적으로 모니터링하기 위한 우수한 도구이다(Nathan et al., N. Engl. J. Med 329 (1993) 977-986; Santiago, J.V., Diabetes 42 (1993) 1549-1554; Benjamin, J. and Sacks, D.B., Clin. Chem. 40 (1994) 683-687; 및 Goldstein D. et al., Clin. Chem 40 (1994) 1637-1640). 상기 DCCT 연구는 또한 각각 비-당화 헤모글로빈인 HbA1c 및 HbA0에 대한 신뢰할 만하고 재현 가능한 측정의 필요성을 분명히 제시하였다.

당화 헤모글로빈을 측정하는 수많은 상이한 방법, 즉 크로마토그래피 및/또는 질량 분석법(MS), 화학적 방법들 및 면역학적 방법들을 포함한 물리-화학적 방법들이 있다. 국제임상화학회(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, IFCC)에서 승인한 인간 혈액에서 HbA1c를 측정하기 위한 참조 방법은 효소 엔도프로테이나제(endoproteinase) Glu-C에 의해 헤모글로빈을 펩타이드로 18-20시간의 기간 동안 효소 절단하는 단계 및 이후에 HPLC 및 전기분무 이온화 질량 분석법 또는 UV-검출 기능이 있는 모세관 전기 영동 및 HPLC를 사용한 2차원 접근 방식으로 β-사슬의 당화 및 비-당화 N-말단 헥사펩타이드를 분리하고 정량화하는 단계를 포함한다(Jeppsson et al., Clin. Chem. Lab. Med. 40 (2002), 78-89).

그러나, 헤모글로빈A의 효소적 분해를 포함한 방법들은 충분한 양의 분해 산물 및 이에 따라 안정적인 측정 신호를 수득하기 위해 일반적으로 밤새 배양해야 한다. 또한, 샘플에 대하여 MS 검출을 실시하기 전에 매트릭스 성분을 포함한 복잡한 펩타이드 혼합물을 기존의 크로마토그래피를 사용하여 분리해야 한다. 따라서, 상기 방법들은 시간이 많이 걸리고 환자 샘플의 높은 처리량 측정에 제한적으로 사용된다.

원형 헤모글로빈 분자를 사용하여 MS로 당화 헤모글로빈을 측정하려는 여러 시도가 설명되었다. Roberts et al. (Clin. Chem. 43 (1997), 771-778)에 따르면, 전혈 샘플을 물로 50배 희석한 다음, 포름산 및 아세토니트릴을 포함하는 산성 변성 용매로 추가로 희석하고, 양이온 모드에서 작동하는 질량 분석기의 전자 분무 소스 내로 직접 도입하였다. 결과로서 생성된 스펙트럼을 처리하여 샘플에서 당화 헤모글로빈의 백분율을 측정하였다.

Biroccio et al. (Anal. Biochem. 336 (2005), 279-288)은 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간형 MS에 의한 원형 당화 및 글루타싸이오닐화된 헤모글로빈의 분석 방법을 개시한다. 상기 목적을 위해, 아세토니트릴 및 트리플루오로 아세트산을 포함하는 시나핀산 매트릭스에서 샌드위치(sandwich) 층 방법으로 샘플을 제조하였다.

Davison et al. (Clin. Chem. Lab. Med. 46 (2008), 1230-1238)은 당화 및 아세틸화 태아성 헤모글로빈의 측정을 위한 전기분무 이온화 MS를 설명한다. 혈액 샘플은 포름산 및 아세토니트릴을 포함하는 산성 변성 용매에 희석하였다. Na 및 K를 제거하기 위해 양이온 교환 비드로 세척한 후, 샘플을 양이온 모드에서 작동하는 질량 분석기의 전기분무 소스 내로 직접 도입하였다.

비행 시간 MS에 의한 제대혈 내 당화 및 아세틸화 헤모글로빈의 측정은 Dupont et al. (Anal. Chem. 83 (2011), 5245-5252)에 의해 설명된다. 전 제대혈을 물로 희석하고 아세토니트릴, 물 및 포름산을 포함하는 혼합물을 첨가하여 샘플을 제조하였다. 질량 분석기 내에 주입하기 전에 최종 용액을 양이온 교환 수지로 처리하였다. 분석은 포지티브 모드 및 W-옵틱스(Optics)에서 작동하는 전기분무 이온화 소스를 사용하여 4중극 직교 가속 비행 시간 MS 상에서 실시하였다.

Hattan et al. (J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (2016), 532-541)은 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화 비행 시간 MS에 의한 당화 헤모글로빈의 분석 및 정량적 측정을 설명한다. 전혈 샘플을 물에 희석하고 원심 분리하였다. 상청액을 시나핀산과 혼합하여 MALDI 표적 상에 스포팅(spotting)하였다. 질량 스펙트럼은 MALDI-TOF 질량 분석기에서 선형 양이온 모드로 생성하였다.

하지만, 상기 방법들은 만족스럽고 재현 가능한 결과를 제공하지 못하기 때문에 단점과 관련이 있다. 특히, 주어진 샘플을 반복적으로 시험할 때 높은 변동 계수가 관찰되었다. 따라서, MS로 HbA1c를 측정하기 위한 빠르고 신뢰할 만한 방법을 제공할 필요가 있다.

본 발명의 제1 양태는 샘플에서 당화 헤모글로빈A(HbA1c)의 원형 분자들을 측정하기 위한 방법으로서:

(a) 헤모글로빈A(HbA) 분자들, 특히 원형 헤모글로빈A 분자들을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;

(b) 상기 샘플 내 분자인 원형 헤모글로빈A, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬을 농축하는 단계; 및

(c) 분자인 원형 헤모글로빈A, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬을 포함하는 샘플에 대해 질량 분석법(MS)에 의한 분석을 실시하여 상기 샘플 내 HbA1c 분자들의 양 또는 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제2 양태는 키트로서:

(i) 원형 당화 HbA1c 분자들을 농축하기 위한 농축 수단으로서, 특히 원형 당화 HbA1c 분자들의 선택적 결합을 위한 소수성 표면을 갖는 고체상을 포함하는 농축 수단;

(ii) 용혈된 전혈 샘플을 희석하고 샘플 구성 요소들을 상기 고체상(i)에 결합시키는 데 사용하기 위한 실질적으로 중성인 고체상 결합 매질; 및

(iii) 상기 농축 수단(i)으로부터 샘플 성분들을 용출하는 데 사용하기 위한 유기 수-혼화성 용매, 예컨대 아세토니트릴을, 특히 약 20% 내지 약 60%(v/v), 특히 약 50%(v/v)의 양으로 포함하는 용출 매질을 포함하는, 키트에 관한 것이다.

상기 키트는 상기에 기재된 바와 같은 방법들에서 사용하기에 특히 적합하다.

본 발명의 제3 양태에서, 상기에 기재된 바와 같은 방법을 실시하기 적합한 진단 시스템이 제공된다. 상기 진단 시스템은 특히 상기에 기재된 바와 같은 키트와 함께 사용하기 위한 것이다.

본 발명은 MS로 샘플에서 원형 당화 HbA1c 분자들 및 선택적으로 원형 비-당화 HbA0 분자들에 대한 빠르고 신뢰할 만한 측정을 가능하게 한다.

도 1은 사전 농축이 없는 용혈물의 LC-MS 스펙트럼을 도시한다(1: 알부민; 2: HbA α-사슬; 3: HbA β-사슬).
도 2는 풍부한 알부민으로부터 HbA 사슬의 분리를 입증하는 로딩된 비드의 배치(완충액 pH 6)로부터의 0% 분획물, 10% 분획물, 20% 분획물, 30% 분획물 및 40% 분획물에 대한 LC-MS 분석을 도시한다.
도 3은 단백질의 상이한 전하 상태를 분석하여 샘플의 10가지 복제품을 시험할 때 HbA1c(w Glc)/HbA0(w/o Glc) 비율의 변동 계수(CV)가 각각 1.56% 및 1.74%임을 입증하는 전혈 용혈물의 비드 기반 정제의 결과를 도시한다.

단어 "포함하다(comprise)" 및 이의 변형들, 예컨대 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 제외를 의미하는 것은 아님이 이해될 것이다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 내용이 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 각각의 복수의 용어를 포함한다.

