CN107389842A - 基于gc‑ms联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于GC‑MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，通过以下步骤实现：(1)采用GC‑MS联用技术检测分析大鼠血清样品及尿液样品；(2)利用PCA和PLS‑DA对数据进行分析，结合SPSS17.0，并利用NIST数据库进行代谢物鉴定找出最终的差异代谢物；(3)通过MetPA在线分析软件对差异代谢物进行通路分析：本发明通过采用GC‑MS联用技术对大鼠血清及尿液样品进行分析，并分别鉴定大鼠血清样品和尿液样品中的差异代谢物，通过对差异代谢物进行代谢通路分析，可从整体水平综合评价辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的作用机制，为中药组方的代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。

Description

基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢 组学研究方法
技术领域
本发明属于中药学研究领域，尤其涉及一种基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法。
技术背景
中药的有效性和实用性已经毋庸置疑，但中药组方的研究至今没有取得突破性进展，主要的两个问题无非是中药组方的成分以及不甚明确的作用机制。中药成分的复杂主要是因为自身化合物的种类多，不同的化合物在不同条件下相互作用，相互变化，难以测得其真实成分。其作用机制主要表现为多成分、多靶点的协同整合作用，难以用单一的成分及靶点来概括其作用机制。中药的多成分、多靶点协同整合作用，组方中的动态变化，都成为了中药组方深层次开发的难点。
代谢组学(Metabonomics/Metabolomics)即通过考察生物体系(细胞、组织或生物体)受刺激或扰动后(如基因变异或环境变化后)，其代谢产物(内源性代谢产物)种类、数量及其变化规律的科学。代谢组学在药物开发、植物学、毒理学、营养科学等研究领域具有广阔的前景，同时为药物筛选、作用机制研究、安全性评价及毒理研究提供了新方法。代谢组学是强调将机体看做一个整体进行研究，与中药治病整体性、多靶点协同整合作用极其相似，为中药组方研究提供了崭新的、强有力的技术手段。代谢组学成为研究中药及中药组方作用机制的重要途径。
“辛芍组方”为贵州少数民族民间验方，由灯盏细辛和赤芍配伍组成。在民间将两者以汤剂煎服用于治疗偏瘫，具有通经活络、活血化瘀的功效，主要将其用于预防和辅助治疗中风、偏瘫，而且疗效显著。尽管其具有较好的疗效，但是其作用机制尚不清楚，限制了辛芍组方的深度开发。理论上，辛芍组方发挥抗脑缺血再灌注损伤的作用机制应该是“多途径、多成分、多靶点”，但目前仍缺乏有效的实验方法和技术手段进行验证。而代谢组学的产生可为阐明辛芍组方的作用机制提供强大的支持。
发明内容
本发明的目的是针对辛芍组方发挥抗脑缺血再灌注损伤的作用机制不明确的难点，提供一种基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法。
实现本发明的技术方案为：一种基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)采用GC-MS联用技术检测分析大鼠血清样品及尿液样品：
随机将大鼠分为模型组、假手术组和辛芍组，放入代谢笼中进行观察，期间正常饮食及饮水；各组大鼠按一定剂量，连续给药10天，收集不同时间点的各组大鼠的血清样品和血尿液样品，进行初步处理和保存；然后再次对血清样品进行前处理、尿液样品进行前处理；对大鼠血清和尿液样品进行方法学考察，包括日内精密度考察、日间精密度考察、重复性考察、冻融稳定性考察和QC样本考察，建立GC-MS联用技术检测分析大鼠血清样品及尿液样品的指纹图谱分析方法；
(2)利用PCA和PLS-DA对数据进行分析，结合SPSS17.0，并利用NIST数据库进行代谢物鉴定找出最终的差异代谢物：
在获得GC-MS数据后，用Agilent MSD Chemstation分析软件将原始数据转换为NetCDF格式，导入基于R编程软件的XCMS的软件进行色谱峰提取、去噪、峰匹配、保留时间的矫正、数据导出、保存，将得到的数据进行峰面积归一化处理，采用修正80％规则去除数据缺失值，将获得的数据进行分析；利用SIMCA-P13.0软件对导入的血清样品数据、尿液样品数据进行模式识别分析，假手术组与模型组采用PCA与PLS-DA方法建模，利用变量重要性投影分析VIP值，结合SPSS17.0进行T检验，按照VIP值>1且T检验时P<0.05的标准，筛选出差异代谢物；
将GC-MS检测总离子流图导入NISTAMDIS软件中，进行解卷积分析，利用NIST11数据库对GC-MS检测的内源性差异代谢物进行定性分析，选择质谱数据库中匹配度大于700的物质，进行分析鉴定，进行去硅烷化反应，得到最终的差异代谢物；
(3)通过MetPA在线分析软件对差异代谢物进行通路分析：
为了探索脑缺血再灌注损伤引起的代谢通路的变化，以及给予辛芍组方后对这些代谢通路的影响，将血清样本及尿样样品筛选出的差异代谢物导入MetPA在线分析软件中进行代谢通路分析；通过代谢通路分析后所得影响值，判断代谢通路在代谢网络中是否具有重要影响。
优选地，所述步骤(1)中所述的模型组、假手术组和辛芍组的具体的处理方法为：模型组和辛芍组采用改良的Longa方法成功制备中脑动脉栓塞大鼠模型，缺血1h后进行再灌注，缓慢外拉栓线使其球端回至颈总动脉内，恢复大脑中动脉的供血，中动脉缺血再灌注造模完成后，放回代谢笼中进行饲养；假手术组除不插栓线外，其它步骤均和模型组一致。
