CN115290797A - 基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法 - Google Patents
基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法，包括以下步骤：(1)溶液配制；(2)大鼠类风湿关节炎模型的建立；(3)黑骨藤提取物的制备；(4)大鼠血浆样品的收集；(5)血浆样品前处理；(6)GC‑MS分析；(7)GC‑MS血浆代谢组矩阵数据模式识别分析；(8)差异代谢物的鉴定及代谢通路分析。本发明的优点为：黑骨藤提取物具有明显的抗类风湿关节炎(RA)的作用；整合GC‑MS及相关分析初步筛选出与黑骨藤治疗RA相关的内源性代谢成分及代谢途径。提示黑骨藤可能是通过对相关代谢通路进行调节，从而达到抗类风湿关节炎的作用。
Description
技术领域
本发明属于中药学研究领域，特别涉及一种基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法。
背景技术
黑骨藤为萝藦科杠柳属植物黑龙骨PeriplocaforrestiiSchltr.的干燥根或全株，主产贵州，为贵州苗族常用药材，具有祛风除湿，舒筋活血，消炎解毒的功效，收载于《中华本草》(苗药卷)、《苗族医药学》、《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003版)中，贵州苗族地区常用于治疗风湿麻木、类风湿性关节炎等症。临床应用结果表明，黑骨藤提取物及其复方制剂对风湿病和类风湿性疾病有较好的疗效，然而，其具体的作用机制尚不清楚，限制了黑骨藤药材资源的深层次开发利用。
类风湿关节炎(RA)是一种慢性全身性自身免疫性疾病，以慢性对称性多关节炎为特征，以滑膜炎、血管翳形成为基本病理改变，并逐渐出现关节软骨和骨破坏，最终导致关节畸形和功能障碍。目前RA治疗的主要目的是减轻疾病引起的疼痛，延缓疾病的发展，降低发病率，提高患者的生活质量，尚不能完全治愈。因此，探究RA的发病机制对早期诊断、治疗和药物研发具有重要意义。研究表明，RA的病因学涉及复杂的反应和大量的代谢产物，这些代谢物来源于代谢途径的异常。在这些异常代谢物中，一些与疾病进展相关的代谢物发生在疾病进程的早期，甚至在多年出现症状之前。因此，代谢组学可能在RA的早期诊断和机制研究中发挥重要作用。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法，包括以下步骤：(1)溶液配制；(2)大鼠类风湿关节炎模型的建立；(3)黑骨藤提取物的制备；(4)大鼠血浆样品的收集；(5)血浆样品前处理；(6)GC-MS分析；(7)GC-MS血浆代谢组矩阵数据模式识别分析；(8)差异代谢物的鉴定及代谢通路分析。
优选的，所述步骤(1)中溶液配制为甲氧胺吡啶溶液配制和MSTFA溶液配制，所述甲氧胺吡啶溶液的配制方法为称取甲氧胺盐酸盐150mg于10mL的容量瓶中，无水吡啶定容至刻度，配制成浓度为15mg/mL的溶液；所述MSTFA溶液的配制方法为吸取MSTFA990μL加TMCS 10μL，混匀即得。
优选的，所述步骤(2)中模型的建立包括以下步骤：各组大鼠测定其足容积及踝关节周长作为基础值，于每只大鼠右后足足垫皮内注射0.1mL CFA试剂，正常组注射相应的生理盐水，7天后再次免疫，造模21天。
优选的，所述步骤(3)中黑骨藤提取物的制备方法包括以下步骤：取黑骨藤药材，加乙醇提取，过滤，滤液减压浓缩，45℃真空干燥，即得。
优选的，所述步骤(4)中正常组、模型组、黑骨藤组3组大鼠，于末次给药1h后，尾静脉采血，放入涂有肝素钠的离心管中，4℃下6000rpm离心10min，分离取上清液，分装为100μL/支，-80℃保存。
优选的，所述步骤(5)中前处理包括以下步骤：取解冻后血浆样本100μL于1.5mL的EP管中，加入甲醇250μL，涡混3min，冰浴10min，离心；取血浆甲醇萃取液250μL，置GC进样瓶，N2吹干，加50μL的15mg/mL甲氧胺吡啶溶液混匀，肟化1h，加50μL衍生化试剂，混匀，衍生化1h，冷却后，转移至1.5mL EP管中离心，移取上清液至内插管中，备用；
分别取各组解冻血浆样品50μL于同一离心管中，涡混，以100μL每管快速分装至1.5mL离心管中，-80℃保存，作为血浆质控样本。每次进样分析处理时均随行QC样品，QC样本的制备方法与血浆样品的制备方法一致。
优选的，所述步骤(6)中GC-MS仪器型号为Agilent 7890A/5975C-GC/MSD，色谱柱为HP-5MS，进样体积1μL；分流模式为：不分流；进样口温度270℃；EI离子源温度230℃；传输线温度280℃；电子电压为70e V；质谱扫描范围m/z40～600；程序升温条件起始80℃，保持5min；以6℃.min-1速度升温至260℃，保持3min；以10℃·min-1速度升温至310℃，保持5min。
优选的，所述步骤(7)中在获得GC-MS原始数据后，用Agilent MSD Chemstation分析软件将原始数据转换为NetCDF格式，导入XCMS Online在线软件进行色谱峰提取、去噪、峰匹配、保留时间的校正后，得到三维的数据矩阵表，得到的数据进行峰面积归一化处理后采用修正80％规则去除数据缺失值，将获得的数据利用SIMCA-P 14.0软件进行模式识别分析，先采用无监督的主成分分析观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定性，然后采用有监督的正交偏最小二乘法分析区分各组间代谢轮廓的总体差异，找到组间的差异代谢物；热图、p-Value和VIP-plot共同确认对类风湿关节炎组大鼠与正常组大鼠区组具有显著贡献的差异代谢产物。
优选的，所述步骤(8)中结合S-plot图和变量权重值挖掘潜在的差异代谢物，进一步利用t检验验证组间差异代谢物是否具有显著性；一般VIP>1，P<0.05即为潜在的差异代谢物；利用NIST数据库对对筛选出的化合物进行定性分析，选择质谱数据库中匹配度较高的物质进行分析鉴定，并通过检索Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes在线数据库和参考相关文献进行特异性差异性代谢物的结构鉴定，根据鉴定的差异性代谢物，整合应用KEGG数据库进行代谢通路分析，根据相关通路的分析进一步对类风湿关节炎致病机理进行解释。
