CN108508123A - 基于液质联用的红花抗硬皮病代谢组学分析方法 - Google Patents

基于液质联用的红花抗硬皮病代谢组学分析方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108508123A
CN108508123A CN201810187048.6A CN201810187048A CN108508123A CN 108508123 A CN108508123 A CN 108508123A CN 201810187048 A CN201810187048 A CN 201810187048A CN 108508123 A CN108508123 A CN 108508123A
Authority
CN
China
Prior art keywords
safflower
group
chorionitis
action
analysis methods
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810187048.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108508123B (zh
Inventor
吕军影
李凯
刘霞
阙铁生
谢爱泽
赵亮娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University filed Critical First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University
Priority to CN201810187048.6A priority Critical patent/CN108508123B/zh
Publication of CN108508123A publication Critical patent/CN108508123A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108508123B publication Critical patent/CN108508123B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8686—Fingerprinting, e.g. without prior knowledge of the sample components

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明公开了基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，包括以下步骤：1)将健康小鼠分成对照组、硬皮病模型组和红花治疗组三个实验组，硬皮病模型组和红花治疗组小鼠每日皮下注射博来霉素溶液复制小鼠硬皮病模型，红花治疗组小鼠每日灌喂红花水煎液进行治疗，造模28天，并以生理改变和病理改变判定造模是否成功；2)造模成功后，取得三个实验组小鼠的血清样本，采用液相色谱质谱法检测，获得三个实验组小鼠血清样本的指纹图谱；3)采用多元统计学分析指纹图谱得到差异代谢物，并鉴定得到生物标记物。本发明的方法获得了红花抗硬皮病代谢组学的生物标记物，分析并验证红花抗硬皮病的“多成分”、“多靶点”作用机制。

Description

基于液质联用的红花抗硬皮病代谢组学分析方法
技术领域
本发明属于中药学研究领域，尤其涉及一种基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法。
背景技术
传统中医药是华夏民族的瑰宝,在中华民族五千年生生不息的历史长河中为本民族的健康繁衍起着保驾护航的作用,中药具有多成分多靶点的特点从人体整体的系统层面发挥作用是中医药精髓。但是，由于中药药效成分的不确定性和作用机制的整体模糊性，中医药的现代化研究如今遭遇到了巨大的瓶颈。与西药单一成分的形式不同，中药化学成分众多，且在煎煮或炮制过程中，不同成分之间会产生相互作用。多成分作用于生物整体发挥药效的作用机制也比传统的协同作用要复杂得多，这些都给中药作用机制的阐明带来了巨大的难度。
代谢组学(metabolomics)是20世纪90年代中期发展起来的一门新兴学科,是关于生物体系受刺激或扰动后其整体内源性小分子代谢产物(分子量＜1000)种类、数量及其变化规律的系统生物学方法，代谢组学基于整体出发，其全局观念与中药的整体调节、综合治疗的作用相通，与中医药整体论的研究思路不谋而合，为中药组方研究提供了崭新的、强有力的技术手段。代谢组学成为研究中药及中药组方作用机制的重要途径。