优选地，所述步骤(1)中所述的各组大鼠按一定剂量是指口服给药，具体为：辛芍组给予辛芍冻干粉针，12.5g·kg-1生药量；假手术组和模型组均给予等量生理盐水。
优选地，所述步骤(1)中所述的连续给药10天是指手术开始前两天开始口服给药，第三天给药30min后进行手术，在造模后连续给药7天，每天给药一次。
优选地，所述步骤(1)中所述的不同时间点是指给药前第0天和手术后第1、3、7天的24h后。
优选地，所述步骤(1)中所述的初步处理和保存的具体方法是将不同时间点获得的血清样品，立刻置于冰上，放置30～40min后，在4℃，6000rpm条件下，离心10min，取上清液，分装为100μL每支，-80℃保存；不同时间点获得的的尿液样品，在4℃，3500rpm条件下，离心10min，取上清液，快速分装为500μL/支，-80℃保存。
优选地，所述步骤(1)中所述的血清样品进行前处理的具体方法为：取解冻后血清样本100μL于1.5mL的EP管中，加入甲醇250μL，涡混3min，冰浴10min，在4℃，10000rpm条件下，离心10min；取血清甲醇萃取液250μL，置GC进样瓶，N2吹干；加50μL的15mg/mL甲氧胺吡啶溶液混匀，在70℃，肟化1h，加50μL衍生化试剂，混匀，在70℃，衍生化1h，冷却后，转移至1.5mLEP管中，在4℃，15000rpm条件下，离心10min，移取上清液至内插管中，供GC-MS分析。
优选地，所述步骤(1)中所述的尿液样品进行前处理的具体方法为：取冻存后尿样在室温下解冻，取尿样上清液50μL，加60U的脲酶，涡混30s，在37℃恒温孵育箱中孵化15min，加入180μL的甲醇，混匀，在13000rpm，4℃条件下，离心10min；取200μL上清液至GC进样瓶中，N2吹干；脱水后的样品加入50μL15mg/mL甲氧胺吡啶溶液，涡混30s，培养振荡器中在30℃，200rpm条件下肟化90min；加入有1％的TMCS的MSTFA 50μL，涡混30s，在70℃保持60min，放冷，加入120μL正庚烷，涡混30s，转移至1.5mL的EP管中，混匀，在12000rpm，4℃条件下离心10min，取上清液至内插管中，待GC-MS分析。
优选地，所述步骤(1)中所述的日内精密度考察包括0、2、6、12、18、24h。
优选地，所述步骤(1)中所述的QC样本考察是指6批QC样品的总离子流图。
与现有技术相比，本发明的优势在于：采用GC-MS联用技术对大鼠血清及尿液样品进行分析，并分别鉴定大鼠血清样品和尿液样品中的差异代谢物，通过对差异代谢物进行代谢通路分析，可从整体水平综合评价辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的作用机制，为中药组方的代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。
附图说明
图1是血清样品的日内精密度考察(S1-S6分别为：0、2、6、12、18、24h GC-MS考察结果)
图2是血清样品日间精密度考察(S1：第一天精密度考察TIC图S2：第二天精密度考察TIC图
S3：第三天精密度考察TIC图)
图3是血清样本重复性考察
图4是血清样本冻融稳定性考察
图5是QC样本考察结果(S1：第一批次随行QC TIC图S2：第二批次随行QC TIC图；S3：第三批次随行QC TIC图S4:第四批次随行QC TIC图S5:第五批次随行QC TIC图；S6:第六批次随行QC TIC图)
图6是尿液样品日内精密度考察(S1-S6分别为：0、2、6、12、18、24h GC-MS考察结果)
图7是尿液样本日间精密度考察(S1：第一天精密度考察TIC图S2：第二天精密度考察TIC图
S3：第三天精密度考察TIC图)
图8是尿液样本重复性考察
图9是尿液样本冻融稳定性考察
图10是QC样本考察结果(S1：第一批次随行QC TIC图S2：第二批次随行QC TIC图；S3：第三批次随行QC TIC图S4:第四批次随行QC TIC图S5:第五批次随行QC TIC图；S6:第六批次随行QC TIC图)
图11是基于GC-MS数据的血清PCA示意图
图12是基于GC-MS数据的血清PLS-DA示意图
图13是基于GC-MS数据的尿液PCA示意图
图14是基于GC-MS数据的尿液PLS-DA示意图
图15是基于GC-MS数据的二维PCA示意图
图16是基于GC-MS数据的二维PLS-DA示意图
图17是亚油酸代谢通路
图18是亚油酸在各生物样本中的变化趋势(*P<0.01vs.Sham group；#P<0.01vs.Mod group，下同)
图19是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成
图20是缬氨酸、异亮氨酸在各组生物样品中的变化趋势
图21是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢通路
图22是苯丙氨酸在各组生物样品中的变化趋势
图23是乙醛酸和二羧酸代谢通路
图24是柠檬酸在各组生物样品中的变化趋势
图25是甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路
图26是甘氨酸在各组生物样品中的变化趋势
图27是甘油酯代谢
图28是甘油在各组生物样品中的变化趋势
图29是组氨酸代谢
图30是组氨酸在各组生物样品中的变化趋势
图31是磷酸肌醇代谢
图32是肌醇在各组生物样品中的变化趋势
图33是色氨酸代谢
图34是5-HT在各组生物样品中的变化趋势
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)采用GC-MS联用技术检测分析大鼠血清样品及尿液样品