백분율, 농도, 양 및 기타 수치 데이터는 본원에서 “범위” 형식으로 표현되거나 제시될 수 있다. 상기 범위 형식은 편의성 및 간결성을 위해서만 사용되므로 상기 범위의 한계로서 명시적으로 언급된 수치 값을 포함할 뿐만 아니라, 각각의 수치 값 및 하위 범위가 명시적으로 언급된 것과 같이 해당 범위 내에 포함된 모든 개별적인 수치 값 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 유연하게 해석되어야 함을 이해해야 한다. 예시로서, "4% 내지 20%"의 수치 범위는 4% 내지 20%의 명시적으로 언급된 값을 포함할 뿐만 아니라, 표시된 범위 내의 개별적인 값 및 하위 범위도 포함하도록 해석되어야 한다. 따라서, 상기 수치 범위에 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, … 18, 19, 20%와 같은 개별 값 및 4-10%, 5-15%, 10-20% 등과 같은 하위 범위가 포함된다. 상기 동일한 원칙은 최소 또는 최대 값을 나타내는 범위에 적용된다. 또한, 상기 해석은 범위의 폭 또는 설명되는 특징에 관계없이 적용되어야 한다.

용어 "약"은 수치 값과 관련하여 사용될 때 표시된 수치 값 대비 5% 더 작은 하한을 갖고 표시된 수치 값 대비 5% 더 큰 상한을 갖는 수치 값을 포함함을 의미한다.

용어 "질량 분석법"("Mass Spec" 또는 "MS")은 질량에 의해 화합물을 식별하기 위해 사용되는 분석 기술에 관한 것이다. MS는 질량 대 전하 비율, 또는 "m/z"에 기반하여 이온을 필터링, 검출 및 측정하는 방법이다. MS 기술은 일반적으로 (1) 화합물을 이온화하여 하전된 화합물을 형성하는 것; 및 (2) 하전된 화합물의 분자량을 검출하고 질량 대 전하 비율을 계산하는 것을 포함한다. 화합물은 임의의 적합한 수단에 의해 이온화되고 검출될 수 있다. "질량 분석기"는 일반적으로 이온화기 및 이온 검출기를 포함한다. 일반적으로, 하나 이상의 관심 분자가 이온화되고, 상기 이온은 이후 질량 분석 기기 내로 도입되고, 여기서 자기장 및 전기장의 조합으로 인해, 상기 이온은 질량("m") 및 전하("z")에 의존하는 공간 중 경로를 따른다. 용어 "이온화(ionization)" 또는 "이온화하는(ionizing)"은 하나 이상의 전자 단위와 동일한 순 전하를 갖는 분석물 이온을 생성하는 과정을 지칭한다. 음이온은 하나 이상의 전자 단위의 순 음전하를 갖는 것인 한편, 양이온은 하나 이상의 전자 단위의 순 양전하를 갖는 것이다. MS 방법은 음이온이 생성 및 검출되는 "음이온 모드" 또는 양이온이 생성 및 검출되는 "양이온 모드"에서 실시될 수 있다.

비행 시간(Time-of-Flight, TOF) MS는 비행 시간 측정을 통해 이온의 질량 대 전하 비율을 측정하는 방법이다. 이온은 공지된 강도의 전기장에 의해 가속된다. 상기 이온의 속도는 질량 대 전하 비율에 따라 다르다. 이온이 공지된 거리에서 검출기에 도달하는 시간이 측정된다. 상기 측정을 기반으로 상기 이온을 식별할 수 있다.

MS에서 대부분의 샘플 워크플로우는 샘플 제조 및/또는 농축 단계를 추가로 포함하고, 여기서 예컨대 관심 분석물(들)이, 예컨대 기체 또는 액체 크로마토그래피를 사용하여 매트릭스로부터, 예컨대 분석물로부터 상이한 샘플 구성요소로부터 분리된다. 전형적으로, 질량 분석법 측정을 위해, 다음 세 단계가 실시된다:

(1.) 관심 분석물을 포함하는 샘플이 일반적으로 양이온과의 부가생성물 형성에 의해, 흔히 양이온으로의 양성자화에 의해 이온화된다. 이온화 소스는 전기분무 이온화(electrospray ionization, ESI) 및 대기압 화학 이온화(atmospheric pressure chemical ionization, APCI)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

(2.) 상기 이온은 질량 및 전하에 따라 분류 및 분리된다. 고자기장 비대칭 파형 이온 이동성 분광법(High-field asymmetric-waveform ion-mobility spectrometry, FAIMS)이 이온 필터로서 사용될 수 있다.

(3.) 이후 분리된 이온이, 예컨대 다중 반응 모드(multiple reaction mode, MRM)에서 검출되고, 그 결과가 차트 상에 표시된다.

용어 "전기분무 이온화" 또는 "ESI"는 용액이 짧은 길이의 모세관을 따라 통과하고, 이의 말단에 높은 양전위 또는 음전위가 인가되는 방법들을 지칭한다. 상기 관의 끝에 도달한 용액은 용매 증기 중의 용액의 매우 작은 액적의 제트 또는 스프레이로 기화된다(분무된다). 상기 액적의 미스트는 응축을 방지하고 용매를 증발시키기 위해 약간 가열되는 증발 챔버를 통해 흐른다. 상기 액적이 작아질수록 전기 표면 전하 밀도는 같은 전하 사이의 자연적인 반발로 인해 이온 및 중성 분자가 방출될 때까지 증가한다.

용어 "대기압 화학 이온화" 또는 "APCI"는 ESI와 유사한 질량 분석법 방법을 지칭하지만; APCI는 대기압에서 플라스마 내에서 발생하는 이온-분자 반응에 의해 이온을 생성한다. 상기 플라스마는 분무 모세관과 상대 전극 사이의 전기 방전에 의해 유지된다. 상기 이온은 전형적으로 일련의 차동 펌핑된 스키머 단계들을 사용하여 질량 분석기 내로 추출된다. 용매의 제거를 개선하기 위해 건조 및 예열된 N₂ 가스의 역류가 사용될 수 있다. APCI의 기상 이온화는 극성인 적은 개체 분석에서 ESI보다 더 효과적일 수 있다.

"다중 반응 모드" 또는 "MRM"은 전구체 이온 및 하나 이상의 단편 이온이 선택적으로 검출되는 MS 기기의 검출 모드이다.

질량 분석계는 다소 상이한 질량의 이온을 분리하고 검출하기 때문에, 주어진 원소의 상이한 동위원소를 쉽게 구별한다. 따라서 질량 분석법은 저분자량 분석물, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 분석물의 정확한 질량 측정 및 특징 규명을 위한 중요한 방법이다. 이의 적용은 단백질의 식별 및 이들의 번역 후 변형, 단백질 복합체의 해명, 이들의 서브유닛 및 기능적 상호작용뿐만 아니라 단백질체학에서 단백질의 전반적인 측정을 포함한다. 질량 분석법에 의한 펩타이드 또는 단백질의 드 노보 시퀀싱(de novo sequencing)은 전형적으로 아미노산 서열에 대한 사전 지식 없이 실시될 수 있다.

질량 분석 측정은 크로마토그래피 방법, 예컨대 기체 크로마토그래피(GC), 액체 크로마토그래피(LC), 특히 HPLC, 및/또는 이온 이동성-기반 분리 기술을 포함하는 추가 분석 방법과 조합될 수 있다.

본 개시의 맥락에서, 용어 "분석물", "분석물 분자", 또는 "관심 분석물(들)"은 상호 교환적으로 사용되어 질량 분석법을 통해 분석될 화학종을 지칭한다. 질량 분석법을 통해 분석하기에 적합한 화학종, 즉 분석물은, 살아있는 유기체에 존재하는 임의의 종류의 분자일 수 있고, 핵산(예컨대, DNA, mRNA, miRNA, rRNA 등), 아미노산, 펩타이드, 단백질(예컨대, 세포 표면 수용체, 시토졸 단백질 등), 대사산물 또는 호르몬(예컨대, 테스토스테론, 에스트로겐, 에스트라디올, 등), 지방산, 지질, 탄수화물, 스테로이드, 케토스테로이드, 세코스테로이드(예컨대, 비타민 D), 또 다른 분자의 특정 변형을 특징으로 하는 분자(예컨대, 단백질의 당 모이어티 또는 포스포릴 잔기, 유전체 DNA의 메틸-잔기) 또는 유기체에 의해 내재화된 물질(예컨대, 치료 약물, 남용 약물, 독소 등) 또는 상기 물질의 대사산물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 분석물은 바이오마커 역할을 할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "바이오마커"는 상기 시스템의 생물학적 상태의 지표로 사용되는 생물학적 시스템 내의 물질을 지칭한다.

분석물은 관심 샘플, 예컨대 생물학적 또는 임상 샘플에 존재할 수 있다. 용어 "샘플" 또는 "관심 샘플"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 조직, 기관 또는 개체의 전체를 나타내도록 의도된, 전형적으로 상기 조직, 기관 또는 개체보다 작은 조직, 기관 또는 개체의 일부 또는 부분을 지칭한다. 분석시 샘플은 조직 상태 또는 기관 또는 개체의 건강 또는 질병 상태에 대한 정보를 제공한다. 샘플의 예는 혈액, 혈청, 혈장, 활액, 척수액, 소변, 타액, 및 림프액과 같은 유체 샘플, 또는 건조된 혈반 및 조직 추출물과 같은 고체 샘플을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 샘플의 추가 예는 세포 배양물 또는 조직 배양물이다.