系统性硬皮病(systemic sclerosis,SSc)是一种病因不明的慢性多系统疾病，以皮肤组织器官纤维化(包括胃肠道、肺脏、心脏和肾脏等)为特征。最后发展至萎缩为特点的自身免疫性疾病。现代医学认为，微血管病变和细胞介导的免疫反应在SSc的发病过程中扮演了重要角色。红花在治疗SSc的中药复方中具有较高的出现频次，且已有研究证实红花对SSc模型动物的真皮厚度及皮肤炎症评分的病理异常，RORγt蛋白、内皮生长因子(VEGF)表达的异常等关键病理机制均具有治疗作用。理论上，红花发挥抗SSc的作用机制应该是“多途径、多成分、多靶点”，但目前仍缺乏有效的实验方法和技术手段进行从系统角度对红花的作用机制进行验证，而代谢组学的产生可为阐明其作用机制提供强大的支持。同时，应用系统理念对红花的抗SSc的作用机制进行全方位的研究，对SSc的发病机制研究和治疗药物的寻找具有重大的意义和前景。
发明内容
本发明有一个目的是通过小鼠皮下注射博来霉素复制小鼠硬皮病模型，提供一种基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，获得红花抗硬皮病代谢组学的生物标记物，用于分析并验证红花抗硬皮病的“多成分”、“多靶点”作用机制。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，包括以下步骤：
1)将健康小鼠分成对照组、硬皮病模型组和红花治疗组三个实验组，硬皮病模型组和红花治疗组小鼠每日皮下注射博来霉素溶液复制小鼠硬皮病模型，对照组给与PBS溶媒同法平行处理，红花治疗组小鼠每日灌喂红花水煎液进行治疗，对照组和硬皮病模型组小鼠均给予等量生理盐水，造模28天，并以生理改变和病理改变判定造模是否成功；
2)造模成功后，分别取得三个实验组小鼠的血清样本，采用液相色谱质谱法检测，获得三个实验组小鼠血清样本的指纹图谱；
3)采用多元统计学分析三个实验组的指纹图谱，得到差异代谢物，并经过数据库鉴定得到生物标记物。
优选的是，所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，步骤2)中采用液相色谱质谱法检测血清样本的条件为：采用Waters Acquityt UPLC Q-TOF平台检测负离子模式，其中色谱条件为：色谱柱采用ACQUITY UPLC HSS T3高效液相色谱柱，规格为2.10mm×100mm,1.8μm，检测波长254nm，柱温为35℃，进样体积为1μl；流动相包括溶剂A和B，A为体积分数为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱流速为0.5ml/min，梯度洗脱程序为：0～4.5min为90％A～85％A逐渐递减；4.5～12min为85％A～60％A逐渐递减；12～13.5min为60％A～35％A逐渐递减；13.5～18min为35％A～30％A逐渐递减；18～21min为30％A～20％A逐渐递减；21～30min，20％A～5％A逐渐递减；
质谱条件为：毛细管电压3kv，ESI电喷雾离子源，检测模式为MSE，干燥气流量为20L/min，加热块温度100℃，准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽，ESI-555.2615m/z；质量扫描范围：50～1200m/z。
优选的是，所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，步骤1)中硬皮病模型组和红花治疗组小鼠注射博来霉素溶液的浓度为1g/L，每天注射一次，每次注射量为0.1-0.3ml；
红花治疗组灌喂红花水煎液的浓度为按生药量计5mg/g，每天一次，每次灌胃量为0.5ml·20g-1，所述红花水煎液的制备方法为：取红花药材适量，干燥置恒重后，加入15倍水浸泡0.5h，水浴加热回流提取3.0h，取滤液真空浓缩至浓度为按生药量计5mg/g；
所述PBS溶媒为0.5mol/L的PBS溶液。
优选的是，所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，步骤1)中健康小鼠造模前，先经过下述处理：将健康SPE级BALB/c小鼠，给与室温20-25℃、相对湿度为50-70％的清洁环境中分笼饲养，采用12h昼/夜循环照明，适应饲养1周后，随机分组至对照组、硬皮病模型组和红花治疗组，每组10只，剔除硬皮病模型组和红花治疗组小鼠背部中央区相同部位被毛，面积为3.0×2.0cm。
优选的是，所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，步骤2)中获取三个实验组小鼠血清样本的方法为：对三个实验组小鼠分别进行麻醉，眼底静脉丛取血，于冰上静置存放40～70min后，在4℃、5000rpm条件下离心25min，取上清液为血清样本，-80℃保存。
优选的是，所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，步骤2)中采用液相色谱质谱法分析血清样本前，对血清样本进行下述处理：
A、将血清样本于4℃解冻后，取200μL血清样本于1.5mL的EP管中，加入乙腈400μL，涡旋震荡30s，在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清液；
B、将上清液转移到1.5mL EP管中，于4℃条件下，氮气吹干并得残渣；
