JP2022534288A - 質量分析による抗うつ剤の定量 - Google Patents

質量分析による抗うつ剤の定量 Download PDF

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Abstract

試料中の抗うつ剤及び／又は抗うつ剤代謝物の量を検出する又は決定する方法を記載する。より詳細には、試料中の抗うつ剤及び／又は抗うつ剤代謝物を検出し、定量するための質量分析法を記載する。【選択図】図１

Description

関連特許出願の相互参照
本出願は、それぞれがその全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年５月１３日に出願の米国仮出願第６２／８５５，８６３号の利益を主張するものである。
ベースライン試験は、患者が１種又は複数の抗うつ薬を使用しているか否かを、治療前に臨床医が決定するのを助けるのに有用である。服薬コンプライアンスを確実にし、意図しない多種薬物使用を避けるため、抗うつ剤を処方される患者をモニターすることは大変重要である。選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）などのいくつかの抗うつ剤は、有害な副作用を有する可能性があり、同じクラス内の薬物と混合されるべきでない。抗うつ剤及び代謝物の正確な試験が必要である。
一態様において、質量分析による抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物の検出及び定量の方法が本明細書で提供される。
質量分析により試料中の抗うつ剤及び／又は抗うつ剤代謝物の存在又は量を検出する方法が本明細書で提供される。方法は、質量分析により検出できる１つ又は複数のイオンを生成するのに適する条件下で、試料をイオン化にかけるステップと、質量分析により１つ又は複数のイオンの量を決定するステップと、１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中の抗うつ剤及び／又は抗うつ剤代謝物の存在又は量を決定するステップとを含む。
いくつかの実施形態において、質量分析はタンデム質量分析を含む。これらの実施形態において、方法は、ａ）前駆イオンを生成するのに適する条件下で、試料をイオン化するステップと、ｂ）前駆イオンをフラグメント化して１つ又は複数のフラグメントイオンを生成するステップと、ｃ）ステップａ）及びｂ）で生成される１つ又は複数のイオンの量を決定するステップと、ｄ）ステップｃ）で決定される１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中の抗うつ剤及び代謝物の存在又は量を決定するステップとを含む。
いくつかの実施形態において、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、セロトニン及びノルエピネフリン再取り込み阻害剤、ノルエピネフリン及びドーパミン再取り込み阻害剤、三環系抗うつ剤、鎮静剤、並びに／又は抗うつ剤代謝物代謝物を含む、１種又は複数の抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物の量を検出する又は決定する方法が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、フルオキセチン、パロキセチン、セルトラリン、シタロプラム、エスシタロプラム、フルボキサミン、ビラゾドン、デュロキセチン、ベンラファキシン、デスメチルベンラファキシン、ヒドロキシブプロピオン、イミプラミン、ノルトリプチリン、アミトリプチリン、ドキセピン、トリミプラミン、デシプラミン、プロトリプチリン、アモキサピン、クロミプラミン、マプロチリン、トラゾドン、ミルタザピン、ボルチオキセチン、デスメチルシタロプラム、デスメチルクロミプラミン、デスメチルドキセピン、ノルフルオキセチン、ノルフルボキサミン、ノルセルトラリン、及び１，３－クロルフェニルピペラジンからなる群から選択される、１種又は複数の抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物の量を検出する又は決定する方法が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、１つ又は複数の選択的セロトニン再取り込み阻害剤（フルオキセチン、パロキセチン、セルトラリン、シタロプラム、エスシタロプラム、フルボキサミン、ビラゾドン）、セロトニン及びノルエピネフリン再取り込み阻害剤（デュロキセチン、ベンラファキシン、デスメチルベンラファキシン）、ノルエピネフリン及びドーパミン再取り込み阻害剤（ヒドロキシブプロピオン）、三環系抗うつ剤（イミプラミン、ノルトリプチリン、アミトリプチリン、ドキセピン、トリミプラミン、デシプラミン、プロトリプチリン、アモキサピン、クロミプラミン、マプロチリン）の量を検出する又は決定する方法が本明細書で提供される。このアッセイで用いられる他の抗うつ剤は鎮静剤としても機能し、トラゾドン、ミルタザピン及びボルチオキセチンである。試験した代謝物は、デスメチルシタロプラム、デスメチルクロミプラミン、デスメチルドキセピン、ノルフルオキセチン、ノルフルボキサミン、ノルセルトラリン、及び１，３－クロルフェニルピペラジンであった。
いくつかの実施形態において、１０種以上の抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物の量を同時に検出する又は決定する方法が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、２０種以上の抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物の量を同時に検出する又は決定する方法が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、３０種の抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物の量を同時に検出する又は決定する方法が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、１つ又は複数の内部標準を添加するステップを含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の内部標準は、重水素化された内部標準を含む。いくつかの実施形態において、重水素化された内部標準は、１，３－クロルフェニルピペラジン－Ｄ８、ヒドロキシブプロピオン－Ｄ６、デスメチル－ベンラファキシン－Ｄ６、デスメチルシタロプラム－Ｄ３、トリミプラミン－Ｄ３、アミトリプチリン－Ｄ３、ノルトリプチリン－Ｄ３、パロキセチン－Ｄ６、プロトリプチリン－Ｄ３、シタロプラム－Ｄ６、ベンラファキシン－Ｄ６、イミプラミン－Ｄ３、トラゾドン－Ｄ６、ビラゾドン－Ｄ４、及びボルチオキセチン－Ｄ８からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、試料は生物学的試料を含む。好ましい実施形態において、試料は尿である。いくつかの実施形態において、試料は血漿又は血清である。いくつかの実施形態において、試料は血液である。
いくつかの実施形態において、イオン化の前に試料を液体クロマトグラフィーにかける。いくつかの実施形態において、液体クロマトグラフィーは高速液体クロマトグラフィーを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、約４ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ（両端の値を含む）の範囲内のレベルの抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物を検出することができる。
いくつかの実施形態において、方法は、約２５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ（両端の値を含む）の範囲内のレベルの抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物を検出することができる。
いくつかの実施形態において、質量分析はタンデム質量分析である。いくつかの実施形態において、タンデム質量分析は、選択反応モニタリング、多重反応モニタリング、前駆イオンスキャニング、又はプロダクトイオンスキャニングにより行われる。
好ましい実施形態において、タンデム質量分析は選択反応モニタリングにより行われる。
いくつかの実施形態において、以下の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を含むイオンを検出するステップを含む、抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物を定量するステップが本明細書で提供される。
Figure 2022534288000002
Figure 2022534288000003
