CN109406675A - 一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法，基于UPLC‑Q‑TOF/MS技术和代谢组学研究方法对高脂血症大鼠尿液代谢物进行检测，通过代谢组学研究方法寻找差异代谢物，通过筛选排除机制，获得13种具有降脂作用机制的特异性生物标记物，利用生物标记物含量的回调变化来实现对降脂作用机制的识别及高通量分析；通过MetaboAnalyst在线分析软件对差异代谢物进行通路分析，可从整体水平综合评价广陈皮降脂作用机制，为中药的代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。

Description

一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法

技术领域

本发明涉及中医药研究领域，具体涉及一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法。

背景技术

高血脂症是一种人体中脂质代谢紊乱或异常的现象。发病率逐年增高，发病人群也逐渐增大，并且呈现年轻化趋势。临床常用降脂药物多为西药，虽疗效显著，但长期服用易引发严重不良反应。中药对调节脂质代谢具有多靶点、多途径、不良反应小等优点，但是存在作用机理及信号通路不明确的缺点，需要我们进一步努力。随着研究水平和技术的提高，需要发现新的生物标记物来解释高脂血症潜在的复杂病理生理机制。

对于高脂血症的病机，中医认为，脾运不足、水谷不能化为精微以至于聚而为痰，一旦停于血脉而成为膏脂，健脾益气可使人体内水谷得到运化，利水消痰可以使痰消之导之，起到调节血脂代谢平衡的作用。广陈皮具有健胃、燥湿化痰的功效，是健脾行气代表药物之一。广陈皮属于芸香科，是茶枝柑的成熟果实的果皮，主产于广东新会，是一种药食同源、食养俱佳的著名中药，也是中国广东的道地药材之一。近代药理证明广陈皮具有保肝，降脂等作用，为治疗高血脂奠定理论基础。由于活性化合物的复杂性和多组分未知的协同作用，阐明其药理作用机制仍然是一项艰巨的任务。

代谢组学是一种研究基因及其在刺激或干扰前后的动态变化的技术。代谢组学以其可行性和有效性被广泛应用于中医药方面，通过代谢组学结合模式识别分析揭示中药的疗效。

但是目前为止尚未有使用代谢组学方法研究广陈皮降脂作用的报导，因此需开发一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法。

本发明的目的在于提供高血脂模型生物标记物及广陈皮具有降脂作用(P<0.05)的特异性生物标记物。

本发明所采取的技术方案是：

一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法，包括以下步骤：

(1)实验分组：将大鼠分为以高脂饲料喂养的模型组，普通饲料喂养的空白对照组，广陈皮干预高脂饲料喂养的给药组；

(2)收集大鼠的血清与尿液样本，血液样本用于检测血脂四项，尿液样本用于代谢组学分析；

(3)样品的前处理与UPLC-Q-TOF/MS检测；

(4)数据处理，比较空白对照组与模型组，筛选出高血脂模型生物标记物，与给药组对比筛选出具有降脂作用机制的特异性生物标记物；

(5)通过MetaboAnalyst在线分析软件对上述步骤获得的特异性生物标记物进行通路分析。

进一步的，步骤(1)所述的高脂饲料喂养的模型组是采用每天饲喂由83.6％普通饲料、15％猪油、1.2％胆固醇和0.2％胆酸钠组成的高脂饲料的方法得到的。

进一步的，所述的给药组所用的广陈皮为广陈皮水煎液，每ml含有1g生药，广陈皮每天给药量为1.04g/kg。

进一步的，步骤(2)所述的大鼠血清样本是通过腹主动脉取血至真空管，离心取上清液，取自第30天的血清样本；尿液样本是收集正常对照组，模型组和广陈皮组第30天的尿样。

进一步的，步骤(2)所述的样品的前处理方法如下：将大鼠血清样本以3000～3500转/分钟离心10分钟，取上清液用于全自动生化分析仪检测；尿液样本以8000～10000转/分钟离心10～15分钟以除去固体杂质，将上清液转移到EP管，并用超纯水以1∶1的比率稀释，再以12000～14000转/分钟离心8～12分钟，将透明上清液移至进样瓶进行UPLC-Q-TOF/MS检测分析。