本发明的有益效果为：
基于GC-MS技术的非靶向代谢谱分析黑骨藤治疗RA的代谢组学研究，结果表明，正常组与模型组可以很好地区分，提示正常组与模型组之间的血浆代谢物存在显著差异，并在正常组、模型组大鼠血浆中鉴定出了32种内源性差异代谢物。将差异代谢物导入MetaboAnalyst 5.0分析平台进行代谢通路分析，发现类风湿关节炎主要与以下通路相关：氨基酸代谢、脂肪酸代谢、三羧酸循环、糖类代谢等。通过黑骨藤治疗后，血浆中23个代谢物被回调，说明黑骨藤可能通过共同调节RA大鼠体内的氨基酸类、糖类、脂类等多个代谢产物对苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代谢、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸的代谢、甘油脂代谢、磷酸肌醇代谢、乙醛酸和二羧酸酯代谢、谷胱甘肽代谢、磷脂酰肌醇信号系统、一次胆汁酸的生物合成、脂肪酸生物合成、糖酵解/糖异生等代谢通路进行调节，进而发挥类风湿关节炎的治疗作用。
附图说明
图1-1治疗前后各组大鼠体重的变化(x±s，n＝8)；图1-2药物对各组大鼠踝周长的影响(x±s，n＝8)；图1-3药物对各组大鼠足容积的影响(x±s，n＝8)；图1-4各组大鼠踝关节病理切片；图2-1血浆样品的精密度考察；图2-2血浆样本重复性考察；图2-3血浆样品的稳定性考察；图2-4系统稳定性；图2-5所有样品PCA分析；图2-6A血浆样品总离子流图(TIC)：A：正常组；图2-6B血浆样品总离子流图(TIC)：B：模型组；图2-6C血浆样品总离子流图(TIC)：C：治疗组；图2-7A正常组与模型组大鼠血浆的PCA得分图(二维图)；图2-7B正常组与模型组大鼠血浆的PCA得分图(三维图)；图2-8A正常组与模型组大鼠血浆的OPLS-DA得分图；图2-8B正常组与模型组大鼠血浆的OPLS-DA置换检验；图2-9正常组和模型组大鼠血浆样品经OPLS-DA分析获得的S-plot图；图2-10正常组与模型组大鼠血浆代谢物热图；图2-11A基于GC-MS的多元统计分析：模型组与治疗组组大鼠血浆的OPLS-DA得分图；图2-11B基于GC-MS的多元统计分析：模型组与治疗组组大鼠血浆的置换检验；图2-11C基于GC-MS的多元统计分析：模型组、正常组及治疗组组大鼠血浆的OPLS-DA得分图；图2-11D基于GC-MS的多元统计分析：模型组、正常组及治疗组组大鼠血浆的OPLS-DA置换检验；图2-12基于GC-MS与MetPA数据库构建的类风湿关节炎总相关代谢通路；图2-13氨基酸代谢通路；图2-14糖代谢通路；图2-15不饱和脂肪酸的生物合成；图2-16三羧酸循环。
具体实施方式
本实验选用经典的类风湿关节炎模型-AA模型，采用雷公藤多苷作为阳性对照药，通过一般情况观察、足肿胀、踝周长测定、踝关节病理检测等，对AA模型进行可靠性评价，对黑骨藤提取物治疗大鼠类风湿关节炎进行药效考察。
1材料
1.1实验试剂
黑骨藤提取物(自制，批号20171113)；雷公藤多苷片(贵州汉方药业有限公司，批号：1459008)；弗氏完全佐剂(CFA，Sigma公司，批号：F1289，规格：10mL)；乙二胺四乙酸二钠(Solarbio，批号：Lot.NO.520L066)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，成都金山化学试剂有限公司，批号：20171013)；苏木精-伊红(Solarbio)，蒸馏水(广州屈臣氏有限公司)。
1.2仪器设备
1.3实验动物
健康SD大鼠32只，SPF级，雄性，体重200±20g，购自贵州医科大学实验动物中心，合格证号SCXK(黔)2018-0001，经贵州医科大学动物实验伦理委员会批准(批准号1603125)，大鼠进入动物室后，饲养于温度20～25℃，湿度40～70％。以标准饲料喂养并每日更换新鲜纯净水，动物饲养室按常规定期消毒，实验前动物适应环境一周。
1.4黑骨藤提取物的制备
黑骨藤药材30kg，加8倍量70％乙醇提取2次，提取时间分别为1.5、1.0h，过滤，合并滤液，减压浓缩至1000g·L-1(以生药计)，45℃真空干燥，即得，提取率7.68％。
2方法
试验通过大鼠一般情况观察、足肿胀测定、病理学检查等，建立了佐剂性关节炎模型作为试验用动物模型。
2.1 AA模型的建立
参照现有文献的方法，各组大鼠测定其足容积及踝关节周长作为基础值，于每只大鼠右后足足垫皮内注射0.1mL CFA试剂，正常组注射相应的生理盐水，7天后再次免疫，造模21天。
2.2动物分组及给药
健康雄性SD大鼠32只，随机分为4个组，即正常组(Control group，简称CG)、模型组(Model group，简称MG)、黑骨藤组(Treatment group，简称TG，87g/kg，以生药计)、雷公藤多苷组(阳性药组，Positive group，简称PG，102mg/kg)每组8只。除正常组注射生理盐水外，其余各组大鼠参照本部分“2.1”项下的造模方法。于造模第21d后开始口服给药，连续给药14天，每天2次，正常组和模型组给予相应的0.5％羧甲基纤维素钠。黑骨藤提取物和雷公藤多苷用0.5％CMC-Na溶液配制。
2.3药理活性评价
2.3.1观察及体重测量
于造模前、造模后第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33天，测量各组大鼠的体重，并观察其精神状态、活跃程度、饮食量、毛色和粪便的变化。
2.3.2关节周长、足肿胀的测定
在大鼠造模前及造模后的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33天，用足趾容积测量仪测定大鼠踝关节及以下容积，并用软尺对大鼠踝关节周长进行测定。
2.3.3血浆样品收集及关节病理检测
建模后第35天，于末次给药后1h经尾静脉取血，放入涂有肝素钠的离心管中，离心10min(4℃，6000rpm)，取上清液，分装为100μL/支，-80℃保存。血浆样品的制备完成后，股动脉取血，切下大鼠右后足踝关节，并将其浸入甲醛溶液中。EDTA-2Na脱钙，乙醇脱水，石蜡包埋切片，苏木精-伊红(HE)染色，用于后续病理检查。
3结果
3.1一般情况的评估