본 개시의 맥락에서, 상기 샘플은 "개체" 또는 "대상체"로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, 상기 대상체는 포유류이다. 포유류는 가축(예컨대, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류(예컨대, 인간 및 원숭이와 같은 비인간 영장류), 토끼, 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

질량 분석법을 통해 분석되기 전에, 샘플은 샘플- 및/또는 분석물 특정 방식으로 전처리될 수 있다. 본 개시의 맥락에서, 용어 "전처리"는 질량 분석법을 통한 원하는 분석물의 후속 분석을 허용하는 데 요구되는 임의의 조치를 지칭한다. 전처리 조치는 전형적으로 고체 샘플의 용출(예컨대, 건조 혈반의 용출), 전혈 샘플에 용혈 시약(hemolizing reagent, HR)의 첨가, 및 소변 샘플에 효소 시약의 첨가를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 내부 표준물질(internal standard, ISTD)의 추가가 샘플의 전처리로 간주된다.

용어 "용혈 시약"(HR)은 샘플에 존재하는 세포를 용해하는 시약을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서 용혈 시약은 특히 전혈 샘플에 존재하는 적혈구를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 혈액 샘플에 존재하는 세포들을 용해하는 시약을 지칭한다. 일반적으로 공지된 용혈 시약은 물(H₂O), 예컨대 탈이온수 또는 증류수이다. 용혈 시약의 추가적인 예는 고 삼투압을 갖는 액체(예컨대, 8M 요소), 이온성 액체, 및 상이한 세제들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

전형적으로, 내부 표준물질(ISTD)은 질량 분광 검출 워크플로우(즉, 임의의 전처리, 농축 및 실제 검출 단계를 포함)를 거칠 때 관심 분석물과 유사한 특성을 나타내는 물질의 공지된 양이다. 비록 상기 ISTD가 관심 분석물과 유사한 특성을 나타내지만, 이는 여전히 관심 분석물과 명확하게 구별 가능하다. 예시된 기체 또는 액체 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 분리 동안, ISTD는 샘플로부터의 관심 분석물과 거의 동일한 체류 시간을 갖는다. 따라서, 분석물 및 ISTD가 모두 질량 분석계에 동시에 들어간다. 하지만, ISTD는 상기 샘플로부터의 관심 분석물과 상이한 분자 질량을 나타낸다. 이는 상이한 질량/전하(m/z) 비율에 의해 ISTD로부터의 이온 및 분석물로부터의 이온 사이의 질량 분광 구분을 허용한다. 둘 모두 분절을 거치고 딸 이온을 제공한다. 상기 딸 이온은 이들의 m/z 비율에 의해 서로를 구별하고 각각의 모 이온으로부터도 구별할 수 있다. 결과적으로, ISTD 및 분석물로부터의 신호에 대한 별개의 측정 및 정량화가 실시될 수 있다. ISTD가 공지된 양으로 첨가되었기 때문에, 샘플로부터의 분석물의 신호 강도는 분석물의 특정 정량적 양에 기인할 수 있다. 따라서, ISTD의 첨가는 검출된 분석물의 양에 대한 상대적 비교를 가능하게게 하며, 분석물(들)이 질량 분석계에 도달할 때 샘플에 존재하는 관심 분석물(들)의 분명한 식별 및 정량화를 가능하게 한다. 반드시 그런 것은 아니지만 전형적으로, ISTD는 관심 분석물의 동위원소로 표지된 변종(예컨대, 적어도 하나의 ²H, ¹³C, 및/또는 ¹⁵N 등의 표지를 포함)이다.

전처리에 더하여, 샘플은 또한 하나 이상의 농축 단계를 거칠 수 있으며, 여기서 상기 샘플은 하나 이상의 "농축 방법” 또는 "농축 워크플로우"를 거치게 된다. 일반적으로 공지된 농축 방법은 화학적 침전, 고체상의 사용 및 크로마토그래피 방법을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

화학적 침전은 샘플에 화학 성분을 첨가하여 샘플의 특정 구성 요소를 참여시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, 일반적으로 공지된 침전 방법은 샘플에 아세토니트릴을 첨가하는 것이다.

고체상은 고체상 추출(Solid Phase Extraction, SPE) 카트리지 및 비드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 용어 "비드"는 비자성, 자성 또는 상자성 구형 입자를 지칭한다. 비드는 관심 분석물에 대해 특화될 수 있도록 상이하게 코팅될 수 있다. 상기 코팅은 의도된 용도, 즉 의도된 포획 분자에 따라 상이할 수 있다. 어떠한 코팅이 어떠한 분석물에 적합한지는 당업자에게 공지되어 있다. 비드는 다양한 재료로 만들어질 수 있다. 상기 비드는 다양한 크기를 가질 수 있고 기공이 있거나 없는 표면을 포함할 수 있다.

용어 "크로마토그래피"는 액체 또는 기체에 의해 운반되는 화학적 혼합물이 화학적 개체가 고정 액체상 또는 고체상 주위에 또는 그 위에 흐를 때 차등 분포의 결과로 성분들로 분리되는 과정을 지칭한다.

용어 "액체 크로마토그래피" 또는 "LC"는 유체가 미분된 물질의 컬럼을 통해, 또는 모세관 통로를 통해 균일하게 스며듦에 따라 유체 용액의 하나 이상의 성분의 선택적 지연 과정을 지칭한다. 상기 지연은 상기 유체가 고정상(들)에 대해 이동함에 따라 하나 이상의 고정상과 벌크 유체(즉, 이동상) 사이의 혼합물의 성분들의 분포로 인해 발생한다. 고정상이 이동상보다 더 극성인 방법은(예컨대, 이동상으로서 톨루엔, 고정상으로서 실리카) 정상 액체 크로마토그래피(normal phase liquid chromatography, NPLC)로 명명되고, 고정상이 이동상보다 덜 극성인 방법은(예컨대, 이동상으로서 물-메탄올 혼합물 및 고정상으로서 C18(옥타데실실릴)) 역상 액체 크로마토그래피(reversed phase liquid chromatography, RPLC)로 명명된다.

"고성능 액체 크로마토그래피" 또는 "HPLC"는 고정상의, 전형적으로 조밀하게 패킹된 컬럼을 통해 압력하에 이동상에 힘을 가하여 분리 정도가 증가하는 액체 크로마토그래피의 방법을 지칭한다. 전형적으로, 상기 컬럼은 불규칙하거나 구형 형상인 입자, 다공성 모놀리스 층, 또는 다공성 막으로 구성된 고정상으로써 패킹된다. HPLC는 역사적으로 이동상 및 고정상의 극성에 기초하여 두 가지의 상이한 하위 부류, 즉 NP-HPLC 및 RP-HPLC로 나뉜다.

마이크로(micro) LC는 일반적으로 1 mm 미만, 예컨대 약 0.5 mm의 좁은 내부 컬럼 직경을 갖는 컬럼을 사용하는 HPLC 방법을 지칭한다. "초고성능 액체 크로마토그래피” 또는 "UHPLC"는, 예컨대 120 MPa(17,405 lbf/in²) 또는 약 1200 기압의 고압을 사용하는 HPLC 방법을 지칭한다.

고속 LC는 <2 cm, 예컨대 1 cm의 짧은 길이와 함께 상기에서 언급한 직경을 갖는 컬럼을 사용하고, 상기에서 언급한 압력과 함께 상기에서 언급한 유량을 적용하는 LC 방법을 지칭한다(마이크로 LC, UHPLC). 단기 고속 LC 프로토콜은 단일 분석 컬럼을 사용하는 포획/세척/용출 단계를 포함하고 <1분의 매우 짧은 시간 안에 LC를 실현한다.

추가의 일반적으로 공지된 LC 방식은 친수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophilic interaction chromatography, HIC), 크기 배제 LC, 이온 교환 LC, 및 친화성 LC를 포함한다.

LC 분리는 단일-채널 LC 또는 병렬로 배열된 복수의 LC 채널을 포함하는 다중-채널 LC일 수 있다. LC에서 분석물은 당업자에게 일반적으로 공지된 바와 같이 극성 또는 로그 P 값, 크기 또는 친화성에 따라 분리될 수 있다.

본 개시의 맥락에서, 용어 "제1 농축 과정", “제1 농축 단계” 또는 "제1 농축 워크플로우"는 샘플의 전처리에 후속하여 발생하는 농축 과정을 지칭하고 초기 샘플에 비해 농축된 분석물을 포함하는 샘플을 제공한다.

