CN106770857A - 一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，通过利用基于高分辨质谱的代谢组学平台，全面准确测定生物样本中内源性小分子代谢物，根据得到代谢谱数据结合单变量、多变量统计学方法，筛选出不同样本之间以及不同组别之间的差异代谢物，利用三个样本之间所共有的差异代谢物，通过比较血浆样本与脑组织样本中化合物的相关性，以此作为利用血浆标志物反应脑组织中代谢组改变的依据；同时以模型组和对照组作为训练集构建模型，给药组作为验证集测试模型的预测能力，以此作为利用血浆代谢组的改变评价抑郁程度的指标，解决了传统行为学实验不可控因素较多、准备较复杂、动物主观性较强的难题。

Description

一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法

技术领域

本发明涉及动物模型抑郁程度定量评价的新方法，具体涉及一种基于超高效液相串联高分辨静电场轨道阱质谱代谢组学平台定量检测大鼠体内多样本中的内源性小分子代谢物，采用单变量和多变量统计处理方法分析数据构建数学模型，比较代谢组改变与行为学实验结果来定量评价抑郁程度的实验方法，即一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法。

背景技术

大量的研究表明，抑郁症患者机体内出现了显著地生理、生化以及组织的异常改变，但是由于抑郁症病因的复杂多样性，因此对于这些异常的深入研究并未取得突破，造成这一现象的主要原因是无法将这些异常与病程相关联，因此通过建立恰当的动物模型对探究抑郁的病因、病理过程以及评价药物的干预效果极为重要。现有技术中对于抑郁动物模型是否成功建立的评价标准主要依靠各种粗略而非精确、片面而非全面的行为学指标进行评价，这些方法的具体不足主要体现在：出现差异时间较长，实验操作准备复杂，人工工作量较大，并且动物具有一定主观随意性，使得结果具有一定的不确定性，进而导致实验的可重现性较差，因此许多基于行为学指标来评价抑郁程度的研究无法在早期进行干预，对结果有一定影响。

对于机体，内源性小分子代谢物是生命活动的基础之一，由于种种因素所引起的机体内环境改变最终会在体内代谢组(内源性小分子代谢物的总称)上得到体现。因此，利用恰当的代谢组学分析平台捕捉到这些代谢组的改变，进而能够系统而全面地研究机体在各种应激下代谢物在不同时间点的变化规律。利用高分辨的质谱仪能够极为灵敏的捕捉到体内代谢组的微小改变，一次性同时监测生物样本中成百上千个分子量小于1000Da的小分子代谢物，以UPLC-Orbitrap MS检测为例，由于其极高的灵敏度与分辨率，能够对包含氨基酸、糖类、胺类、脂类、神经递质类小分子做出准确的定性以及定量分析，因此能够深入探究机体受到外源性应激后，与生命活动息息相关的能量代谢、糖代谢脂质代谢改变，客观、系统而全面的反映出机体状态。迄今为止，还没有利用代谢组学平台结合统计学方法构建模型并利用代谢组的改变来客观准确评价动物模型抑郁程度的报道。

发明内容

1、要解决的问题

本发明要解决的技术问题是提供一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，通过利用基于高分辨质谱的代谢组学平台，全面准确测定生物样本中内源性小分子代谢物，根据得到的经过恰当前处理的代谢谱数据结合单变量、多变量统计学方法，筛选出不同样本之间以及不同组别之间的差异代谢物，利用三个样本之间所共有的差异代谢物，通过比较血浆样本与脑组织样本中化合物的相关性，以此作为利用血浆标志物反应脑组织中代谢组改变的依据；同时以模型组和对照组作为训练集构建模型，给药组作为验证集测试模型的预测能力，以此作为利用血浆代谢组的改变评价抑郁程度的指标，解决了传统行为学实验不可控因素较多、准备较复杂、动物主观性较强的难题。

2、技术方案

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于包括如下步骤：

S1模型构建与评价：将实验动物分为对照组，慢性温和不可预知应激(ChronicUnpredictable Mild Stress,CUMS)模型组，盐酸帕罗西汀抗抑郁阳性给药组三组，进行长期应激造模处理，造模过程中结合进行行为学实验对模型的构建进行评价；

S2样本采集和处理：所有动物接受步骤S1所述行为学实验后，分别对所述三组动物采用甲醇沉淀蛋白的方法对各自血浆样本进行前处理及对脑组织中的小分子代谢物进行提取，并最终收集血浆、海马和前额皮层样本；

