CN114994198B - 一种液相色谱质谱联用法同时定量检测78种神经精神类药物的方法 - Google Patents

一种液相色谱质谱联用法同时定量检测78种神经精神类药物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种液相色谱质谱联用法同时定量检测78种神经精神类药物的方法，包括：S1、待测全血样品前处理：将待测全血样品进行离心后，得到的血清加入提取试剂，涡旋混匀，离心取上清至收集板，再加入甲醇水溶液混匀，得待测样品；S2、制备校准品，将校准品采用与S1相同的处理方法，得待测校准品；S3、将待测样品和待测校准品均采用液相色谱质谱联用进行检测，以校准品的检测结果绘制校准曲线，并对待测样品进行定值，获得待测样品中各神经精神类药物的浓度。本发明首次提供了一种可同时检测15种抗癫痫药物、23中抗精神病药物和40种抗抑郁药物浓度的方法，大大提高了检测通量和效率，且检测稳定性好、准确性高。

Description

一种液相色谱质谱联用法同时定量检测78种神经精神类药物 的方法
技术领域
本发明涉及药物检测技术领域，特别是涉及一种液相色谱质谱联用法同时定量检测78种神经精神类药物的方法。
背景技术
Therapeutic Drug Monitoring(TDM)是一门研究个体化药物治疗机制、技术、方法和临床标准，并将研究结果转化应用于临床治疗以达到最大化合理用药的药学临床学科。通过测定患者体内的药物暴露、药理标志物或药效指标，利用定量药理模型，以药物治疗窗为基准，制定适合患者的个体化给药方案。其核心是个体化药物治疗。TDM工作内容包括药物(及其代谢物、药理标志物)分析、定量计算、临床干预三部分。患者存在个体差异、药物治疗窗窄、药物毒性反应难以判断、药物暴露受多种因素影响是开展TDM的主要临床指征。TDM的临床意义在于能够优化药物治疗方案，提高药物疗效、降低毒副作用，同时通过合理用药最大化应该能节省药物治疗费用。特异而灵敏地定量测定药物及其代谢物的分析方法是成功实施TDM的基本条件。
测定生物样本中药物浓度(血药浓度、尿药浓度、其他组织液或匀浆药物浓度)的分析技术主要有光谱分析、色谱分析、液相色谱－质谱联用技术、免疫学检测技术等技术方法，从药物专属性上推荐采用液相色谱－质谱联用技术和高效液相色谱技术。高效液相色谱技术仪器成本低，灵敏度在ng级别，能满足绝大多数药物的测定需求，并且紫外检测器信号稳定，不用每个批次都定标，但前处理操作繁琐，生物样本干扰多且检测周期长从而限制了样本检测通量，部分药物无法实现同时定量原药及其活性代谢物，另外对于定量限低于1ng以下的化合物灵敏度不够，无法准确定量。而液相色谱－质谱联用技术能很好解决这些问题，质谱法的优势是灵敏度、特异性、准确性高，一次能同时检测几十上百种药物及其代谢物，检测时间短，重现性好，并且仅用简单地前处理就能上机检测实现了通量高的要求。
然而，在现有的精神类疾病治疗药物检测中，采用的液相色谱－质谱联用技术进行检测的缺陷主要在于：
第一，通量低，现有方法多为一种类别药物同时测定，效率低，不同类别药物需建立不同方法，检测过程中需频繁切换色谱柱、流动相，花费较大成本的人力、物力。另外，即使涉及到不同类别的药物测定，能同时检测的药物种类仍然有限，影响了检测的效率。如专利文献CN111812216A中记载了一种检测血清中抗癫痫药物浓度的方法，其仅能同时检测10种抗癫痫药物浓度；专利文献CN111812222A中记载了一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法，其仅能检测18种抗抑郁药物；专利文献CN109668979A中记载了一种同时检测血液样品中17种抗精神病药物的方法，专利文献CN113820424A中记载了一种同时检测人血浆中14种抗抑郁药物浓度的HPLC-MS/MS方法。专利文献CN109655568A中记载了一种高效液质联用同时测定35种精神药物的方法，虽然实现了同时检测抗癫痫药物、抗精神病药物、抗抑郁药物的浓度，但其达到的同时检测的种类也仅为35种。