Figure 2022534288000004
いくつかの実施形態において、本明細書で述べる方法は、４ｎｇ／ｍＬ～５０００ｎｇ／ｍＬ（両端の値を含む）の範囲内のレベルの抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物を検出することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で述べる方法は、２５ｎｇ／ｍＬ～５０００ｎｇ／ｍＬ（両端の値を含む）の範囲内のレベルの抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物を検出することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で述べる方法は、下限１０ｎｇ／ｍＬの抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物を定量することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で述べる方法は、下限５０ｎｇ／ｍＬの抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物を定量することができる。
いくつかの実施形態において、イオン化の前に試料は固相抽出（ＳＰＥ）カラムなどの抽出カラムにかけられる。いくつかの関連実施形態において、ＳＰＥ及び質量分析はオンライン処理を用いて行う。
いくつかの実施形態において、イオン化の前に試料は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムなどの分析カラムにかけられる。いくつかの関連実施形態において、ＨＰＬＣ及び質量分析はオンライン処理を用いて行う。
いくつかの実施形態において、方法は、血漿又は血清などの生物学的試料中の抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物の存在又は量を決定するのに用いることができる。いくつかの関連実施形態において、生物学的試料は１つ又は複数のステップにより処理されて、処理された試料を発生させ、次いでこれが質量分析にかけられてよい。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の処理ステップは、タンパク質沈殿、ろ過、液液抽出、固相抽出、液体クロマトグラフィー、あらゆる免疫精製工程、又は同類のもの、及びこれらのいずれかの組み合わせなどの１つ又は複数の精製ステップを含む。
本明細書で開示する方法の特定の好ましい実施形態において、質量分析はポジティブイオンモードで実施される。或いは、質量分析はネガティブイオンモードで実施される。例えば、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）又はエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を含む、様々なイオン化源を本発明の実施形態で用いることができる。特定の実施形態において、抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物は、ポジティブイオンモード用いて測定される。
好ましい実施形態において、単独で検出できる内部標準が試料に加えられ、その量も試料中で決定される。これらの実施形態において、試料中に存在する対象の被分析物及び内部標準の両方のすべて又は一部がイオン化されて、質量分析計で検出できる複数のイオンを生成し、それぞれから生成した１つ又は複数のイオンが質量分析により検出される。これらの実施形態において、対象の被分析物から生成したイオンの存在又は量は、試料中の対象の被分析物の量の存在に関連付けることができる。
他の実施形態において、試料中の抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物の量は、１つ又は複数の外部参照標準との比較により決定することができる。具体例としての外部参照標準は、抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物又はその同位体標識変異体をスパイクしたブランク血漿又は血清である。
本明細書で用いる場合、特に示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａ ｐｒｏｔｅｉｎ」への言及は、複数のタンパク質分子を含む。
本明細書で用いる場合、「精製」又は「精製する」という用語は、対象の被分析物（単数又は複数）以外のすべての物質を試料から除去することを意味しない。それよりも、精製は、対象の被分析物の検出を妨害する可能性がある試料中の他の成分と比較して対象の１つ又は複数の被分析物の量を高くする手順を意味する。様々な手段による試料の精製は、１つ又は複数の妨害物質、例えば、質量分析による選択される親又は娘イオンの検出を妨害する可能性がある又は妨害しない可能性がある１つ又は複数の物質の相対的な減少を可能にする。この用語を用いるときの相対的な減少は、精製すべき材料中に対象の被分析物とともに存在する物質が精製により完全に除去されることを必要としない。
本明細書で用いる場合、「免疫精製」又は「免疫精製する」という用語は、対象の１つ又は複数の被分析物を濃縮するためにポリクローナル又はモノクローナル抗体を含む抗体を利用する精製手順を意味する。免疫精製は、当技術分野で周知の免疫精製法のいずれかを用いて実施することができる。しばしば免疫精製手順は、固体担体、例えば、カラム、ウェル、チューブ、ゲル、カプセル、粒子又は同類のものに結合した、コンジュゲートした又は別の状態で結合した抗体を利用するものである。免疫精製は、本明細書で用いる場合、当技術分野でしばしば免疫沈降と呼ばれる手順、並びに当技術分野でしばしばアフィニティークロマトグラフィーと呼ばれる手順を制限なしに含む。
本明細書で用いる場合、「免疫粒子」という用語は、その表面（粒子上及び／又は内）に結合した、コンジュゲートした又は別の状態で結合した抗体を有するカプセル、ビーズ、ゲル粒子又は同類のものを意味する。免疫精製を利用する特定の実施形態において、免疫粒子は、セファロース又はアガロースビーズを含む。免疫精製を利用する代替実施形態において、免疫粒子は、ガラス、プラスチック若しくはシリカビーズ又はシリカゲルを含む。
本明細書で用いる場合、「試料」という用語は、対象の被分析物を含み得る試料を意味する。本明細書で用いる場合、「体液」という用語は、個人の身体から分離することができる流体を意味する。例えば、「体液」は、血液、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙液、汗及び同類のものを含み得る。いくつかの実施形態において、試料は体液試料、好ましくは血漿又は血清を含む。
本明細書で用いる場合、「固相抽出」又は「ＳＰＥ」という用語は、溶液が通過又は周りに流れる固体（すなわち、固相）に対する溶液（すなわち、移動相）中に溶解又は懸濁した成分の親和性の結果として化学物質の混合物を成分に分離する方法を意味する。ＳＰＥは、本明細書で用いる場合、固相に対する移動相中の成分の親和性が、免疫親和性ではなく化学的又は物理的相互作用の結果であるという点で、免疫精製とは異なる。場合によっては、移動相が固相を通過又はその周りに流れるとき、移動相の望ましくない成分が固相により保持されて、移動相中の被分析物の精製がもたらされる可能性がある。他の場合には、被分析物が固相により保持されて、移動相の望ましくない成分が固相を通過又はその周りに流れることが可能になり得る。これらの場合、さらなる処理又は分析のために次に第２の移動相を用いて、保持された被分析物を固相から溶出する。ＴＦＬＣを含むＳＰＥは、単一又は混合モード機構により機能し得る。混合モード機構は、同じカラムにおいてイオン交換と疎水性保持を利用するものであり、例えば、混合モードＳＰＥカラムの固相は、強い陰イオン交換及び疎水性保持を示し得る、又は強い陽イオン交換及び疎水性保持を示し得る。
本明細書で用いる場合、「クロマトグラフィー」という用語は、液体又は気体により運ばれる化学物質の混合物が、静止液体又は固相の周り又は上に流れるときに化学物質の差別的分配の結果として成分に分離される方法を意味する。
本明細書で用いる場合、「液体クロマトグラフィー」又は「ＬＣ」という用語は、流体が微細な物質のカラム又は毛細管通路に均一に浸透するときに流体溶液の１つ又は複数の成分が選択的に遅延する方法を意味する。遅延は、１つ又は複数の固定相とバルク流体（すなわち、移動相）との間のこの流体が固定相（単数又は複数）に対して移動するときの混合物の成分の分配に起因する。「液体クロマトグラフィー」の例としては、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）（時に高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）又は高処理液体クロマトグラフィーとして公知である）がある。