S3样品分析：采用代谢组学平台对血浆、海马和前额皮层样本进行非靶标性代谢轮廓分析获得代谢组学数据；

S4数据处理：应用SIEVE软件对代谢组学数据进行预处理后，将其导入SIMCA-P13.0软件进行模式判别分析，再应用R语言包和SPSS17.0软件对数据进行单变量和多变量数据分析；

S5模式判别分析以及数学模型的建立：采用训练集建模，测试集验证的方式，判断代谢组的改变与抑郁程度的联系，建立以代谢组来评价抑郁程度的方法。

优选地，步骤S1中所述行为学实验的具体方法为：

S11、模型构建及分组：实验动物随机分为三组：对照组，慢性温和不可预知应激(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)模型组，盐酸帕罗西汀抗抑郁阳性给药组三组；

S12、应激造模处理：除了对照组外，所有动物接受包括20h禁水，20h禁食，20h禁水禁食，潮湿垫料(将300mL水倒入大鼠垫料，充分混合至垫料基本潮湿)，同笼饲养，4h白噪音刺激，3h频闪光刺激，45°倾斜饲养笼，昼夜颠倒在内的长期慢性温和应激过程，每天随机给予一种应激并且3天之内不得重复，保证应激的不可预知性；

S13、模型构建成功的判定：在经过三周上述造模后，行为学糖水偏好实验结果明显降低视为模型已经初步构建成功，抑郁样行为已经出现。

优选地，步骤S13中所述行为学糖水偏好实验具体为：由于啮齿类动物天生偏好甜食，适当给予糖水对其意味着奖赏行为，而经过应激后大鼠出现抑郁症状，对奖赏行为的反馈减退，因此能评估抑郁程度；处理方法如下，经过20小时禁水禁食之后，所有动物被转移至安静无压力的环境，每笼一只大鼠，并且每个笼子内均有两种不同的饮用水，一种为1％蔗糖水溶液，另一种为普通饮用水；每只大鼠都确保能够自由饮水，在无应激的环境中接受时长为2小时的测试，测试结束后取走两瓶饮用水并进行称重以计算两种饮用水的摄入量；

根据以下公式计算每只大鼠的糖水偏好值

蔗糖偏好＝1％蔗糖水摄入量/(1％蔗糖水摄入量+普通水摄入量)×100％。

优选地，步骤S2中所述样本采集和处理包括样本采集前处理、样本采集及样本处理；

所述样本采集前处理具体为：对盐酸帕罗西汀抗抑郁阳性给药组每天接受10mg/kg剂量的盐酸帕罗西汀灌胃处理，其余动物接受等体积生理盐水灌胃，再次造模以及药物抗抑郁干预3周；

所述样本采集具体为：所有动物接受行为学实验后，以腹腔注射水合氯醛麻醉，首先通过门静脉以抗凝管采集外周血，然后充分震荡，使血液与抗凝剂充分混匀，对抗凝管中的血液样本，首先在3000rpm低速离心15分钟，分离血浆与血细胞，吸取上层血浆后分装至多个1.5mLEP管内，转移至-80℃冰箱保存；血样采集完成后，动物快速断头处死，以4℃超纯水冲洗脑组织中血块，除去多余肌肉、脂类物质后，快速分离前额皮层以及海马组织，称重后将前额皮层以及海马组织放入标记过的2.0mL冷冻管中，液氮速冻后转移至-80℃冰箱保存；

所述样本处理具体为：

血浆样本具体处理方法为从-80℃冰箱中取出分装后装有上层血浆样本的的LEP小管，于室温解冻，涡旋混匀，取出500μL上层血浆样品以1:3(v/v)的比例加入甲醇并且在4℃，12000rpm高速冷冻离心20分钟，除去大分子蛋白类物质，取出500μL上清液进一步加入1.5mL超纯水(1:3，v/v)稀释，转移到进样小瓶中等待测定；

前额皮层以及海马组织样本具体处理方法为从-80℃冰箱中取出分装后装有前额皮层以及海马组织样本的冷冻管，于室温解冻后，取出组织，用消毒过的手术剪剪取20mg样本转移至2mL离心管内，向其中加入1mL提取液；混合物充分混匀后，加入洗净消毒后的小钢珠一颗，将离心管放入Tissuelyser组织匀浆机，以50Hz的振动频率充分匀浆15分钟；待脑组织完全匀浆后，匀浆在4℃，12000rpm高速冷冻离心10分钟从而去除大分子蛋白类物质，离心后吸取200μL上清液转移至带内衬管的进样小瓶中等待测定。