第二，灵敏度低，在同时检测多种药物的过程中，存在某些药物检测信号低而无法准确测出的问题，影响检测的准确度。另外在同时兼顾含量高的药物时低含量药物的准确定量更容易成为挑战。
第三，准确度低，干扰大，有的方法如专利文献CN109655568A中采用外标法定值，虽降低了成本，但血清基质内源性杂质多，干扰大，仅通过简单的蛋白沉淀法进行前处理获得的血清样本提取液就上机检测，导致准确度低。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种液相色谱质谱联用法同时定量检测78种精神类药物的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种液相色谱质谱联用法同时定量检测78种神经精神类药物的方法，包括以下步骤：
S1、待测全血样品前处理：将待测全血样品进行离心后，得到的血清加入提取试剂，涡旋混匀，然后离心，取上清至收集板，再加入甲醇水溶液混匀，得待测样品；
S2、制备校准品，将校准品采用与S1相同的处理方法，得待测校准品；
S3、将步骤S1得到的待测样品和步骤S2得到的待测校准品均采用液相色谱质谱联用进行检测，以校准品的检测结果绘制校准曲线，并对待测样品进行定值，获得待测样品中各神经精神类药物的浓度；
其中，步骤S3中，采用液相色谱质谱联用进行检测分析时，进行液相分析采用的色谱柱为ClassicShell C18色谱柱。
色谱柱的材质对实现这么多种药物的色谱分离起到关键作用，本发明前期的实验中对比考察了CSH C18、Kinetex C18、ClassicShell C18、Kromasil EternityXT C18、HSSPFP色谱柱，CSH C18色谱柱的材质为十八烷基硅烷键合表面带电杂化颗粒，对碱性化合物具有更优的峰型佳、灵敏度高、平衡快的特点，耐受性明显优于硅胶基质C18柱。进一步地相比CSH C18色谱柱，ClassicShell C18融合了核壳技术和高纯硅胶基体技术，该色谱柱的突出特点是柱效高，柱压低，能在中低pH条件下进行高效率分析，因此不仅在色谱分离性能上具有相同效果，而且药物检测数据的准确度更高，系统压力更低，从而具有更出色的性能。
优选地，步骤S2中，所述提取试剂为甲醇和乙腈的混合试剂，且甲醇和乙腈的混合体积比为1:0.5-2；更优选甲醇和乙腈的混合体积比为1：1,采用该比例时沉淀蛋白的效果最优，可以最大程度的除去杂质和背景基质。
所述提取试剂中还含有质量百分含量为0.05-0.2％的抗氧化剂a；更优选含有质量百分含量为0.1％的抗氧化剂a；
所述抗氧化剂a为抗坏血酸；
所述血清与提取试剂的体积比为1:5-7，更优选体积比为1:6。
优选地，步骤S2中，所述甲醇水溶液的中甲醇的质量含量为3-7％，更优选质量含量为5％；所述上清与甲醇水溶液的体积比为1:1。
优选地，步骤S3中，所述检测分析时，进行液相色谱分析采用的流动相A为含0.1-0.3％乙酸的乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈；更优选流动相A为含0.2％乙酸的乙酸铵水溶液；
所述乙酸铵水溶液中，乙酸铵的浓度为8-12mM，更优选浓度为10mM。
在前期的实验中发现，乙酸的比例不同会影响分析物的检测信号，本发明前期的实验对比考察了不同含量比例的乙酸，发现0.2％的乙酸含量能够达到最佳的检测信号且稳定。另外，乙酸铵的浓度对于色谱分离、峰型的效果影响很大，本发明前期的实验还对比考察不同浓度的乙酸铵，发现10mM能实现良好的分离效果，分析物的峰型比较对称，而且不同分析物的检测信号高且稳定。另外，采用乙酸-乙酸铵体系可以改善苯巴比妥、丙戊酸等负离子模式检测的药物的峰型，以及提高检测信号，同时兼顾了正负离子模式的药物。