본 개시의 맥락에서, 용어 "제2 농축 과정", “제2 농축 단계” 또는 "제2 농축 워크플로우"는 샘플의 전처리 및 제1 농축 과정에 후속하여 발생하는 농축 과정을 지칭하고 초기 샘플 및 제1 농축 과정 후의 샘플에 비해 농축된 분석물을 포함하는 샘플을 제공한다.

"키트"는 적어도 하나의 시약, 예컨대 장애 치료를 위한 약제, 또는 구체적으로 본 발명의 분석물을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 임의의 제품(예컨대, 패키지 또는 용기)이다. 상기 키트는 바람직하게는 본 발명의 방법을 실시하기 위한 단위로서 홍보, 배포, 또는 판매된다. 전형적으로, 키트는 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기 수단을 밀폐 수용하도록 구획화된 담체 수단을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 용기 수단은 제1 양태의 방법에서 사용될 개별 요소들 중 하나를 포함할 수 있다. 키트는 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용을 위한 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 추가의 재료를 포함하는 하나 이상의 다른 용기를 추가로 포함할 수 있다. 표지는 조성물이 특정 적용에 사용됨을 표시하기 위해 용기 상에 존재할 수 있고, 생체 내 또는 생체 외 사용을 위한 지침을 표시할 수도 있다. 상기 키트는 광학 저장 매체(예컨대, 컴팩트 디스크)와 같은 데이터 저장 매체 또는 장치 상에 제공되거나 컴퓨터 또는 데이터 처리 장치 상에 직접 제공될 수도 있다. 또한, 상기 키트는 보정 목적을 위해 본원의 다른 곳에서 설명된 바이오마커에 대한 표준 양을 포함할 수 있다.

“포장 삽입물”은 진단용 제품의 상업적인 패키지 내에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 지칭하는 데 사용되는데, 이것은 상기 진단용 제품의 사용과 관련된 지시사항, 용법, 성능 및/또는 주의사항에 관한 정보를 내포한다.

구현예

본 발명의 제1 양태는 샘플에서 당화 헤모글로빈A(HbA1c)의 원형 분자들을 측정하기 위한 방법으로서:

(a) 헤모글로빈A(HbA) 분자들, 특히 원형 헤모글로빈A(HbA) 분자들을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;

(b) 상기 샘플 내 상기 헤모글로빈A 분자들, 특히 α-사슬 및/또는 β-사슬 분자들을 농축하는 단계; 및

(c) 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 α-사슬 및/또는 β-사슬 분자들을 포함하는 샘플에 대해 질량 분석법(MS)에 의한 분석을 실시하여 상기 샘플 내 HbA1c의 양 또는 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

이에 따라, 샘플에서 HbA1c의 양 또는 농도, 특히 HbA1c의 상대적인 양, 즉 비-당화 HbA0 분자들 또는 총 HbA 분자들에 대한 당화 HbA1c 분자들의 비율이 측정될 수 있다. 상기 방법은 매우 정확하며, 주어진 샘플에서 HbA1c의 양, HbA1c/HbA의 비율 또는 HbA1c/HbA0의 비율을 반복적으로 측정할 때 2.5% 이하, 더욱 상세하게는 2.0% 이하의 변동 계수(CV)를 제공할 수 있다.

단계(a)에 따라 헤모글로빈 분자들을 포함하는 샘플이 제공된다. 상기 샘플은 바람직하게는 용혈된 전혈 샘플, 특히 용혈된 인간 전혈 샘플, 예컨대 대상체로부터 유래되어 당화 헤모글로빈A의 양에 대하여 시험될 혈액이다. 용혈은 특히 물(H₂O), 예컨대 탈이온수 또는 증류수로, 특히 샘플:물의 비율을 약 1:2 내지 약 1:20, 예컨대 약 1:5, 약 1:10, 또는 특히 약 1:9(v/v)로 하여 희석함으로써 실시된다. 상기 샘플은 약 30분 미만, 약 10분 미만, 약 5분 미만 또는 심지어 약 2분 미만의 시간 동안 용혈될 수 있다. 특정 구현예들에서, 상기 샘플은 약 10초 내지 약 60초의 시간 동안 용혈된다.

특정 구현예들에서, 상기 용혈은 샘플 및 물을 혼합함으로써, 특히 샘플 및 물을 와동시킴으로써 실시된다. 특히, 샘플 및 물은 1 내지 60초 동안, 특히 5 내지 30초, 특히 10초 동안 혼합, 특히 와류된다.

용혈하는 동안, 상기 샘플은 20°C 내지 30°C, 특히 22~25°C, 특히 실온에서 보관할 수 있다.

특정 구현예들에서, 상기 샘플의 용혈은 실온에서 10초 동안 와류(vortex)시켜 샘플을 물과 1:9의 비율로 혼합함으로써 실시한다.

특정 구현예들에서, 단계(a)에서 수득된 샘플은 농축 워크플로우, 즉 상기 샘플 내 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 α- 및/또는 β-사슬 분자들의 농축을 포함하는 농축 단계(b)를 거치게 된다. 상기 농축 단계는 MS로 샘플을 분석하기 전에 다른 샘플 구성 요소들에 비해 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 헤모글로빈A 분자들의 α- 및/또는 β-사슬의 상대적인 양을 증가시킨다.

특정 구현예들에서, 상기 농축 단계(b)는 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자들을 헤모글로빈A α-사슬 분자들에 비하여 특히 약 2배 이상, 약 5배 이상 또는 약 10배 이상 농축시키고, 그리고/또는 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자들을 알부민 분자들에 비하여 특히 2배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상 농축시키는 것을 포함한다.

상기 농축 단계(b)는 하나 이상의 농축 방법, 특히 제1 및/또는 제2 농축 단계를 포함할 수 있다. 농축 방법은 당해 분야에서 일반적으로 공지되어 있으며 화학적 침전을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 화학적 농축 방법, 및 고체상 추출 방법, 비드 워크플로우, 및 크로마토그래피 방법(예컨대, 기체 또는 액체 크로마토그래피)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 고체상을 사용한 농축 방법을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이에 따라, 특정 구현예들에서, 농축 단계(b)는 화학적 침전, 고체상 추출 방법을 사용한 방법, 비드 워크플로우 및 크로마토그래피 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 농축 방법을 포함한다.

구현예들에서, 농축 단계(b)는 1개 또는 2개의 농축 방법을 포함하고, 즉 농축 단계(b)(i) 및/또는 농축 단계(b)(ii)를 포함한다. 상기 방법이 농축 단계(b)(i) 및 농축 단계(b)(ii)를 포함하는 구현예들에서, 농축 단계(b)(i)는 농축 단계(b)(ii) 전에 실시된다.

구현예들에서, 농축 단계(b)(i)는 전처리된 샘플에 분석물-선택적 기들을 운반하는 고체상을 첨가하는 것을 포함하는 결속/자유 분리 단계를 포함한다. 상기 고체상은 고체 입자들 또는 비-특정 고체상, 예컨대 용기 또는 웰 내의 코팅된 표면으로 구성될 수 있다. 특정 구현예들에서, 상기 고체상은 자성 또는 상자성 입자들, 특히 자기 또는 상자성 코어를 갖는 입자들로 구성된다. 구현예들에서, 상기 자기 또는 상자성 코어는 금속 산화물 및/또는 금속 탄화물을 포함한다. 특히 특정한 구현예에서, 상기 코어는 Fe₃O₄를 포함한다.

상기 고체상, 특히 자기 또는 상자성 비드의 표면은 소수성 표면일 수 있으며, 특히 소수성 유기기, 예컨대 C₃-C₁₈ 알킬기, 더욱 상세하게는 C₄ 알킬기를 포함할 수 있다. 또한, 상기 고체상의 소수성 표면, 특히 자기 또는 상자성 비드의 표면은 기공들을 포함한다. 상기 기공 크기는 1 nm 내지 200 nm의 범위, 특히 약 100 nm 미만, 특히 약 10 nm 미만일 수 있다. 적합한 소수성 표면은, 예컨대 “The HPLC Expert: Possibilities and Limitations of Modern High Performance Liquid Chromatography” DOI:10.1002/9783527677610에서 찾을 수 있다.