造模前，各组大鼠健康状态良好，皮毛顺滑且带有光泽，饮食正常，精神状态良好。造模后数小时，大鼠脚掌开始出现明显红肿，造模后第1天开始，大鼠踝关节和足趾开始出现红肿，且愈发严重，行动不便。二次免疫后，大鼠多处关节肿胀变形，且出现不同程度的畸形，活动受限。给组体重变化趋势如图1-1显示，正常组大鼠的体重持续增加，而模型组大鼠的体重增加较缓慢。而雷公藤多苷和黑骨藤干预后的疾病大鼠，体重持续上升，且增幅接近正常。
3.2大鼠足肿胀、踝关节周长的测定
实验结果显示，正常组在整个实验过程中，足容积以及踝关节周长几乎无变化，其余组造模后约2h造模侧开始轻微肿胀，2～7天开始减轻，二次免疫后第二天(第9天)各组大鼠足容积和足肿胀达峰值。与正常组相比，各组大鼠足容积及踝关节周长均明显增加；与模型组相比，造模后33d，雷公藤多苷片组和黑骨藤给药组大鼠足容积及踝关节周长显著减少，与雷公藤多苷片组的作用相当。结果见图1-2，1-3。
3.3各组大鼠踝关节HE切片病理分析
选用HE染色方法评价大鼠患关节炎的形态学改变。将制备好的组织切片置于光学显微镜上调至×40倍和×100倍观察。病理学检查显示，正常组大鼠关节结构正常，滑膜细胞单层排列，未见炎性细胞浸润及新生血管形成。与正常组相比较，模型组出现明显的炎症症状，包括滑膜组织中滑膜巨噬细胞大量增生，纤维细胞增生形成纤维组织，大量炎症细胞浸润；与模型组相比较，雷公藤多苷片组和黑骨藤组大鼠的病变明显减轻，滑膜巨噬细胞、纤维细胞轻度增生，炎症细胞浸润散在。从病理角度可以看出，黑骨藤提取物可以改善类风湿关节炎的发病病程，具有较好的干预作用。结果见图1-4。
4讨论
佐剂性关节炎(AA)动物模型，又称弗氏佐剂关节炎模型，是一种使用广泛的风湿性关节炎动物模型，此方法建立较早，简单易行，其病理表现也类似于人，是一种研究类风湿关节炎的经典模型。类风湿关节炎的病因尚未明了，但越来越多的研究表明可能与遗传、环境以及内分泌等因素有关，其中多种细胞参与了RA的发生及发展过程，如成纤维样滑膜细胞，其异常活化后产生大量炎性浸润和过度增殖将诱发并加重炎症反应，释放多种细胞因子，如TNF-α和IL-1β等进一步刺激细胞产生各种炎症因子，从而形成一个恶性循环，不断加重炎症反应[26]。课题前期也研究表明，黑骨藤能显著降低血浆中的RF，TNF-α和IL-1β浓度，明确了黑骨藤具有抗类风湿关节炎的作用。
本研究结果表明，黑骨藤提取物干预后，能延缓继发性病变的进程，减轻整个病程中的炎症症状，使损伤的大鼠骨质得到恢复从而改善了疾病大鼠的生命状态。在RA中，滑膜细胞的增生、炎性细胞的浸润、软骨破坏以及血管翳的形成是最主要的病理学特征。病理切片实验结果表明，黑骨藤能显著改善造模后大鼠踝关节出现的炎性细胞浸润、软骨的破坏、关节间隙狭窄以及血管翳形成等现象。这表明黑骨藤可以通过减少发炎的爪组织中炎性细胞的浸润和滑膜的发炎并抑制破骨细胞的分化和增加来保护骨骼和关节。仅从体重、足肿胀、关节炎指数和病理切片这几个方面结果分析，认为其对类风湿关节炎的治疗有良好的效果。另外，我们也发现模型组大鼠的足趾体积、踝关节周长随着时间的推移，也呈现减小的趋势，这可能是由于大鼠机体具有自我修复的作用，但模型组减小的速率明显低于药物干预组。但同时我们也看到，经治疗药物干预后，AA模型大鼠的生理状态并没有完全恢复到正常水平，可能是由于类风湿关节炎本身是一种慢性退行性疾病，其对于机体的损伤是以一种长期的，不可逆的方式进行的。因此，对于类风湿关节炎早预防、早发现、早治疗至关重要。
5小结
本研究成功复制大鼠佐剂性关节炎模型，AA模型组大鼠出现明显的炎症症状，包括细胞炎症、滑膜增生、骨侵蚀、软骨破坏。经过雷公藤多苷片和黑骨藤治疗后，AA模型大鼠的病变明显减轻，滑膜巨噬细胞、纤维细胞轻度增生，炎症细胞浸润散在。从病理角度可以看出，黑骨藤提取物可以改善类风湿关节炎的发病病程，具有较好的干预作用。
通过建立AA大鼠模型，以大鼠体重变化、足肿胀程度、踝关节周长等直观评价黑骨藤提取物对AA模型大鼠的疾病改善作用。实验结果表明，黑骨藤能一定程度的改善模型大鼠的关节炎外观症状，随着治疗时间的增加，通过药物治疗后的模型大鼠体重增加明显高于模型组，初步证实黑骨藤具有缓解类风湿关节炎病情发展的作用。本章动物模型的构建及评价为后续研究奠定了基础。
类风湿关节炎(RA)是一种发生于滑膜关节的慢性炎症性疾病。RA的组织病理学表现为明显的血管生成、细胞增生、炎性白细胞内流以及细胞表面粘附分子、蛋白酶、蛋白酶抑制剂和多种细胞因子的表达变化。RA的发病机制复杂，故针对单个靶点治疗存在一定的局限性，难以达到理想的治疗效果。黑骨藤治疗RA疗效确切，且具有多途径、多环节、多靶点的整体性调节特点，但其作用机制尚不明确，这限制了黑骨藤药材的深层次开发和利用。代谢组学是系统生物学的重要组成部分，其借助现代分析技术和生物信息学技术，通过分析药物干预前后生物体液、组织中的内源性小分子物质代谢轮廓的变化，从整体上反映机体的状况，符合中药治疗多途径、多环节、多层次、多靶点的研究需要，可以更好地揭示黑骨藤治疗RA的作用机制。因此，本研究采用GC-MS技术，通过正常对照组与AA模型组血浆代谢物进行比较，寻找与RA密切相关的差异性代谢物，通过模式识别方法研究黑骨藤治疗后代谢通路的变化，进一步了解黑骨藤治疗RA的作用机制。
1材料
1.1实验试剂
甲醇为色谱醇，购置于德国Merck公司；正庚烷为色谱纯，吡啶(无水级，纯度≥99.9％)、甲氧胺盐酸盐，购置于aladdin；丙酮为分析醇，购置于天津科密欧化学试剂有限公司；N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)均购置于sigma。
1.2仪器设备
1.3实验动物
同第一部分。
2方法
2.1溶液配制
甲氧胺吡啶：称取甲氧胺盐酸盐150mg于10mL的容量瓶中，无水吡啶定容至刻度，配制成浓度为15mg/mL的溶液。
MSTFA(含1％TMCS)溶液：吸取MSTFA990μL加TMCS 10μL，混匀即得。
2.2大鼠类风湿关节炎模型的的建立
同第一部分。
2.3黑骨藤提取物的制备
同第一部分。
2.4大鼠血浆样品收集
取“第一部分”中正常组(CG)、模型组(MG)、黑骨藤组(TG)3组大鼠，于末次给药1h后，尾静脉采血，放入涂有肝素钠的离心管中，4℃下6000rpm离心10min，分离取上清液，分装为100μL/支，-80℃保存。
2.5血浆样品前处理