本明細書で用いる場合、「高速液体クロマトグラフィー」又は「ＨＰＬＣ」（時に「高圧液体クロマトグラフィー」として公知である）という用語は、移動相を加圧下で固定相、一般的に密に充填されたカラムに強制的に通すことによって分離の程度を増大させる液体クロマトグラフィーを意味する。
本明細書で用いる場合、「乱流液体クロマトグラフィー」又は「ＴＦＬＣ」（時に高乱流液体クロマトグラフィー又は高処理液体クロマトグラフィーとして公知である）という用語は、カラム充填剤に通すアッセイされる物質の乱流を分離を行う基盤として利用するクロマトグラフィーの形態を意味する。ＴＦＬＣは、質量分析による分析の前に２つの無名の薬物を含む試料の調製に適用された。例えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、Ａ８５４巻、２３～３５頁（１９９９年）を参照のこと。ＴＦＬＣをさらに説明している、米国特許第５，９６８，３６７号、第５，９１９，３６８号、第５，７９５，４６９号及び第５，７７２，８７４号も参照のこと。当業者は、「乱流」を理解している。流体がゆっくりと滑らかに流れている場合、その流れは、「層流」と呼ばれる。例えば、ＨＰＬＣカラム中を低流速で移動している流体は、層流である。層流において、流体の粒子の運動は規則的であり、粒子が一般的に直線的に移動する。より速い速度では、水の慣性が流体の摩擦力に打ち勝ち、乱流が生ずる。不規則な境界と接触していない流体は、摩擦により遅くなるか、又は平坦でない表面により偏向させられるそれを「追い越す」。流体が乱れて流れている場合、それは、流れが層流である場合より大きい「抵抗」により渦状に旋回して（又は渦巻き状で）流れる。流体の流れが層流又は乱流である場合を判断するうえで助けとするための多くの参考文献が入手可能である（例えば、Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｐ．Ｓ．Ｂｅｒｎａｒｄ ＆ Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００年）、Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ、Ｊｅａｎ Ｍａｔｈｉｅｕ ＆ Ｊｕｌｉａｎ Ｓｃｏｔｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１年））。
本明細書で用いる場合、「ガスクロマトグラフィー」又は「ＧＣ」という用語は、試料混合物を蒸発させ、液体又は粒子状固体からなる固定相を含むカラム中を移動するキャリヤーガス（窒素又はヘリウムとしての）の流れに注入し、固定相に対する化合物の親和性に従ってその成分化合物に分離するクロマトグラフィーを意味する。
本明細書で用いる場合、「大粒子カラム」又は「抽出カラム」という用語は、約５０μｍより大きい平均粒子直径を含むクロマトグラフィーカラムを意味する。この文脈において用いる場合、「約」という用語は、±１０％を意味する。
本明細書で用いる場合、「分析カラム」という用語は、被分析物の存在又は量の決定を可能にするのに十分なカラムから溶出する試料中の物質の分離を達成するのに十分なクロマトグラフプレートを有するクロマトグラフィーカラムを意味する。そのようなカラムは、さらなる分析のための精製試料を得るために保持されない物質から保持される物質を分離又は抽出するという一般的な目的を有する「抽出カラム」としばしば区別される。この文脈において用いる場合、「約」という用語は、±１０％を意味する。好ましい実施形態において、分析カラムは、直径が約５μｍの粒子を含む。
本明細書で用いる場合、「オンライン」及び「インライン」という用語は、例えば、「オンライン自動式（ｏｎ－ｌｉｎｅ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｆａｓｈｉｏｎ）」又は「オンライン抽出」に用いられているように、操作者の介入の必要なしに実施される手順を意味する。対照的に、「オフライン」という用語は、本明細書で用いる場合、操作者の手作業による介入を必要とする手順を意味する。したがって、試料を沈殿に供し、次いで、上清を手作業でオートサンプラーに装填する場合、沈殿及び装填ステップは、その後のステップからオフラインである。方法の様々な実施形態において、１つ又は複数のステップをオンライン自動式で実施することができる。
本明細書で用いる場合、「質量分析」又は「ＭＳ」という用語は、化合物をそれらの質量により同定するための分析技術を意味する。ＭＳは、イオンの質量電荷比又は「ｍ／ｚ」に基づいてイオンをフィルタリングし、検出し、測定する方法を意味する。ＭＳ技術は、一般的に（１）化合物をイオン化して、荷電化合物を生成するステップと、（２）荷電化合物の分子量を検出し、質量電荷比を計算するステップとを含む。化合物は、適切な手段によりイオン化し、検出することができる。「質量分析計」は、一般的にイオン化装置及びイオン検出器を含む。一般的に、対象の１つ又は複数の分子がイオン化され、その後イオンが質量分析装置に導入され、そこでは、磁界と電界の組み合わせにより、イオンが質量（「ｍ」）及び電荷（「ｚ」）に依存する空間内の経路をたどる。例えば、「表面からの質量分析（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆｒｏｍ Ｓｕｒｆａｃｅｓ）」と題する米国特許第６，２０４，５００号、「タンデム質量分析の方法及び装置（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」と題する第６，１０７，６２３号、「質量分析に基づくＤＮＡ診断（ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」と題する第６，２６８，１４４号、「被分析物の脱離及び検出のための表面増強光感受性結合及び放出（Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｆｏｒ Ｄｅｓｏｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎａｌｙｔｅｓ）」と題する第６，１２４，１３７号、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１９９９年、２巻、２６４～７６頁並びにＭｅｒｃｈａｎｔ及びＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２０００年、２１巻、１１６４～６７頁を参照のこと。
本明細書で用いる場合、「ネガティブイオンモードで動作する」という用語は、負イオンを発生させ、検出する質量分析法を意味する。「ポジティブイオンモードで動作する」という用語は、本明細書で用いる場合、正イオンを発生させ、検出する質量分析法を意味する。
本明細書で用いる場合、「イオン化」又は「イオン化する」という用語は、１以上の電子単位に等しい正味の電荷を有する被分析物イオンを発生させる方法を意味する。負イオンは、１以上の電子単位の正味の負電荷を有するものであり、一方、正イオンは、１以上の電子単位の正味の正電荷を有するものである。
本明細書で用いる場合、「電子イオン化」又は「ＥＩ」という用語は、気相又は蒸気相中の対象の被分析物が電子の流れと相互作用する方法を意味する。電子と被分析物との衝突が、次に質量分析技術にかけることができる被分析物イオンを生成する。
本明細書で用いる場合、「化学イオン化」又は「ＣＩ」という用語は、試薬ガス（例えば、アンモニア）が電子衝撃にかけられ、試薬ガスイオンと被分析物分子との相互作用により被分析物イオンが生じる方法を意味する。
本明細書で用いる場合、「高速原子衝撃」又は「ＦＡＢ」という用語は、高エネルギー原子（しばしばＸｅ又はＡｒ）のビームが不揮発性試料に衝突し、試料に含まれている分子を脱離させ、イオン化する方法を意味する。試験試料をグリセロール、チオグリセロール、ｍ－ニトロベンジルアルコール、１８－クラウン－６クラウンエーテル、２－ニトロフェニルオクチルエーテル、スルホラン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンなどの粘性液体マトリックスに溶解する。化合物又は試料に対する適切なマトリックスの選択は、経験的プロセスである。
本明細書で用いる場合、「マトリックス支援レーザー脱離イオン化」又は「ＭＡＬＤＩ」という用語は、不揮発性試料を、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化及びクラスタ崩壊を含む様々なイオン化経路により試料中の被分析物を脱離させ、イオン化するレーザー照射にさらす方法を意味する。ＭＡＬＤＩのために、試料を、被分析物分子の脱離を促進するエネルギー吸収マトリックスと混合する。
本明細書で用いる場合、「表面エンハンス型レーザー脱離イオン化」又は「ＳＥＬＤＩ」という用語は、不揮発性試料を、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化及びクラスタ崩壊を含む様々なイオン化経路により試料中の被分析物を脱離させ、イオン化するレーザー照射にさらす他の方法を意味する。ＳＥＬＤＩのために、試料を一般的に、対象の１つ又は複数の被分析物を優先的に保持する表面に結合させる。ＭＡＬＤＩと同様に、この方法は、イオン化を促進するエネルギー吸収物質も用いることができる。