进一步的，所述的UPLC-Q-TOF/MS检测分析条件为：使用C18色谱柱，柱温为38～42℃，流速设定为0.25～0.35mL/min，进样体积为2.5～3.5μL，自动进样器保持在3～4℃，流动相由0.1％甲酸(A)和乙腈(B)组成；所述UPLC洗脱条件为0～10min，0～5％B；10～11min，30～50％B；11～16.5min，50～100％B；16.5～17.5min，100～5％B；17.5～19min，5～0％B。进一步的，步骤(3)所述数据处理的方法：利用MASSLYNX 4.1软件对步骤(2)获得的UPLC-Q-TOF/MS的数据进行处理，获得数据矩阵，将数据矩阵导入SIMCA-P 14.0软件，进行无监督主成分分析和监督正交偏最小二乘判别分析，基于OPLS-DA分析的S图和VIP，识别和揭示差异代谢物并将其在不同组之间分离，VIP值高于1.5和P值低于0.05的代谢物为高血脂模型生物标记物，根据生物标记物分子量应用Marker Lynx XS进行元素组成分析，确定分子式，应用在线数据库进行质量数、分子式、质谱裂解信息的比对，对生物标记物进行结构鉴定，最后与对照品对比，确定高血脂模型生物标记物。

进一步的，所述高血脂模型生物标记物具体如下所示：

进一步的，具有降脂作用机制的特异性生物标记物为：左旋肉碱、肌酐、3,4-亚甲基丁二酸、N-乙酰组氨酸、N-α-乙酰精氨酸、尿酸、泛酸、苯甲酸、乙酰半胱氨酸、吲哚乙酸、9-癸酰肉碱、油酸酰胺、MG(16:0/0:0/0:0)；所述特异性生物标记物具体如下所示：

进一步的，步骤(5)所述的通路分析还包括将30个生物标记物导入MetaboAnalyst、KEGG数据库构建分析疾病相关代谢通路，得到相关的代谢路径；广陈皮干预高血脂药效作用的关键通路主要与能量代谢、甘油酯代谢、脂肪酸代谢、嘌呤代谢、泛酸与CoA生物合成、氨基酸代谢等通路相关，并对特异性标志物MG(16:0/0:0/0:0)、泛酸和左旋肉碱表达异常有显著的回调。

本发明的有益效果是：

本发明基于UPLC-Q-TOF/MS技术和代谢组学研究方法，对高脂血症大鼠尿液代谢物进行检测，通过代谢组学研究方法寻找差异代谢物，通过筛选排除机制，获得13种具有降脂作用机制的特异性生物标记物，利用生物标记物含量的回调变化来实现对降脂作用机制的识别及高通量分析；通过MetaboAnalyst在线分析软件对差异代谢物进行通路分析，可从整体水平综合评价广陈皮降脂作用机制，为中药的代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。

附图说明：

图1是肝组织外观图及病理显微图(HE染色200×)，A、B、C分别为空白对照组、模型组和广陈皮组的肝组织外观图，D、E、F分别为空白对照组、模型组和广陈皮组病理显微图。

图2是尿液样本色谱BPI图，a是空白对照组，b是模型组，c是广陈皮组。

图3是尿液样本PCA得分图(control是空白对照组，gcp是广陈皮组，model是模型组，)。

图4A是尿液OPLS-DA得分图，图4B是500X置换检验图，图4C是Loading图，图4D是S-plot图。

图5空白对照组Control、模型组Model及广陈皮组GCP基于30个代谢标记物的聚类热图。

图6是基于30个代谢标记物的代谢路相关度示意图，a:Fatty acid elongationin mitochondria(线粒体中脂肪酸的延伸)；b:Fatty acid metabolism(脂肪酸代谢)；c:Pantothenate and CoA biosynthesis(泛酸和CoA生物合成)；d:Purine metabolism(嘌呤代谢)；e:Starch and sucrose metabolism(淀粉和蔗糖代谢)；f:Glycerolipidmetabolism(甘油脂代谢)；g:Pentose and glucuronate interconversions(戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化)。

图7是基于30个代谢标记物的代谢路径关系图(蓝色字体为代谢路径名称)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法