选取280～300g健康SD大鼠，雄性，共分为3组，分别为模型组(采用改良的Longa方法成功制备中脑动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion，MACO)大鼠模型)、假手术组(除不插栓线外，同制备MACO大鼠模型方法一致)、辛芍组(成功制备MACO模型的大鼠)，每组6只。放入代谢笼中进行观察，期间正常饮食及饮水。假手术组(口服给药，分别给予等量生理盐水)、模型组(口服给药，分别给予等量生理盐水)、辛芍组(口服给药，辛芍冻干粉针，12.5g·kg-1生药量)，手术开始前两天开始口服给药，第三天给药30min后进行手术，每天给药一次，连续给药10天；给予辛芍组(12.5g·kg-1生药量)，假手术组、模型组等容体积的蒸馏水；假手术组除不插栓线外，其它步骤均和模型组一致。模型组、辛芍组于缺血1h后进行再灌注，缓慢外拉栓线使其球端回至CCA内，恢复大脑中动脉的供血，中动脉缺血再灌注造模完成后，放回代谢笼中进行饲养，在造模后连续给药7天。
取大鼠给药前(第0天)和手术后(第1、3、7天)的血样，立刻置于冰上，放置30～40min后，离心10min(4℃，6000rpm)，取上清液，分装为100μL每支，-80℃保存。同时收集(第0天)和手术后(第1、3、7天)的24h的尿液样品，离心10min(4℃，3500rpm)，取上清液，快速分装为500μL/支，-80℃保存。
1)仪器
GC-MS为Agilent 7890A/5975C-GC/MSD(美国)，配备自动进样器，ChemStation工作站和NIST质谱数据库；DB-5MS(30m×0.25mm，0.25μm，Agilent公司，美国)气相色谱柱；低温高速离心机(型号Allegra 64R，美国Beckman Coulter公司)；EL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；微量移液器(德国eppendorf股份公司)；ZH-2涡旋混合器(天津药典标准仪器厂)；GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；ZDP-150培养振荡器(上海习仁科学仪器有限公司)，ABSON TMC恒温孵育箱(美国)；氮气发生器(型号XYN-20L PSA，上海析友分析仪器有限公司)
2)QC样本制备
分别取各组解冻血清样品50μL于同一离心管中，涡混，以100μL每管快速分装至1.5mL离心管中，-80℃保存，作为血清质控样本。
分别取各组解冻尿液样品50μL于同一离心管中，涡混，以100μL每管快速分装至1.5mL离心管中，-80℃保存，作为尿液质控样本。
3)血清样品前处理
取解冻后血清样本100μL于1.5mL的EP管中，加入甲醇250μL，涡混3min，冰浴10min，离心(10000rpm，10min，4℃)。取血清甲醇萃取液250μL，置GC进样瓶，N2吹干。加50μL的15mg/mL甲氧胺吡啶溶液混匀，肟化1h(70℃)，加50μL衍生化试剂(MSTFA:TMCS＝99：1，V/V)，混匀，衍生化1h(70℃)，冷却后，转移至1.5mL EP管中离心(15000rpm，10min，4℃)，移取上清液至内插管中，供GC-MS分析。
每次进行血清样品处理时均随行QC样品，QC样本的制备方法与血清样品的制备方法一致，以控制该批次样品处理的质量。血清样品色谱条件和色谱柱升温程序分别见表1和表2。
表1气质联用仪(GC-MS)分析条件
表2 GC-MS色谱柱升温程序
4)尿液样品前处理
取冻存后尿样在室温下解冻，取尿样上清液50μL，加60U(30U/10μL)的脲酶，涡混30s，在37℃恒温孵育箱中孵化15min，加入180μL的甲醇，混匀，离心(13000rpm，10min，4℃)。取200μL上清液至GC进样瓶中，N2吹干。脱水后的样品加入50μL 15mg/mL甲氧胺吡啶溶液，涡混30s，在培养振荡器中肟化90min(30℃，200rpm)。加入有1％的TMCS的MSTFA 50μL，涡混30s，在70℃保持60min。放冷，加入120μL正庚烷，涡混30s，转移至1.5mL的EP管中，混匀，离心(12000rpm，10min，4℃)。取上清液至内插管中，待GC-MS分析。
每次进行尿液样品处理时均带上QC样品，QC样本的制备方法与尿液样品的制备方法一致，以控制该批次样品处理的质量。尿液样品色谱条件和色谱柱升温程序分别见表3和表4。
表3气质联用仪(GC-MS)分析条件
表4 GC-MS色谱柱升温程序
5)血清样品方法学考察
①日内精密度
取一份血清样品，按照“3)”项下血清样品前处理方法制备，连续进样六次(0、2、6、12、18、24h)，将6次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较(见图1)，同时考察10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在2.0％-4.3％之间。
②日间精密度
取同一血清样品，平行制备5份，按照“3)”项下血清样品前处理方法制备，分别在1、2、3天同一时间进样，即在每天进样一次，将每次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较(见图2)，同时考察10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在3.0％-5.7％之间。
③重复性考察
取同一血清样品，平行制备5份，按照“3)”项下血清样品前处理方法制备，将每次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较(见图3)，同时考察10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在1.1％-3.2％之间。