取解冻后血浆样本100μL于1.5mL的EP管中，加入甲醇250μL，涡混3min，冰浴10min，离心(10000rpm，10min，4℃)。取血浆甲醇萃取液250μL，置GC进样瓶，N2吹干。加50μL的15mg/mL甲氧胺吡啶溶液混匀，肟化1h(70℃)，加50μL衍生化试剂(MSTFA:TMCS＝100：1，V/V)，混匀，衍生化1h(70℃)，冷却后，转移至1.5mL EP管中离心(15000rpm，10min，4℃)，移取上清液至内插管中，供GC-MS分析。
分别取各组解冻血浆样品50μL于同一离心管中，涡混，以100μL每管快速分装至1.5mL离心管中，-80℃保存，作为血浆质控样本。每次进样分析处理时均随行QC样品，QC样本的制备方法与血浆样品的制备方法一致。
2.6 GC-MS分析
GC-MS仪器型号为Agilent 7890A/5975C-GC/MSD(美国)，色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm，0.25μm)，进样体积1μL。分流模式为：不分流；进样口温度270℃；EI离子源温度230℃；传输线温度280℃；电子电压为70e V；质谱扫描范围m/z 40～600；程序升温条件起始80℃，保持5min；以6℃.min-1速度升温至260℃，保持3min；以10℃·min-1速度升温至310℃，保持5min。
2.7 GC-MS血浆代谢组矩阵数据模式识别分析
在获得GC-MS原始数据后，用Agilent MSD Chemstation分析软件将原始数据转换为NetCDF格式，导入XCMS Online(https://xcmsonline.scripps.edu)在线软件进行色谱峰提取、去噪、峰匹配、保留时间的校正后，得到三维的数据矩阵表，得到的数据进行峰面积归一化处理后采用修正80％规则去除数据缺失值，将获得的数据利用SIMCA-P 14.0软件(version 14.0，Umetrics，Umea，Sweden)进行模式识别分析，先采用无监督的主成分分析(PCA)观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定性，然后采用有监督的正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)区分各组间代谢轮廓的总体差异，找到组间的差异代谢物。热图(Heatmap)、p-Value和VIP-plot(VIP>1)共同确认对类风湿关节炎组大鼠与正常组大鼠区组具有显著贡献的差异代谢产物。
2.8差异代谢物的鉴定及代谢通路分析
结合S-plot图和变量权重值(VIP)挖掘潜在的差异代谢物，进一步利用t检验验证组间差异代谢物是否具有显著性(P<0.05)。一般VIP>1，P<0.05即为潜在的差异代谢物。最后，利用NIST数据库对对筛选出的化合物进行定性分析，选择质谱数据库中匹配度较高的物质(>800)进行分析鉴定[30]。并通过检索Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)(http://www.kegg.jp/)、HumanMetabolome Database(HMDB)http://www.hmdb.ca/)在线数据库和参考相关文献进行特异性差异性代谢物的结构鉴定。最后根据鉴定的差异性代谢物，整合应用KEGG(http://www.kegg.jp/)，MetaboAnalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca/)数据库进行代谢通路分析，根据相关通路的分析进一步对类风湿关节炎致病机理进行解释。
3结果
3.1 GC-MS分析方法验证
所有血浆样品，取等体积混合制备质量控制(QC)样品。取混合血浆100μL，按血浆样品处理方法制备后进行分析。选择10个不同保留时间的离子(6.175min、12.206min、13.561min、18.186min、21.316min、24.224min、24.974min、31.896min、34.753min、37.533min)，计算各离子归一化后峰面积的相对标准偏差，并比较多次进样后得到的TIC图的色谱峰个数，考察分析方法的性能[31]。
3.1.1仪器精密度
取混合血浆样品，按血浆样品处理方法制备1份QC样品，连续进样分析5次，将5次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较(见图2-1)，同时考察10个主要共有峰，结果表明，色谱峰个数均一致，共有峰峰面积的RSD均在2.1％-10.6％之间，结果表明仪器精密度良好。
3.1.2方法重复性
取一份血浆样品，按血浆样品处理方法平行制备5份样品进样分析，将TIC图的色谱峰个数进行比较(见图2-2)，同时考察10个主要共有峰，结果表明，色谱峰个数均一致，共有峰峰面积的RSD均在1.8％-11.4％之间，结果表明方法重复性良好。
3.1.3样品稳定性
取一份血浆样品，按血浆样品处理方法制备，24h内连续进样六次(0、2、6、12、18、24h)，将6次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较(见图2-3)，同时考察10个主要共有峰，结果表明，色谱峰个数均一致，共有峰峰面积的RSD均在3.3％-12.4％之间，表明样品衍生化后放置24h稳定。
3.1.4系统稳定性
随机抽取每批次随行处理的QC样品1个，进行分析，将每次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较(见图2-4)，同时考察10个主要共有峰峰面积的RSD，结果表明，色谱峰个数基本上一致，RSD均在5.0％-14.4％之间。另外，对所有样本进行PCA分析，观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的系统稳定性，如下图2-5所示，对所获得的所有代谢物进行PCA分析，所有QC样品在原点附近紧密聚集，表明本实验的重复性良好。
3.2大鼠血浆GC-MS分析TIC图
采用目前较为成熟的GC-MS代谢组学平台技术对血浆样本进行检测。正常组、模型组和黑骨藤治疗组大鼠血浆样品的典型总离子流色谱图(TIC)如图2-6所示，由于共流出峰的存在，数据相当复杂，故采用“2.7项下”代谢组学数据处理方法对采集到的质谱数据进行质谱数据预处理，将复杂的质谱信号转化成有用的定性定量数据，以表征各组之间的代谢特征。在下面的分析中，将采用多元统计分析方法来获得各组的组学特征。