优选地，所述抗凝管为用肝素钠抗凝的真空管；所述提取液包括按体积比为2:5:2的水、乙腈和三氯甲烷。

优选地，步骤S3中所述代谢组学平台为为Ultimate3000-Orbitrap MS戴安超高效液相色谱串联静电场轨道阱高分辨质谱仪；

其色谱条件为色谱分离柱为粒径是1.9μm Hypersile C₁₈色谱柱(100mm×2.1mm)，柱温维持在40℃；流动相A：含有0.1％甲酸的超纯水；流动相B：含有0.1％甲酸的乙腈，流动相A和B的流速为0.4mL/min；自动进样器样品盘温度为4℃，进样体积为5μL；流动相A和B的梯度洗脱程序见下表：

流动相梯度洗脱程序

其质谱条件为：采用加热型电喷雾离子源(HESI)，正负离子切换同时扫描(+)/(-)，毛细管电离电压为+2.5kV/-3.5kV，毛细离子传输管温度为300℃；鞘气流速为50au；辅助气流速为10au；吹扫气流速为2au；分辨率为70,000；扫描离子范围为70-1050amu；AGCtarget为5E6。

优选地，步骤S3中所述非靶标性代谢轮廓分析具体为：以三个样本为一个集合，每个集合中包含一个对照组样本、一个模型组样本、一个给药组样本，每个样本均随机抽取，从而减少由仪器分析波动所引起的组间差异；在分析过程中，每十个样品后插入一个质控样的分析，以监测仪器运行状况，确保仪器的稳定性和重现性，保证结果的可靠性；同时，质谱仪每天以校正液进行正负离子质量轴校正，保证结果的准确性。

优选地，步骤S4具体为：首先对采集到的代谢组学质谱数据在SIEVE软件中进行背景扣除、峰匹配对齐、基峰校正以及归一化处理后，得到可以被统计学软件分析的包含变量编号、信号强度以及组别的并由精确质量数、保留时间以及峰面积组成的三维数据表。

优选地，步骤S5具体包括：

S51、以血浆代谢组反映脑组织改变的可行性评估，具体是将所得三维数据表导入SIMCA-P13.0软件进行模式判别分析构建模型，获取模型参数以及样本在多位数学模型中的分布情况，所述判别分析包括主成分分析法(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)法；另外再结合R语言2.11.1和SPSS17.0软件对所得三维数据表进行单变量统计分析筛选出不同组别之间的差异代谢物，选择三个样本中所共有的代谢物并将代谢组进行简化，利用相关性分析评价血浆代谢组改变与脑组织代谢组改变的相关性，评估以血浆代谢组反映脑组织改变的可行性；

S52、代谢组评价抑郁程度的方法，具体是对步骤S51中简化的代谢组在多样本间的相对含量进行二元Logistic回归分析，然后再以对照组和模型组数据集作为训练集构建新的PLS-DA模型，新模型中，横坐标为实际的行为学实验结果，纵坐标为根据训练集数据所拟合出的结果，以给药组的数据集作为测试集来验证通过代谢组来评价抑郁程度的可靠性。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明利用基于高分辨质谱的代谢组学平台，全面准确测定生物样本中内源性小分子代谢物，根据得到的经过恰当前处理的代谢谱数据结合单变量、多变量统计学方法，筛选出不同样本之间以及不同组别之间的差异代谢物，利用三个样本之间所共有的差异代谢物，通过比较血浆样本与脑组织样本中化合物的相关性，以此作为利用血浆标志物反应脑组织中代谢组改变的依据；同时以模型组和对照组作为训练集构建模型，给药组作为验证集测试模型的预测能力，以此作为利用血浆代谢组的改变评价抑郁程度的指标，解决了传统行为学实验不可控因素较多、准备较复杂、动物主观性较强的难题；

(2)本发明利用代谢组学研究结果可以更加全面、综合反映出机体的代谢改变，评价抑郁状况，避免一些指标只能初步、单一反映疾病状态的问题；

(3)本发明以血浆代谢组学研究结果与脑组织中的代谢组改变相一致，因此加深了以相对较容易采集的血浆的代谢组研究，避免脑组织活检以及脑脊液提取的有创性以及侵入性，增加了临床上运用的意义；