구현예들에서, 농축 단계(b)는 자기 또는 상자성 비드를 사용하는 제1 농축 단계(b)(i)를 포함한다. 구현예들에서, 상기 제1 농축 단계(b)(i)는 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 샘플 내에 존재하는 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬의 선택적 결합을 위한 기들을 운반하는 자성 또는 상자성 비드를 첨가하는 것을 포함한다. 구현예들에서, 자기 비드의 첨가는 교반 또는 혼합을 포함한다. 비드 상에서 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬을 포획하기 위한 소정의 배양 기간이 이어진다. 구현예들에서, 상기 워크플로우는 자기 비드와 함께 배양한 후 세척 단계(W1)를 포함한다. 분석물(들)에 따라 하나 이상의 추가 세척 단계(W2)가 실시된다. 하나의 세척 단계(W1, W2)는 자석 또는 전자석을 포함한 자기 비드 처리 단위에 의한 자기 비드의 분리, 액체의 흡인, 세척 완충액의 첨가, 자기 비드의 재현탁, 다른 자기 비드의 분리 단계 및 다른 액체의 흡인을 포함하는 일련의 단계를 포함한다. 또한, 세척 단계는 세척 주기의 부피 및 수 또는 조합을 제외하고는 용매의 유형(물/유기/염/pH) 측면에서 상이할 수 있다. 각각의 파라미터를 선택하는 방법은 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 최종 세척 단계(W1, W2) 이후에, 용출 시약의 첨가가 이어지고, 자기 비드의 재현탁 및 관심 분석물(들)을 자기 비드로부터 방출하기 위한 소정의 배양 기간이 이어진다. 이어서, 결합-자유 자기 비드가 분리되고, 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬을 포함하는 상청액이 포획된다.

특정 구현예들에서, 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬을 포함하는 샘플을 고체상과 접촉시키는 것은, 예컨대 실질적으로 중성인 pH에서, 예컨대 약 5 내지 약 7의 pH에서, 특히 약 6의 pH에서 발생한다. 상기 목적을 위해, 샘플, 예컨대 용혈된 전혈 샘플은 고체상 결합 매질에서 희석될 수 있다. 완충액은 바람직하게는 Na⁺ 또는 K⁺ 이온을 포함하지 않는 완충액, 예컨대 암모늄, 일치환, 이치환 또는 삼치환형 암모늄 이온을 포함하는 완충액이다. 상기 음이온은 바람직하게는 포름산염과 같은 카르복실레이트 음이온이다. 특히 바람직한 완충액은 포름산 암모늄, 예컨대 pH 6의 포름산 암모늄 완충액이다.

상기 고체상으로부터 결합된 구성 요소들의 선택적 용출은 샘플 구성 요소들로 로딩된 고체상을 유기 수-혼화성 용매, 예컨대 비양자성 용매, 예컨대 아세토니트릴을 20 내지 60%(v/v), 특히 약 20, 30, 40 또는 50%(v/v)의 양으로 포함하는 용출 매질과 접촉시킴으로써 실시될 수 있다. 용출 매질의 pH 및 용출 매질의 수성 부분의 구성 요소들은 고체상 결합 매질에 대해 설명된 바와 동일할 수 있다.

대안적으로 또는 추가적으로, 농축 단계(b)는 제2 농축 단계(b)(ii)를 포함할 수 있다. 상기 제2 농축 단계(b)(ii)에서, 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬이 샘플 내에서 추가로 농축된다. 특정 구현예들에서, 농축 단계(b)(ii)는 크로마토그래피 단계를 포함하며, 여기서 상기 샘플의 개별 구성 요소들은 서로 분리된다. 특히, 상기 제2 농축 단계(b)(ii)에서는, 헤모글로빈A의 α- 및 β-사슬이 서로 분리된다. 구현예들에서, 상기 제2 농축 단계(b)(ii)는 상기에서 상세하게 설명된 바와 같이 상기 제1 농축 단계(b)(i) 이후에 실시될 수 있다.

구현예들에서, 상기 크로마토그래피 분리는 기체 또는 액체 크로마토그래피이다. 두 방법이 모두 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 구현예들에서, 상기 액체 크로마토그래피는 HPLC, 고속 LC, 마이크로 LC, 흐름 주입, 및 트랩(trap) 및 용출로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예들에서, 상기 크로마토그래피 분리는 단일 색채 컬럼의 사용 또는 2개 이상의 색채 컬럼의 사용을 포함한다. 2개 이상의 색채 컬럼이 사용되는 특정 구현예들에서, 상기 컬럼들은 서로의 하류에 위치하고, 즉 제2 컬럼은 제1 컬럼의 하류에 위치하며, 선택적인 제3 컬럼은 상기 제2 컬럼의 하류에 위치한다. 2개 이상의 컬럼이 사용되는 구현예들에서, 상기 컬럼들은 원하는 기능에 따라 동일하거나 서로 상이할 수 있다. 올바른 컬럼을 선택하고 설정하는 것은 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다.

구현예들에서, 단계(a) 또는 상기 제1 농축 단계(b)(i)에서 용혈 후 수득한 샘플은 LC 스테이션으로 이동되거나, 또는 희석 액체를 첨가하여 희석 단계 후에 상기 LC 스테이션으로 이동된다. 예를 들어 용매의 유형 (물/유기/염/pH) 및 부피를 변화시켜 여러 상이한 용리 절차/시약이 또한 사용될 수 있다. 다양한 파라미터가 당업자에게 공지이고 쉽게 선택된다.

특정 구현예들에서, 농축 단계(b)는 제1 농축 단계(b)(i) 및 제2 농축 단계(b)(ii)를 포함하고, 여기서 상기 제2 농축 단계(b)(ii)는 상기 제1 농축 단계(b)(i) 후에 실시된다. 특정 구현예들에서, 상기 제1 농축 단계(b)(i)는 상기 상세하게 기재된 바와 같은 비드 워크플로우를 포함하고, 상기 제2 농축 단계(b)(ii)는 액체 크로마토그래피, 특히 HPLC, 고속 LC, 마이크로-LC, 흐름 주입, 및/또는 트랩 및 용출로 이루어진 군으로부터 선택된 액체 크로마토그래피를 포함한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 방법의 단계(c)는 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬의 분석, 즉 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 트립신 또는 Glu-C와 같은 프로테아제로 분해되지 않은 분자인 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬의 분석을 포함한다.

단계(c)에 따른 분석은 MS로 실시된다. 원칙적으로, 상이한 MS 분석 절차들을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 MS 분석 절차는 비행 시간(TOF) MS 분석, 특히 사중 극자(Q) TOF MS 분석을 포함한다. 또한, 상기 MS 분석은 포지티브 모드에서 실시되고, 그리고/또는 특히 M+17H에서 M+13H로의 전하 상태를 포함하는 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자의 여러 전하 상태들의 신호 통합이 실시되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 샘플에서 HbA1c의 정량적 측정을 포함한다. 특히, 비-당화 HbA0 분자 또는 전체 HbA 분자에 대한 당화 HbA1c 분자의 상대적인 양이 측정된다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 상대적인 양은 2.5% 이하, 특히 2.0% 이하의 변동 계수(CV)로 측정된다.

특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기과 같은 워크플로우를 포함한다:

(a) 전혈 샘플을, 예컨대 H₂O와의 희석에 의해 용혈하는 단계,

(b) 상기 단계(a)에서 생성된 용혈된 샘플에서 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 헤모글로빈A의 α- 및 β-사슬을 농축하는 단계로서, 상기 샘플을 고체상과 접촉시키되, 특히 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자가 상기 고체상에 결합하는 조건하에서, 소수성 표면을 갖는 자성 또는 상자성 입자들로 구성된 고체상과 접촉시키고, 상기 로딩된 고체상으로부터 결합된 분자들을 선택적으로 용출함으로써 농축하는 단계, 및

(c) 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자들을 포함하는 상기 단계(b)로부터의 샘플에 대해 TOF-MS에 의한 분석을 실시하여 상기 샘플 내 HbA1c의 양 또는 농도를 측정하는 단계.

특정 구현예들에서,상기 워크플로우는 시간당 100개를 초과하는 샘플에 대한 높은 처리량 분석을 가능하게 한다.

특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기과 같은 워크플로우를 포함한다:

(a) 전혈 샘플을, 예컨대 H₂O와의 희석에 의해 용혈하는 단계,

(b) 상기 단계(a)에서 생성된 용혈된 샘플에서 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 헤모글로빈A의 β-사슬을 농축하는 단계로서, 상기 샘플에 대해 액체 크로마토그래피, 특히 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자가 상기 고체상에 결합하는 조건하에서, HPLC 또는 고속 LC를 실시하고, 상기 로딩된 고체상으로부터 결합된 분자들을 선택적으로 용출함으로써 농축하는 단계, 및

(c) 원형 헤모글로빈A 분자들을 포함하는 상기 단계(b)로부터의 샘플에 대해 TOF-MS에 의한 분석을 실시하여 상기 샘플 내 HbA1c의 양 또는 농도를 측정하는 단계.

특정 구현예들에서,상기 워크플로우는 헤모글로빈A의 α- 및 β-사슬의 특정한 분리를 가능하게 한다.