优选地，采用ClassicShell C18色谱柱进行梯度洗脱的条件如实施例中的表2所示。梯度洗脱条件对这么多药物的色谱分离起到关键作用。由于不同药物的浓度要求差异很大，考虑到血清基质背景干扰的影响，需要考察不同梯度参数的分离效果，同时需结合临床快速检测的要求因此分析时间控制在6min以内。
优选地，步骤S3中，所述检测分析时，进行质谱分析的参数条件如实施例中的表3所示。
本发明在前期的实验中对梯度洗脱的条件和质谱分析的参数条件进行了优化，最终才确定了采用前述的梯度洗脱的条件和质谱分析的参数条件时，可实现78种神经精神类药物的准确检测。而在其他条件下时，会导致分离效果差、峰型拖尾、基质干扰等问题，最终检测信号不稳定、重现性差、准确度低。
优选地，所述方法还包括质控品的制备，以及将质控品采用与S1相同的处理方法得待测质控品，并进行采用液相色谱质谱联用进行检测、定值并获得待测质控品中各精神类药物的浓度的步骤。
优选地，步骤S1中，所述质控品或校准品中，各包括78种神经精神类药物、基质、抗氧化剂b；
所述基质包括人血清、牛血清、马血清、大鼠血清中的任一种；
所述抗氧化剂b在质控品或校准品中的质量含量为0.2-0.5％。
优选地，所述基质为马血清；
所述抗氧化剂b为质量比2:1:1的抗坏血酸、丁基羟基甲苯、乙二胺四乙酸；
所述质控品、校准品中，还包括质量含量为0.01-0.03％的防腐剂；所述防腐剂选自硫柳汞、庆大霉素、proclin 300中的至少一种。
优选地，所述校准品以标示浓度为自变量，以测定结果为因变量求出线性回归方程，然后计算校准曲线的相关系数(r)，运用校准曲线对待测样本、质控品进行定值，从而起到校准作用；
所述质控品测得的值用于质量控制，评估检测过程的准确度和精密度。
优选地，所述78种神经精神类药物包括15种抗癫痫药物、23种抗精神病药物和40种抗抑郁药物；
所述15种抗癫痫药物为卡马西平(Carbamazepine)、环氧卡马西平(Carbamazepine epoxide)、拉莫三嗪(lamotrigine)、左乙拉西坦(levetiracetam)、奥卡西平(oxcarbazepine)、苯巴比妥(phenobarbital)、苯妥英(phenytoin)、扑米酮(primidone)、托吡酯(topiramate)、丙戊酸(2-Propylvaleric acid)、10羟基卡马西平(10-Hydroxycarbamazepine)、氯硝西泮(Clonazepam)、拉考沙胺(Lacosamide)、吡仑帕奈(Perampanel)、唑尼沙胺(Zonisamide)；
所述23种抗精神病药物为氨磺必利(amisulpride)、氟奋乃静(anatensol)、阿立哌唑(aripiprazole)、氯丙嗪(chlorpromazine)、氯普噻吨(chlorprothixene)、氯氮平(clozapine)、脱氢阿立哌唑(dehydro aripiprazole)、氟哌噻吨(flupentixol)、氟哌啶醇(haloperidol)、洛沙平(loxapine)、鲁拉西酮(lurasidone)、奥氮平(olanzapine)、奋乃静(perphenazine)、喹硫平(quetiapine)、利培酮(risperidone)、舒必利(sulpiride)、硫利达嗪(thioridazine)、齐拉西酮(ziprasidone)、9-羟利培酮(9-hydroxyrisperidone)、N-去甲氯氮平(n-demethylclozapine)、去甲喹硫平(norquetiapine)、还原氟哌啶醇(Reduced haloperidol)、去甲奥氮平(N-demethylolanzapine)；