(4)本发明利用代谢组学研究结果可以实时定量的反映出动物的抑郁程度，增强了客观性、实时性和准确性，避免了行为学实验复杂的准备工作以及动物的主观性的问题；

(5)本发明利用高分辨代谢组学平台，能够检测到体内大量的小分子代谢物，并以此为基础评价机体的代谢状态。当受到外源性应激，抑郁程度加重时，整体代谢谱发生明显改变，当经过给药治疗后，代谢谱改变减小并且有向正常状态靠拢的趋势。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明所述简化的代谢组在各样本间的相对含量分布图；

图2是本发明中所述血浆中代谢物与脑组织中代谢组的二元Logistic回归分析图；

图3是本发明中所述对照组、模型组和模型给药组的主成分分析的分散点图；

图4是本发明中所述行为学实验中所有动物在不同时间点的各组糖水偏好值分析图；

图5是本发明以训练集构建PLS-DA模型，将测试集放入模型进行验证的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，包括如下步骤：

S1模型构建与评价：将实验动物分为对照组，慢性温和不可预知应激(ChronicUnpredictable Mild Stress,CUMS)模型组，盐酸帕罗西汀抗抑郁阳性给药组三组，进行长期应激造模处理，造模过程中结合进行行为学实验对模型的构建进行评价；

S2样本采集和处理：所有动物接受步骤S1所述行为学实验后，分别对所述三组动物采用甲醇沉淀蛋白的方法对各自血浆样本进行前处理及对脑组织中的小分子代谢物进行提取，并最终收集血浆、海马和前额皮层样本；

S3样品分析：采用代谢组学平台对血浆、海马和前额皮层样本进行非靶标性代谢轮廓分析获得代谢组学数据；

S4数据处理：应用SIEVE软件对代谢组学数据进行预处理后，将其导入SIMCA-P13.0软件进行模式判别分析，再应用R语言包和SPSS17.0软件对数据进行单变量和多变量数据分析；

S5模式判别分析以及数学模型的建立：采用训练集建模，测试集验证的方式，判断代谢组的改变与抑郁程度的联系，建立以代谢组来评价抑郁程度的方法。

步骤S1中所述行为学实验的具体方法为：

S11、模型构建及分组：实验动物随机分为三组：对照组，慢性温和不可预知应激(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)模型组，盐酸帕罗西汀抗抑郁阳性给药组三组；

S12、应激造模处理：除了对照组外，所有动物接受包括20h禁水，20h禁食，20h禁水禁食，潮湿垫料(将300mL水倒入大鼠垫料，充分混合至垫料基本潮湿)，同笼饲养，4h白噪音刺激，3h频闪光刺激，45°倾斜饲养笼，昼夜颠倒在内的长期慢性温和应激过程，每天随机给予一种应激并且3天之内不得重复，保证应激的不可预知性；

S13、模型构建成功的判定：在经过三周上述造模后，行为学糖水偏好实验结果明显降低视为模型已经初步构建成功，抑郁样行为已经出现。

步骤S13中所述行为学糖水偏好实验具体为：行为学指标主要为蔗糖偏好实验，其被认为是评价啮齿类动物快感减退行为的一个良好标准，由于啮齿类动物天生偏好甜食，适当给予糖水对其意味着奖赏行为，而经过应激后大鼠出现抑郁症状，对奖赏行为的反馈减退，因此能评估抑郁程度；处理方法如下，经过20小时禁水禁食之后，所有动物被转移至安静无压力的环境，每笼一只大鼠，并且每个笼子内均有两种不同的饮用水，一种为1％蔗糖水溶液，另一种为普通饮用水；每只大鼠都确保能够自由饮水，在无应激的环境中接受时长为2小时的测试，测试结束后取走两瓶饮用水并进行称重以计算两种饮用水的摄入量；

根据以下公式计算每只大鼠的糖水偏好值

蔗糖偏好＝1％蔗糖水摄入量/(1％蔗糖水摄入量+普通水摄入量)×100％。

所述行为学实验中所有动物在不同时间点的各组糖水偏好值分析如图4所示。

步骤S2中所述样本采集和处理包括样本采集前处理、样本采集及样本处理；

所述样本采集前处理具体为：对盐酸帕罗西汀抗抑郁阳性给药组每天接受10mg/kg剂量的盐酸帕罗西汀灌胃处理，其余动物接受等体积生理盐水灌胃，再次造模以及药物抗抑郁干预3周；