C、将残渣中加入200μL乙腈与水按体积比为1:9的乙腈水溶液复溶，并在4℃、12000rpm条件下离心10min，移取上清液至内插管中，供液相色谱质谱分析。
优选的是，所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，红花治疗组小鼠造模灌喂红花水煎液为每天注射博来霉素溶液后8-9h后进行。
优选的是，所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，步骤3)中采用多元统计学分析的具体方法为：在MATLAB软件平台下对三个实验组的指纹图谱原始数据信号进行识别，校正保留时间、峰对齐，后在EXCEL程序进行下一步分析，内容包括面积归一化，并组织为二维数据矩阵，并导入SIMCA-P，进行偏最小二乘判别分析，并按照OPLS的VIP值筛选得到差异代谢物。
优选的是，所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，步骤3)中数据库鉴定包括利用Mass对照、HMDB数据库、METLIN、KEGG中的Mass数据进行匹配鉴别和自建数据库进行检索。
本发明至少包括以下有益效果：
1)通过小鼠皮下注射博来霉素复制小鼠硬皮病模型，进行红花抗硬皮病血清代谢组学分析，获得并鉴定了小鼠血液中的差异代谢物，从而得到生物标记物，根据其变化，可以用于推导相关代谢通路、代谢途径和上游蛋白质信号通路的内在变化，从而基于整体水平综合评价红花抗硬皮病的作用机制，为中药组方的代谢组学及作用机制的阐明提供研究依据；
2)本发明提供的基于LC-MS联用技术的红花抗硬皮病的代谢组学研究的实验方法，通过代谢组学技术能获得机体大量内源性代谢产物轮廓信息，并从中筛选红花中多种化学成分在发挥中药“多成分，多靶点”作用机制效应所对应的代谢物轮廓变化，进而从整体上评价红花的药效作用，为评价红花的作用机制和硬皮病的发病机理提供新的技术参考；
3)本发明中液质分析使用的色谱条件和质谱条件，针对硬皮病和红花治疗作用相关色谱峰的检测灵敏度进行了优化，在对应的条件下实现增大对代谢物信息检测的范围。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的实施方案中对照组和硬皮病模型组的血清样本基于液相色谱质谱检测，统计学分析得到的PLS-DA得分图(ESI-)；
图2为本发明的实施方案中对照组、硬皮病模型组和红花治疗组的血清样本基于液相色谱质谱检测，统计学分析得到的PLS-DA得分图(ESI-)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明提供一种基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，包括以下步骤：
1)将健康小鼠分成对照组、硬皮病模型组和红花治疗组三个实验组，硬皮病模型组和红花治疗组小鼠每日皮下注射博来霉素溶液复制小鼠硬皮病模型，对照组给与PBS溶媒同法平行处理，红花治疗组小鼠每日灌喂红花水煎液进行治疗，对照组和硬皮病模型组小鼠均给予等量生理盐水，造模28天，并以生理改变和病理改变判定造模是否成功；
其中，步骤1)中健康小鼠造模前，先经过下述处理：将健康SPE级BALB/c小鼠，给与室温20-25℃、相对湿度为50-70％的清洁环境中分笼饲养，采用12h昼/夜循环照明，适应饲养1周后，随机分组至对照组、硬皮病模型组和红花治疗组，每组10只，剔除硬皮病模型组和红花治疗组小鼠背部中央区相同部位被毛，面积为3.0×2.0cm。
其中，步骤1)中硬皮病模型组和红花治疗组小鼠注射博来霉素溶液的浓度为1g/L，每天注射一次，每次注射量为0.1-0.3ml，在本实施方案中注射量为0.1ml，注射时于小鼠背部中央区2-5mm进行肌肉注射，并放置液体渗出；
红花治疗组灌喂红花水煎液的浓度为按生药量计5mg/g，每天一次，每次灌胃量为0.5ml·20g-1，所述红花水煎液的制备方法为：取红花药材适量，干燥置恒重后，加入15倍水浸泡0.5h，水浴加热回流提取3.0h，取滤液真空浓缩至浓度为按生药量计5mg/g；
所述PBS溶媒为0.5mol/L的PBS溶液，PBS于-4℃保存，临用前30min配置。
其中，红花治疗组小鼠造模灌喂红花水煎液为每天注射博来霉素溶液后8-9h后进行。
动物模型评价：
造模后，硬皮病模型组小鼠的生理改变：小鼠精神较差，进食、进水减少，活动灵敏度降低，攻击性降低，体质量略减轻；小鼠背部注射部位出现皮肤增厚变硬、弹性降低、毛发未见生长的改变，背部周围毛发光泽度较正常降低，绝大部分小鼠皮肤与皮下组织有粘连，精神萎靡，体力显著下降；部分小鼠在注射部位出现硬结、结痂，少数出现浅表溃疡。硬皮病模型组小鼠的病理组织改变：小鼠背部皮肤组织出现了胶原纤维明显增粗、膨大、数量增多、排列紧密、均质化等改变。
红花治疗组小鼠的生理变化与病理组织改变均轻于硬皮病模型组小鼠，对照组小鼠的生理和病理组织无明显变化，说明本技术方案下的小鼠硬皮病造模成功。