④冻融稳定性考察
取一份血清样品待冻融后吸取100μL于离心管中，平行5份,剩余血清样品迅速放回-80℃超低温冰箱，如此往复三次，按照“3)”项下血清样品前处理方法制备，将每次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较(见图4)，同时考察10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在2.4％-6.7％之间。
⑤QC样本的考察
随机抽取每批次随行处理的QC样品2个，进行分析，结果见图5，将每次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较，同时考察10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在2.3％-5.2％之间。
6)尿液方法学考察
①日内精密度
取一份尿液样品，按照“4)”项下尿液样品前处理方法制备，连续进样六次(0、2、6、12、18、24h)，将6次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较(见图6)，同时考察10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在1.4％-4.0％之间。
②日间精密度
取同一尿液样品，平行制备5份，按照“4)”项下尿液样品前处理方法制备，分别在1、2、3天同一时间进样，即在每天进样一次，将每次进样后的TIC图的色谱峰个数进行比较(见图7)，同时考察10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在1.8％-6.2％之间。
③重复性考察
取同一尿液样品，平行制备5份，按照“4)”项下尿液样品前处理方法制备，将每次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较(见图8)，同时考察10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在1.0％-3.9％之间。
④冻融稳定性考察
取一份尿液样品待冻融后吸取100μL于离心管中，平行5份，剩余尿液样品迅速放回-80℃超低温冰箱，如此往复三次，按照“4)”项下尿液样品前处理方法制备，将每次进样后TIC图的色谱峰个数进行比较(见图9)，同时考察10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在1.9％-7.3％之间。
⑤QC样本的考察
随机抽取每批次随行处理的QC样品2个，进行分析，结果见图10，比较每次进样后得到的TIC图中色谱峰个数，及10个主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)，结果色谱峰个数均一致，RSD均在2.5％-6.5％之间。
(1)利用PCA，PLS-DA对数据进行分析，结合SPSS17.0，找出差异代谢物，并利用NIST数据库进行代谢物鉴定
Sham组与Mod组采用PCA与PLS-DA方法建模，利用变量重要性投影分析VIP(variable importance in projection)值，结合SPSS17.0进行T检验，筛选出差异代谢物。VIP值>1，说明内源性差异代谢物对于各组别的差异贡献较大，而这种变化与分类密切相关，即这种物质可能是组间的潜在差异代谢物；同时结合T检验P<0.05的为两组之间的差异代谢物。
将GC-MS检测总离子流图(TIC)导入NIST AMDIS(automated mass spectraldeconvolution and idengtification system)软件中，进行解卷积分析，利用NIST11数据库对GC-MS检测的内源性差异代谢物进行定性分析，选择质谱数据库中匹配度较高的物质(>700)，进行分析鉴定，进行去硅烷化反应，得到最终的差异代谢物。
1)假手术组与模型组的血清代谢物GC-MS分析
①假手术组与模型组的血清样本PCA分析
用非监督的主成分PCA模型来考察Sham组、Mod组的分类趋势。观察在非监督的情况下，两组代谢谱的分布情况。反映组间离散程度的PCA得分图见图11，由此图可见，Sham组与Mod组的样本点分离良好，并在95％的置信区间内聚集良好，说明MACO手术导致大鼠正常的代谢被干扰，从内源性代谢物变化认为MACO模型建立成功。
②假手术组与模型组的血清样本PLS-DA分析
相对于无监督的PCA来说，有监督的PLS-DA更关注对分类中做出显著贡献的化合物。为了更进一步的了解内源性差异代谢物的含量变化，因此，本研究采用PLS-DA建模来筛选Sham组与Mod组之间的差异代谢物，见图12(模型判别系数：R2X＝0.478，R2Y＝0.994，Q2＝0.842)。根据PLS-DA模型中变量重要性投影分析VIP值，选择VIP>1的物质，利用T检验对内源性代谢物含量变化差异显著性进行分析，同时满足VIP>1，以及p<0.05属于潜在差异代谢物。
③差异代谢物的鉴定
根据PLS-DA模型分析出的变量重要性投影分析VIP值(VIP>1.0)，结合T检验分析(p<0.05)，筛选出血清中差异代谢物。
再利用NIST 11数据库对血清GC-MS检测的内源性代谢物进行定性分析，将GC-MS检测的总离子流图(TIC)导入到NIST 11数据库中，进行鉴定，选择质谱NIST数据库中匹配度较高的物质。
结合PLS-DA分析得到的VIP>1以及T检验p<0.05筛选出23个内源性代谢物。其详细信息见表5.