本明細書で用いる場合、「エレクトロスプレーイオン化」又は「ＥＳＩ」という用語は、末端に高い正又は負電位を印加した短い毛細管に溶液を通す方法を意味する。管の末端に到達した溶液は、蒸発して（霧化）、溶媒蒸気中溶液の非常に小さな液滴のジェット又は噴霧体になる。この液滴の噴霧体は、蒸発チャンバー中を流れる。液滴がより小さくなるとき、同符号電荷の間の自然反発力によってイオン並びに中性分子が放出されるような時点まで表面電荷密度が増加する。
本明細書で用いる場合、「大気圧化学イオン化」又は「ＡＰＣＩ」という用語は、ＥＳＩと同様な質量分析法を意味するが、ＡＰＣＩは、大気圧のプラズマ内で起こるイオン－分子反応によりイオンを生成する。プラズマは、噴霧毛細管と対極との間の放電により維持される。次いで、イオンは、一般的に一組の差動排気スキマーステージを用いることにより質量分析計内に抽出される。向流の乾燥し、予熱されたＮ２ガスを用いて、溶媒の除去を改善することができる。ＡＰＣＩにおける気相イオン化は、極性がより低い種を分析するのにＥＳＩより有効であり得る。
「大気圧光イオン化」又は「ＡＰＰＩ」という用語は、本明細書で用いる場合、分子Ｍの光イオン化の機構が分子イオンＭ＋を生成する光子の吸収及び電子の放出である質量分析の形態を意味する。光子エネルギーが一般的にイオン化電位の直上であるため、分子イオンは解離を受けにくい。多くの場合に、クロマトグラフィーの必要なしに試料を分析することが可能であり、それによりかなりの時間と費用の節約となり得る。水蒸気又はプロトン性溶媒の存在下では、分子イオンは、Ｈを引き抜いてＭＨ＋を形成し得る。Ｍが高いプロトン親和性を有する場合、これが起こる傾向がある。Ｍ＋とＭＨ＋の合計が一定であるため、これは、定量の正確度に影響を与えない。プロトン性溶媒中の薬物化合物は、通常ＭＨ＋として観測されるが、ナフタレン又はテストステロンなどの非極性化合物は、通常Ｍ＋を形成する。例えば、Ｒｏｂｂら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、７２巻（１５号）、３６５３～３６５９頁を参照のこと。
本明細書で用いる場合、「誘導結合プラズマ」又は「ＩＣＰ」という用語は、大部分の元素が原子化され、イオン化されるような十分に高い温度で試料が部分的にイオン化されたガスと相互作用する方法を意味する。
本明細書で用いる場合、「電界脱離」という用語は、不揮発性試験試料をイオン化表面上にのせ、強い電界を用いて被分析物イオンを発生させる方法を意味する。
本明細書で用いる場合、「脱離」という用語は、表面からの被分析物の除去及び／又は被分析物の気相への侵入を意味する。レーザー脱離熱脱離は、被分析物を含む試料をレーザーパルスにより気相中に熱的に脱離させる技術である。レーザーは、金属基部を備えた特製の９６ウェルプレートの裏面を照射する。レーザーパルスが底部を加熱し、熱が試料を気相に移行させる。気相試料が次に質量分析計に引き込まれる。
本明細書で用いる場合、「選択イオンモニタリング」という用語は、比較的狭い質量範囲内、一般的に約１質量単位の範囲内のイオンのみが検出される質量分析機器の検出モードである。
本明細書で用いる場合、「選択反応モニタリング」として時として公知である「多重反応モード」は、前駆イオン及び１つ又は複数のフラグメントイオンが選択的に検出される質量分析機器の検出モードである。
本明細書で用いる場合、「定量化下限」、「定量下限」又は「ＬＬＯＱ」という用語は、測定が定量的に意味があるようになるポイントを意味する。このＬＯＱにおける被分析物の応答は、特定可能であり、個別的であり、２０％未満の相対標準偏差（ＲＳＤ％）及び８５％～１１５％の正確度で再現性がある。
本明細書で用いる場合、「検出限界」又は「ＬＯＤ」という用語は、測定値がそれに関連する不確実さより大きいポイントである。ＬＯＤは、値がその測定に関連する不確実さを超えるポイントであり、ゼロ濃度における平均値のＲＳＤの３倍と定義される。
本明細書で用いる場合、体液試料中の被分析物の「量」は、一般的に試料の体積において検出できる被分析物の質量を反映する絶対値を意味する。しかし、量は、他の被分析物の量と比較した相対量も意図する。例えば、試料中の被分析物の量は、試料中に通常存在する被分析物の対照又は正常レベルより大きい量であり得る。
「約」という用語は、イオンの質量の測定を含まない定量的測定に関して本明細書で用いる場合、表示値プラス又はマイナス１０％を意味する。質量分析機器は、所定の被分析物の質量を決定することについてわずかに異なり得る。イオンの質量又は質量／電荷比に関する「約」という用語は、＋／－０．５０原子質量単位を意味する。
上述の本発明の概要は、非限定的なものであり、本発明の他の特徴及び利点は、本発明の以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである。
すべての被分析物及び代謝物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳプロファイルを示す図である。 （Ａ）アミトリプチリン、（Ｂ）マプロチリン、及び（Ｃ）ベンラファキシンのベースライン分離の例を示す図である（被分析物：左、内部標準（ＩＳ）：右）。 別の実験室と比較したシタロプラムの正確度を示す図である。値の±２０％より大きいバイアスは示さない。 別の実験室と比較した代謝物デスメチルシタロプラムの正確度を示す図である。値の±２０％より大きいバイアスは示さない。 分離されたシクロベンザプリン妨害を示す図である。図は、５ｎｇ／ｍＬマプロチリン＋１００ｘシクロベンザプリンを示す。 デスメチルベンラファキシン対トラマドールの、質量スペクトルでの差異を示す図である。 分離されたトラマドール妨害を示す図である。図は、５ｎｇ／ｍＬデスメチルベンラファキシン＋１００ｘトラマドールを示す。 アミトリプチリン、マプロチリン、及びベンラファキシンのベースライン分離を示す図である。 （図８－１の続き） ノルトリプチリン、プロトリプチリン、デスメチルベンラファキシンのベースライン分離を示す図である。 （図９－１の続き） デスメチルドキサピン及びミルタザピンのベースライン分離を示す図である。 様々な遷移により同定されたデシプラミン対ミルタザピンを示す図である。 （図１１－１の続き） イオン比及び／又は相対保持時間（ＲＲＴ）が、ミルタザピンに対して陽性の患者ではデシプラミンについてみられないことを示す図である。 （図１２－１の続き）
特定の実施形態において、本明細書で述べる抗うつ剤パネルは、このクラス内の薬物の使用及び又は乱用の歴／リスクを有する患者の服薬コンプライアンスモニタリングとともに用いることができる。このクラスの薬物を処方する前のベースライン試験により、提供者は多剤併用による薬物対立の可能性に対して注意喚起される。服薬コンプライアンスモニタリングでは、これらの患者集団について、存在すべき処方された薬物及び処方されていない薬物の非存在が必要である。
特定の脳化学物質、神経伝達物質、より具体的にはセロトニン、ノルエピネフリン及びドーパミンはうつに関連する。大部分の抗うつ剤は、これらの神経伝達物質に影響を与えることでうつを治療する。様々な種類／クラスの抗うつ剤が、様々な様式でこれらの神経伝達物質に影響を与える。これらの種類は、ＳＳＲＩ、ＳＮＲＩ、ＮＤＲＩ、三環系、非定型、ＭＡＯＩなど（以下を参照のこと）を含む。
選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）。医師はしばしば、ＳＳＲＩを処方することから始める。これらの薬剤は、他の種類の抗うつ剤よりも安全であり、概して厄介な副作用を引き起こしにくい。ＳＳＲＩは、フルオキセチン（プロザック、セルフェムラ（Ｓｅｌｆｅｍｒａ））、パロキセチン（パキシル、ペキセバ（Ｐｅｘｅｖａ））、セルトラリン（ゾロフト）、シタロプラム（セレクサ）、エスシタロプラム（レクサプロ）、フルボキサミン（ファベリン（Ｆａｖｅｒｉｎ）、フェバリン（Ｆｅｖａｒｉｎ）、フロキシフラル（Ｆｌｏｘｙｆｒａｌ）、デュミロクス（Ｄｕｍｙｒｏｘ）、ルボックス）、ビラゾドン（ビブライド（Ｖｉｉｂｒｙｄ））を含む。
セロトニン及びノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）－デュロキセチン（サインバルタ）、ベンラファキシン（イフェクサーＸＲ）、デスメチルベンラファキシン（ベンラファキシンの主代謝物の合成形態、Ｏ－デスメチルベンラファキシン；プリスティーク、ケデズラ（Ｋｈｅｄｅｚｌａ））及びレボミルナシプラン（フェトジマ（Ｆｅｔｚｉｍａ））。ＳＮＲＩは、セロトニン及びノルエピネフリン両方のレベルを上昇させる独自の二重作用を有し、ゆえにＳＮＲＩはうつの１つ超の原因を抑制する。
ノルエピネフリン及びドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）。ブプロピオン（ウェルブトリン、アプレンジン（Ａｐｌｅｎｚｉｎ）、フォルフィボ（Ｆｏｒｆｉｖｏ）ＸＬ）はこのカテゴリーに分類される。これは、性的副作用にほとんど関連しない数少ない抗うつ剤の１種である。