특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기과 같은 워크플로우를 포함한다:

(a) 전혈 샘플을, 예컨대 H₂O와의 희석에 의해 용혈하는 단계,

(b) (i) 상기 단계(a)에서 생성된 용혈된 샘플에서 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 헤모글로빈A의 α- 및 β-사슬을 농축하는 단계로서, 상기 샘플을 고체상과 접촉시키되, 특히 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자가 상기 고체상에 결합하는 조건하에서, 소수성 표면을 갖는 자성 또는 상자성 입자들로 구성된 고체상과 접촉시키고, 상기 로딩된 고체상으로부터 결합된 분자들을 선택적으로 용출함으로써 농축하는 단계, 및

(ii) 상기 단계(b)(i)에서 생성된 용혈된 샘플에서 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 헤모글로빈A의 β-사슬을 추가로 농축하는 단계로서, 상기 샘플에 대해 액체 크로마토그래피, 특히 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자가 상기 고체상에 결합하는 조건하에서, HPLC 또는 고속 LC를 실시하고, 상기 로딩된 고체상으로부터 결합된 분자들을 선택적으로 용출함으로써 농축하는 단계, 및

(c) 원형 헤모글로빈A 분자들을 포함하는 상기 단계(b)로부터의 샘플에 대해 TOF-MS에 의한 분석을 실시하여 상기 샘플 내 HbA1c의 양 또는 농도를 측정하는 단계.

제1 양태의 추가 구현예들에서, 샘플에서 당화 헤모글로빈A(HbA1c)를 측정하는 방법은 상기 샘플(ISTD)에 내부 표준 물질을 첨가하는 추가적인 단계를 포함한다. 내부 표준물질은 바람직하게는 동위 원소 표지된 HbA1c 분자이다. 구현예들에서, 상기 동위 원소 표지된 ISTD는 적어도 하나의 ²H,　¹³C, 및/또는　¹⁵N 표지를 포함한다.

본 발명의 제2 양태는 키트로서:

(i) 원형 당화 HbA1c 분자들을 농축하기 위한 농축 수단으로서, 특히 원형 당화 HbA1c 분자들의 선택적 결합을 위한 소수성 표면을 갖는 고체상;

(ii) 용혈된 전혈 샘플을 희석하고 샘플 구성 요소들을 상기 고체상(i)에 결합시키는 데 사용하기 위한 실질적으로 중성인 고체상 결합 매질, 및

(iii) 상기 농축 수단(i)으로부터 샘플 성분들을 용출하는 데 사용하기 위한 유기 수-혼화성 용매, 예컨대 아세토니트릴을, 특히 약 20 내지 약 60%(v/v), 특히 약 20, 30, 40 또는 50%(v/v)의 양으로 포함하는 용출 매질을 포함하는, 키트에 관한 것이다.

본 발명의 제2 양태의 특정 구현예들과 관련하여, 제1 양태와 같은 맥락에서 상술한 모든 구현예가 참조된다.

구현예들에서, 상기 키트는 (i) 고체상, 예컨대 소수성으로 개질된 표면을 가진 입자와 같은 입자들, (ii) 용혈된 전혈 샘플을 희석하고 샘플 구성 요소들을 상기 고체상(i)에 결합시키는 데 사용하기 위한 실질적으로 중성인 고체상 결합 매질, 예컨대 Na⁺ 및 K⁺ 이온이 없는 완충액, 및 (iii) 상기 고체상(i)으로부터 샘플 성분들을 용출하는 데 사용하기 위한 유기 수-혼화성 용매, 예컨대 아세토니트릴을, 특히 약 20 내지 약 60%(v/v), 특히 약 20, 30, 40 또는 50%(v/v)의 양으로 포함하는 매질 완충액을 포함한다.

구현예들에서, 상기 키트는 적어도 하나의 농축 단계, 특히 결합/자유 분리 단계 및/또는 크로마토그래피 단계를 실시하기 적합한 농축 수단을 포함한다. 구현예들에서, 상기 농축 수단은 고체 입자들, 예컨대 자성 또는 상자성 입자들, 또는 비-특정 고체상으로 구성될 수 있는 고체상을 포함한다.

특정 구현예들에서, 상기 고체상은 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 분자인 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬, 예컨대 소수성 유기기의 선택적 결합을 위한 기들을 운반한다. 추가의 특정 구현예들에서, 상기 농축 수단은 크로마토그래피 컬럼, 특히 크로마토그래피 단계를 실시하기 위한 크로마토그래피 컬럼을 포함할 수 있다.

구현예들에서, 상기 키트에 선택적으로 포함된 용출 매질은 유기 수-혼화성 용매, 특히 아세토니트릴(ACN)을 포함하는 수용액을 포함한다. 상기 유기 수-혼화성 용매, 특히 ACN은 약 20 내지 60%(v/v), 특히 약 20, 30, 40 또는 50%(v/v)의 양으로 존재한다.

상기 키트는 개별 성분들의 용기들을 포함하는 단일 패키지로 제공되거나, 또는 개별 성분들의 용기를 각각 포함하는 여러 패키지의 세트로 제공될 수 있다.

구현예들에서, 상기 키트는 패키지 삽입물을 추가로 포함한다. 구현예들에서, 상기 패키지 삽입물은 상기 키트에 관한 지시사항, 용법, 효과 및/또는 주의사항에 관한 정보를 포함한다.

본 발명의 제3 양태는 샘플에서 특히 상술된 방법을 실시함으로써 당화 HbA1c를 측정하기 적합한 진단 시스템이다.

특정 구현예들에서, 상기 진단 시스템은 하기를 포함한다:

(i) 원형 HbA1c 분자들을 포함하는 샘플들의 제조를 위한 적어도 하나의 스테이션으로서, 특히 여기서 상기 제조는 전혈 샘플의 용혈을 포함하는 스테이션,

(ii) 상기 샘플로부터 원형 헤모글로빈A 분자, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬을 선택적으로 농축하기 적합한 하나 이상의 농축 스테이션, 및

(iii) 상기 샘플에서 질량 분석법(MS)에 의한 원형 헤모글로빈A 분자, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬의 분석을 위해 그리고 HbAc1의 양 또는 농도를 측정하기 적합한 적어도 하나의 스테이션.

본 발명의 제3 양태의 특정 구현예들과 관련하여, 제1 및 제2 양태와 같은 맥락에서 상술한 모든 구현예가 참조된다.

특정 구현예들에서, 상기 진단 시스템은 샘플들의 높은 처리량을 가능하게 하며, 특히 시간당 100개 이상의 처리량을 가능하게 한다. 예를 들어, 본원에 원용되는 WO 2017/103180에 기재된 시스템이 사용될 수 있다.

특정 구현예들에서, 상기 진단 시스템은 임의 접근 샘플 제조를 위한 적어도 하나의 스테이션, 및 원형 헤모글로빈A 분자, 특히 MS 분석 전의 헤모글로빈 A의 α- 및/또는 β-사슬의 농축을 위한 적어도 하나의 스테이션을 포함한다.

구현예들에서, 상기 진단 시스템은 원형 헤모글로빈A 분자, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β- 사슬을 포함하는 샘플의 자동화 제조를 위한 샘플 제조 스테이션을 포함한다. 특정 구현예들에서, 상기 스테이션은 하나 이상의 샘플을 용혈하기 위한 섹션을 포함한다.

구현예들에서, 상기 진단 시스템은 농축 스테이션을 더 포함한다. 상기 농축 스테이션은 용혈 후 하나 이상의 샘플을 농축 수단, 특히 고체상, 특히 자성 또는 상자성 입자와 접촉시키기 위한 섹션을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 상기 농축 스테이션은 크로마토그래피 섹션, 특히 LC 섹션을 포함한다. 구현예들에서, 상기 LC 섹션은 하나 이상의 LC 채널을 포함한다. 상기 LC 섹션이 하나를 초과하는 LC 채널을 포함하는 구현예들에서, 상기 채널들은 병렬로 배열될 수 있다.

구현예들에서, 상기 진단 시스템은 이전에 제조된 샘플들을 후속 섹션 또는 스테이션에 투입하기 위한 상이한 섹션 및 스테이션 사이에 적어도 하나의 인터페이스를 포함한다.

구현예들에서, 상기 진단 시스템은 샘플 제조 및 농축 단계들의 소정의 순서를 각각 포함하고 완료를 위해 소정의 시간을 각각 필요로 하는 소정의 샘플 제조 및 농축 워크플로우에 샘플들을 할당하도록 프로그래밍될 수 있는 제어기를 추가로 포함한다.

특정 구현예들에서, 상기 제어기는 상이한 농축 스테이션 채널들로부터의 원형 HbA β-사슬 분자들이 예상 용출 시간을 기반으로 겹치지 않는 용출물 출력 순서로 용출되도록 하는 제조된 샘플들을 투입하기 위한 농축 스테이션 채널 입력 서열을 계획한다.