2)造模成功后，分别取得三个实验组小鼠的血清样本，对血液样本进行蛋白沉淀、复溶等前处理，再采用液相色谱质谱法检测，获得三个实验组小鼠血清样本的指纹图谱；
其中，所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，步骤2)中获取三个实验组小鼠血清样本的方法为：对三个实验组小鼠分别采用饱和乙醚蒸汽中呼吸0.5-1.5min进行麻醉，眼底静脉丛取血，于冰上静置存放40～70min后，在4℃、5000rpm条件下离心25min，取上清液为血清样本，-80℃保存。
其中，所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，步骤2)中采用液相色谱质谱法分析血清样本前，对血清样本进行下述处理：
A、将血清样本于4℃解冻后，取200μL血清样本于1.5mL的EP管中，加入乙腈400μL，涡旋震荡30s，在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清液；
B、将上清液转移到1.5mL EP管中，于4℃条件下，氮气吹干并得残渣；
C、将残渣中加入200μL乙腈与水按体积比为1:9的乙腈水溶液复溶，并在4℃、12000rpm条件下离心10min，移取上清液至内插管中，供液相色谱质谱分析。
其中，所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，步骤2)中采用液相色谱质谱法检测血清样本的条件为：采用Waters Acquityt UPLC Q-TOF平台检测负离子模式，其中色谱条件为：色谱柱采用ACQUITY UPLC HSS T3高效液相色谱柱，规格为2.10mm×100mm,1.8μm，检测波长254nm，柱温为35℃，进样体积为1μl；流动相包括溶剂A和B，A为体积分数为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱流速为0.5ml/min，梯度洗脱程序为：0～4.5min为90％A～85％A逐渐递减；4.5～12min为85％A～60％A逐渐递减；12～13.5min为60％A～35％A逐渐递减；13.5～18min为35％A～30％A逐渐递减；18～21min为30％A～20％A逐渐递减；21～30min，20％A～5％A逐渐递减；
质谱条件为：毛细管电压3kv，ESI电喷雾离子源，检测模式为MSE，干燥气流量为20L/min，加热块温度100℃，准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽，ESI-555.2615m/z；质量扫描范围：50～1200m/z。
3)采用多元统计学分析三个实验组的指纹图谱，得到差异代谢物，并经过数据库鉴定得到生物标记物。
其中，所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，步骤3)中采用多元统计学分析的具体方法为：在MATLAB软件平台下对三个实验组的指纹图谱原始数据信号进行识别，校正保留时间、峰对齐，后在EXCEL程序进行下一步分析，内容包括面积归一化，并组织为二维数据矩阵，并导入SIMCA-P，进行偏最小二乘判别分析，并按照OPLS的VIP值筛选得到差异代谢物。
其中，最小二乘判别分析方法如下：为了剔除与各组间代谢物轮廓区分不相关的信号和噪音，进一步的挖掘引起各组间代谢轮廓区分贡献较大的化学成分，以便对疾病发病机制和药物的治疗作用进行有针对性的分析，本实施方案采用有监督的模式识别分析方法PLS-DA进行建模分析，结果表明负离子模式下，共3个主成份，R2Y＝0.865，Q2＝0.756，PLS-DA得分图见图1和图2，模型的参数R2Y表示该模型的预测能力，此参数大于0.7说明模型可靠，多元统计模型可信度高，分析结果可信度高，预测性良好。图1为两组样本PLS-DA得分图(ESI-)，其中P为对照组血清样本，M为硬皮病模型组血清样本，从图1中可以得出，硬皮病模型组小鼠血清代谢产物的代谢轮廓与对照组小鼠血清代谢产物的代谢轮廓有明显差异；图2为三组样本的PLS-DA得分图(ESI-)，其中P为对照组血清样本，M为硬皮病模型组血清样本，H为红花治疗组血清样本，图2中可知服用红花水煎液会改变硬皮病模型组小鼠的血清代谢产物的代谢轮廓，并向空白组有移动的趋势，表明红花对疾病模型引起的代谢紊乱具有一定的治疗作用。
步骤3)中，采用PLS-DA模型的变异权重系数(Variable Importance in theProjection)VIP值＞1和t-text检验的p值＜0.05来寻找差异代谢物，利用Mass对照、HMDB数据库、METLIN、KEGG中的Mass数据进行匹配鉴别和自建数据库进行检索，得到生物标记物及其变化趋势见表1。
表1.生物标记物组间差异变化表
注：对照组(P)，硬皮病模型组(M)，红花治疗组(H)；
硬皮病模型组与对照组中，p<0.05为显著采用#表示，p<0.01为极显著，采用##表示；
红花治疗组与硬皮病模型组中，p<0.05为显著采用*表示，p<0.01为极显著，采用**表示。