三環系抗うつ剤（ＴＣＡ）は、より新しい抗うつ剤よりも多くの副作用を引き起こす傾向がある。三環系抗うつ剤は概して、患者がまずＳＳＲＩを試して改善がみられない限り処方されない。ＴＣＡは、イミプラミン（トフラニール）、ノルトリプチリン（パメロール（Ｐａｍｅｌｏｒ））、アミトリプチリン（エラビル、エンデップ（Ｅｎｄｅｐ）、レンチゾール（Ｌｅｎｔｉｚｏｌ）、レバテ（Ｌｅｖａｔｅ）、サロテン（Ｓａｒｏｔｅｎ）、トリプタノール、トリプチゾール（Ｔｒｙｐｔｉｚｏｌ））、ドキセピン（アダピン（Ａｄａｐｉｎ）、クラチン（Ｃｕｒａｔｉｎ）、サイレノール、シネクアン（Ｓｉｎｅｑｕａｎ））、トリミプラミン（スルモンチール）、デシプラミン（ノルプラミン（Ｎｏｒｐｒａｍｉｎ））、プロトリプチリン（ビバクチル（Ｖｉｖａｃｔｉｌ））、アモキサピン（アセンジン（Ａｓｅｎｄｉｎ））、クロミプラミン（アナフラニール）、及びマプロチリン（ルジオミール）を含む。
非定型抗うつ剤。これらの薬剤は、他の抗うつ剤カテゴリーのいずれにもうまく入らない。これらは、トラゾドン（オレプトロ（Ｏｌｅｐｔｒｏ））、ミルタザピン（レメロン）及びボルチオキセチン（ブリンテリックス（Ｂｒｉｎｔｅｌｌｉｘ））を含む。これらは鎮静性であり、通常夜に服用される。
モノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）はこのアッセイに含まれない。これらの薬剤はＳＳＲＩと組み合わせることができない。一般的なＭＡＯＩは、トラニルシプロミン（パルネート（Ｐａｒｎａｔｅ））、フェネルジン（ナルディル（Ｎａｒｄｉｌ））及びイソカルボキサジド（マープラン（Ｍａｒｐｌａｎ））を含む。
試料中の被分析物の量を測定する方法を記載する。より具体的には、ヒト血漿又は血清などの生物学的試料中の被分析物を検出し、及び／又は定量する質量分析法を記載する。方法では液体クロマトグラフィーを利用してよく、その後試料中の被分析物を定量するためのタンデム質量分析が続く。
本発明の方法に用いる適切な試験試料は、対象の被分析物を含み得る試験試料である。いくつかの好ましい実施形態において、試料は、生物学的試料、すなわち、動物、細胞培養、器官培養等などの生物学的源から得られる試料である。特定の好ましい実施形態において、試料は、イヌ、ネコ、ウマ等などの哺乳動物から得られる。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくは男性又は女性ヒトである。好ましい試料は、尿、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液などの体液又は組織試料、好ましくは尿を含む。そのような試料は、例えば、患者、すなわち、疾患又は状態の診断、予後診断又は治療のために臨床施設に出頭する男性又は女性の生者から得ることができる。いくつかの実施形態において、好ましい試料は、妊娠の可能性がある女性ヒトから得ることができる。試料が生物学的試料を含む実施形態において、方法は、試料が生物学的源から得られた場合の試料中のレフルノミド代謝物の量（すなわち、試料中の内因性レフルノミド代謝物の量）を決定するために用いることができる。
本発明はまた、抗うつ剤の定量アッセイ用のキットを企図する。抗うつ剤の定量アッセイ用のキットは、本明細書で提供する組成物を含むキットを含み得る。例えば、キットは、包装材料及び少なくとも１回のアッセイに十分な量の一定量の同位体標識内部標準を含み得る。一般的に、抗うつ剤の定量アッセイ用の包装済み試薬の使用についての有形の形式で記録された（例えば、紙又は電子媒体上に含まれた）取扱説明書も含む。
本発明の実施形態に用いる較正及びＱＣプールは、好ましくは、被分析物が本質的に存在しないという条件で、対象とする試料マトリックスと同様なマトリックスを用いて調製する。
質量分析用の試料の調製
質量分析のための調製において、例えば、液体クロマトグラフィー、ろ過、遠心分離、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、毛細管電気泳動を含む電気泳動、免疫アフィニティー分離を含むアフィニティー分離、酢酸エチル若しくはメタノール抽出を含む抽出法及びカオトロピック剤の使用又は上記のもの若しくは同類のもののいずれかの組み合わせを含む当技術分野で公知の様々な方法により、被分析物を試料（例えば、タンパク質）中の１つ又は複数の他の成分と比べて濃縮することができる。
タンパク質沈殿は、試験試料、特に血清又は血漿などの生物学的試験試料を調製する１つの方法である。タンパク質精製法は当技術分野で周知である。例えば、Ｐｏｌｓｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ ２００３年、７８５巻：２６３～２７５頁では、本発明の方法に用いるのに適切なタンパク質沈殿技術が記載されている。上清中に被分析物を残して試料からタンパク質の大部分を除去するために、タンパク質沈殿を用いることができる。試料を遠心分離して、沈殿したタンパク質から液体の上清を分離してもよく、或いは、試料をろ過して、沈殿したタンパク質を除去してもよい。次いで、生じた上清又はろ液を質量分析に直接かけてもよく、或いは液体クロマトグラフィーなどの追加の精製法、及びその後の質量分析にかけてもよい。特定の実施形態において、タンパク質沈殿、例えば、アセトニトリルタンパク質沈殿などの使用により、質量分析、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び質量分析の前の、ＴＦＬＣ又は他のオンライン抽出の必要がなくなり得る。
質量分析の前に用いることができる試料の精製の他の方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）である。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む液体クロマトグラフィーの特定の方法は、比較的に遅い層流技術に依拠している。伝統的なＨＰＬＣ分析は、カラム中を通る試料の層流が試料からの対象の被分析物の分離の基礎であるカラム充填に依拠している。当業者は、そのようなカラムにおける分離が分配過程であることを理解し、被分析物とともに用いるのに適切であるＨＰＬＣを含むＬＣ、機器及びカラムを選択することができる。クロマトグラフカラムは、一般的に化合物構成成分の分離（すなわち、分別）を促進するための媒体（すなわち、充填剤）を含む。媒体は、微細な粒子を含み得る。粒子は、一般的に、様々な化合物構成成分と相互作用して化合物構成成分の分離を促進する結合表面を含む。１つの適切な結合表面は、アルキル結合、シアノ結合、又はビフェニル結合表面などの疎水性結合表面である。アルキル結合表面は、Ｃ－４、Ｃ－８、Ｃ－１２又はＣ－１８結合アルキル基を含み得る。好ましい実施形態において、カラムはビフェニルカラムである。クロマトグラフカラムは、試料を受け入れる入口部及び分別試料を含む溶出物を排出するための出口部を含む。試料は、入口部に直接、又はオンライン抽出カラムなどのＳＰＥカラム若しくはＴＦＬＣカラムから供給することができる。いくつかの実施形態において、試料がＨＰＬＣカラムに達する前に試料中の粒子及びリン脂質を除去するために、オンラインガードカートリッジをＨＰＬＣカラムの前に用いることができる。いくつかの実施形態において、ガードカートリッジはビフェニルガードカートリッジであってよい。
１つの実施形態において、試料は、入口部においてＬＣカラムに加え、溶媒又は溶媒混合物により溶出し、出口部において排出することができる。対象の被分析物（単数又は複数）を溶出するための各種溶媒モードを選択することができる。例えば、液体クロマトグラフィーは、勾配モード、無勾配モード又は多型的（すなわち、混合）モードを用いて実施することができる。クロマトグラフィー中、物質の分離は、溶出液（「移動相」としても公知）、溶出モード、勾配条件、温度の選択等などの変数による影響を受ける。
特定の実施形態において、対象の被分析物はカラム充填剤に可逆的に保持されるが、１つ又は複数の他の物質は保持されない条件下で試料をカラムに加えることによって、被分析物を精製することができる。これらの実施形態において、対象の被分析物がカラムにより保持される第１の移動相条件を用いることができ、保持されない物質が洗い流されたならば、保持された物質をカラムから除去するためにその後に第２の移動相条件を用いることができる。或いは、対象の被分析物が１つ又は複数の他の物質と比べて異なる速度で溶出する移動相条件下で試料をカラムに加えることによって、被分析物を精製することができる。そのような手順は、試料の１つ又は複数の他の成分と比べて対象の１つ又は複数の被分析物の量を高め得る。
１つの好ましい実施形態において、ＨＰＬＣはビフェニルカラムクロマトグラフシステムを用いて実施される。特定の好ましい実施形態において、ビフェニル分析カラム（例えば、Ｒｅｓｔｅｋ Ｉｎｃ．製のＰｉｎｎａｃｌｅ ＤＢビフェニル分析カラム（５μｍ粒子径、５０ｘ２．１ｍｍ）、又は同等物）が用いられる。特定の好ましい実施形態において、ＨＰＬＣは、溶媒ＡとしてのＨＰＬＣ用０．１％水性ギ酸及び溶媒Ｂとしてのアセトニトリル中０．１％ギ酸を用いて実施する。