구현예들에서, 상기 제어기는 농축 스테이션 채널 입력 서열과 일치하는 샘플 제조 스테이션에서 제조된 샘플 출력 서열을 생성하는 샘플 제조 시작 서열을 설정하고 개시하여 샘플의 제조가 완료되면 할당된 농축 스테이션 채널도 입수 가능하게 되고 제조된 샘플은 다른 샘플의 제조가 완료되기 전에 또는 다음 제조된 샘플이 샘플 제조/농축 인터페이스에 도착하기 전에 할당된 농축 스테이션 채널에 입력될 수 있다.

구현예들에서, 상기 제어기는 워크플로우의 적절한 시기를 위한 기준 기간을 설정한다. 이를 통해, 다음 처리 단계를 구현할 수 있다: (1) 샘플 제조 시작 서열에서 연속적인 샘플들 사이에 가능한 하나 이상의 참조 기간으로 참조 기간 당 최대 하나의 샘플 제조를 시작하는 단계; 및/또는 (2) 제조된 샘플 출력 서열의 연속적으로 제조된 샘플들 사이에 가능한 하나 이상의 참조 기간으로 참조 기간 당 최대 하나의 샘플의 제조를 완료하는 단계; 및/또는 (3) 연속적인 농축 스테이션 채널 입력들 사이에 가능한 하나 이상의 참조 기간을 사용하여 참조 기간 당 하나의 제조된 샘플을 농축 스테이션 채널 중 하나에 입력하는 단계; 및/또는 (4) 연속적인 농축 스테이션 용출액들 사이에 가능한 하나 이상의 참조 기간으로 기준 참조 기간 당 하나의 농축 스테이션 용출액을 출력하는 단계.

또한, 본 발명은 하기의 실시예들에 관한 것이다:

1. 샘플에서 당화 헤모글로빈A(HbA1c)를 측정하는 방법으로서:

(a) 헤모글로빈A(HbA) 분자들, 특히 원형 헤모글로빈A(HbA)를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;

(b) 상기 샘플 내 분자인 원형 헤모글로빈A, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬을 농축하는 단계; 및

(c) 분자인 원형 헤모글로빈A, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬을 포함하는 샘플에 대해 질량 분석법(MS)에 의한 분석을 실시하여 상기 샘플 내 HbA1c 분자들의 양 또는 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

2. 실시예 1에 있어서,

상기 단계(a)의 샘플은 용혈된 전혈 샘플, 특히 용혈된 인간 전혈 샘플인, 방법.

3. 실시예 1 또는 실시예 2에 있어서,

상기 단계(a)의 샘플은 물(H₂O)을 사용하여, 특히 샘플:물의 비율을 1:2 내지 약 1:20(v/v), 예컨대 약 1:5 내지 약 1:10의 비율로, 또는 약 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10(v/v)의 비율로 하여 용혈되는, 방법.

4. 실시예 1 내지 실시예 3 중 어느 한 실시예에 있어서,

상기 샘플은 약 30분 미만, 약 10분 미만, 약 5분 미만, 또는 약 2분 미만의 기간 동안, 특히 약 10초 내지 약 60초의 시간 동안 용혈되는, 방법.

5. 실시예 1 내지 실시예 4 중 어느 한 실시예에 있어서,

상기 농축 단계(b)는 제1 농축 단계(특히 결합/자유 분리 단계)(b)(i)를 포함하고, 특히 원형 헤모글로빈A, 특히 헤모글로빈A의 α- 및 β-사슬이 고체상에 결합하는 조건하에서, 상기 원형 헤모글로빈A, 특히 헤모글로빈A의 α- 및 β-사슬을 선택적으로 결합하기 위한 그리고 상기 고체상으로부터 결합된 헤모글로빈A, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬을 선택적으로 용출하기 위한 표면을 갖는 고체상과 상기 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.

6. 실시예 5에 있어서,

상기 고체상은 소수성 표면을 포함하는, 방법.

7. 실시예 5 또는 실시예 6에 있어서,

상기 단계(b)(i)에서, 상기 샘플은 약 pH 5 내지 약 pH 7에서, 특히 약 pH 6에서 상기 고체상과 접촉되는, 방법.

8. 실시예 5 내지 실시예 7 중 어느 한 실시예에 있어서,

상기 단계(b)(i)에서, 상기 샘플은 완충액의 존재하에, 특히 포름산 암모늄의 존재하에 상기 고체상과 접촉되는, 방법.

9. 실시예 5 내지 실시예 8 중 어느 한 실시예에 있어서,

상기 고체상은 입자들, 특히 자성 또는 상자성 입자들, 특히 금속 산화물 및/또는 금속 탄화물, 특히 Fe₃O₄를 포함하는 자성 또는 상자성 코어를 갖는 입자들로 구성되는, 방법.

10. 실시예 5 내지 실시예 9 중 어느 한 실시예에 있어서,

상기 고체상의 소수성 표면은 C₃-C₁₈ 알킬기, 특히 C₄ 알킬기를 포함하는, 방법.

11. 실시예 5 내지 실시예 10 중 어느 한 실시예에 있어서,

상기 고체상의 소수성 표면은 약 100 nm 미만, 특히 약 10 nm 미만의 공극 크기를 갖는 공극들을 포함하는, 방법.

12. 실시예 5 내지 실시예 11 중 어느 한 실시예에 있어서,

상기 농축 단계(b)(i)에서, 분자인 원형 헤모글로빈A, 특히 헤모글로빈A의 α- 및 β-사슬은, 상세하게는 20% 내지 60%(v/v) 아세토니트릴의 존재하에, 더욱 상세하게는 약 50%(v/v) 아세토니트릴의 존재하에 상기 고체상으로부터 선택적 용출에 의해 농축되는, 방법.

13. 실시예 1 내지 실시예 12 중 어느 한 실시예에 있어서,

상기 농축 단계(b)는 제2 농축 단계(b)(ii)를 포함하고, 특히 크로마토그래피 단계(b)(ii), 특히 상기 샘플의 HPLC, 마이크로-LC 및 고속 LC로 이루어진 군으로부터 선택되는 액체 크로마토그래피(LC)를 포함하는, 방법.

14. 실시예 5 내지 실시예 13 중 어느 한 실시예에 있어서,

상기 농축 단계(b)는 결합/자유 분리 단계(b)(i) 및 크로마토그래피 단계(b)(ii)를 포함하는, 방법.

15. 실시예 13 또는 실시예 14에 있어서,

상기 크로마토그래피 농축 단계(b)(ii)에서, 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자들이 헤모글로빈A α-사슬 분자들에 비하여 특히 10배 이상 농축되고, 그리고/또는 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자들이 알부민 분자들에 비하여 특히 10배 이상 농축되는, 방법.

16. 실시예 1 내지 실시예 15 중 어느 한 실시예에 있어서,

상기 단계(c)는 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자들의 분석을 포함하고, 특히 여기서 상기 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자들은 트립신 또는 Glu-C와 같은 프로테아제로 분해되지 않는, 방법.

17. 실시예 1 내지 실시예 16 중 어느 한 실시예에 있어서,

상기 단계(c)는 비행 시간(TOF) MS 분석, 특히 원형 헤모글로빈 A β-사슬 분자들의 사중 극자(Q) TOF MS 분석을 포함하는, 방법.

18. 실시예 1 내지 실시예 16 중 어느 한 실시예에 있어서,

상기 샘플 내 HbA1c의 양을 측정하는 단계는, 특히 M+17H에서 M+13H로의 전하 상태를 포함하는 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자들의 여러 전하 상태들의 신호 통합을 포함하는, 방법.

19. 실시예 1 내지 실시예 18 중 어느 한 실시예에 있어서,

비-당화 헤모글로빈A(HbA0) 또는 총 헤모글로빈A(HbA)에 대한 당화 헤모글로빈A(HbA1c)의 비율이 측정되는, 방법.

20. 실시예 1 내지 실시예 19 중 어느 한 실시예에 있어서,

상기 비율은 2.5% 이하, 특히 2.0% 이하의 변동 계수(CV)로 측정되는, 방법.

21. 키트로서:

(i) 원형 당화 HbA1c 분자들을 농축하기 위한 농축 수단으로서, 특히 원형 당화 HbA1c 분자들의 선택적 결합을 위한 소수성 표면을 갖는 고체상을 포함하는 농축 수단;

(ii) 용혈된 전혈 샘플을 희석하고 샘플 구성 요소들을 상기 고체상(i)에 결합시키는 데 사용하기 위한 실질적으로 중성인 고체상 결합 매질; 및

(iii) 상기 농축 수단(i)으로부터 샘플 성분들을 용출하는 데 사용하기 위한 유기 수-혼화성 용매, 예컨대 아세토니트릴을, 특히 50%(v/v)의 양으로 포함하는 용출 매질을 포함하는, 키트.