所述40种抗抑郁药物为阿戈美拉汀(agomelatine)、阿米替林(amitriptyline)、安非他酮(bupropion)、西酞普兰(citalopram)、氯米帕明(clomipramine)、多塞平(doxepin)、度洛西汀(duloxetine)、艾司西酞普兰(escitalopram)、氟西汀(fluoxetine)、氟伏沙明(fluvoxamine)、羟基安非他酮(hydroxybupropion)、丙米嗪(imipramine)、马普替林(maprotiline)、米安色林(mianserin)、米那普仑(milnacipran)、米氮平(mirtazapine)、吗氯贝胺(moclobemide)、去甲阿米替林(noramitriptyline)、去甲西酞普兰(norcitalopram)、去甲氯米帕明(norclomipramine)、去甲多塞平(nordoxepin)、去甲氟西汀(norfluoxetine)、去甲丙米嗪(norimipramine)、帕罗西汀(paroxetine)、瑞波西汀(reboxetine)、舍曲林(sertraline)、噻奈普汀(tianeptine)、曲唑酮(trazodone)、文拉法辛(venlafaxine)、伏硫西汀(vortioxetine)、O-去甲文拉法辛(O-Desmethylvenlafaxine)、N-去甲艾司西酞普兰(N-desmethylescitalopram)、吗氯贝胺N氧化物(moclobemide-N-Oxide)、去甲马普替林(desmethylmaprotiline)、去甲米安色林(N-desmethylmianserin)、O-去乙基瑞波西汀(O-desethylreboxetine)、去甲基舍曲林(N-desmethylsertraline)、N-去甲米氮平(N-demethylmirtazapine)、N-去甲文拉法辛(N-desmethylvenlafaxine)、间氯苯基哌嗪(M-Chlorophenylpiperazine)。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明首次提供了一种可同时检测15种抗癫痫药物、23中抗精神病药物和40种抗抑郁药物浓度的方法，大大提高了检测通量和效率。
2、本发明通过采用甲醇、乙腈或甲醇乙腈混合试剂作为提取试剂，有效去除血清基质蛋白成分，充分提取与蛋白结合的药物，操作简便。并进一步通过在提取试剂中加入特定抗氧化剂，确保血清基质样本中药物在提取、在机检测过程的稳定性，提高了检测结果的准确性。
3、通过采用本发明选取的色谱柱、流动相、梯度洗脱参数、质谱参数，对于15种抗癫痫药物、23种抗精神病药物、40种抗抑郁药物均能实现有效分离和检测，不需更换色谱柱、流动相，提高仪器使用的效率。
4、本发明进一步通过采用包含78种神经精神类药物的质控品和校准品，通过采用动物来源的血清代替人血来源的血清作为基质，基质效应小，来源易获得，实现了低成本生产，方便临床的应用；进一步通过添加特定的抗氧化剂，可使制备的质控品和/或校准品具有高度的稳定性，有效消除了质谱检测血清样本的神经精神类药物过程中产生的基质效应，显著提高了质谱检测的准确性和室内精密度，为质谱检测精神治疗药物技术的产业化和广泛应用解决了技术瓶颈。
5、本发明方法设置的质谱参数，每种药物均能获得很好的检测信号，不同类别的药物不存在交叉干扰，准确度高、特异性强。该方法可以满足临床用户在测试不同种类药物联合治疗患者时进行血药浓度监测的需求。
6、本发明的方法能覆盖浓度水平差异很大的药物种类，检测浓度范围大。抗精神病药物含量较低，一般ng/ml级别，甚至pg/ml级别，比如奋乃静定量限仅有0.12ng/ml；而抗癫痫药物含量很高，一般μg/ml级别，比如丙戊酸最高浓度达到150μg/ml。因此同时上样检测时，需要两者均兼顾。
7、本发明的检测系统压力更低，重现性更好，适合常规液相色谱系统。ClassicShell C18色谱柱融合了核壳技术和Kromasil高纯硅胶基体技术，该色谱柱的突出特点是柱效高，柱压低，能在中低pH条件下进行高效率分析。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为中浓度质控品中1-10种药物的检测图谱；
图2为中浓度质控品中11-20种药物的检测图谱；
图3为中浓度质控品中21-30种药物的检测图谱；