弁及び継手配管の注意深い選択により、手作業によるステップの必要なく１つのクロマトグラフィーカラムから次のカラムに物質が通るように２つ以上のクロマトグラフィーカラムを必要に応じて接続することができる。好ましい実施形態において、弁及び配管の選択は、必要なステップを実施するようにあらかじめプログラムされたコンピュータにより制御される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムは、そのようなオンライン式で検出システム、例えば、ＭＳシステムにも接続されている。したがって、操作者が試料のトレーをオートサンプラーに取り付けることができ、残りの操作は、コンピュータ制御のもとに実施されて、選択されるすべての試料の精製及び分析が行われる結果となる。
いくつかの実施形態において、質量分析の前の被分析物の精製のためにＴＦＬＣを用いることができる。そのような実施形態において、被分析物を捕捉するＴＦＬＣカラムを用いて試料を抽出することができる。次いで、被分析物を溶出し、オンラインで分析ＨＰＬＣカラムに移す。例えば、試料の抽出は、ＴＦＬＣ抽出カートリッジを用いて、又は大粒子径（５０μｍ）充填カラムを用いて達成することができる。このカラムから溶出した試料は、質量分析の前のさらなる精製のためにオンラインで分析ＨＰＬＣカラムに移される。これらのクロマトグラフィー手順に含まれるステップを自動式で連結することができるので、被分析物の精製中の操作者の関与の必要性を最小限にすることができる。この特徴により、時間と費用の節約がもたらされ、操作者の誤りの機会が排除される可能性がある。
質量分析による検出及び定量
様々な実施形態において、被分析物は、当業者に公知の方法によりイオン化することができる。質量分析は、分別試料をイオン化し、さらなる分析のために荷電分子を生成するためのイオン源を含む質量分析計を用いて実施される。例えば、試料のイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、レーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、液体二次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）及び粒子ビームイオン化により行うことができる。当業者は、イオン化法の選択は、測定される被分析物、試料の種類、検出器の種類、ポジティブ対ネガティブモードの選択等に基づいて決定することができることを理解する。
被分析物はポジティブモードでイオン化されても、ネガティブモードでイオン化されてもよい。いくつかの実施形態において、被分析物は、ポジティブモードでイオン化される。
質量分析技術において、一般的に、試料をイオン化した後、それにより生成した正又は負に荷電したイオンを分析して、質量電荷比（ｍ／ｚ）を決定することができる。ｍ／ｚを決定するための適切な分析計は、四重極型分析計、イオントラップ型分析計及び飛行時間型分析計を含む。具体例としてのイオントラップ方法は、Ｂａｒｔｏｌｕｃｃｉら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２０００年、１４巻、９６７～７３頁に記載されている。
本発明のいくつかの方法によれば、高分解能／高精度質量分析は、被分析物の定量に用いられる。すなわち、質量分析は、対象のイオンについて約５０ｐｐｍ又はそれ以下の正確度で少なくとも１０，０００の分解能（ＦＷＨＭ）を示すことができる質量分析計を用いて実施される。好ましくは質量分析計は、２０，０００又はそれ以上の分解能（ＦＷＨＭ）と約２０ｐｐｍ又はそれ以下の正確度、例えば、２５，０００又はそれ以上の分解能（ＦＷＨＭ）と約５ｐｐｍ又はそれ以下の正確度など、例えば、２５，０００又はそれ以上の分解能（ＦＷＨＭ）と約３ｐｐｍ又はそれ以下の正確度などを示す。被分析物イオンについて必要なレベルの性能を示すことができる３つの具体例としての質量分析計は、オービトラップ質量分析計、特定のＴＯＦ質量分析計又はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計を含む質量分析計である。
炭素、酸素及び窒素などの生物学的活性分子に見いだされる元素は、多種の同位体で天然に存在する。例えば、ほとんどの炭素は、１２Ｃとして存在するが、すべての天然に存在する炭素の約１％は、１３Ｃとして存在する。したがって、分子を含有する天然に存在する炭素の一部分は、少なくとも１つの１３Ｃ原子を含有することになる。天然に存在する元素同位体が分子に含まれることにより、複数の分子同位体が生じる。分子同位体の質量の差は、少なくとも１原子質量単位（ａｍｕ）である。これは、元素同位体が少なくとも１つの中性子異なるからである（１つの中性子の質量≒１ａｍｕ）。分子同位体が多荷電状態にイオン化される場合、質量分析での検出が質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいているため、同位体の間の質量の差異は、識別することが困難になり得る。例えば、両方が５＋状態にイオン化される、質量が１ａｍｕ異なる２つの同位体は、わずか０．２（差１ａｍｕ／荷電状態５）のそれらのｍ／ｚの差を示す。高分解能／高精度質量分析は、高度に多荷電イオン（±４、±５、±６、±７、±８、±９又はより高度の電荷を有するイオンなど）の同位体を識別することができる。
天然に存在する元素同位体のため、すべての分子イオン（十分に感度の高い質量分析機器により分析した場合、それぞれが個別に検出できるスペクトルピークを生じ得る）について複数の同位体が一般的に存在する。複数の同位体のｍ／ｚ比及び相対存在量は、分子イオンの同位体シグニチャを集合的に含む。いくつかの実施形態において、２つ以上の分子同位体のｍ／ｚ及び相対存在量は、検討中の分子イオンの同一性を確認するために利用することができる。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の同位体の質量分析ピークを用いて分子イオンを定量する。いくつかの関連実施形態において、１つの同位体の単一質量分析ピークを用いて分子イオンを定量する。他の関連実施形態において、複数の同位体ピークを用いて分子イオンを定量する。これらの後者の実施形態において、複数の同位体ピークは、適切な数学的処理にかけることができる。いくつかの数学的処理は、当技術分野で公知であり、多重ピーク下面積の合計又は多重ピークによる応答の平均を含むが、これらに限定されない。
質量分析技術では概して、イオンは、数種の検出モードを用いて検出することができる。例えば、選択されるイオンは、すなわち、選択イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）を用いて、又は代わりになるべきものとして、衝突活性化解離（ＣＡＤ）に起因する質量遷移、例えば多重反応モニタリング（ＭＲＭ）若しくは選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を用いて検出することができる。しばしばＣＡＤを用いて、後続の検出のためにフラグメントイオンを生成する。ＣＡＤにおいて、前駆イオンは、不活性ガスとの衝突によりエネルギーを獲得し、その後「単分子分解」と呼ばれる過程によりフラグメントになる。振動エネルギーの増加によりイオン内の特定の結合を切断できるように、十分なエネルギーが前駆イオンに蓄積されなければならない。或いは、ニュートラルロスをモニターすることができる。
いくつかの実施形態において、質量電荷比を四重極型分析計を用いて決定する。例えば、「四重極」又は「四重極型イオントラップ」機器において、振動高周波電界におけるイオンは、電極間に印加されたＤＣ電位、ＲＦシグナルの振幅及び質量／電荷比に比例する力を受ける。電圧及び振幅は、特定の質量／電荷比を有するイオンのみが四重極を縦断するが、他のすべてのイオンは偏向させられるように選択できる。したがって、四重極機器は、機器に注入されるイオンの「マスフィルター」及び「質量検出器」の両方として機能し得る。
ＭＳ技術の特異性を「タンデム質量分析」又は「ＭＳ／ＭＳ」により向上させることができる。この技術において、対象の分子から得られる前駆イオン（親イオンとも呼ばれる）は、ＭＳ機器によりフィルターすることができ、前駆イオンは、その後フラグメント化されて、第２のＭＳ手順で分析される１つ又は複数のフラグメントイオン（娘イオン又はプロダクトイオンとも呼ばれる）を生じる。前駆イオンの注意深い選択により、特定の被分析物により生成するイオンのみがフラグメント化チャンバーに通され、そこでの不活性ガスの原子との衝突により、フラグメントイオンが生成する。前駆及びフラグメントイオンの両方が一連の所定のイオン化／フラグメント化条件下で再現性よく生成するので、ＭＳ／ＭＳ技術は、極めて強力な分析ツールとなり得る。例えば、フィルトレーション／フラグメンテーションの組み合わせは、妨害物質を除去するために用いることができ、生物学的試料のような複雑な試料に特に有用であり得る。