表5血清差异代谢物
④各差异代谢物的相对含量
表6血清差异代谢物相对含量变化趋势
#P<0.05vs.Mod group
2)假手术组与模型组的尿液代谢物GC-MS分析
①假手术组与模型组的尿液样本PCA分析
用非监督的主成分PCA模型来考察Sham组、Mod组的分类趋势。观察在非监督的情况下，两组代谢谱的分布情况。反映组间离散程度的PCA得分图见图13，由图可以看出，Sham组与Mod组的样本点分离良好，并在95％的置信区间内聚集良好，说明MACO手术导致大鼠正常的代谢被干扰，从内源性代谢物变化认为MACO模型建立成功。
②假手术组与模型组的尿液样本PLS-DA分析
相对于无监督的PCA来说，有监督的PLS-DA更关注对分类中做出显著贡献的化合物。为了更进一步的了解MACO导致的内源性差异代谢物含量变化，因此，本研究采用PLS-DA建模来筛选假手术组与模型组之间的差异代谢物，见图14(模型判别系数：R2X＝0.518，R2Y＝0.992，Q2＝0.842)，从PLS-DA图可以看出，模型组与假手术组完全分离，说明通过对大鼠进行MACO手术，大鼠体内的代谢物发生显著性变化。根据PLS-DA模型中变量重要性投影分析VIP值，选择VIP>1的物质，利用T检验对内源性代谢物含量变化差异显著性进行分析，同时满足VIP>1，以及p<0.05属于潜在差异代谢物。
同血清样本差异代谢物的鉴定方法一致，利用NIST 11数据库进行鉴定，最后鉴定出19个差异代谢物，各差异代谢物在信息如表7。
表7尿液中差异代谢物
③各差异代谢物的相对含量
表8尿液差异代谢物相对含量变化趋势
#P<0.05vs.Mod group
3)辛芍组进行PCA分析
利用SIMCA-P软件对辛芍组不同时间点进行PCA分析
用非监督的主成分PCA模型来考察辛芍组的分类趋势。观察在非监督的情况下，各时间点的代谢谱的分布情况。反映组间离散程度的PCA得分图见图15，由图15可见，辛芍组的各时间点有分离趋势，说明MACO手术导致大鼠正常的代谢被干扰，给予辛芍组方后大鼠代谢紊乱状态发生改变，有向正常状态发展的趋势。
4)辛芍组进行PLS-DA分析
相对于无监督的PCA来说，有监督的PLS-DA更关注对分类中做出显著贡献的化合物。为了更进一步的了解MACO导致的内源性差异代谢物含量变化，以及给予辛芍组方后，辛芍组方对脑缺血再灌注损伤模型内源性差异代谢物的干扰情况。从图16(模型判别系数：R2X＝0.478，R2Y＝0.994，Q2＝0.842)可以见，辛芍组各时间点分离良好，说明通过对大鼠进行MACO手术，大鼠体内的代谢物发生显著性变化，给予辛芍组方后，差异代谢物发生回调，且有往正常状态发展的趋势，从内源性差异代谢物的变化可以看出辛芍组方抗大鼠脑缺血再灌注损伤的有效性。
(2)利用MetPA对差异代谢物进行通路分析
为了探索脑缺血再灌注损伤引起的代谢通路的变化，以及给予辛芍组方后对这些代谢通路的影响，将血清样本及尿样样品筛选出的差异代谢物导入MetPA(MetabolomicsPathway Analysis)在线分析软件中进行代谢通路分析，分析结果见表9。通过代谢通路分析后所得影响值(impact value)，当影响值大于0.1时，认为该条代谢通路在代谢网络中具有重要影响，见表10。表10结果表明，在血清及尿液样品代谢组学层面上，脑缺血再灌注损伤主要影响了10条代谢途径：亚油酸代谢通路；缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成；苯丙氨酸代谢；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；乙醛酸和二羧酸代谢；色氨酸代谢；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；组氨酸代谢；磷酸肌醇代谢；甘油酯代谢。根据相关通路分析，进而了解脑缺血再灌注损伤的发生机制，以及辛芍组方的抗脑缺血再灌注损伤的作用机制。
表9基于GC-MS与MetPA数据库构建的脑缺血再灌注损伤总代谢通路结果
表10基于GC-MS与MetPA数据库构建的脑缺血再灌注损伤总代谢通路结果(Impact>0.1)
1)亚油酸代谢通路分析及相关差异代谢物在各组间的相对含量变化趋势
血清中筛选出亚油酸为脑缺血再灌注损伤的差异代谢物，亚油酸又被称作十八碳二烯酸，参与亚油酸代谢通路。亚油酸在各组中的变化见图17，图18。
亚油酸结构中含有双键，易被自由基氧化，同时可诱导机体产生大量的活性氧，当体内活性氧的含量超过机体的清除能力时，活性氧会释放到细胞外，开始攻击周围组织，从而引起细胞损伤。体内亚油酸含量与脑缺血再灌注损伤发生密切的关系。而亚油酸通过脱氢去饱和反应和碳链延长形成花生四烯酸(AA)，AA在脑组织、神经末梢、神经组织中含量较高，是大脑功能调控的重要物质，可代谢出血栓素A2、白三烯、自由基等毒性产物，产生的自由基又可启动一连串的链式不饱和脂肪酸过氧化反应，进一步对细胞进行破坏，使细胞死亡。由于给大鼠建立脑缺血再灌注损伤模型，大鼠体内的亚油酸含量极具增高，影响体内亚油酸的正常代谢，在给予辛芍组方后，大鼠体内亚油酸含量降低，而达到抑制由于脑缺血再灌注损伤引起的亚油酸含量增高导致的细胞损伤的效果。经分析后，进一步推测，亚油酸代谢是改善脑缺血再灌注损伤程度的通路之一。