图4为中浓度质控品中31-40种药物的检测图谱；
图5为中浓度质控品中41-50种药物的检测图谱；
图6为中浓度质控品中51-63种药物的检测图谱；
图7为中浓度质控品中64-78种药物的检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供了一种同时监测78种神经精神类药物的方法，包括以下步骤：
1)制备质控品和标准品
1.1准确称取15种抗癫痫药物、23种抗精神病药物、40种抗抑郁药物，并采用甲醇溶解，得到表1所示浓度的各药物标准母液。
1.2移取表1中各药物标准母液体积与55μL 50％甲醇水溶液混合，得到包含全部药物的混合标准溶液1，其中各药物浓度如表1中所示。
1.3将20μL混合标准溶液1与980μL 50％甲醇水溶液混合，得混合标准溶液2，其中的各药物浓度如表1中所示。
表1
Figure BDA0003655298410000071
Figure BDA0003655298410000081
Figure BDA0003655298410000091
Figure BDA0003655298410000101
1.4将混合标准溶液1分别用50％甲醇水溶液稀释8倍、4倍和1.25倍，分别得到相应的低浓度质控混合标液、中浓度质控混合标液和高浓度质控混合标液。
1.5将上述的质控混合标液与马血清混合，再加入含抗氧化剂b(包括浓度为0.02g/ml的抗坏血酸、浓度为0.01g/ml的丁基羟基甲苯、浓度为0.01g/ml的丁基羟基甲苯)和防腐剂(浓度为0.002g/ml的硫柳汞)的混合溶液，各质控混合标液与马血清、含抗氧化剂b和防腐剂的混合溶液的体积比为5:90:5，混匀(总体积100ml)后得到相应的低浓度质控品L、中浓度质控品M和高浓度质控品H(各抗氧化剂b在质控品中的质量含量为0.2％、防腐剂在质控品中的质量含量为0.01％)。
1.6将混合标准溶液1、混合标准溶液2分别与马血清混合，再加入与步骤1.5相同的含抗氧化剂b和防腐剂的混合溶液，混合的体积比与步骤1.5相同，得到不同水平的校准品Cal-1、Cal-6；然后将校准品Cal-6、Cal-1分别按照1:19、1:3、1:1、3:1的体积比例混合配制得到其他不同水平的校准品Cal-2、Cal-3、Cal-4、Cal-5。
2)分别取50μL步骤1)制备的各质控品和校准品至离心管中，加入300μL甲醇乙腈混合试剂(含0.1％抗坏血酸，甲醇与乙腈的体积比为1:1)，涡旋混匀，4℃16000g高速离心10min，取100μL上清至收集板，加入100μL 5％甲醇水溶液，混匀，备用。
3)将步骤2)制得的各样本溶液置于进样器中，调出色谱分离的梯度洗脱参数文件、质谱参数文件，对各样本溶液进行检测。
采用的具体液相分析条件为：采用ClassicShell C18色谱柱(2.1*50mm,2.5μm)(Kromasil)，采用的流动相A为含0.2％乙酸的乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，其中乙酸铵浓度为10mM。采用的流动相梯度条件为表2所示。
表2
Figure BDA0003655298410000102
Figure BDA0003655298410000111
采用的质谱分析条件如表3所示。
表3
Figure BDA0003655298410000112
Figure BDA0003655298410000121
Figure BDA0003655298410000131
Figure BDA0003655298410000141
Figure BDA0003655298410000151
Figure BDA0003655298410000161
其中所得包含78种药物的中浓度质控品M的检测图谱如图1-图7所示。
以校准品的标示浓度为自变量、测定结果为因变量求出线性回归方程，然后计算校准曲线的相关系数(r)，运用校准曲线对质控品进行定值，即得到质控品中各药物的浓度值。