タンデム質量分析機器を操作する代替モードは、プロダクトイオンスキャニング及び前駆イオンスキャニングを含む。これらの操作モードの説明については、例えば、Ｅ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｔｈｕｒｍａｎら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｔｒａｃｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ ８（Ａｍａｄｅｏ Ｒ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ａｌｂａ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ２００５）（３８７）を参照のこと。
被分析物アッセイの結果は、当技術分野で公知の多くの方法により最初の試料中の被分析物の量に関連付けることができる。例えば、サンプリング及び分析パラメーターが注意深く管理されているならば、所定のイオンの相対存在量は、当該相対存在量を最初の分子の絶対量に換算する表と比較することができる。或いは、外部標準を試料とともに実施することができ、標準曲線をそれらの標準から得たイオンに基づいて作成する。そのような標準曲線を用いて、所定のイオンの相対存在量を最初の分子の絶対量に換算することができる。特定の好ましい実施形態において、内部標準を用いて被分析物の量を計算するための標準曲線を作成する。そのような標準曲線を作成し、用いる方法は、当技術分野で周知であり、当業者は適切な内部標準を選択することができる。例えば、被分析物と同様のｍ／ｚを有する、１つ又は複数の形の同位体標識分子を内部標準として用いることができる。本明細書で述べるいくつかの実施形態において、具体例としての内部標準は同位体標識ジアゼパムであるが、多くの他の化合物（同位体標識されているか又は別の状態）を用いることができる。イオンの量を最初の分子の量に関連させる多くの他の方法は、当業者に周知である。
本明細書で用いる場合、「同位体標識」は、質量分析技術により分析するとき、非標識分子と比べて標識分子の質量シフトをもたらす。適切な標識の例としては、重水素（２Ｈ）、１３Ｃ及び１５Ｎなどがある。１つ又は複数の同位体標識を分子における１つ又は複数の位置に組み込むことができ、１つ又は複数の種類の同位体標識を同じ同位体標識分子に用いることができる。
方法の１つ又は複数のステップは、自動装置を用いて実施することができる。特定の実施形態において、１つ又は複数の精製ステップをオンラインで実施し、より好ましくは精製及び質量分析ステップのすべてをオンライン式で実施することができる。
特に好ましい実施形態において、試料中の被分析物は、次のようにＭＳ／ＭＳを用いて検出され、及び／又は定量される。試料は好ましくは、液体クロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣにかけられ、クロマトグラフカラムからの液体溶媒の流れがＭＳ／ＭＳ分析計の加熱ネブライザーインターフェースに入り、溶媒／被分析物混合物がインターフェースの加熱荷電チューブ中で蒸気に変換される。これらの過程において、被分析物（すなわち、抗うつ剤又は代謝物）が分析される。イオン、例えば、前駆イオンは、機器の開口部を通過し、第１の四重極に入る。四重極１及び３（Ｑ１及びＱ３）は、イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいてイオンの選択（すなわち、Ｑ１及びＱ３におけるそれぞれ「前駆」及び「フラグメント」イオンの選択）を可能にするマスフィルターである。四重極２（Ｑ２）は、イオンがフラグメント化されるコリジョンセルである。質量分析計の第１の四重極（Ｑ１）は、被分析物の質量電荷比を有する分子を選択する。正しい質量／電荷比を有する前駆イオンは、コリジョンチャンバー（Ｑ２）内に通されるが、他の質量／電荷比を有する不要なイオンは、四重極の側面に衝突し、除去される。Ｑ２に入った前駆イオンは、中性アルゴンガス分子と衝突し、フラグメントになる。生成したフラグメントイオンは、四重極３（Ｑ３）に通され、ここで被分析物のフラグメントイオンが選択され、他のイオンは除去される。
本方法は、ポジティブ又はネガティブイオンモード、好ましくはポジティブイオンモードで実施されるＭＳ／ＭＳを含み得る。当技術分野で周知の標準的な方法を用いて、当業者は、四重極３（Ｑ３）での選択に用いることができる被分析物の特定の前駆イオンの１つ又は複数のフラグメントイオンを同定することができる。
イオンが検出器に衝突するとき、それらは、デジタル信号に変換される電子のパルスを生じる。取得されたデータは、コンピュータに転送され、コンピュータは、収集されたイオンの計数を時間に対してプロットする。得られる質量クロマトグラムは、伝統的なＨＰＬＣ－ＭＳ法で得られるクロマトグラムに類似している。特定のイオンに対応するピーク下面積又はそのようなピークの振幅を測定し、対象の被分析物の量と関連させることができる。特定の実施形態において、フラグメントイオン（単数又は複数）及び／又は前駆イオンのピークの曲線下面積又は振幅を測定して、被分析物の量を決定する。上述のように、所定のイオンの相対存在量は、内部又は外部分子標準の１つ又は複数のイオンのピークに基づく較正標準曲線を用いて最初の被分析物の絶対量に変換することができる。
以下の実施例は、本発明を説明する役割を果たす。これらの実施例は、本方法の範囲を制限するものではない。
実施例１：試料の調製
以下の表１に示す２３種の処方抗うつ剤の被分析物及びそれらの代謝物についての同時分析のための、検証されたＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法について記載する。
Figure 2022534288000005
Figure 2022534288000006
品質コントロール、キャリブレーター、及び内部標準：薬物不含の尿対照（ＵＴＡＫ）に被分析物の保存液をスパイクすることにより、較正標準（４～５，０００ｎｇ／ｍＬ）並びに５、１２．５、及び４，０００ｎｇ／ｍＬの品質コントロール（ＱＣ）を調製した。内部標準（ＩＳ）は、１，３－クロルフェニルピペラジン－Ｄ８、ヒドロキシブプロピオン－Ｄ６、デスメチル－ベンラファキシン－Ｄ６、デスメチルシタロプラム－Ｄ３、トリミプラミン－Ｄ３、アミトリプチリン－Ｄ３、ノルトリプチリン－Ｄ３、パロキセチン－Ｄ６、プロトリプチリン－Ｄ３、シタロプラム－Ｄ６、ベンラファキシン－Ｄ６、イミプラミン－Ｄ３、トラゾドン－Ｄ６、ビラゾドン－Ｄ４、及びボルチオキセチン－Ｄ８の２５～１００ｎｇ／ｍＬの混合物であった。
試料の調製：尿試料、キャリブレーター、及びＱＣ（各２５μＬ）を１ｍＬの９６ウェル抽出プレートでＩＳ（２５μＬ）と混合し、水中１０ｍＭギ酸アンモニウム（移動相Ａ）４５０μＬで希釈し、次いで１，１００ｒｐｍで２分間ボルテックスした後、注入及び分析のためＬＣ－ＭＳ／ＭＳに移した。
実施例２：液体クロマトグラフィー－質量分析
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ：抽出された試料（２５μＬ）を、Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）フェニル－ヘキシル５０ｘ４．６ｍｍ ２．６μカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で、移動相Ａ／移動相Ｂ（アセトニトリル中２５％メタノール）勾配を用いてクロマトグラフィーにより分離した。４－カラムＬＣマルチプレックスを用いて、Ｐｒｅｌｕｄｅ ＬＸ－４ ＭＤ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での処理量を最大にした。Ｓｃｉｅｘ ４５００ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ（商標）質量分析計を選択反応モニタリングに用いた。図１はすべての被分析物についての代表的なクロマトグラムであり、図２は近縁の被分析物のベースライン分離を示す。
表２は、質量分析アッセイで各被分析物を検出するのに用いられた質量遷移を示す。
Figure 2022534288000007
Figure 2022534288000008
Figure 2022534288000009
Figure 2022534288000010
実施例３：検証及び結果
検証：標準的な実験室方法により以下の特性を決定した：定量限界（ＬＯＱ）、直線性（希釈による直線性上限［ＵＬＯＬ］を含む）、精度、正確度、１５０種超の様々な薬物による妨害、安定性、抽出された検体の安定性、マトリックス効果、及び持ち越し。
直線性：
５～９点の較正曲線は、回帰係数（ｒ）＞０．９９０で、その標的の±２０％の範囲で一貫した直線性及び再現性を示した。
ＣＶは７．５％～１０％であった。
すべての抗うつ剤被分析物及び代謝物についての分析測定範囲（ＡＭＲ）は４～５，０００ｎｇ／ｍＬで、ＬＯＱは１０ｎｇ／ｍｌ（例外１つ）で、ＵＬＯＬは５０，０００ｎｇ／ｍＬであった。例外は代謝物ノルセルトラリンであり、ＡＭＲは２５～５，０００ｎｇ／ｍＬで、ＬＯＱは５０ｎｇ／ｍＬであった。
精度：
５日間にわたる精度試験により、低、中間及び高レベルのＱＣについて、３より大きいシグマ値で一貫した結果が示された。