表1中的7种生物标记物，在实际应用过程中，可根据归属的生物标记物和其对应的代谢途径研究，并结合相关的基因蛋白构建网络，为硬皮病的发病机制研究和红花的治疗作用机制提供依据。本发明的实施方案中获得了7种生物标记物，这充分说明了红花治疗硬皮病是基于“多途径、多成分、多靶点”的作用机制。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将健康小鼠分成对照组、硬皮病模型组和红花治疗组三个实验组，硬皮病模型组和红花治疗组小鼠每日皮下注射博来霉素溶液复制小鼠硬皮病模型，对照组给与PBS溶媒同法平行处理，红花治疗组小鼠每日灌喂红花水煎液进行治疗，对照组和硬皮病模型组小鼠均给予等量生理盐水，造模28天，并以生理改变和病理改变判定造模是否成功；
2)造模成功后，分别取得三个实验组小鼠的血清样本，采用液相色谱质谱法检测，获得三个实验组小鼠血清样本的指纹图谱；
3)采用多元统计学分析三个实验组的指纹图谱，得到差异代谢物，并经过数据库鉴定得到生物标记物。
2.如权利要求1所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，其特征在于，步骤2)中采用液相色谱质谱法检测血清样本的条件为：采用Waters AcquitytUPLC Q-TOF平台检测负离子模式，其中色谱条件为：色谱柱采用ACQUITY UPLC HSS T3高效液相色谱柱，规格为2.10mm×100mm,1.8μm，检测波长254nm，柱温为35℃，进样体积为1μl；流动相包括溶剂A和B，A为体积分数为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱流速为0.5ml/min，梯度洗脱程序为：0～4.5min为90％A～85％A逐渐递减；4.5～12min为85％A～60％A逐渐递减；12～13.5min为60％A～35％A逐渐递减；13.5～18min为35％A～30％A逐渐递减；18～21min为30％A～20％A逐渐递减；21～30min，20％A～5％A逐渐递减；
质谱条件为：毛细管电压3kv，ESI电喷雾离子源，检测模式为MSE，干燥气流量为20L/min，加热块温度100℃，准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽，ESI-555.2615m/z；质量扫描范围：50～1200m/z。
3.如权利要求2所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，其特征在于，步骤1)中硬皮病模型组和红花治疗组小鼠注射博来霉素溶液的浓度为1g/L，每天注射一次，每次注射量为0.1-0.3ml；
红花治疗组灌喂红花水煎液的浓度为按生药量计5mg/g，每天一次，每次灌胃量为0.5ml·20g-1，所述红花水煎液的制备方法为：取红花药材适量，干燥置恒重后，加入15倍水浸泡0.5h，水浴加热回流提取3.0h，取滤液真空浓缩至浓度为按生药量计5mg/g；
所述PBS溶媒为0.5mol/L的PBS溶液。
4.如权利要求1所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，其特征在于，步骤1)中健康小鼠造模前，先经过下述处理：将健康SPE级BALB/c小鼠，给与室温20-25℃、相对湿度为50-70％的清洁环境中分笼饲养，采用12h昼/夜循环照明，适应饲养1周后，随机分组至对照组、硬皮病模型组和红花治疗组，每组10只，剔除硬皮病模型组和红花治疗组小鼠背部中央区相同部位被毛，面积为3.0×2.0cm。
5.如权利要求1所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，其特征在于，步骤2)中获取三个实验组小鼠血清样本的方法为：对三个实验组小鼠分别进行麻醉，眼底静脉丛取血，于冰上静置存放40～70min后，在4℃、5000rpm条件下离心25min，取上清液为血清样本，-80℃保存。
6.如权利要求5所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，其特征在于，步骤2)中采用液相色谱质谱法分析血清样本前，对血清样本进行下述处理：
A、将血清样本于4℃解冻后，取200μL血清样本于1.5mL的EP管中，加入乙腈400μL，涡旋震荡30s，在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清液；
B、将上清液转移到1.5mL EP管中，于4℃条件下，氮气吹干并得残渣；
C、将残渣中加入200μL乙腈与水按体积比为1:9的乙腈水溶液复溶，并在4℃、12000rpm条件下离心10min，移取上清液至内插管中，供液相色谱质谱分析。
7.如权利要求3所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，其特征在于，红花治疗组小鼠造模灌喂红花水煎液为每天注射博来霉素溶液后8-9h后进行。