5)均匀性检测
分别随机抽取步骤1)方法制备的每个水平校准品各10支、每个水平质控品各10支进行测试，计算检测结果的均值和CV，均匀性应<15％，结果如表4所示。
表4
Figure BDA0003655298410000162
Figure BDA0003655298410000171
6)准确度分析
分别随机抽取每个水平校准品各3支、每个水平质控品各3支，对其进行浓度检测，各浓度水平的药物检测值与靶值的偏差均满足在15％范围内，准确度结果如表5所示。
表5
Figure BDA0003655298410000172
Figure BDA0003655298410000181
Figure BDA0003655298410000191
Figure BDA0003655298410000201
实施例2
本实施例考察了采用不同血清基质制备的校准品对检测效果的影响。校准品的制备方法为：
1)将实施例1得到的混合标准溶液1、混合标准溶液2分别用人血清、牛血清、马血清、大鼠血清按照1:19体积比例混合，分别得到相应的不同血清基质的、不同水平的校准品Cal-6、Cal-1。校准品Cal-6、Cal-1分别按照1:19、1:3、1:1、3:1的体积比例混合配制得到不同血清基质的、其他不同水平的校准品Cal-2、Cal-3、Cal-4、Cal-5。
2)采用与实施例1相同的方法进行检测分析，配制的不同血清基质校准品的线性相关系数和浓度偏差的检测结果如表6所示，结果表明：不同血清基质配制的校准品的线性相关系数r以及浓度偏差均符合要求,其中马血清的偏差更小。
表6
Figure BDA0003655298410000202
Figure BDA0003655298410000211
Figure BDA0003655298410000221
Figure BDA0003655298410000231
此外，本实施例还考察了加入不同血清基质制备的质控品的浓度偏差和基质效应，其结果也显示了采用马血清的浓度偏差更小、基质效应更小。
实施例3
本实施例考察了采用不同抗氧化剂b制备质控品的稳定性。采用实施例1的步骤1)中的相同制备方法，配制采用表7所示不同组合的抗氧化剂b的中浓度质控品。然后将其冷冻干燥(冷冻干燥采用的具体条件为：预冻温度设置-50℃，持续时间300min；一次干燥温度设置-30℃，持续时间1200min,压力维持0.2mbar；解析干燥温度设置-30℃，持续时间360min，压力维持0.3mbar)即得相应的采用不同抗氧化剂组的质控品组1-7；同时还制备仅未添加抗氧化剂组的质控品组8。
将所得质控品组分别放置于37℃恒温箱进行加速实验，经液相色谱-串联质谱系统检测，考察质控品在37℃条件下保存1天、3天、5天、7天的稳定性情况。结果如表6所示，结果表明，质控品3(采用抗氧化剂组3制备)的检测值变化较小，稳定性良好。
表7
Figure BDA0003655298410000232
Figure BDA0003655298410000241
表8
Figure BDA0003655298410000242
Figure BDA0003655298410000251
Figure BDA0003655298410000261
实施例4
本实施例考察了提取试剂中添加抗氧化剂a的药物在机稳定性。采用实施例3中的质控品3作为待测样本。将质控品3采用实施例1中步骤2)的方法进行处理(分别采用表9所示含不同质量百分含量的抗坏血酸的甲醇乙腈混合试剂)，然后采用步骤3)的方法经液相色谱-串联质谱系统检测，考察质控品在自动进样器10℃条件下72小时内的稳定性情况。测试结果如表10所示，采用考察组1的含0.1％抗坏血酸的甲醇乙腈混合试剂处理的质控品的检测值变化较小，在机稳定性良好。该结果表明在提取试剂中加入特定含量的抗氧化剂a能使所需药物的稳定性得到改善。
表9
考察组 1 2 3 4
抗坏血酸质量百分含量 0.1％ 1％ 0.01％ 0
表10
Figure BDA0003655298410000271