3.3血浆代谢物谱主成分分析(PCA)
采用基于GC-MS的代谢组学方法分析模型组大鼠(MG)和正常组(CG)大鼠血浆中内源性代谢物的变化，结合PCA分析和OPLS-DA分析进行模式识别。首先采用SIMCA-P 14.0对正常组和模型组数据进行PCA分析。结果如图2-7A所示，模型组(MG)和正常组(CG)能够明显分开。R2X是评价PCA模型质量的主要参数。R2X(R2X＝0.646)大于0.5，说明模型质量好，预测准确。为了更清晰的直观的观察两组生物样本的空间分布，我们又展示了主成分分析的三维立体得分图，在3D图中(图2-7B)，能够更加直观的看到模型组大鼠(MG)和正常组(CG)也同样的自然聚集为两部分；左部分聚集了模型组大鼠样本，正常组大鼠样本都聚集到了右部分，结果说明完全佛氏佐剂干预后大鼠体内代谢物发生显著变化。
3.4正交偏最小二乘法(OPLS-DA)及置换检验
为了清楚的解释究竟是哪些内源性代谢物的变化导致模型组与正常组有如此大的差异，我们将进一步采用有监督的OPLS-DA分析区分各组间代谢轮廓的总体差异，找到组间的差异代谢物。结果如图2-8A所示，模型组大鼠(MG)和正常组(CG)明显的位于两侧，说明两组代谢物之间存在显著差异。由于多元统计分析是基于模型构建的基础上进行，所以对模型的可靠性评价是非常有必要的，评价模型的参数有R2X，R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q2表示模型的预测能力，这3个指标越接近于1时表示模型越稳定可靠，一般Q2>0.5表示模型的预测能力较好。结果表明，模型组大鼠(MG)和正常组(CG)所建立的OPLS-DA数据模型具有较好区分能力以及预测能力(R2X＝0.540，R2Y＝0.981，Q2＝0.953)，采用置换检验进行模型验证，经200次置换检验后模型所有R2的点从左到右均高于Q2的点，见图2-8B(R2＝0.459，Q2＝-0.651)，说明模型可靠，不存在过拟合情况，可用于差异代谢物分析。
3.5差异性代谢物的鉴定与比较
经过模型的诊断确认模型可用于其差异标志物的筛选后，本研究进一步对差异的标志代谢物进行筛选，以期寻找与类风湿关节炎相关的差异性代谢标志物，为疾病的早期诊断奠定基础。结合S-plot图(图2-9)和VIP>1及t检验(P<0.05)筛选正常对照组与模型组之间显著改变的差异变量，再利用NIST数据库对内源性代谢物进行定性分析，选择NIST数据库中匹配度>800的物质。并通过检索KEGG和HMDB在线数据库确认代谢标志物结构。综合以上信息，共鉴定出与类风湿关节炎相关的潜在生物标记物32个，见表2-1。
为了更直观地显示不同样本中代谢物的表达差异，我们对所有显著的代谢物进行聚类分析。如热图(Heatmap)图2-10所示，横坐标表示样本名称，纵坐标表示差异代谢物。颜色从绿到红表示代谢物的表达丰度从低到高，即越红表示差异代谢物的表达丰度越高。从图2-10中可以看出正常组(CG)和模型组(MG)清晰地分为两个簇，与PCA模型结果一致，说明筛选出的代谢产物是合理的，从热图中也可以看到，与正常组(CG)比较，模型组(MG)中有14种内源性代谢产物上调，18种内源性代谢产物下调。这些物质主要包括以下几类：
(1)脂类：
Propanoic acid(丙酸)、Glycerol(甘油)、9，12-Octadecadienoic acid(9，12-十八碳二烯酸)、Oleic acid(油酸)、Eicosanoic acid(二十烷酸)、Octadecanoic acid(十八烷酸)、Butanoic acid(丁酸)、Hentriacontane(庚三烷)、Myo-Inositol(肌醇)、Heptacosane(庚烷)、Arachidonic acid(花生四烯酸)、Hexadecanoic acid(十六烷酸)、Tetracosane(四烷)、Octadecane(十八烷)、Triacontane(金刚烷)、Urea(尿素)；
(2)氨基酸类：
L-Valine(缬氨酸)、aminoethanesulfonic acid(氨基乙磺酸)、Glycine(甘氨酸)、L-phenylalanine(L-苯丙氨酸)、DL-Ornithine(DL-鸟氨酸)、L-Lysine(L-赖氨酸)；(3)糖类：
D-Ribose(D-核糖)、D-(+)-Xylose(D-(+)-木糖)、1，5-Anhydro-D-sorbitol(1，5-脱水-D-山梨糖醇)、d-Mannose(甘露糖)、D-Fructose(D-果糖)、d-Glucose(葡萄糖)；
(4)其它：
(R)-3-Hydroxybutyric acid((R)-3-羟基丁酸)、Estragole(雌草酮)、Butanedioic acid(琥珀酸)、1，3，5-Triazine(1，3，5-三嗪)。
表2-1正常组与模型组比较血浆中潜在的生物标志物及其含量水平(↑，上调；↓，下调)
3.6黑骨藤对佐剂型关节炎大鼠血浆代谢轮廓的影响
黑骨藤是一种治疗类风湿关节炎有效的苗药，然而由于黑骨藤化学成分复杂，其治疗类风湿关节炎的作用机制仍然不是十分清楚。由于32种类风湿关节炎相关的潜在生物标志物已经通过上述代谢组学研究得到，可见，利用这些标志物作为监测指标进一步研究黑骨藤的治疗作用是合理的。因此，使用这32种生物标志物水平作为变量的OPLS-DA模型进一步用于评价黑骨藤的治疗作用，同时对标志物在不同组的变化情况也进行了分析。
对模型组(MG)和黑骨藤治疗组(TG)进行OPLS-DA分析，其模型评价参数(R2X＝0.847，R2Y＝0.998，Q2＝0.78)表明模型具有很好的预测能力和可靠性，不存在过拟合现象(见图2-11B，R2＝0.754，Q2＝-0.48)。从图2-11A看出，模型组(MG)和黑骨藤治疗组(TG)分布于两个区域，且都在95％的区间内，说明样本未出现离散值，且黑骨藤治疗组大鼠代谢轮廓向正常组偏移(见图2-11C，模型评价参数参数R2X＝0.823，R2Y＝0.970，Q2＝0.871)，表明黑骨藤可以调节关节炎大鼠的代谢扰动，一定程度的逆转了RA的病理过程。置换检验结果见图2-11D(R2＝0.611，Q2＝-0.472)，说明模型较好，不存在过拟合现象。进一步分析发现黑骨藤的确能够不同程度的回调类风湿关节炎大鼠血浆中的23种内源性物质(见表2-2)，包括雌草酮、缬氨酸、丁酸、尿素、甘油、氨基磺酸、甘氨酸、L-苯丙氨酸、庚三烷、DL-鸟氨酸、1，5-脱水-D-山梨糖醇、D-果糖、葡萄糖、L-赖氨酸、肌醇、庚烷、9，12-十八碳二烯酸、油酸、二十烷酸、十六烷酸、十八烷酸、十八烷、金刚烷等小分子代谢物向正常水平恢复的趋势。