所述样本采集具体为：所有动物接受行为学实验后，以腹腔注射水合氯醛麻醉，首先通过门静脉以抗凝管采集外周血，然后充分震荡，使血液与抗凝剂充分混匀，对抗凝管中的血液样本，首先在3000rpm低速离心15分钟，分离血浆与血细胞，吸取上层血浆后分装至多个1.5mLEP管内，转移至-80℃冰箱保存；血样采集完成后，动物快速断头处死，以4℃超纯水冲洗脑组织中血块，除去多余肌肉、脂类物质后，快速分离前额皮层以及海马组织，称重后将前额皮层以及海马组织放入标记过的2.0mL冷冻管中，液氮速冻后转移至-80℃冰箱保存；

所述样本处理具体为：

血浆样本具体处理方法为从-80℃冰箱中取出分装后装有上层血浆样本的的LEP小管，于室温解冻，涡旋混匀，取出500μL上层血浆样品以1:3(v/v)的比例加入甲醇并且在4℃，12000rpm高速冷冻离心20分钟，除去大分子蛋白类物质，取出500μL上清液进一步加入1.5mL超纯水(1:3，v/v)稀释，转移到进样小瓶中等待测定；

前额皮层以及海马组织样本具体处理方法为从-80℃冰箱中取出分装后装有前额皮层以及海马组织样本的冷冻管，于室温解冻后，取出组织，用消毒过的手术剪剪取20mg样本转移至2mL离心管内，向其中加入1mL提取液(水/乙腈/三氯甲烷，2:5:2，v/v/v)；混合物充分混匀后，加入洗净消毒后的小钢珠一颗，将离心管放入Tissuelyser组织匀浆机，以50Hz的振动频率充分匀浆15分钟；待脑组织完全匀浆后，匀浆在4℃，12000rpm高速冷冻离心10分钟从而去除大分子蛋白类物质，离心后吸取200μL上清液转移至带内衬管的进样小瓶中等待测定。

所述抗凝管为用肝素钠抗凝的真空管。

步骤S3中所述代谢组学平台为Ultimate 3000-Orbitrap MS戴安超高效液相色谱串联静电场轨道阱高分辨质谱仪。

其色谱条件为色谱分离柱为粒径是1.9μm Hypersile C₁₈色谱柱(100mm×2.1mm)，柱温维持在40℃；流动相A：含有0.1％甲酸的超纯水；流动相B：含有0.1％甲酸的乙腈，流动相A和B的流速为0.4mL/min；自动进样器样品盘温度为4℃，进样体积为5μL；流动相A和B的梯度洗脱程序见下表：

表 流动相梯度洗脱程序

其质谱条件为：采用加热型电喷雾离子源(HESI)，正负离子切换同时扫描(+)/(-)，毛细管电离电压为+2.5kV/-3.5kV，毛细离子传输管温度为300℃；鞘气流速为50au；辅助气流速为10au；吹扫气流速为2au；分辨率为70,000；扫描离子范围为70-1050amu；AGCtarget为5E6。

步骤S3中所述非靶标性代谢轮廓分析具体为：以三个样本为一个集合，每个集合中包含一个对照组样本、一个模型组样本、一个给药组样本，每个样本均随机抽取，从而减少由仪器分析波动所引起的组间差异；在分析过程中，每十个样品后插入一个质控样的分析，以监测仪器运行状况，确保仪器的稳定性和重现性，保证结果的可靠性；同时，质谱仪每天以校正液进行正负离子质量轴校正，保证结果的准确性。

步骤S4具体为：首先对采集到的代谢组学质谱数据在SIEVE软件中进行背景扣除、峰匹配对齐、基峰校正以及归一化处理后，得到可以被统计学软件分析的包含变量编号、信号强度以及组别的并由精确质量数、保留时间以及峰面积组成的三维数据表。

对于信息的提取，主要是将高分辨代谢组学仪器平台所采集到的原始图谱数据通过软件处理，使之转化为可以被统计学软件分析的数据，主要包括背景扣除，基峰校正，峰对齐匹配以及去卷积化。通过以上处理，主要能够在一定程度上减少由于仪器所造成的保留时间偏移，此外，对于生物样品中的代谢物的含量与种类受环境影响比较明显，因此为了尽可能较少这些干扰因素的影响，对所得到的数据也需要做出相应归一化或者标准化处理从而增加数据的稳定性。目前最常用的方法是对数据做归一化进而利用代谢物的相对含量而不是绝对含量来消除一些误差。将所有得到的raw格式原始文件导入SIEVE软件进行基峰校正，背景扣除，峰去卷积化处理，经过导出得到由精确质量数、保留时间以及峰面积组成的三维数据表。