Figure BDA0003655298410000281
Figure BDA0003655298410000291
对比例1
本对比例提供了一种同时监测78种神经精神类药物的方法，步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于：本对比例中采用CSH C18色谱柱(2.1*50mm,1.7um)代替实施例1中的ClassicShell C18色谱柱。本对比例测试得到质控品偏差结果如表11所示。根据表11与实施例1中的表5中质控品偏差结果对比可见，ClassicShell C18色谱柱可更好实现覆盖ng到μg级别含量差异较大的药物的同时定量检测，如高浓度的丙戊酸、低浓度的氟奋乃静、氟哌噻吨、氟哌啶醇、奋乃静，其偏差均明显低于CSH C18色谱柱。此外，采用CSH C18色谱柱分离同分异构体的效果差于ClassicShell C18色谱柱(如ClassicShell C18色谱柱可实现奥卡西平与环氧卡马西平的分离，而采用CSH C18色谱柱无法实现)。
表11
Figure BDA0003655298410000301
Figure BDA0003655298410000311
应用实施例
采用实施例1相同的方法，对20例患者血清中治疗药物的浓度进行检测，并通过检测校准品的标示浓度为自变量，测定结果为因变量求出线性回归方程，然后计算校准曲线的相关系数(r)，运用校准曲线对检测结果进行定值，得到的药物浓度结果如表12、表13所示。检测结果显示，通过与神经精神药理学治疗药物监测共识指南(2017版)(简称：AGNP指南)的治疗浓度范围进行对比，血药浓度值与临床治疗的效果一致，由此可见准确定量血药浓度对于辅助临床医生进行治疗药物浓度监测起到了关键作用。
表12为应用建立的检测方法对10例服用抗癫痫药物的患者进行血药浓度分析。根据ANGP指南的治疗浓度范围，多数患者体内抗癫痫药物未达到该浓度范围内，有1位患者体内丙戊酸含量超出治疗浓度范围。这些检测结果可以帮助医生准确掌握患者体内的药物类型和血药浓度，从而为给患者进行精准用药提供依据。在检测过程中还发现，医生为某位患者开具了左乙拉西坦、丙戊酸钠、拉莫三嗪3种药物的处方，但这位患者体内除这3种药物外，还检出了较高含量的氯硝西泮。在治疗过程中，医生往往不能完全掌握患者曾经的用药情况，开药时往往可能发生用药种类重复、用药剂量大、联合用药产生不良反应等问题，而本方法能够同时筛查15种抗癫痫药物，便于了解患者之前的用药史，从而帮助医生根据患者之前的用药情况更有针对性地进行治疗。
表13为应用建立的检测方法对10例服用抗精神病药物以及抗抑郁药物的患者进行血药浓度分析。根据ANGP指南的治疗浓度范围，患者体内药物浓度均能达到该浓度范围内，并且提供了原药及其代谢物的浓度值，可以帮助医生准确掌握患者体内药物的代谢情况。
表12 10例抗癫痫药物患者样本检测结果
Figure BDA0003655298410000321
备注：/是未检测到；*是低于治疗浓度范围；#是高于治疗浓度范围。
表13 10例抗精神病药物以及抗抑郁药物患者样本检测结果
Figure BDA0003655298410000322
Figure BDA0003655298410000331
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种液相色谱质谱联用法同时定量检测78种神经精神类药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、待测全血样品前处理：将待测全血样品进行离心后，得到的血清加入提取试剂，涡旋混匀，然后离心，取上清至收集板，再加入甲醇水溶液混匀，得待测样品；
S2、制备校准品，将校准品采用与S1相同的处理方法，得待测校准品；
S3、将步骤S1得到的待测样品和步骤S2得到的待测校准品均采用液相色谱质谱联用进行检测，以校准品的检测结果绘制校准曲线，并对待测样品进行定值，获得待测样品中各神经精神类药物的浓度；