22. 실시예 1 내지 실시예 20 중 어느 한 실시예에 따른 방법에서 실시예 21에 따른 키트의 사용.

23. 실시예 1 내지 실시예 20 중 어느 한 실시예에 따른 방법을 실시하기 적합한 샘플에서 당화 헤모글로빈A(HbA1c)를 측정하기 위한 진단 시스템.

24. 샘플에서 당화 헤모글로빈A(HbAc1)를 측정하기 위한 진단 시스템으로서:

(i) 원형 HbA1c 분자들을 포함하는 샘플들의 제조를 위한 적어도 하나의 스테이션으로서, 여기서 상기 제조는 전혈 샘플의 용혈을 포함하는 스테이션,

(ii) 상기 샘플로부터 원형 헤모글로빈A 분자, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬을 선택적으로 농축하기 적합한 하나 이상의 농축 스테이션, 및

(iii) 상기 샘플에서 질량 분석법(MS)에 의한 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 헤모글로빈A의 β-사슬의 분석을 위해 그리고 HbAc1의 양 또는 농도를 측정하기 적합한 적어도 하나의 스테이션을 포함하는, 진단 시스템.

25. 실시예 1 내지 실시예 20 중 어느 한 실시예에 따른 방법에서, 실시예 23 또는 실시예 24에 따른 진단 시스템의 사용.

이하에서, 본 발명은 실시예를 참고로 더욱 상세히 설명된다.

실시예

실시예 1

전혈에서 원형 HbA1c의 측정

3개의 100 μL 전혈 샘플을 각각 400 μL의 탈이온수로 희석하고, 맑은 용액이 수득될 때까지 10초 동안 와류에 의해 혼합하였다. 이어서, 각각의 용혈물을 각각 pH 2, 6 또는 10을 갖는 상이한 완충액 내에서 20배 희석하였다.

3개 배치(batch)의 소수성 자성 비드(각각 100 μL)를 상기에 표시된 바와 같이 3개의 상이한 완충액 각각의 900 μL와 혼합하여 평형을 이루었다. 이 후, 900 μL의 상청액을 버리고, 평형화된 비드를 회수하였다.

3개의 900 μL 전혈 용혈물 샘플(상기에 표시된 바와 같이 3개의 상이한 완충액에 이미 희석됨)을 평형화된 비드의 각 배치에 추가하여 로딩된 비드를 수득하였다. 그런 다음, 상기 혼합물을 37°C에서 1200 rpm으로 15분 동안 진탕하였다.

로딩된 비드로부터 LC-MS를 위한 일련의 여러 분획물을 하기와 같이 수집하였다.

먼저, 로딩된 비드의 각 배치로부터 900 μL의 상청액을 수집하였다. 상기 "0% 분획물"의 100 μL를 LC-MS를 위해 900 μL의 0.1%(v/v) 포름산(용리액 A)을 첨가하여 10배 희석하였다. 상기 비드를 유지하여 추가 분획물들을 수집하였다.

다음으로, 700 μL의 각 완충액 및 200 μL의 50%(v/v) 아세토니트릴(ACN)을 각 배치의 비드에 첨가하여 "10% 분획물"을 수집하였다. 상기 혼합물을 37°C에서 1200 rpm으로 1분 동안 진탕하였다.

900 μL의 "10% 분획물"을 수집하였다. 그런 다음, 100 μL를 LC-MS를 위해 0.1%(v/v) 포름산에 10배 희석하였다.

이 후, 20%(v/v), 30%(v/v) 및 40%(v/v) ACN의 증가하는 농도를 함유하는 완충액을 사용하여 로딩된 비드의 각 배치에 대하여 상기 절차를 유사하게 반복함으로써, “20% 분획물”, “30% 분획물” 및 “40% 분획물”을 수득하였다.

로딩된 비드의 각 배치로부터 결과로서 생성된 분획물들인 0% 분획물, 10% 분획물, 20% 분획물, 30% 분획물 및 40% 분획물에 대하여 LC-MS 분석을 실시하였다.

LC-MS 측정은 워터스 시냅트(Waters Synapt) G2-Si HDMS QuanTof 장치에서 실시하였다. 포름산 암모늄 완충계 및 최적화된 소스 매개변수를 원형 단백질 측정에 사용하였다. 이온 전달은 HbA1c 분절 없이 화학적 노이즈를 제거하도록 최적화되었다. α 및 β-사슬의 탈염 및 분리를 위해 C4 컬럼을 사용하였다. 전하 상태(M+17H 내지 M+13H)의 수동 및 소프트웨어 신호 통합을 사용하였다.

Claims (13)

1. 샘플에서 당화 헤모글로빈A(HbA1c)를 측정하는 방법으로서:
   (a) 헤모글로빈A(HbA) 분자들을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
   (b) 상기 샘플 내 분자인 원형 헤모글로빈A, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬을 농축하는 단계; 및
   (c) 분자인 원형 헤모글로빈A, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬을 포함하는 샘플에 대해 질량 분석법(MS)에 의한 분석을 실시하여 상기 샘플 내 HbA1c 분자들의 양 또는 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 단계(a)의 샘플은 용혈된 전혈 샘플, 특히 용혈된 인간 전혈 샘플인, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 농축 단계(b)는 제1 농축 단계(b)(i)를 포함하고, 특히 상기 샘플을 고체상과 접촉시키되, 특히 원형 헤모글로빈A 분자가 상기 고체상에 결합하는 조건하에서, 상기 원형 헤모글로빈A 분자, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬을 선택적으로 결합하기 위한 그리고 상기 고체상으로부터 결합된 단편들을 선택적으로 용출하기 위한 표면을 갖는 고체상과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 농축 단계(b)는 제2 농축 단계(b)(ii)를 포함하고, 특히 상기 단계(a)에서 생성된 용혈된 샘플 또는 상기 농축 단계(b)(i)에서 생성된 농축된 샘플에 대해, 원형 헤모글로빈A 분자들, 특히 헤모글로빈A의 β-사슬이 농축되는 조건하에서, 크로마토그래피의 농축 단계, 특히 액체 크로마토그래피, 특히 HPLC 또는 급속 LC를 실시하는 단계를 포함하는, 방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 농축 단계(b)(ii)에서 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자들이 헤모글로빈A α-사슬 분자들에 비하여 특히 10배 이상 농축되고, 그리고/또는 원형 헤모글로빈A β-사슬 분자들이 알부민 분자들에 비하여 특히 10배 이상 농축되는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 단계(c)는 원형 헤모글로빈A 분자, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬에 대한 분석을 포함하고, 특히 상기 원형 헤모글로빈A 분자, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬은 프로테아제, 예컨대 트립신 또는 Glu-C에 의해 분해되지 않는, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   비-당화 헤모글로빈A(HbA0) 또는 총 헤모글로빈A(HbA)에 대한 당화 헤모글로빈A(HbA1c)의 비율이 측정되는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 비율은 변동 계수(CV) 2.5% 이하, 특히 2.0% 이하로 측정되는, 방법.
9. 키트로서:
   (i) 원형 당화 HbA1c 분자들을 농축하기 위한 농축 수단으로서, 특히 원형 당화 HbA1c 분자들의 선택적 결합을 위한 소수성 표면을 갖는 고체상을 포함하는 농축 수단;
   (ii) 용혈된 전혈 샘플을 희석하고 샘플 성분들을 상기 고체상(i)에 결합하는 데 사용하기 위한 실질적으로 중성인 고체상 결합 매질; 및
   (iii) 상기 농축 수단(i)으로부터 샘플 성분들을 용출하는 데 사용하기 위한 유기 수-혼화성 용매, 예컨대 아세토니트릴을, 특히 약 50%(v/v)의 양으로 포함하는 용출 매질을 포함하는, 키트.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 제9항에 따른 키트의 사용.
11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실시하기 적합한 샘플에서 당화 헤모글로빈A(HbA1c)를 측정하기 위한 진단 시스템.
12. 샘플에서 당화 헤모글로빈A(HbAc1)를 측정하기 위한 진단 시스템으로서:
    (i) 원형 HbA1c 분자들을 포함하는 샘플들의 제조를 위한 하나 이상의 스테이션으로서, 상기 제조는 전혈 샘플의 용혈을 포함하는, 스테이션;
    (ii) 선택적으로 상기 샘플로부터 원형 헤모글로빈A 분자, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬을 선택적으로 농축하기 적합한 하나 이상의 농축 스테이션; 및
    (iii) 상기 샘플에서 질량 분석법(MS)에 의한 원형 헤모글로빈A 분자, 특히 헤모글로빈A의 α- 및/또는 β-사슬의 분석을 위해 그리고 HbAc1의 양 또는 농도를 측정하기 적합한 적어도 하나의 스테이션.
13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 제11항 또는 제12항에 따른 진단 시스템의 사용.

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