正確度：
濃度範囲４～２０，０００ｎｇ／ｍＬにわたる６５の試料を、別の実験室からの別の６５の結果と関連させることにより、正確度試験を実施した。例を図３及び４に示す。
概して、Ｄｅｍｉｎｇ回帰により、バイアスなしで、相関係数１．０２２及び切片－０．０６８１が示された。
妨害：
（カットオフの１００倍の、１５０超の複数の違法薬物及び処方薬を試験した。これらの試験は、ネガティブマトリックス対照及び関連物質をスパイクしたＬｏＱ対照の両方を用いて行った。）
試験した妨害薬物はいずれも、ＬＯＱのパネル薬物のシグナル強度において≧２０％の偏差を引き起こさない。
安定性：
検体は室温で７日間、冷蔵で１４日間、冷凍で３０日間安定であった。抽出後は、試料は２４時間安定であった。
マトリックス効果：
未希釈及び希釈したマトリックスとともに、試料を３つの様々なレベル（０．５ｘ、２ｘ、及び０．８ｘＵＬＯＬ）で比較した。
マトリックス効果は観測されなかった。
持ち越し：
試料２つを４０００ｎｇ／ｍＬで連続してスパイクし、その後ブランク試料４つをスパイクして持ち越し効果を決定した。これを３回反復で実施した。
持ち越しは観測されなかった。
本明細書で言及又は引用した論文、特許及び特許出願、並びにその他の全文献及び電子的に入手できる情報の内容は、各個別の刊行物が参照により具体的及び個別に組み入れられるように示される場合と同程度に参照により本明細書に全体として組み入れられる。出願人らは、任意のこのような論文、特許、特許出願又はその他の物理的及び電子的文献からのありとあらゆる材料及び情報を本出願に物理的に組み入れる権利を保持する。
本明細書で例示的に記載した方法は、本明細書に具体的に開示していない任意の要素又は要素（複数）、限定又は限定（複数）の非存在下で適切に実施することができる。したがって、例えば、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」などは、広範に、限定されることなく読み取られるべきである。さらに、本明細書で使用した用語及び表現は、限定ではなく説明のために使用されており、このような用語及び表現の使用において、示された、及び説明された特徴の任意の同等物又はその一部を排除するものではない。請求した本発明の範囲内において様々な変更が可能であることは認識されている。したがって、本発明を好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示してきたが、本明細書で開示しその中で実施される本発明の変更及び変形は当業者であれば用いることができ、このような変更及び変形は本発明の範囲内であると見なされることを理解されたい。
本発明は、本明細書において広範及び一般的に記載してきた。一般的な開示に含まれるより狭い種及び亜種のそれぞれも本方法の一部を形成する。これには、部類から任意の対象物を削除する条件又は消極的限定を有する方法の一般的説明が、削除された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かに関わらず、含まれる。
その他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。さらに、方法の特徴又は態様がマーカッシュ群によって記載されている場合は、当業者であれば、本発明はまた、マーカッシュ群の任意の個々の構成要素又は構成要素の亜群によって記載されることを理解するであろう。

Claims (20)

  1. 質量分析により試料中の１種又は複数の抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物の量を検出する又は決定する方法であって、
    ａ．質量分析により検出できる１つ又は複数のイオンを生成するのに適する条件下で、試料をイオン化にかけるステップと、
    ｂ．質量分析により１つ又は複数のイオンの量を決定するステップと、
    ｃ．ステップ（ｂ）で決定される１つ又は複数のイオンの量を用いて、試料中の抗うつ剤又は抗うつ剤代謝物の量を決定するステップと
    を含む、方法。
  2. 前記１種又は複数の抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物が、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、セロトニン及びノルエピネフリン再取り込み阻害剤、ノルエピネフリン及びドーパミン再取り込み阻害剤、三環系抗うつ剤、鎮静剤、並びに抗うつ剤代謝物代謝物を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記１種又は複数の抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物が、フルオキセチン、パロキセチン、セルトラリン、シタロプラム、エスシタロプラム、フルボキサミン、ビラゾドン、デュロキセチン、ベンラファキシン、デスメチルベンラファキシン、ヒドロキシブプロピオン、イミプラミン、ノルトリプチリン、アミトリプチリン、ドキセピン、トリミプラミン、デシプラミン、プロトリプチリン、アモキサピン、クロミプラミン、マプロチリン、トラゾドン、ミルタザピン、ボルチオキセチン、デスメチルシタロプラム、デスメチルクロミプラミン、デスメチルドキセピン、ノルフルオキセチン、ノルフルボキサミン、ノルセルトラリン、及び１，３－クロルフェニルピペラジンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. １０種以上の抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物の量を同時に検出する又は決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  5. ２０種以上の抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物の量を同時に検出する又は決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  6. ３０種の抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物の量を同時に検出する又は決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  7. １つ又は複数の内部標準を添加する、請求項１に記載の方法。
  8. １つ又は複数の内部標準が、重水素化された内部標準を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 重水素化された内部標準が、１，３－クロルフェニルピペラジン－Ｄ８、ヒドロキシブプロピオン－Ｄ６、デスメチル－ベンラファキシン－Ｄ６、デスメチルシタロプラム－Ｄ３、トリミプラミン－Ｄ３、アミトリプチリン－Ｄ３、ノルトリプチリン－Ｄ３、パロキセチン－Ｄ６、プロトリプチリン－Ｄ３、シタロプラム－Ｄ６、ベンラファキシン－Ｄ６、イミプラミン－Ｄ３、トラゾドン－Ｄ６、ビラゾドン－Ｄ４、及びボルチオキセチン－Ｄ８からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 試料が生物学的試料を含む、請求項１に記載の方法。
  11. 試料が尿を含む、請求項１に記載の方法。
  12. イオン化の前に試料を液体クロマトグラフィーにかける、請求項１に記載の方法。
  13. 前記液体クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 約４ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ（両端の値を含む）の範囲内のレベルの抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物を検出することができる、請求項１に記載の方法。
  15. 約２５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ（両端の値を含む）の範囲内のレベルの抗うつ剤及び抗うつ剤代謝物を検出することができる、請求項１に記載の方法。
  16. 前記質量分析がタンデム質量分析である、請求項１に記載の方法。
  17. 前記タンデム質量分析が、選択反応モニタリング、多重反応モニタリング、前駆イオンスキャニング、又はプロダクトイオンスキャニングにより行われる、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記タンデム質量分析が選択反応モニタリングにより行われる、請求項１６に記載の方法。
  19. 定量下限が１０ｎｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
  20. 定量下限が５０ｎｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
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