其中，步骤S3中，采用液相色谱质谱联用进行检测分析时，进行液相分析采用的色谱柱为ClassicShell C18色谱柱；
步骤S2中，所述提取试剂为甲醇和乙腈的混合试剂，且甲醇和乙腈的混合体积比为1:0.5-1:2；
所述提取试剂中还含有质量百分含量为0.05-0.2%的抗氧化剂a；
所述抗氧化剂a为抗坏血酸；
所述方法还包括质控品的制备，以及将质控品采用与S1相同的处理方法得待测质控品，并采用液相色谱质谱联用进行检测、定值并获得待测质控品中各精神类药物的浓度的步骤；
所述校准品或质控品中，各包括78种神经精神类药物、基质、含抗氧化剂b和防腐剂的混合溶液；所述基质为马血清；所述抗氧化剂b为浓度0.02g/ml的抗坏血酸、浓度0.01g/ml的丁基羟基甲苯、浓度0.01g/ml的乙二胺四乙酸的组合；所述含抗氧化剂b和防腐剂的混合溶液在质控品或校准品中的体积占比为5%；
所述78种神经精神类药物包括15种抗癫痫药物、23种抗精神病药物和40种抗抑郁药物；
所述15种抗癫痫药物为卡马西平、环氧卡马西平、拉莫三嗪、左乙拉西坦、奥卡西平、苯巴比妥、苯妥英、扑米酮、托吡酯、丙戊酸、10-羟基卡马西平、氯硝西泮、拉考沙胺、吡仑帕奈、唑尼沙胺；
所述23种抗精神病药物为氨磺必利、氟奋乃静、阿立哌唑、氯丙嗪、氯普噻吨、氯氮平、脱氢阿立哌唑、氟哌噻吨、氟哌啶醇、洛沙平、鲁拉西酮、奥氮平、奋乃静、喹硫平、利培酮、舒必利、硫利达嗪、齐拉西酮、9-羟利培酮、N-去甲氯氮平、去甲喹硫平、还原氟哌啶醇、去甲奥氮平；
所述40种抗抑郁药物为阿戈美拉汀、阿米替林、安非他酮、西酞普兰、氯米帕明、多塞平、度洛西汀、艾司西酞普兰、氟西汀、氟伏沙明、羟基安非他酮、丙米嗪、马普替林、米安色林、米那普仑、米氮平、吗氯贝胺、去甲阿米替林、去甲西酞普兰、去甲氯米帕明、去甲多塞平、去甲氟西汀、去甲丙米嗪、帕罗西汀、瑞波西汀、舍曲林、噻奈普汀、曲唑酮、文拉法辛、伏硫西汀、O-去甲文拉法辛、N-去甲艾司西酞普兰、吗氯贝胺 N 氧化物、去甲马普替林、去甲米安色林、O-去乙基瑞波西汀、去甲基舍曲林、N-去甲米氮平、N-去甲文拉法辛、间氯苯基哌嗪；
步骤S3中，所述检测分析时，进行液相色谱分析采用的流动相A为含0.1-0.3%乙酸的乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈；
所述乙酸铵水溶液中，乙酸铵的浓度为8-12mM；
采用所述ClassicShell C18色谱柱进行梯度洗脱的条件为：
Figure 595440DEST_PATH_IMAGE002
；
步骤S3中，所述检测分析时，进行质谱分析的参数条件为：
Figure 840477DEST_PATH_IMAGE004
Figure 213689DEST_PATH_IMAGE006
Figure 77740DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE010
Figure DEST_PATH_IMAGE012
Figure DEST_PATH_IMAGE014
。
2.根据权利要求1所述的液相色谱质谱联用法同时定量检测78种神经精神类药物的方法，其特征在于，步骤S2中，所述血清与提取试剂的体积比为1:5-7。
3.根据权利要求1所述的液相色谱质谱联用法同时定量检测78种神经精神类药物的方法，其特征在于，步骤S2中，所述甲醇水溶液的中甲醇的质量含量为3-7%；所述上清与甲醇水溶液的体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的液相色谱质谱联用法同时定量检测78种神经精神类药物的方法，其特征在于，所述校准品或质控品中，所述防腐剂的浓度为0.002g/ml；所述防腐剂选自硫柳汞、庆大霉素、proclin 300中的至少一种。
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