2)缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成通路分析及相关差异代谢物在各组中相对含量变化趋势
血清中筛选出脑缺血再灌注损伤的差异代谢物缬氨酸、异亮氨酸，参与缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成通路，缬氨酸、异亮氨酸在各组中的变化见图19，图20。
缬氨酸为必需氨基酸，和异亮氨酸一样为支链氨基酸，支链氨基酸是必需氨基酸的碳结构的一个分支点，对人的生命至关重要，与能力、应激，肌肉代谢相关，缬氨酸缺乏，引起大脑神经功能缺失，而异亮氨酸缺乏则可以导肌肉导致震颤明显。从图20中可以看出，与假手术组相比，模型组中的缬氨酸、异亮氨酸含量显著下降(p<0.05)。与模型组相比，辛芍组缬氨酸、异亮氨酸含量显著上升(p<0.05)。大鼠经脑缺血再灌注损伤手术后，体内代谢发生紊乱，引起血清缬氨酸、异亮氨酸消耗增加，来维持体内代谢，体内缬氨酸、异亮氨酸含量下降，通过辛芍组方干预后，血清中缬氨酸、异亮氨酸含量上升，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成趋向正常状态发展。
3)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成及苯丙氨酸代谢通路分析及相关差异代谢物在各组中相对含量变化趋势
苯丙氨酸是必需氨基酸，是酪氨酸的前体。参与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，以及苯丙氨酸代谢通路，如图21。
从图22可以看出，与假手术组相比，模型组苯丙氨酸含量显著升高(p<0.05)，与模型组相比，辛芍组的含量显著下降(p<0.05)。苯丙氨酸属于中性氨基酸，血液中苯丙氨酸浓度过高时，苯丙氨酸会与其它中性氨基酸(包括缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸和色氨酸)竞争共同的载体，其亲和力较强，会优先通过血脑屏障，从而导致脑内酪氨酸减少，造成脑内中性氨基酸比例失调，文献报道，高浓度的苯丙氨酸会引起中脑-前额叶多巴胺能神经元功能障碍、兴奋性氨基酸受体功能异常、钙离子通道异常、抑制Na+，K+-ATP酶活性。给予大鼠辛芍组方干预后，大鼠血清中的苯丙氨酸含量下降并且趋向于假手术组含量，朝着正常状态发展。
4)乙醛酸和二羧酸代谢通路分析及相关差异代谢物在各组中相对含量变化趋势
尿液样本中筛选出脑缺血再灌注损伤的差异代谢物柠檬酸，参与乙醛酸和二羧酸代谢(图23)。
由图24可以看出，与假手术组相比，模型组柠檬酸含量显著降低；给予辛芍组方干预后，辛芍组柠檬酸含量显著上升。柠檬酸是一种弱酸，参与乙醛酸和二羧酸代谢，同时也参与柠檬酸循环，当大鼠发生脑缺血再灌注损伤后，代谢发生异常，柠檬酸含量降低时，乙醛酸和二羧酸代谢以及柠檬酸代谢发生异常，能量代谢异常，机体能量供应不足，脑细胞不能维持正常的代谢，神经元的正常生理功能受损，导致神经元坏死。在给予辛芍组方后，柠檬酸含量上升，纠正了大鼠异常代谢，表明辛芍组方能改善机体由脑缺血再灌注损伤引起的能量代谢紊乱，作用显著。
5)甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路与相关差异代谢物在各组间相对含量变化趋势
血清样本中筛选出脑缺血再灌注损伤的差异代谢物甘氨酸，参与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。甘氨酸在各组生物样本中的变化趋势见图25，26。
甘氨酸为非必须氨基酸，主要存在于灰质中的神经递质。甘氨酸是中枢神经系统最重要的离子型谷氨酸能受体之一，甘氨酸是NMDAR(N-甲基-D-天冬氨酸受体)的共同激动剂，也是一个最主要的抑制性神经递质，有研究表明甘氨酸在高浓度时，结合NMDAR上的甘氨酸结合位点，NMDAR过度激活，ATP供给不足，细胞内外离子浓度梯度紊乱，兴奋性递质释放，各种蛋白激酶激活，线粒体等细胞器损坏，最终导致神经元损伤、变形或死亡。当大鼠经过脑缺血再灌注损伤后，甘氨酸含量极巨升高，从图26可以看出，与假手术组相比，模型组甘氨酸含量显著性升高(p<0.05)。与模型组相比，给予大鼠辛芍组方干预后，辛芍组甘氨酸含量显著降低(p<0.05)。通过干预后可以使甘氨酸含量逐渐朝着假手术组甘氨酸含量水平发展。6)甘油酯代谢通路分析及相关差异代谢物在各组中相对含量变化趋势
血清中筛选出脑缺血再灌注损伤差异代谢物甘油，参与甘油酯代谢通路(图27)。