步骤S5具体包括：

S51、以血浆代谢组反映脑组织改变的可行性评估，具体是将所得三维数据表导入SIMCA-P13.0软件进行模式判别分析构建模型，获取模型参数以及样本在多位数学模型中的分布情况，所述判别分析包括主成分分析法(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)法；采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)等多维投影分析的数据处理方法的突出优点是能够方便、直接的观察到各个样本在多维空间模型中的相对位置信息，以位置信息反映复杂的代谢谱信息。图3显示经过长期慢性应激后，模型组的代谢状态发生明显改变，而经过帕罗西汀阳性给药后能够对模型组大鼠体内异常的代谢状态进行一定调节，使其代谢谱逐渐趋向于正常状态。另外再结合R语言2.11.1和SPSS17.0软件对所得三维数据表进行单变量统计分析筛选出不同组别之间的差异代谢物，选择三个样本中所共有的代谢物并将代谢组进行简化，利用相关性分析评价血浆代谢组改变与脑组织代谢组改变的相关性，评估以血浆代谢组反映脑组织改变的可行性；参阅图1-图2，从图1可显示出简化的代谢组在各个样本之间的分布情况，表现出良好的一致性；为进一步将其量化，对不同样本间代谢组进行二元Logistic回归分析，图2显示出不同样本间代谢组的良好相关性。对于经过预处理得到的三维数据信息，导入SIMCA-P进行主成分分析，在最大程度上保留原始数据的信息，同时将高维复杂数据进行降维，简化得到相应二元或者三元数据，将极其复杂的生物信息转化为能够体现出生物代谢变化的空间位置信息，并且通过主成分得分图来初步判断各组样本之间的总体分布情况以及是否存在离群特异样本使信息得到可视化。主成分分析法通过赋予海量原始数据特定权重进行一系列线性变化后得到新变量，从而使得每个新变量包含原始数据集的绝大部分生物学信息。主成分得分图上的每个样本都能够以数据点的形式直观地表现出不同生理病理状态下，体内代谢组的模式改变。

S52、代谢组评价抑郁程度的方法，具体是对步骤S51中简化的代谢组在多样本间的相对含量进行二元Logistic回归分析，所述二元Logistic回归相关系数如下表，由表可见血浆代谢组能够充分反映出脑组织中的代谢组改变。然后再以对照组和模型组数据集作为训练集构建新的PLS-DA模型，新模型中，横坐标为实际的行为学实验结果，纵坐标为根据训练集数据所拟合出的结果，以给药组的数据集作为测试集来验证通过代谢组来评价抑郁程度的可靠性。图4显示通过训练集所拟合出的行为学实验结果与测试集中的实际结果相差无几，表明以代谢组的改变方式能够客观准确的反映出机体的抑郁程度，并且置换检验结果也证明该结果并非是由于模型的过拟合所导致，而是由于实际预测能力所产生。相对于主成分分析(PCA)，其虽然能够利用空间位置信息反映出代谢谱改变情况，并且该方法被运用于代谢组学研究，但是这样的目视观察方法一般仅能够作为定性依据，主要问题是无法量化；而通过训练集和测试集的数据拟合，能够将抑郁程度如行为学实验一般进行量化。在主成分分析的基础之上，为进一步将组间差异进行放大以便更加直观探究各组之间细微差异，通过有监督的识别方法，例如偏最小二乘法判别分析，能够更好地展现不同情况下的代谢谱特征，并且能够通过构建模型对未知样本进行预测分析，达到诊断效果。

二元Logistic回归相关系数

基于上述，由于经过外源性应激后机体代谢功能发生改变，表现为小分子代谢物含量的异常，在代谢组学上的表现为主成分分析(PCA)得分图上，模型组的散点明显远离正常组；经过药物干预治疗后，机体代谢异常得到一定缓解，即表现为给药组散点接近正常组，远离模型组；在此基础之上，结合统计学分析得到血浆、海马、皮层中的差异代谢物，利用三个样本间共有的差异代谢物，结合相关性分析，得到血浆代谢组与脑组织代谢组改变的相关性；进一步利用训练集与测试集，评价学将代谢组改变能否正确可靠地反映出机体抑郁程度。利用代谢组学研究结果可以更加全面、综合反映出机体的代谢改变，评价抑郁状况，避免一些指标只能初步、单一反映疾病状态的问题；并以血浆代谢组学研究结果与脑组织中的代谢组改变相一致，因此加深了以相对较容易采集的血浆的代谢组研究，避免脑组织活检以及脑脊液提取的有创性以及侵入性，增加了临床上运用的意义。