表2-2黑骨藤治疗组与模型组比较血浆中潜在的生物标志物及其含量水平
↑：代谢物水平上调；↓：代谢物水平下调；a变化趋势：MG组与CG组相比，b变化趋势：TG组与MG组相比。
3.7代谢通路分析
为了探索类风湿关节炎引起的代谢通路的变化，以及给予黑骨藤治疗后对这些代谢通路的影响，将血浆样品中筛选出的32个差异代谢物导入MetaboAnalyst 5.0数据库中进行代谢通路分析，分析结果见图2-12及表2-3。结果表明，在血浆样品代谢组学层面上，类风湿关节炎主要影响了血浆中的36条代谢通路，主要包括脂肪酸代谢、氨基酸代谢、糖代谢及其它：
(1)脂肪酸代谢：
Linoleic acidmetabolism(亚油酸代谢)、Arachidonic acidmetabolism(花生四烯酸代谢)、Citrate cycle(柠檬酸盐循环(三羧酸循环))、Fatty acid biosynthesis(脂肪酸生物合成)、Biosynthesis ofunsaturated fatty acids(不饱和脂肪酸的生物合成)、Butanoate metabolism(丁酸酯代谢)、Propanoate metabolism(丙酸酯代谢)、Fatty acidelongation(脂肪酸伸长率)、Fatty acid degradation(脂肪酸降解)；
(2)糖代谢：
Glycolysis/Gluconeogenesis(糖酵解/糖异生)、Pentose phosphate pathway(磷酸戊糖途径)、Pentose and glucuronate interconversions(戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化)、Glyoxylate and dicarboxylate metabolism(乙醛酸和二羧酸的代谢)、Galactose metabolism(半乳糖代谢)、Synthesis and degradation ofketone bodies(酮体的合成与降解)；
(3)氨基酸代谢：
Phenylalanine，tyrosine and tryptophanbiosynthesis(苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成)、Taurine andhypotaurine metabolism(牛磺酸和牛磺酸的代谢)、Lysine degradation(赖氨酸降解)、Phenylalanine metabolism(苯丙氨酸代谢)、Glycine，serine andthreonine metabolism(甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸的代谢)、Glutathione metabolism(谷胱甘肽代谢)、Valine,leucine,andisoleucinebiosynthesis(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成)、Argininebiosynthesis(精氨酸生物合成)、Alanine,aspartate,and glutamate metabolism(丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢)、Valine,leucine,and isoleucine degradation Purinemetabolism(缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的降解嘌呤代谢)；
(4)磷脂代谢：
Glycerolipid metabolism(甘油脂代谢)、Inositol phosphate metabolism(磷酸肌醇代谢)、Phosphatidylinositol signaling system(磷脂酰肌醇信号系统)；
(5)其它：
Primary bile acid biosynthesis(一次胆汁酸的生物合成)、Aminoacyl-tRNAbiosynthesis(氨酰基-tRNA的生物合成)、Pantothenate and CoAbiosynthesis(泛酸和CoA生物合成)、Amino sugar and nucleotide sugar metabolism(氨基糖和核苷酸糖代谢)、Purine metabolism(嘌呤代谢)。
代谢通路分析结果见图2-12，代谢通路图中每个气泡可代表一条代谢通路，气泡越大颜色越深表示与类风湿关节炎越密切。表2-3中所示的代谢通路均是RA模型组中大鼠代谢物异常的代谢通路，黑骨藤可通过共同调节氨基酸类、糖类、脂类等多个代谢产物对氨基酸代谢甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢、糖酵解/糖异生等代谢通路进行调节，进而发挥类风湿关节炎的治疗作用。
表2-3基于GC-MS与MetPA数据库构建的类风湿关节炎主要的代谢通路结果
表注：总数是该途径中化合物的总数；匹配数是用户上传数据中实际匹配的数字；Rawp是通过富集分析计算得出的原始p值；Holmp是通过Holm-Bonferroni方法调整的p值；FDR是错误发现率；影响是根据路径拓扑分析计算得出的路径影响值。
4讨论
近年来代谢组学技术迅速发展，在各个领域的应用越来越广泛，在疾病的诊断生物标记物发现和机制研究方面具有很大的优势和潜力。本研究采用气相色谱质谱联用技术(GC-MS)对血浆样本进行非靶向代谢组学研究，实验过程严谨有序，数据经过归一化处理，应用SIMCA-P14.0软件对数据进行PCA、OPLS-DA等系统性分析，我们发现类风湿关节炎大鼠血浆与正常大鼠血浆有明显的分离，说明模型大鼠体内出现代谢紊乱。根据S-plot图相应的VIP值筛选出差异代谢产物。另外经我们对差异代谢物进行通路分析，发现类风湿关节炎疾病过程涉及的代谢通路主要包括氨基酸代谢、脂肪酸代谢、三羧酸循环、糖类代谢。黑骨藤可能主要通过调节上述通路产生抗类风湿关节炎的作用。