甘油和脂肪酸是甘油三酯的最终产物，大鼠经过脑缺血再灌注损伤手术后，体内甘油含量降低，根据文献报道，脑缺血模型组大鼠的甘油含量下降。从图28中可以看出，与假手术组相比，模型组中的甘油含量显著降低(p<0.05)，与模型组相比，给予辛芍组方后，辛芍组中甘油含量均显著升高(p<0.05)。
7)组氨酸代谢通路分析及相关差异代谢物在各组中相对含量变化趋势
血清中筛选出脑缺血再灌注损伤的差异代谢物组氨酸，参与组氨酸代谢通路(图29)。
从图30中可以看出，与假手术组相比，模型组的组氨酸含量显著性降低(p<0.05)，给予辛芍组方干预后，组氨酸含量显著上升(p<0.05)。组氨酸为带有咪唑基团的α-氨基酸。在组氨酸脱羧酶的作用下，组氨酸脱羧形成组胺。大鼠经过脑缺血再灌注损伤后，组氨酸代谢通路异常，导致组氨酸急剧下降，转化为组胺的量降低，而内源性组胺可以诱导血管内皮生长因子上调，从而减轻脑组织缺血再灌注损伤，同时组胺可通过调节兴奋性神经递质谷氨酸释放，而减轻脑缺血后神经元损伤。组胺含量减少，不能起到保护作用；在给予辛芍组方干预后，组氨酸代谢通路朝着正常状态变化，组氨酸含量升高，可转化为组胺的量增多，可起到脑保护作用。
8)磷酸肌醇代谢通路分析及相关差异代谢物在各组中相对含量变化趋势
血清、尿液中共同筛选出肌醇为脑缺血再灌注损伤的差异代谢物，参与磷酸肌醇代谢通路(图31)。
由图32，可以看出，与假手术组相比，模型组的肌醇含量显著降低(p<0.05)，给予辛芍组方干预后，辛芍组的肌醇含量显著上升(p<0.05)。肌醇是一种循环多元醇，在细胞中作为第二信使，以肌醇磷酸盐的形式存在，为磷酸肌醇代谢通路中的一个重要中间产物。当细胞发生肿胀，使的细胞膜功能发生改变，磷酸肌醇代谢异常，肌醇含量降低，使得周细胞DNA合成发生障碍，降低周细胞的增值能力，加重脑缺血。给予辛芍组方后，可干预磷酸肌醇代谢，使得磷酸肌醇含量上升，说明辛芍组方对磷酸肌醇代谢影响显著。
9)色氨酸代谢通路分析及相关差异代谢物在各组中相对含量变化趋势
血清中筛选出脑缺血再灌注损伤的差异代谢物5-HT，参与色氨酸代谢通路(图33)。
经过脑缺血再灌注损伤后，大鼠色氨酸代谢紊乱。由图34可以看出，与假手术组相比，模型组5-HT含量显著上升(p<0.05)，辛芍组与模型组相比，通过辛芍组方干预后，辛芍组中的5-HT含量显著降低(p<0.05)。色氨酸是生物体内的一种必需氨基酸，可以通过线粒体内的色氨酸羟化酶的羟化作用而形成5-HT。大鼠进行脑缺血再灌注损伤手术后，大脑缺血，Ca2+离子顺浓度梯度大量进入细胞内，进而促进5-HT等神经递质大量释放于突触间隙，最终导致突触传递失常，然而5-HT等神经递质又可激活磷脂酰肌醇系统，使储存于内质网的Ca2+释放而进入细胞质，使细胞内的Ca2+异常升高，加重脑组织缺血和神经细胞坏死，5-HT同时可能直接兴奋血管平滑肌的5-HT2受体，增强其它内源性缩血管物质的作用及促进肾上腺能神经元末梢释放去甲肾上腺素而使血管收缩，加重缺血。在辛芍组方干预后，色氨酸代谢紊乱达到调节，5-HT含量降低，脑缺血再灌注损伤得到改善。
通过GC-MS对血清样本及尿液进行检测，同时结合模式识别的方法对大鼠血清、尿液样品进行代谢组学研究，结合代谢通路分析，对辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的作用机制进行探讨，辛芍组方对抗脑缺血再灌注损伤效果明显，同时发现，脑缺血再灌注损伤模型主要影响体内氨基酸代谢，能量代谢、脂质代谢等。通过代谢组学的方法，推测了辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的作用，可能与辛芍组方可增强组织抗氧化能力，减少炎症因子对组织的影响，减轻脑组织缺血、细胞坏死情况，减少神经功能缺失，减轻神经元损伤，改善脑内中性氨基酸比例失调，增强能量代谢，促进细胞生长等作用有关。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)采用GC-MS联用技术检测分析大鼠血清样品及尿液样品：
随机将大鼠分为模型组、假手术组和辛芍组，放入代谢笼中进行观察，期间正常饮食及饮水；各组大鼠按一定剂量，连续给药10天，收集不同时间点的各组大鼠的血清样品和血尿液样品，进行初步处理和保存；然后再次对血清样品进行前处理、尿液样品进行前处理；对大鼠血清和尿液样品进行方法学考察，包括日内精密度考察、日间精密度考察、重复性考察、冻融稳定性考察和QC样本考察，建立GC-MS联用技术检测分析大鼠血清样品及尿液样品的指纹图谱分析方法；
(2)利用PCA和PLS-DA对数据进行分析，结合SPSS17.0，并利用NIST数据库进行代谢物鉴定找出最终的差异代谢物：