由技术常识可知，本发明可以通过其他的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明所包含。

Claims (9)

1.一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于包括如下步骤：

S1模型构建与评价：将实验动物分为对照组，慢性温和不可预知应激(ChronicUnpredictable Mild Stress,CUMS)模型组，盐酸帕罗西汀抗抑郁阳性给药组三组，进行长期应激造模处理，造模过程中结合进行行为学实验对模型的构建进行评价；

S2样本采集和处理：所有动物接受步骤S1所述行为学实验后，分别对所述三组动物采用甲醇沉淀蛋白的方法对各自血浆样本进行前处理及对脑组织中的小分子代谢物进行提取，并最终收集血浆、海马和前额皮层样本；

S3样品分析：采用代谢组学平台对血浆、海马和前额皮层样本进行非靶标性代谢轮廓分析获得代谢组学数据；

S4数据处理：应用SIEVE软件对代谢组学数据进行预处理后，将其导入SIMCA-P13.0软件进行模式判别分析，再应用R语言包和SPSS17.0软件对数据进行单变量和多变量数据分析；

S5模式判别分析以及数学模型的建立：采用训练集建模，测试集验证的方式，判断代谢组的改变与抑郁程度的联系，建立以代谢组来评价抑郁程度的方法。

2.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，步骤S1中所述行为学实验的具体方法为：

S11、模型构建及分组：实验动物随机分为三组：对照组，慢性温和不可预知应激(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)模型组，盐酸帕罗西汀抗抑郁阳性给药组三组；

S12、应激造模处理：除了对照组外，所有动物接受包括20h禁水，20h禁食，20h禁水禁食，潮湿垫料，同笼饲养，4h白噪音刺激，3h频闪光刺激，45°倾斜饲养笼，昼夜颠倒在内的长期慢性温和应激过程，每天随机给予一种应激并且3天之内不得重复，保证应激的不可预知性；

S13、模型构建成功的判定：在经过三周上述造模后，行为学糖水偏好实验结果明显降低视为模型已经初步构建成功，抑郁样行为已经出现。

3.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，步骤S13中所述行为学糖水偏好实验具体为：由于啮齿类动物天生偏好甜食，适当给予糖水对其意味着奖赏行为，而经过应激后大鼠出现抑郁症状，对奖赏行为的反馈减退，因此能评估抑郁程度；处理方法如下，经过20小时禁水禁食之后，所有动物被转移至安静无压力的环境，每笼一只大鼠，并且每个笼子内均有两种不同的饮用水，一种为1％蔗糖水溶液，另一种为普通饮用水；每只大鼠都确保能够自由饮水，在无应激的环境中接受时长为2小时的测试，测试结束后取走两瓶饮用水并进行称重以计算两种饮用水的摄入量；

根据以下公式计算每只大鼠的糖水偏好值

蔗糖偏好＝1％蔗糖水摄入量/(1％蔗糖水摄入量+普通水摄入量)×100％。

4.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，步骤S2中所述样本采集和处理包括样本采集前处理、样本采集及样本处理；

所述样本采集前处理具体为：对盐酸帕罗西汀抗抑郁阳性给药组每天接受10mg/kg剂量的盐酸帕罗西汀灌胃处理，其余动物接受等体积生理盐水灌胃，再次造模以及药物抗抑郁干预3周；

所述样本采集具体为：所有动物接受行为学实验后，以腹腔注射水合氯醛麻醉，首先通过门静脉以抗凝管采集外周血，然后充分震荡，使血液与抗凝剂充分混匀，对抗凝管中的血液样本，首先在3000rpm低速离心15分钟，分离血浆与血细胞，吸取上层血浆后分装至多个1.5mLEP管内，转移至-80℃冰箱保存；血样采集完成后，动物快速断头处死，以4℃超纯水冲洗脑组织中血块，除去多余肌肉、脂类物质后，快速分离前额皮层以及海马组织，称重后将前额皮层以及海马组织放入标记过的2.0mL冷冻管中，液氮速冻后转移至-80℃冰箱保存；