1.试剂和仪器

甲醇、乙腈和甲酸均购自默克公司(HPLC级德国)。油酸酰胺对照品(No:H3490005)购自CNW技术有限公司(德国)。肌酸酐对照品(No.10087.7901)购自国家药品和生物制品研究所(中国北京)，所有其他化学药品和试剂均为分析纯。甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的检测试剂盒购自罗氏诊断有限公司(德国)。普通饲料和高脂饲料由广东省实验动物中心提供，高脂饲料由83.6％普通饲料，15％猪油，1.2％胆固醇和0.2％胆酸钠组成。使用仪器包括Waters ACQUITY^TM UltraPerformance LC系统，Waters Q-Tof-Xevo G2质谱分析仪，ACQUITY^TM BEH C18色谱柱(1.7m,2.1×100mm,Waters,美国)，罗氏cobas c701全自动生化分析仪(德国)，奥林巴斯BX41荧光显微镜(日本)。

2方法与结果

2.1广陈皮对高血脂大鼠血清生化指标及肝脏组织的形态病理学影响

2.1.1广陈皮水煎液的制备广陈皮购自江门市新会区祥益有限公司，符合《中华人民共和国药典》标准。按照传统煎煮法将广陈皮粉碎成粗粉末，浸泡在20倍水中1小时，用武火煮沸后改用文火慢煮30分钟。滤出滤液，然后加入20倍水以相同方法再煎煮一次，合并滤液，蒸发浓缩至500毫升，4℃保存备用。该水煎液中的广陈皮(生药)浓度等于1g/ml。

2.1.2分组与给药方法选取180～210g健康SD大鼠24只，雄性。放入代谢笼中适应性观察3天，期间正常饮食及饮水。之后随机分为3组，分别为空白对照组(8只)、模型组(8只)、广陈皮组(8只)。24只大鼠于第30天采集血、尿和肝组织标本。对照组饲喂普通饲料，其余各组饲喂高脂饲料。广陈皮组给药量1.04g/kg(临床等效剂量)，其余各组灌胃等量蒸馏水。药物和水每天灌胃一次，持续一个月。

2.1.3动物实验及样本收集将大鼠置于代谢笼中，收集三个组第30天的尿样，收集24小时，期间大鼠只进食水。收集到的所有尿样离心10min(4℃，3000rpm)，取上清液，分装为100μL每支，储存在冰箱中(-80℃)，备用。用10％水合氯醛腹腔注射24小时后处死大鼠，取腹主动脉至真空管，离心。取血清标本进行血脂分析，评价高脂血症模型的成功率。同时取24只大鼠的肝组织，以4％福尔马林固定，用HE染色法进行组织学检查。每周称取大鼠体重观察体重变化。

2.1.4血清生化指标检测采用罗氏Cobasc701全自动生化分析仪对血清样本进行TG、TC、LDL-C和HDL-C水平的测定。结果显示：高脂饮食喂养30天后，体重、TC、TG、LDL水平均显著高于对照组(P＜0.05)，而HDL显著降低(P＜0.01)。表明高脂血症模型已成功建立。同时，与模型组比较，广陈皮组体重、TC、TG、LDL-C水平明显降低(P＜0.05)，HDL-C水平显著升高(P＜0.05)。(具体的见表1)

表1正常对照组、模型组和广陈皮组血清生化指标和体重水平的比较

*P<0.05and**P<0.01,与对照组比较；^#P<0.05and^##P<0.01,与模型组比较

2.1.5肝脏组织的形态病理学肝组织采用福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色。HE染色切片使用奥林巴斯BX41荧光显微镜进行观察。大鼠肝脏外观图和显微图见图1。通过观察图1(A-C)的肝脏，空白对照组大鼠肝脏颜色暗紫红润，肝脏表面光滑，肝脏的体积适中，触摸组织弹性较好。高脂模型组大鼠肝脏颜色呈粉白色，肝脏包膜紧胀，组织胖大，相对正常组弹性较差，触之有油腻感。广陈皮组与高脂血症模型组肝脏相比：肝脏颜色好转明显，为淡红色至深红色，表面也比较光滑，无较强的油腻感。肝组织切片经染色后光镜检查(见图1(D-F)：空白对照组肝脏细胞光镜下可见细胞形态规则，细胞质均匀，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶轮廊清晰，肝索排列整齐，无明显脂肪滴和脂肪空泡堆积。模型组对照组肝细胞排列不规则，肝小叶结构紊乱，肝细胞胖胀，空泡样变性，脂肪滴和脂肪空泡积聚明显。广陈皮组个别肝细胞内见小的脂肪空泡形成，汇管区未见明显炎细胞浸润，肝细胞好转明显。实验结果表明广陈皮组对高血脂症有治疗作用。

2.2广陈皮对降血脂作用机制尿液代谢组学研究

2.2.1样本收集方法参照2.1.3。

2.2.2样本的制备

(1)尿液溶液的制备所有尿液样品先在4℃条件下解冻，然后以8000rpm离心5分钟除去固体杂质，取上清液(1ml)移至EP管中，用超纯水以1∶1的比例稀释。稀释液再以13000rpm离心10分钟取上清液，制成供试品。

(2)QC样本制备为了进行方法学验证，所有尿液样品均吸取10μL混合制成QC样本，并平均分成6个QC样本。每次进行尿液样品处理时均随行QC样品，QC样本的制备方法与尿液样品的制备方法一致，以控制该批次样品处理的质量。

2.2.3UPLC-MS分析条件柱温保持在40℃。流速设定为0.3mL/min并进样体积为3μL。自动进样器保持在4℃。流动相由0.1％甲酸(A)和乙腈(B)组成。UPLC洗脱条件为0～10min，0～5％B；10～11min，30～50％B；11～16.5min，50～100％B；16.5～17.5min，100～5％B；17.5～19min，5～0％B.在配备有正电喷雾电离源(ESI+)的Q-Tof-Xevo G2质谱仪上获得质谱分析。扫描范围为50至1200m/z。毛细管和锥形电压分别设定在3.5kV和40V。去溶剂化气体在350℃的温度下设定为600L/h；锥形气体设定为50L/h。数据采集速率设定为0.2秒，间歇延迟0.2秒。锁定喷雾用于校准质量的准确性。使用亮氨酸脑啡肽作为锁定质量(正离子模式下m/z 556.2771)。

2.2.4尿液样品方法学考察

(1)稳定性考察取一份尿液样品，按照“2.2.2”项下尿液样品制备方法制备，分别于0、3、6、12、18、24h进样，将6次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较，考察各主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在2.0％-4.3％之间。

(2)精密度考察取同一尿液样品，按照“2.2.2”项下尿液样品制备方法制备，连续进样6次，将6次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较，考察各主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在3.0％-5.7％之间。

(3)重复性考察取同一尿液样品，平行制备6份，按照“2.2.2”项下尿液样品制备方法制备，将每次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较，考察各主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在1.1％-3.2％之间。

(4)QC样本的考察随机抽取每批次随行处理的QC样品2个，进行分析，将每次进样后得到的TIC图的色谱峰个数进行比较，考察各主要共有峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)，结果表明，色谱峰个数均一致，RSD均在2.3％-5.2％之间。

2.2.5生物标记物的寻找与鉴定

对正常组与模型组大鼠之间的差异进行统计学分析,取正常组与模型组大鼠的尿液样本按照“2.2.2”项下尿液样品制备方法制备，采用UPLC-Q-TOF/MS正离子模式检测，记录色谱图。所得的保留时间和峰面积数据矩阵利用MassLynx 4.1软件进行峰检测、匹配及峰对齐处理。所有数据，包括检测质量、保留时间和每个色谱中洗脱的峰的强度，都归一化为每个色谱中总离子强度，以获得代谢物的相对强度。将得到的三维数据、峰数(保留时间和m/z对)、样品名称和归一化离子强度导入SIMCA-P 14.0进行无监督PCA和有监督OPLS-DA。通过R2Y和Q2对OPLS-DA模型进行了评价和测试，R2Y表示模型对Y变量的可解释性，Q2表示模型的可预测性。基于OPLS-DA分析的S-plot和VIP值用于识别和揭示负责识别组间分离的不同代谢物。采用t检验来表达其差异性(P＜0.05)。VIP值在1.5以上、t检验P值在0.05以下的候选代谢产物被认为是高血脂模型生物标记物。根据生物标记物的分子量，采用MassLynx XS分析元素组成，确定分子式，通过联机数据库比较质量数、分子式与质量碎裂信息，确定生物标记物的结构。具体检索策略如下：首先，通过第一级质谱测定质谱的精确质量比，提取化合物的总离子流程图，确定保留时间，提取相应的质谱图；用Finder公式计算化合物的元素组成，观察二能级质谱的碎裂信息，在以下数据库中搜索：

Chemspider、HMDB、METLIN、KEGG结合化合物的化学键断裂规律，确定生物标记物的结构，最终鉴定生物标记物。寻找将潜在生物标记物输入MetaboAnalyst 4.0的代谢途径，并进一步发现与代谢物有关的代谢途径。

2.2.6高脂血症相关代谢通路分析

为了探索高脂血症引起的代谢通路的变化，以及给予广陈皮后对这些代谢通路的影响，将尿样样品筛选出的差异代谢物导入Metabo Analyst4.0在线分析软件中进行代谢通路分析。通过代谢通路分析后所得影响值(impact value)，当影响值大于0.1时，认为该条代谢通路在代谢网络中具有重要影响。

2.2.7结果分析

(1)色谱图比较采用上述方法检测了正常对照组、模型组和广陈皮组30天尿样。图2显示了30天空白对照组、模型组和广陈皮组尿液BPI色谱图，对三组数据的BPI图进行直观分析。结果显示，这三组样品(图2a、b和c)轮廓相似，通过UPLC-Q-TOF/MS图谱很难发现内源成分中的差异代谢产物，因此需要采用多变量统计分析方法进一步确定它们之间的差异。

(2)尿液样本PCA分析对3组来自空白对照组、模型组和广陈皮组第30天的尿样进行检测，并利用主成分分析(PCA)分析检测数据，PCA二维评分如图3所示。可见，空白对照组、模型组和广陈皮组的3组样本点被完全分开，表明3组之间存在差异，空白组和广陈皮组之间的距离较为接近，表明广陈皮具有使高血脂模型恢复正常状态的趋势。

(3)尿液样本OPLS-DA分析只进行无监督的PCA分析还不足以证明它们之间的差异，还需进行有监督的OPLS-DA分析。通过对数据进行OPLS-DA分析，在图4A中观察到空白对照组与模型组之间的完全分离，这表明两组之间存在显著的代谢谱差异。使用500×置换测试(图4B)验证OPLS-DA模型是可靠的。该软件分类的参数为R2Y＝0.995，Q2＝0.953，表明建立了一个拟合良好的OPLS-DA模型。图4C显示了离子的分散，图4C和图4D中的离子离原点越远，则表明其在组间差异越大，图中红色标记的点为空白对照组和模型组的标志代谢物。

(4)高血脂模型标志代谢物的鉴定用重要性投影参数(VIP)和t检验评价尿内源代谢物相对峰面积的差异。差异代谢物必须满足VIP＞1.5和P＜0.05的两个条件。根据上述原理，对所有的信号峰进行元素组成分析。根据分子式、保留时间、质量比、离子碎片、对照品等因素以及Chemspider、HMDB、KEGG等相关数据库，鉴定出30种代谢物为与高脂血症相关的生物标记物，结果见表2。此外，所鉴定的代谢物的热图显示空白对照组、模型组和广陈皮组的相对增加(红色)或减少(蓝色)(见图5)。综合上述结果，确定了30个差异代谢物为高脂血症大鼠模型的生物标记物。

表2高血脂大鼠尿液特异性生物标记物

a为模型组与空白对照组比较，b为广陈皮组与模型组比较。↑表示信号的相对增加；↓表示信号的相对减少。*和**分别代表统计学差异P<0.05、P<0.01。

(5)广陈皮具有回调作用的生物标记物筛选

通过模型组与给药组数据进行t检验，从表2中的30个模型生物标记物中，筛选出广陈皮干预后具有回调作用的13个代谢标记物(P<0.05)(见表3)，作为广陈皮具有降脂作用机制的特异性生物标记物。

表3具有回调作用的生物标记物

a为模型组与空白对照组比较，b为广陈皮组与模型组比较。↑表示信号的相对增加；↓表示信号的相对减少。*、**分别代表统计学差异P<0.05、P<0.01。

(6)代谢路径分析及机制探讨

将高血脂30个生物标记物输入在线MetaboAnalyst、KEGG数据库，构建分析疾病相关代谢通路，得到相关代谢路径，结果见表4和图6。根据分析结果构建代谢路径关系图，见图7。研究表明：广陈皮干预高血脂药效作用的关键通路主要与能量代谢、甘油酯代谢、脂肪酸代谢、嘌呤代谢、泛酸与CoA生物合成、氨基酸代谢等通路相关，并对模型主要代谢标志物MG(16:0/0:0/0:0)、泛酸和左旋肉碱表达异常有显著的回调。这些化合物在代谢通路中受到扰动，从而揭示了血脂调节的生化基础。

表4基于UPLC-MS与MetaboAnalyst数据库构建的高脂血症代谢通路结果

1)脂肪酸代谢甘油酯代谢通路分析及相关差异代谢物在各组间的相对含量变化趋势

大量的研究证明脂质代谢紊乱在高脂血症的发生和发展中起着关键的致病作用。高脂血症的特点是脂肪沉积在肝脏中，这可能是由高脂饮食引起的。高浓度的脂肪酸已被用作疾病风险的指示器。与此相一致，我们可以观察到脂肪酸和甘油酯的变化，如尿中的3,4-亚甲基丁二酸、3,4-亚甲基辛二酸，MG(16:0/0:0/0:0)。3,4-亚甲基丁二酸和3,4-亚甲基辛二酸是存在于尿液中的中链脂肪酸。一些研究报道发现，饮食诱导小鼠模型中的中链脂肪酸水平升高。本研究发现，与对照组相比，模型组中3,4-亚甲基丁二酸、3,4-亚甲基辛二酸的水平显著增加，表明高脂饮食的消耗可上调脂肪酸的生物合成，产生更多的3,4-亚甲基丁二酸、3,4-亚甲基辛二酸。而广陈皮组中3,4-亚甲基丁二酸、3,4-亚甲基辛二酸水平低于模型组。对3,4-亚甲基丁二酸、3,4-亚甲基辛二酸水平的降低有两种可能的解释。首先，通过抑制脂肪酸生物合成，广陈皮可以抑制它们的增加。其次，可以通过消耗它们来降低血清胆固醇水平。经分析后，进一步推测，脂肪酸代谢是改善高脂血症肥胖程度的通路之一。

2)产热作用通路分析及相关差异代谢物在各组间的相对含量变化趋势

油酸酰胺是脂肪酸油酸的酰胺，棕榈酰胺是来自棕榈酸(C16:0)的主要脂肪酸酰胺。代谢产物棕榈酰胺和油酸酰胺是脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)的底物，水解的相对速率受FAAH活性的影响。由FAAH上调引起的。与对照组相比，在模型组中显著降低。油酸酰胺的异常变化可能表明脂肪酸代谢紊乱。代谢产物左旋肉碱、9-癸烯肉碱、棕榈酰胺、油酸酰胺、3,4-亚甲基丁二酸、3,4-亚甲基辛二酸和MG(16:0/0:0/0:0)都与脂肪酸的β氧化有关。左旋肉碱是哺乳动物脂肪酸代谢的一个重要因素。其最重要的已知代谢功能是将脂肪运输到肌肉细胞的线粒体，包括心脏中的氧化。9-癸烯肉碱是含有脂肪酸的酰基肉碱。据报道，在高脂血症条件下，脂肪酸氧化的过程被促进以提供所需的能量，其中肉碱被消耗以促进脂肪酰基辅酶A进入线粒体。与之相反，与对照组相比，模型组的左旋肉碱和9-癸烯肉碱的水平显著升高，广陈皮组出现回调，可能的原因是脂肪酸β氧化加快，使肉碱水平堆积。

3)泛酸与CoA生物合成通路分析及相关差异代谢物在各组间的相对含量变化趋势

泛酸，也称维生素B5，是维持生命所需的水溶性维生素。泛酸需要形成辅酶A(CoA)，因此对碳水化合物、蛋白质和脂肪的代谢和合成至关重要。TCA循环是生物生物体中ATP生成的主要来源，而乙酰辅酶A(CoA)是TCA循环中的中间代谢物。泛酸是乙酰辅酶A的组成部分,因此，泛酸的变化被认为会对乙酰辅酶A代谢产生影响，从而影响TCA循环。我们已经发现泛酸被作为二甲双胍预防肥胖的尿生物标记物。与模型组相比，广陈皮组明显降低了泛酸的含量。根据这些结果，广陈皮的治疗效果可能是基于影响TCA循环。

4)肠道微生物体代谢通路分析及相关差异代谢物在各组间的相对含量变化趋势

苯甲酸和马尿酸与多条代谢路径有关。已有研究发现，绿咖啡豆提取物和黑豆多肽促进脂肪酸的代谢，可以达到减肥的效果，使人体的苯甲酸含量升高，相反，本实验的高脂模型中，苯甲酸的水平降低，可能的原因是机体的脂肪酸代谢功能受损，使得体内脂肪酸堆积，降低了脂肪酸代谢分解能力。马尿酸是尿液中的正常成分,参与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的代谢。已有研究表明马尿酸是肾损伤的尿生物标记物.同时在Yue-Tao Liu等的报道中，马尿酸被减少，并被视为与HCD引起的兔动脉粥样硬化相关的尿生物标记物。

5)精氨酸和脯氨酸代谢通路分析及相关差异代谢物在各组间的相对含量变化趋势

肌酸是由精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸在肝脏中合成，存在于组织和尿液中，肌酸是细胞能量穿梭器的一部分。在肌肉组织中，ATP的高能磷酸基团转移到肌酸形成磷酸肌酸以储存能量，通过可逆反应可以快速地重新合成ATP来提供能量。肌酸酐是肌肉中肌酸的分解产物，肌酸的水分子的丢失导致肌酐的形成，并在肝脏和肾脏中代谢。作为一种常用的肾功能指标，尿液中肌酐的水平上升说明肾功能发生了明显损伤。因此，在饮食诱导的高脂血症大鼠中观察到的尿肌酐水平升高可能表明高脂血症引起的肾损伤。在体内，肌酐通常以与肌肉质量成比例的恒定速率产生，肌酐的水平升高可能是由于肥胖使骨骼肌和心肌增大以维持机体的支撑与运动。之前的的研究已经发现，在高脂模型中，肌酸和肌酐的升高影响了生物体肝脏和肾脏的代谢，造成了肝功能和肾功能的损伤。

6)嘌呤代谢通路分析及相关差异代谢物在各组间的相对含量变化趋势

在这项研究中，与嘌呤代谢有关的生物标记物有尿酸和cAMP。尿酸是嘌呤代谢的最终氧化产物。同时，cAMP是ATP的代谢产物。尿酸和cAMP的升高，说明嘌呤代谢增强。一种可能的解释是过量膳食脂肪引起的活性氧增加和ATP降解加快，导致DNA损伤和凋亡细胞死亡，从而造成肝脏损伤和高脂血症。

7)色氨酸代谢通路分析及相关差异代谢物在各组间的相对含量变化趋势

吲哚，3-甲基二氧吲哚，吲哚-3-羧酸-O-硫酸盐，吲哚乙酸和3-亚甲基吲哚都是色氨酸分解代谢的代谢产物。据报道，色氨酸代谢的改变在糖尿病、动脉粥样硬化和高脂血症中有所改变。以及四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型中3-甲基二氧吲哚的水平发生改变。

综合上述，高脂血症大鼠代谢组学研究表明，疾病大鼠体内能量代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢等微观指标代谢异常，这与疾病大鼠体重、血脂四项和肝组织病理观察等宏观指标研究结果相符。广陈皮干预高血脂药效作用的关键通路主要与能量代谢、甘油酯代谢、脂肪酸代谢、嘌呤代谢、泛酸与CoA生物合成、氨基酸代谢等通路相关，并对模型主要代谢标志物MG(16:0/0:0/0:0)、泛酸和左旋肉碱表达异常有显著的回调。这些化合物在代谢通路中受到扰动，从而揭示了血脂调节的生化基础。本发明揭示了高脂血症的发生机制，以及广陈皮降脂作用机制。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法，包括以下步骤：

(1)实验分组：将大鼠分为以高脂饲料喂养的模型组，普通饲料喂养的空白对照组，广陈皮干预高脂饲料喂养的给药组；

(2)收集大鼠的血清与尿液样本，血液样本用于检测血脂四项，尿液样本用于代谢组学分析；样品的前处理与UPLC-Q-TOF/MS检测；

(3)数据处理，比较空白对照组与模型组代谢物，筛选出高血脂模型生物标记物，与给药组对比筛选出具有降脂作用机制的特异性生物标记物；

(4)通过MetaboAnalyst在线分析软件对上述步骤获得的特异性生物标记物进行通路分析。

2.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法，其特征在于，步骤(1)所述的高脂饲料喂养的模型组是采用每天饲喂由83.6％普通饲料、15％猪油、1.2％胆固醇和0.2％胆酸钠组成的高脂饲料的方法得到的。

3.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法，其特征在于，所述的给药组所用的广陈皮为广陈皮水煎液，每ml含有1g生药，广陈皮每天给药量为1.04g/kg。

4.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法，其特征在于，步骤(2)所述的大鼠血清样本是通过腹主动脉取血至真空管，离心取上清液，取自第30天的血清样本；尿液样本是收集正常对照组，模型组和广陈皮组第30天的尿样。

5.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法，其特征在于，步骤(2)所述的样品的前处理方法如下：将大鼠血清样本以3000～3500转/分钟离心10分钟，取上清液用于全自动生化分析仪检测；尿液样本以8000～10000转/分钟离心10～15分钟以除去固体杂质，将上清液转移到EP管，并用超纯水以1∶1～2的比率稀释，再以12000～14000转/分钟离心8～12分钟，将透明上清液移至进样瓶进行UPLC-Q-TOF/MS检测分析。

6.根据权利要求5所述的一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法，其特征在于，所述的UPLC-Q-TOF/MS检测分析条件为：使用C18色谱柱，柱温为38～42℃，流速设定为0.25～0.35mL/min，进样体积为2.5～3.5μL，自动进样器保持在3～4℃，流动相由0.1％甲酸(A)和乙腈(B)组成；所述UPLC洗脱条件为0～10min，0～5％B；10～11min，30～50％B；11～16.5min，50～100％B；16.5～17.5min，100～5％B；17.5～19min，5～0％B。

7.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法，其特征在于，步骤(3)所述数据处理的方法是：利用MASSLYNX 4.1软件对步骤(2)获得的UPLC-Q-TOF/MS的数据进行处理，获得数据矩阵，将数据矩阵导入SIMCA-P 14.0软件，进行无监督主成分分析和监督正交偏最小二乘判别分析，基于OPLS-DA分析的S图和VIP图，识别和揭示差异代谢物并将其在不同组之间分离，VIP值高于1.5和P值低于0.05的代谢物为高血脂模型生物标记物，根据生物标记物分子量应用Marker Lynx XS进行元素组成分析，确定分子式，进行质量数、分子式、质谱裂解信息的比对，对高血脂模型生物标记物进行结构鉴定，最后与对照品比对，确定高血脂模型生物标记物。

8.根据权利要求7所述的一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法，其特征在于，所述高血脂模型生物标记物具体如下所示：

9.根据权利要求1或7所述的一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法，其特征在于，所述的具有降脂作用机制的特异性生物标记物为：左旋肉碱、肌酐、3,4-亚甲基丁二酸、N-乙酰组氨酸、N-α-乙酰精氨酸、尿酸、泛酸、苯甲酸、乙酰半胱氨酸、吲哚乙酸、9-癸酰肉碱、油酸酰胺、MG(16:0/0:0/0:0)；所述特异性生物标记物具体如下所示：

10.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法，其特征在于，步骤(5)所述的通路分析还包括将30个高血脂模型生物标记物导入MetaboAnalyst、KEGG数据库构建分析疾病相关代谢路径，得到相关代谢路径；广陈皮干预高血脂药效作用的关键通路主要与能量代谢、甘油酯代谢、脂肪酸代谢、嘌呤代谢、泛酸与CoA生物合成、氨基酸代谢等通路相关，并对特异性标记物MG(16:0/0:0/0:0)、泛酸和左旋肉碱表达异常有显著的回调。