在获得GC-MS数据后，用Agilent MSD Chemstation分析软件将原始数据转换为NetCDF格式，导入基于R编程软件的XCMS的软件进行色谱峰提取、去噪、峰匹配、保留时间的矫正、数据导出、保存，将得到的数据进行峰面积归一化处理，采用修正80％规则去除数据缺失值，将获得的数据进行分析；利用SIMCA-P13.0软件对导入的血清样品数据、尿液样品数据进行模式识别分析，假手术组与模型组采用PCA与PLS-DA方法建模，利用变量重要性投影分析VIP值，结合SPSS17.0进行T检验，按照VIP值>1且T检验时P<0.05的标准，筛选出差异代谢物；
将GC-MS检测总离子流图导入NISTAMDIS软件中，进行解卷积分析，利用NIST11数据库对GC-MS检测的内源性差异代谢物进行定性分析，选择质谱数据库中匹配度大于700的物质，进行分析鉴定，进行去硅烷化反应，得到最终的差异代谢物；
(3)通过MetPA在线分析软件对差异代谢物进行通路分析：
为了探索脑缺血再灌注损伤引起的代谢通路的变化，以及给予辛芍组方后对这些代谢通路的影响，将血清样本及尿样样品筛选出的差异代谢物导入MetPA在线分析软件中进行代谢通路分析；通过代谢通路分析后所得影响值，判断代谢通路在代谢网络中是否具有重要影响。
2.根据权利要求1所述基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的模型组、假手术组和辛芍组的具体的处理方法为：模型组和辛芍组采用改良的Longa方法成功制备中脑动脉栓塞大鼠模型，缺血1h后进行再灌注，缓慢外拉栓线使其球端回至颈总动脉内，恢复大脑中动脉的供血，中动脉缺血再灌注造模完成后，放回代谢笼中进行饲养；假手术组除不插栓线外，其它步骤均和模型组一致。
3.根据权利要求1所述基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的各组大鼠按一定剂量是指口服给药，具体为：辛芍组给予辛芍冻干粉针，12.5g·kg-1生药量；假手术组和模型组均给予等量生理盐水。
4.根据权利要求1所述基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的连续给药10天是指手术开始前两天开始口服给药，第三天给药30min后进行手术，在造模后连续给药7天，每天给药一次。
5.根据权利要求1所述基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的不同时间点是指给药前第0天和手术后第1、3、7天的24h后。
6.根据权利要求1所述基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的初步处理和保存的具体方法是将不同时间点获得的血清样品，立刻置于冰上，放置30～40min后，在4℃，6000rpm条件下，离心10min，取上清液，分装为100μL每支，-80℃保存；不同时间点获得的的尿液样品，在4℃，3500rpm条件下，离心10min，取上清液，快速分装为500μL/支，-80℃保存。
7.根据权利要求1所述基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的血清样品进行前处理的具体方法为：取解冻后血清样本100μL于1.5mL的EP管中，加入甲醇250μL，涡混3min，冰浴10min，在4℃，10000rpm条件下，离心10min；取血清甲醇萃取液250μL，置GC进样瓶，N2吹干；加50μL的15mg/mL甲氧胺吡啶溶液混匀，在70℃，肟化1h，加50μL衍生化试剂，混匀，在70℃，衍生化1h，冷却后，转移至1.5mLEP管中，在4℃，15000rpm条件下，离心10min，移取上清液至内插管中，供GC-MS分析。
8.根据权利要求1所述基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的尿液样品进行前处理的具体方法为：取冻存后尿样在室温下解冻，取尿样上清液50μL，加60U的脲酶，涡混30s，在37℃恒温孵育箱中孵化15min，加入180μL的甲醇，混匀，在13000rpm，4℃条件下，离心10min；取200μL上清液至GC进样瓶中，N2吹干；脱水后的样品加入50μL15mg/mL甲氧胺吡啶溶液，涡混30s，培养振荡器中在30℃，200rpm条件下肟化90min；加入有1％的TMCS的MSTFA 50μL，涡混30s，在70℃保持60min，放冷，加入120μL正庚烷，涡混30s，转移至1.5mL的EP管中，混匀，在12000rpm，4℃条件下离心10min，取上清液至内插管中，待GC-MS分析。
9.根据权利要求1所述基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的日内精密度考察包括0、2、6、12、18、24h。
10.根据权利要求1所述基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的QC样本考察是指6批QC样品的总离子流图。
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