所述样本处理具体为：

血浆样本具体处理方法为从-80℃冰箱中取出分装后装有上层血浆样本的的LEP小管，于室温解冻，涡旋混匀，取出500μL上层血浆样品以1:3的体积比加入甲醇并且在4℃，12000rpm高速冷冻离心20分钟，除去大分子蛋白类物质，取出500μL上清液进一步加入1.5mL超纯水稀释，转移到进样小瓶中等待测定；

前额皮层以及海马组织样本具体处理方法为从-80℃冰箱中取出分装后装有前额皮层以及海马组织样本的冷冻管，于室温解冻后，取出组织，用消毒过的手术剪剪取20mg样本转移至2mL离心管内，向其中加入1mL提取液；混合物充分混匀后，加入洗净消毒后的小钢珠一颗，将离心管放入Tissuelyser组织匀浆机，以50Hz的振动频率充分匀浆15分钟；待脑组织完全匀浆后，匀浆在4℃，12000rpm高速冷冻离心10分钟从而去除大分子蛋白类物质，离心后吸取200μL上清液转移至带内衬管的进样小瓶中等待测定。

5.根据权利要求4所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，所述抗凝管为用肝素钠抗凝的真空管；所述提取液包括按体积比为2:5:2的水、乙腈和三氯甲烷。

6.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，步骤S3中所述代谢组学平台为Ultimate 3000-Orbitrap MS戴安超高效液相色谱串联静电场轨道阱高分辨质谱仪；

其色谱条件为色谱分离柱为粒径是1.9μm Hypersile C₁₈色谱柱(100mm×2.1mm)，柱温维持在40℃；流动相A：含有0.1％甲酸的超纯水；流动相B：含有0.1％甲酸的乙腈，流动相A和B的流速为0.4mL/min；自动进样器样品盘温度为4℃，进样体积为5μL；流动相A和B的梯度洗脱程序见下表：

流动相梯度洗脱程序

其质谱条件为：采用加热型电喷雾离子源(HESI)，正负离子切换同时扫描毛细管电离电压为+2.5kV/-3.5kV，毛细离子传输管温度为300℃；鞘气流速为50au；辅助气流速为10au；吹扫气流速为2au；分辨率为70,000；扫描离子范围为70-1050amu；AGC target为5E6。

7.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，步骤S3中所述非靶标性代谢轮廓分析具体为：以三个样本为一个集合，每个集合中包含一个对照组样本、一个模型组样本、一个给药组样本，每个样本均随机抽取，从而减少由仪器分析波动所引起的组间差异；在分析过程中，每十个样品后插入一个质控样的分析，以监测仪器运行状况，确保仪器的稳定性和重现性，保证结果的可靠性；同时，质谱仪每天以校正液进行正负离子质量轴校正，保证结果的准确性。

8.根据权利要求6所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，步骤S4具体为：首先对采集到的代谢组学质谱数据在SIEVE软件中进行背景扣除、峰匹配对齐、基峰校正以及归一化处理后，得到可以被统计学软件分析的包含变量编号、信号强度以及组别的并由精确质量数、保留时间以及峰面积组成的三维数据表。

9.根据权利要求8所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，步骤S5具体包括：

S51、以血浆代谢组反映脑组织改变的可行性评估，具体是将所得三维数据表导入SIMCA-P13.0软件进行模式判别分析构建模型，获取模型参数以及样本在多位数学模型中的分布情况，所述判别分析包括主成分分析法(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)法；另外再结合R语言2.11.1和SPSS17.0软件对所得三维数据表进行单变量统计分析筛选出不同组别之间的差异代谢物，选择三个样本中所共有的代谢物并将代谢组进行简化，利用相关性分析评价血浆代谢组改变与脑组织代谢组改变的相关性，评估以血浆代谢组反映脑组织改变的可行性；

S52、代谢组评价抑郁程度的方法，具体是对步骤S51中简化的代谢组在多样本间的相对含量进行二元Logistic回归分析，然后再以对照组和模型组数据集作为训练集构建新的PLS-DA模型，新模型中，横坐标为实际的行为学实验结果，纵坐标为根据训练集数据所拟合出的结果，以给药组的数据集作为测试集来验证通过代谢组来评价抑郁程度的可靠性。