8.如权利要求1所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，其特征在于，步骤3)中采用多元统计学分析的具体方法为：在MATLAB软件平台下对三个实验组的指纹图谱原始数据信号进行识别，校正保留时间、峰对齐，后在EXCEL程序进行下一步分析，内容包括面积归一化，并组织为二维数据矩阵，并导入SIMCA-P，进行偏最小二乘判别分析，并按照OPLS的VIP值筛选得到差异代谢物。
9.如权利要求1所述的基于液质联用的红花抗硬皮病作用机制代谢组学分析方法，其特征在于，步骤3)中数据库鉴定包括利用Mass对照、HMDB数据库、METLIN、KEGG中的Mass数据进行匹配鉴别和自建数据库进行检索。
CN201810187048.6A 2018-03-07 2018-03-07 基于液质联用的红花抗硬皮病代谢组学分析方法 Active CN108508123B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810187048.6A CN108508123B (zh) 2018-03-07 2018-03-07 基于液质联用的红花抗硬皮病代谢组学分析方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810187048.6A CN108508123B (zh) 2018-03-07 2018-03-07 基于液质联用的红花抗硬皮病代谢组学分析方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108508123A true CN108508123A (zh) 2018-09-07
CN108508123B CN108508123B (zh) 2020-05-12

Family

ID=63377324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810187048.6A Active CN108508123B (zh) 2018-03-07 2018-03-07 基于液质联用的红花抗硬皮病代谢组学分析方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108508123B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109406675A (zh) * 2018-11-30 2019-03-01 广州中医药大学第附属医院 一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法
CN109752549A (zh) * 2019-03-04 2019-05-14 北京和合医学诊断技术股份有限公司 基于靶向代谢组学数据分析的模型建立方法
CN110221011A (zh) * 2019-05-22 2019-09-10 南京鼓楼医院 系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111413431B (zh) * 2020-04-17 2022-03-01 中国药科大学 一种药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101411770A (zh) * 2008-12-01 2009-04-22 李兰荣 一种治疗瘀血阻滞型多发性硬化症的药物
CN101901300A (zh) * 2010-07-09 2010-12-01 大连理工大学 一种采用链状多种群的遗传算法从体液代谢轮廓中筛选肝病标志物的方法
CN102305802A (zh) * 2011-08-26 2012-01-04 重庆医科大学 Hbv感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型及其构建方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101411770A (zh) * 2008-12-01 2009-04-22 李兰荣 一种治疗瘀血阻滞型多发性硬化症的药物
CN101901300A (zh) * 2010-07-09 2010-12-01 大连理工大学 一种采用链状多种群的遗传算法从体液代谢轮廓中筛选肝病标志物的方法
CN102305802A (zh) * 2011-08-26 2012-01-04 重庆医科大学 Hbv感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型及其构建方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
梁娟等: "红花水煎液对系统性硬皮病小鼠皮肤及肺组织纤维化的影响及机制", 《山东医药》 *
连江山: "酒精性肝硬化和乙肝肝硬化患者血清代谢组学初步研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109406675A (zh) * 2018-11-30 2019-03-01 广州中医药大学第附属医院 一种基于代谢组学的降脂作用机制研究方法