4.1氨基酸类代谢物的生物学意义
实验发现，RA模型组大鼠血浆中甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸的浓度降低，赖氨酸也是必需氨基酸之一，能促进机体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。另外赖氨酸还可与其他营养一起形成胶原蛋白，保护骨骼和结缔组织。RA患者常出现关节肿胀变形，可能与体内的氨基酸代谢紊乱有关。苯丙氨酸是一种必需氨基酸，是酪氨酸和儿茶酚胺等神经递质的前体。RA模型大鼠血浆中苯丙氨酸含量降低，提示苯丙氨酸代谢可能得到促进。可能是由于机体肠道菌群异常，导致苯丙氨酸代谢异常。缬氨酸是一种含有脂肪族侧链的支链氨基酸。支链氨基酸可以改变细胞因子的产生模式，导致免疫反应的转移。我们发现一些缬氨酸在RA大鼠血浆中上调，表明在RA大鼠氨基酸代谢过程中对必须氨基酸的利用降低，缬氨酸水平下降，可能引起免疫系统的改变。甘氨酸是许多代谢反应中的关键化合物，甘氨酸受体是一种重要的抑制性受体，分布在如单核巨噬细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞等细胞膜上，并参与体内的免疫反应和炎症反应。甘氨酸受体可通过与其受体结合，抑制这些细胞的活性，从而发挥抗炎作用。
本研究发现RA大鼠血浆中甘氨酸水平降低，导致机制炎症反应增强。另外，牛磺酸以其具有独特的抗氧化功能特性，可以下调促炎症细胞因子，如TNF-α。本文中发现，RA大鼠血浆中牛磺酸(又称α-氨基乙磺酸)含量下降，表明牛磺酸在参与抗氧化过程中因参与分解活性氧被大量消耗，从而导致含量降低。这些发现提示，RA患者体内的氨基酸分解代谢异常增强，紊乱的氨基酸分解代谢与炎症关节的低氧状态，限制了葡萄糖和其他大分子从血液扩散进入滑膜，导致脂质降解增加，酮体在滑膜内富集，最终致使RA的发生。
4.2糖类代谢物的生物学意义
在我们的研究中，在RA疾病进展过程中，D-葡萄糖、D-果糖水浓度下降，提示糖酵解活性和有氧氧化降低。RA模型大鼠血浆中1，5-脱水-D-山梨糖醇、甘露糖、L-缬氨酸、甘油、肌醇、丙酸的水平改变。在这些代谢产物中，甘露糖、1，5-脱水-D-山梨糖醇、甘油、丙酸、L-缬氨酸升高，肌醇降低。这些代谢产物参与了乙醛酸和二羧酸代谢、半乳糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化、肌醇代谢和丙酸代谢。半乳糖代谢可能与慢性炎症有关，它的缺失与类风湿关节炎的严重程度相关。因此，半乳糖代谢的紊乱可能是类风湿关节炎的重要特征。
4.3脂肪酸类代谢物的生物学意义
在RA患者体内，脂肪酸代谢发生了显著的改变。游离脂肪酸9，12-十八碳二烯酸、油酸、二十烷酸、十八烷酸和短链脂肪酸丙酸的浓度在患者血浆中异常増高，与此同时，游离脂肪酸发生β氧化的代谢产物3-羟基丁酸的水平也AA模型组中显著升高，这说明RA患者体内脂肪酸的分解代谢加强。体循环中的脂肪酸主要来自于甘油三酯的水解，实验发现在RA组中甘油三酯的另一水解产物甘油也显著增加，这说明患者体内的脂肪被大量动员，脂肪酸的生成速率超过了其分解代谢速率，最终引起游离脂肪酸的异常升高。另外，具有重要生物活性的多不饱和脂肪酸花生四烯酸在RA组中也明显改变。不饱和脂肪酸可促进炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的产生，进而增加与RA相关的两种重要炎症因子PGE2和NO的产生。在我们的研究中观察到大量脂肪酸代谢中的代谢物显著上调。黑骨藤对油酸、二十烷酸、十六烷酸、十八烷酸、9，12-十八碳二烯酸的含量有明显的调节作用。
4.4三羧酸循环的生物学意义
三羧酸循环发生在线粒体中，三羧酸循环是糖、蛋白质、脂质的最终代谢通路，也是机体获得能量的主要方式，三羧酸循环的中间体也是许多生物合成途径的前体。三羧酸循环的速率反映了能量代谢的状况。由于细胞线粒体中含有大量的三羧酸循环酶，组织中三羧酸循异常分泌可导致线粒体功能发生障碍。在本文中，与对照组相比，AA模型组大鼠血浆中的琥珀酸水平下降，提示三羧酸循环发生紊乱。三羧酸循环紊乱会使机体出现低氧、缺氧状态，机体的低氧状态导致ATP生成障碍，关节骨质破坏，细胞受损，导致RA的产生与加剧。
本研究以正常大鼠及RA模型大鼠血浆为样本，采用GC-MS代谢组学技术对其进行差异代谢物筛选，结果共筛选出32种差异代谢物，这些差异代谢物的升高或降低可能与RA的发生发展密切相关。为了更好地阐释RA的发病机制，本研究构建了差异性代谢物的代谢通路，结果发现这些代谢物主要涉及4条代谢通路，主要包括：氨基酸代谢、脂肪酸代谢、三羧酸循环、糖类代谢等。通过给予黑骨藤治疗后，模型大鼠体内的23个内源性物质被回调，包括雌草酮、缬氨酸、丁酸、尿素、甘油、氨基磺酸、甘氨酸、L-苯丙氨酸、庚三烷、DL-鸟氨酸、1，5-脱水-D-山梨糖醇、D-果糖、葡萄糖、L-赖氨酸、肌醇、庚烷、9，12-十八碳二烯酸(Z，Z)、油酸、二十烷酸、十六烷酸、十八烷酸、十八烷、金刚烷等。黑骨藤可能通过共同调节RA大鼠体内的氨基酸类、糖类、脂类等多个代谢产物对苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代谢、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸的代谢、甘油脂代谢、磷酸肌醇代谢、乙醛酸和二羧酸酯代谢、谷胱甘肽代谢、磷脂酰肌醇信号系统、一次胆汁酸的生物合成、脂肪酸生物合成、糖酵解/糖异生等代谢通路进行调节，进而发挥类风湿关节炎的治疗作用。
本研究成功复制了大鼠佐剂性关节炎(AA)模型，给予黑骨藤治疗后，通过大鼠足肿胀程度，踝关节，踝关节病理检测结果表明黑骨藤具有明显的抗类风湿关节炎的作用。第二部分以正常大鼠及AA模型大鼠血浆为样本，采用GC-MS代谢组学技术进行差异性代谢物筛选，结果共筛选出32种差异性代谢物，这些差异性代谢物共涉及4条代谢通路，主要包括：氨基酸代谢、脂肪酸代谢、三羧酸循环、糖类代谢。通过黑骨藤治疗后，23个内源性物质被回调，包括雌草酮、缬氨酸、丁酸、尿素、甘油、氨基磺酸、甘氨酸、L-苯丙氨酸、庚三烷、DL-鸟氨酸、1，5-脱水-D-山梨糖醇、D-果糖、葡萄糖、L-赖氨酸、肌醇、庚烷、9，12-十八碳二烯酸(Z，Z)、油酸、二十烷酸、十六烷酸、十八烷酸、十八烷、金刚烷等。
综上所述，佐剂型关节炎大鼠的血浆中糖类、氨基酸类、不饱和脂肪酸、甘油磷脂、鞘脂、脂肪酰基、吲哚及其衍生物等多种物质的水平显著改变，黑骨藤通过共同改变体内的糖类代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、甘油磷酸代谢等通路的代谢紊乱发挥治疗类风湿关节炎的作用。为进一步深入研究类风湿关节炎的病理生理基础及寻找诊断标志物提供实验依据。有助于进一步了解类风湿关节炎可能的发病机制以及黑骨藤治疗RA的作用机制，为类风湿关节炎的早期疾病预测、诊断和药物治疗提供了参考。
5研究特色与创新
5.1本研究采用非靶向代谢组学的研究方法研究佐剂型关节炎模型大鼠血浆中代谢物质组的变化规律，代谢组学作为一种新兴的研究手段，为研究RA提供了一种新的手段。
5.2首次采用代谢组学的研究方法研究黑骨藤干预的类风湿关节炎大鼠血浆中代谢组的变化规律，将中药的治疗作用用可视化的多维统计结果表示出来，并探讨了黑骨藤可能的作用靶点，为黑骨藤的药效评价和机制研究提供了新的研究思路。
Claims (9)
1.一种基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)溶液配制；
(2)大鼠类风湿关节炎模型的建立；
(3)黑骨藤提取物的制备；
(4)大鼠血浆样品的收集；
(5)血浆样品前处理；
(6)GC-MS分析；
(7)GC-MS血浆代谢组矩阵数据模式识别分析；
(8)差异代谢物的鉴定及代谢通路分析。
2.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法，其特征在于：所述步骤(1)中溶液配制为甲氧胺吡啶溶液配制和MSTFA溶液配制，所述甲氧胺吡啶溶液的配制方法为称取甲氧胺盐酸盐150mg于10mL的容量瓶中，无水吡啶定容至刻度，配制成浓度为15mg/mL的溶液；所述MSTFA溶液的配制方法为吸取MSTFA990μL加TMCS 10μL，混匀即得。
3.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法，其特征在于：所述步骤(2)中模型的建立包括以下步骤：各组大鼠测定其足容积及踝关节周长作为基础值，于每只大鼠右后足足垫皮内注射0.1mL CFA试剂，正常组注射相应的生理盐水，7天后再次免疫，造模21天。
4.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法，其特征在于：所述步骤(3)中黑骨藤提取物的制备方法包括以下步骤：取黑骨藤药材，加乙醇提取，过滤，滤液减压浓缩，45℃真空干燥，即得。
5.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法，其特征在于：所述步骤(4)中正常组、模型组、黑骨藤组3组大鼠，于末次给药1h后，尾静脉采血，放入涂有肝素钠的离心管中，4℃下6000rpm离心10min，分离取上清液，分装为100μL/支，-80℃保存。
6.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法，其特征在于：所述步骤(5)中前处理包括以下步骤：取解冻后血浆样本100μL于1.5mL的EP管中，加入甲醇250μL，涡混3min，冰浴10min，离心；取血浆甲醇萃取液250μL，置GC进样瓶，N2吹干，加50μL的15mg/mL甲氧胺吡啶溶液混匀，肟化1h，加50μL衍生化试剂，混匀，衍生化1h，冷却后，转移至1.5mL EP管中离心，移取上清液至内插管中，备用；
分别取各组解冻血浆样品50μL于同一离心管中，涡混，以100μL每管快速分装至1.5mL离心管中，-80℃保存，作为血浆质控样本。每次进样分析处理时均随行QC样品，QC样本的制备方法与血浆样品的制备方法一致。
7.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法，其特征在于：所述步骤(6)中GC-MS仪器型号为Agilent7890A/5975C-GC/MSD，色谱柱为HP-5MS，进样体积1μL；分流模式为：不分流；进样口温度270℃；EI离子源温度230℃；传输线温度280℃；电子电压为70e V；质谱扫描范围m/z 40～600；程序升温条件起始80℃，保持5min；以6℃.min-1速度升温至260℃，保持3min；以10℃·min-1速度升温至310℃，保持5min。
8.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法，其特征在于：所述步骤(7)中在获得GC-MS原始数据后，用Agilent MSD Chemstation分析软件将原始数据转换为NetCDF格式，导入XCMS Online在线软件进行色谱峰提取、去噪、峰匹配、保留时间的校正后，得到三维的数据矩阵表，得到的数据进行峰面积归一化处理后采用修正80％规则去除数据缺失值，将获得的数据利用SIMCA-P 14.0软件进行模式识别分析，先采用无监督的主成分分析观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定性，然后采用有监督的正交偏最小二乘法分析区分各组间代谢轮廓的总体差异，找到组间的差异代谢物；热图、p-Value和VIP-plot共同确认对类风湿关节炎组大鼠与正常组大鼠区组具有显著贡献的差异代谢产物。
9.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法，其特征在于：所述步骤(8)中结合S-plot图和变量权重值挖掘潜在的差异代谢物，进一步利用t检验验证组间差异代谢物是否具有显著性；一般VIP>1，P<0.05即为潜在的差异代谢物；利用NIST数据库对对筛选出的化合物进行定性分析，选择质谱数据库中匹配度较高的物质进行分析鉴定，并通过检索Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes在线数据库和进行特异性差异性代谢物的结构鉴定，根据鉴定的差异性代谢物，整合应用KEGG数据库进行代谢通路分析，根据相关通路的分析进一步对类风湿关节炎致病机理进行解释。
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