CN109752549A (zh) * 2019-03-04 2019-05-14 北京和合医学诊断技术股份有限公司 基于靶向代谢组学数据分析的模型建立方法
CN110221011A (zh) * 2019-05-22 2019-09-10 南京鼓楼医院 系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108508123B (zh) 2020-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108508123A (zh) 基于液质联用的红花抗硬皮病代谢组学分析方法
Liu et al. Chemometrics applied to quality control and metabolomics for traditional Chinese medicines
CN103257188B (zh) 一种复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法
CN102100706A (zh) 一种应用代谢组学对中成药质量评价的方法
CN110187020A (zh) 基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法
Chang et al. Multicomponent, multitarget integrated adjustment–metabolomics study of qizhiweitong particles curing gastrointestinal motility disorders in mice induced by atropine
CN105169105A (zh) 具有抗肿瘤、滋阴养胃、增强免疫力功能的中药制剂及其制备方法
CN109633012A (zh) 一种浙麦冬的鉴别方法
Tao et al. Urine metabonomic study for blood-replenishing mechanism of Angelica sinensis in a blood-deficient mouse model
Zhao et al. Analysis of Psoralea corylifolia L. fruits in different regions
CN110376310A (zh) 当归质量的检测方法
Jin et al. Metabolic regulation mechanism of Aconiti Radix Cocta extract in rats based on 1H-NMR metabonomics
CN101373182A (zh) 一种中药北五味子的质量检测方法
CN102507829A (zh) 一种烟草hplc指纹图谱数据库的建立方法及应用
CN109507312A (zh) 一种黄柏的鉴定方法及其应用
Zhang et al. Identification of anti-inflammatory components of raw and steamed Panax notoginseng root by analyses of spectrum-effect relationship
CN107884431B (zh) 基于1h-nmr的代谢组学鉴别鲜鹿茸与热炸茸的方法
Kwon et al. The traditional medicine bojungikki-tang increases intestinal motility
CN115944688A (zh) 一种缓解疲劳的中药组合物、制剂与应用
Dai et al. Simultaneous determination of multiple constituents, serum composition, and tissue distribution of Qingshen granule using ultra‐high performance liquid chromatography‐quadrupole‐orbitrap high‐resolution mass spectrometry
CN106918673A (zh) 一种中药组合物的指纹图谱的建立方法
CN106018594B (zh) 一种理气舒心片hplc特征图谱的构建方法
CN110322929B (zh) 一种预测中药复方直接靶点和作用成分的方法
CN107607654A (zh) 一种核桃花中黄酮类化学成分的分析方法
Gao et al. Assisted analysis of acne metagenomics sequencing data based on FP-Growth method

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant