CN110187020A - 基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法 - Google Patents

基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药成分分析技术领域，具体为基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法。目的是为了通过建立黄芪不同极性部位组合配伍的黄芪建中汤UHPLC‑MS/MS指纹图谱，标定共有峰，通过谱效数学模型评价黄芪中化学成分治疗慢性萎缩性胃炎的作用，可以快速、准确地评价黄芪中具有治疗慢性萎缩性胃炎作用的化学成分及活性成分筛选，为黄芪的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。本发明利用化学模式识别方法将黄芪提取物在指纹图谱上所体现的化学成分的变化和药效的变化建立了相关性，为黄芪的质量控制提供了更为全面和准确的谱效基础。

Description

基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法
技术领域
本发明涉及中药成分分析技术领域，具体为基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法。
背景技术
黄芪为多年生草本植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，前者主产东北，后者主产区在山西和内蒙、陕北等地。始载于《神农本草经》，列为上品，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效，可用于治疗用于气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，气虚水肿等。现代研究表明，黄芪中含有黄酮类、皂苷类、多糖和氨基酸等多种生物活性成分。
中药指纹图谱与化学计量学相结合，通过偏最小二乘法、相关性分析、回归分析等方法进行化学模式识别的方法来评价中药的质量，已经被世界卫生组织所认可。中药指纹图谱可以从整体与宏观的角度最大程度的体现中药所含成分，中药产生药理活性以治疗不同疾病是通过其各种活性成分群共同作用的结果，所以对于中药质量的全面控制，研究发挥药效的药理机制，需要对中药的药效成分具体分析。因此中药指纹图谱的高级阶段可将指纹图谱与药理药效结合研究，这种谱效关系的分析可用于中药及复方的物质基础研究，有利于中药质量控制标准的建立。黄芪建中汤为仲景经方，出自《金匮要略》，具有温中补虚、缓急止痛之功效，黄芪为该方中的君药，大量药理研究表明，黄芪建中汤复方在治疗慢性萎缩性胃炎上表现出较好的药效。因此本发明以黄芪不同极性组分提取物配伍的黄芪建中汤UHPLC-MS/MS指纹图谱为基础，通过灰色关联分析，考察黄芪治疗慢性萎缩性胃炎药效活性的谱效关系。
发明内容
本发明的目的在于提供基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，通过建立黄芪不同极性部位组合配伍的黄芪建中汤UHPLC-MS/MS指纹图谱，标定共有峰，通过谱效数学模型评价黄芪中化学成分治疗慢性萎缩性胃炎的作用，可以快速、准确地评价黄芪中具有治疗慢性萎缩性胃炎作用的化学成分及活性成分筛选，为黄芪的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，包括以下步骤：
步骤1，制备黄芪不同极性的部位；
步骤2，将步骤1所得黄芪不同极性的部位随机组合，并与黄芪建中汤中其余六味药白芍、甘草、桂枝、生姜、大枣和饴糖进行配伍；分别用10倍水与8倍水的量进行回流提取，纱布过滤，合并两次提取液并加入饴糖，减压浓缩，得到不同组分配伍的黄芪建中汤；
步骤3，采用液相色谱串联质谱法建立黄芪不同极性部位配伍的黄芪建中汤指纹图谱；
步骤4，通过已有黄芪化学成分数据库及文献检索，获取黄芪建中汤总离子流图、黄芪标准品的质谱图与特征碎片，将步骤3中建立的黄芪不同极性部位配伍的黄芪建中汤指纹图谱对比黄芪建中汤总离子流图，并与标准品的质谱图与特征碎片比对，找出其共有峰，得到匹配的共有峰面积数据；
步骤5，对实验大鼠进行慢性萎缩性胃炎模型的复制；
步骤6，以黄芪为君药的黄芪建中汤为对象，以慢性萎缩性胃炎造模的大鼠为药效评价平台进行药效评价并进行血清的代谢组学分析得到药效活性数据和血清代谢组学数据；
步骤7，将步骤4中得到的指纹图谱共有峰数据和步骤6得到的药效活性数据带入数学模型进行灰色关联分析，评价黄芪中化学成分的药效活性；
步骤8，将步骤4中得到的指纹图谱共有峰数据和步骤6得到的血清代谢组学数据带入数学模型进行灰色关联分析，评价黄芪中化学成分的药效活性；
步骤9，根据步骤7和步骤8中黄芪中化学成分的药效活性得出治疗慢性萎缩性胃炎黄芪中关键的活性成分为8(3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷)、9(7,2'-二羟基-3,4'-二甲氧基异黄烷)、15(芒柄花素-7-o-葡萄糖-6”-O-乙酸盐)、22(异黄芪皂苷I)，从而完成基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价。
进一步，所述步骤1中制备黄芪不同极性的组分的具体步骤包括：
步骤1.1，取同等于黄芪建中汤复方中所含黄芪药材的量，置于圆底烧瓶中；
步骤1.2，在圆底烧瓶中加入蒸馏水，回流提取，第一次加入药材的10倍量蒸馏水，回流提取2h，第二次加入8倍量的蒸馏水，提取1.5h；
步骤1.3，滤过，合并滤液，滤液经回收溶剂，浓缩为浓度为0.5g/mL的黄芪水提液；
步骤1.4，将步骤1.3中的黄芪水提液经AB-8大孔树脂层析柱纯化，得到黄芪不同极性的部位。
再进一步，所述步骤1.4中黄芪水提液经AB-8大孔树脂层析柱纯化方法，包括以下步骤：
步骤1.4.1，将浓缩到0.5g/mL的黄芪水提液通过AB-8大孔吸附树脂；
步骤1.4.2，用20倍柱体积的蒸馏水进行洗脱，获得A极性部位；
步骤1.4.3，用10倍柱体积的35％乙醇进行洗脱，获得B极性部位；
步骤1.4.4，用5倍柱体积的95％乙醇进行洗脱，获得C极性部位；
步骤1.4.5，收集各洗脱部位，经回收溶剂、真空干燥，制得干燥提取物，得到黄芪不同极性的部位；
经以上所述逐步洗脱收集的各极性部位包含了黄芪药材中各个不同的极性成分，为更好的找寻其活性成分提供了条件。
更进一步，所述步骤2中将步骤1所得黄芪不同极性的部位随机组合，并与黄芪建中汤中其余六味药白芍、甘草、桂枝、生姜、大枣和饴糖进行配伍；分别用10倍水与8倍水的量进行回流提取，纱布过滤，合并两次提取液并加入饴糖，减压浓缩，得到不同组分配伍的黄芪建中汤；包括：
将所得A、B、C三个极性部位随机组合，得到A、B、C、AB、AC、BC、ABC七个不同极性部位的组合，并与白芍、甘草、桂枝、生姜、大枣和饴糖混合；分别用10倍水与8倍水的量进行回流提取，纱布过滤，合并两次提取液并加入饴糖，减压浓缩，得到不同组分配伍的黄芪建中汤。
通过上述步骤将洗脱的得到的三个极性部位随机组合，并与白芍、甘草、桂枝、生姜、大枣和饴糖六味药材混合，得到七种黄芪不同极性部位配伍的黄芪建中汤，能够更全面的表征黄芪建中汤的指纹图谱。
更进一步，所述步骤3中采用液相色谱串联质谱法建立黄芪不同极性部位配伍的黄芪建中汤指纹图谱的条件包括液相条件和质谱条件：
其中，液相条件如下：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相为：A为含0.1％甲酸的水溶液，B为乙腈；采用梯度洗脱：0-3min，1％B；3-13min，1％B-20％B；13-15min，20％B-25％B；15-18min，25％B-30％B；18-20min，30％B-40％B；20-23min，40％B-60％B；23-25min，60％B-99％B；25-27min，99％B；27-27.5min，99％B-1％B；27.5-30min，1％B；流速：0.2mL/min；柱温：35℃，进样量：2μL；
质谱条件如下：离子源：热电喷雾离子源HESI；正离子模式检测；扫描范围：m/z100-1500；扫描模式：Full Scan/dd-MS2；高离子喷射电压：+3500V；鞘气流速：35arb，辅助气流速：10arb，毛细管温度：320℃；
黄芪不同极性部位组合配伍的黄芪建中汤UHPLC-MS/MS指纹图谱方法，在以上所述的液相条件下，样品达到更好的分离度，在以上所述的质谱条件下能够获得更全面的化合物指纹谱，并具有较高的灵敏度。
更进一步，所述步骤4中得到的共有峰共24个，所述24个共有峰的保留时间(tR)分别为：1.74min、17.03min、18.84min、18.92min、19.88min、20.26min、20.27min、21.41min、21.82min、21.91min、22.13min、22.61min、22.85min、23.03min、23.21min、23.77min、24min、24.38min、24.82min、24.97min、25.6min、26.1min、26.25min、26.32min；
更进一步，所述步骤4中得到的24个共有峰分别为：1号峰为蔗糖，2号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，3号峰为芹菜素，4号峰为红车轴草苷，5号峰为甘草苷，6号峰为芒柄花苷，7号峰为毛蕊异黄酮-7-o-葡萄糖-6”-o-乙酸盐，8号峰为3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷，9号峰为7,2'-二羟基-3,4'-二甲氧基异黄烷，10号峰为7,2'-二羟基-3,4'-二甲氧基异黄酮，11号峰为毛蕊异黄酮，12号峰为二羟基-二甲氧基异黄酮，13号峰为黄芪皂苷VII，14号峰为黄芪异黄酮葡萄糖苷，15号峰为芒柄花素-7-o-葡萄糖-6”-o-乙酸盐，16号峰为二羟基-三甲氧基-二甲氧基异黄酮，17号峰为黄芪皂苷IV，18号峰为黄芪皂苷III，19号峰为芒柄花素，20号峰为7-羟基-6,4'-二甲氧基异黄烷，21号峰为黄芪皂苷II，22号峰为异黄芪皂苷I，23号峰为华良姜素，24号峰为黄芪皂苷I。
更进一步，所述步骤5中对实验大鼠进行慢性萎缩性胃炎模型的复制的步骤包括：
步骤5.1，大鼠适应一周后随机分为空白对照组和模型组；
步骤5.2，空白对照组大鼠自由饮水与摄食，模型组大鼠给予0.1％氨水与20mmol/L脱氧胆酸钠，每日交替饮用，同时采用饥饿紊乱法造模(两天足食，一天禁食)，循环实施10周，建立慢性萎缩性胃炎模型，实现慢性萎缩性胃炎大鼠模型的复制；
上述慢性萎缩性胃炎大鼠的造模方法，能够快速、有效的造成大鼠的慢性萎缩性胃炎模型，为黄芪治疗慢性萎缩性胃炎的活性成分研究提供了很好的药效评价平台。
更进一步，所述步骤6以黄芪为君药的黄芪建中汤为对象，以慢性萎缩性胃炎造模的大鼠为药效评价平台进行药效评价并进行血清的代谢组学分析得到药效活性数据和血清代谢组学数据，包括:
步骤6.1，慢性萎缩性胃炎大鼠模型复制4周后，从第5周灌胃给予黄芪建中汤，给药量为10.605g生药/kg，给药周期为6周,实验期间，每三天对大鼠进行称重，记录体重，绘制体重趋势图；
步骤6.2，慢性萎缩性胃炎大鼠最后一次称重后，禁食不禁水48h进行腹主动脉取血，使用乙醚麻醉慢性萎缩性胃炎大鼠，结扎胃部贲门，大鼠储存胃液3h，缝合腹腔，皮下注射10％的水合氯醛麻醉大鼠，先结扎贲门，后腹主动脉取血，收集血液，摘出全胃，洗去表面血水，滤纸吸干，收集胃液，将所得胃液与血液均在4℃、3000rpm/min下离心15min，分别获得上清，其中部分胃液上清立即检测，获得胃液pH值，测定胃蛋白酶的活性(PA)，其余胃液与血液上清保存在-80℃待测，并通过冷冻离心机离心得到血清样本，从而得到药效活性数据；
步骤6.3，取解冻后300μL血清样本与300μL D2O混合，涡旋60s，于4℃、13,000rpm下离心10min，取550μL上清转移到直径为5mm的核磁管中进行核磁检测；
步骤6.4，利用SPSS 16.0对各组大鼠的血清差异代谢物数据进行主成分分析，根据相关矩阵、特征值与累计方差贡献率获得相应的主成分,选择方差排名靠前的主成分，保留了初始变量的大部分信息，可将其作为血清代谢组学的评价指标，从而得到血清代谢组学数据。
上述步骤中黄芪建中汤的给药剂量为本实验室前期研究确定的最佳给药剂量，同时评价黄芪建中汤治疗慢性萎缩性胃炎大鼠的药效指标，包括体重的增长趋势、胃液的pH、胃蛋白酶活性(PA)可以直接显示大鼠的胃部病变及给药后药物的回调作用；血清样本的核磁备样方法及代谢组学的数据处理方法，可以全面表征血清中的代谢成分，主成分分析的方法可以利用降维的思想将相关性高的变量聚为一起，用少数几个成分描述多个变量的关系，使各个维度之间互不相关，降低了分析的变量与问题的复杂性，灵敏的表示代谢组学的变化。
更进一步，所述步骤7和步骤8中的灰色关联分析包括如下步骤：
步骤S1，将传统药效指标与血清核磁代谢组学数据作为参考数列Y，指纹图谱中化学成分的面积作为比较数列Xi：
参考数列Y(k)，k＝1,2,3...m
比较数列Xi(k)，i＝1,2,3...m
步骤S2，对数据进行最大值标准化；
步骤S3，根据步骤S2所得标准化数据计算各共有峰与药效之间的关联系数，其中关联系数按以下公式计算：
i＝1,2,3,...,n；k＝1,2,3,...,m；
其中，ξi为第k个样品的比较数列Xi与参考数列Y的关联系数，
Δi(k)＝|Y(k)-Xi(k)|比较数列与参考数列差值的绝对值；
Δmin＝minminΔi(k),两极的最小差值；Δmax＝maxmaxΔi(k),两极的最大差值；
步骤S4，对步骤S3所得关联系数按下面公式进行关联度的计算：
步骤S5，对步骤S4所得关联度进行排序，以评价各共有峰的药效活性从而得到黄芪中化学成分的药效活性。
上述步骤中灰色关联分析的化学计量方法，可以根据关联度的大小分析各共有峰与药效指标及血清代谢组学数据的关联性大小。首先采用最大值标准化方法处理以消除量纲的差异，以指纹图谱中共有峰的面积作为X，大鼠体重、胃液pH值、胃蛋白酶活性与血清代谢组学数据为Y，利用灰色关联方法，对其谱效关系进行研究。当关联度大于0.6时表明化学成分与药效具有关联性。
本评价方法通过建立数学模型，将指纹图谱数据与慢性萎缩性胃炎大鼠的体重、胃液pH值、胃蛋白酶活性及血清代谢组学数据进行关联分析，说明论证了黄芪药材中8(3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷)、9(7,2'-二羟基-3,4'-二甲氧基异黄烷)、15(芒柄花素-7-o-葡萄糖-6”-o-乙酸盐)、22(异黄芪皂苷I)这4个化学成分为治疗慢性萎缩性胃炎的关键的活性成分。并且本方法通过传统药效评价结合血清的代谢组学研究，全面的评价了黄芪在黄芪建中汤复方中治疗慢性萎缩性胃炎的药效物质基础，基本能够快捷明确的确定黄芪药材治疗慢性萎缩性胃炎的活性成分。本发明具有客观性强，重现性强，共有峰明确等优点，使黄芪药材的质量控制更加科学完善，采用实验室前期基础黄芪建中汤供试品的UHPLC-MS/MS指纹图谱中的色谱峰保留时间和光谱特征对共有峰进行识别和筛选，保证识别共有峰的准确性和重复性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明利用化学模式识别方法将黄芪提取物在指纹图谱上所体现的化学成分的变化和药效的变化建立了相关性，为黄芪的质量控制提供了更为全面和准确的谱效基础。
2.本发明利用化学模式识别方法将黄芪提取物在指纹图谱上所体现的化学成分的变化和血清的代谢组学研究建立了相关性，更全面的评价了黄芪在黄芪建中汤治疗慢性萎缩性胃炎的活性成分。
3.利用本发明的方法可实现黄芪治疗慢性萎缩性胃炎药效的活性组分的评价，明确了黄芪中与药效活性较为密切的化学成分，为黄芪治疗慢性萎缩性胃炎的药效物质基础研究提供依据。
附图说明
图1为本发明的不同极性组分组合配伍的黄芪建中汤的UHPLC-MS/MS指纹图谱；
图2为本发明的慢性萎缩性胃炎药效实验的体重变化趋势图；
图3为本发明的慢性萎缩性胃炎药效实验的胃液pH变化图；
图4为本发明的慢性萎缩性胃炎药效实验的胃蛋白酶活性(PA)变化趋势图；
图5为本发明的大鼠血清样本1H-NMR图谱；
图6为本发明的各组大鼠血清样本的1H-NMR图谱PLS-DA得分图；
图7为本发明的空白组(C)与模型组(M)大鼠血清样本的OPLS-DA得分图；
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的实施例采用的实验材料和仪器如下：
1.材料与试剂
所需药材黄芪、白芍、桂枝、炙甘草被购于太原同仁堂药店，饴糖被购于临桂天香食品原料有限公司，生姜、大枣购于当地市场，各药材均经过山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定。黄芪为豆科植物蒙古黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)的干燥根，白芍为毛茛科植物芍药(Paeonialactiflora Pall.)的干燥根，桂枝为樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥嫩枝，炙甘草为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)干燥根的炮制品，生姜为姜科植物姜(Zingiber officinale Rosc.)的新鲜根茎，大枣为鼠李科植物枣(ZiziphusJujuba Mill.)的成熟果实。
脱氧胆酸钠(北京奥博星生物技术有限责任公司)；氨水(天津市大茂化学试剂厂)；NMR试剂重水(D2O,Norell，美国)；3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠(TSP，CambridgeIsotope Laboratories Inc.，美国)；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠(天津市化学试剂六厂)；生理盐水(0.9％氯化钠，华北制药)，胃蛋白酶(PA)试剂盒(A080-1)。
2.实验动物
SD大鼠，雄性，体重160g-200g。
3.仪器
UHPLC-Q Exactive MS四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱；Scientz-1LS离心浓缩仪；高精度台式酸度仪；SC-3160低速离心机；TGL-16高速台式冷冻离心机；Bruker 600-MHzAVANCE III NMR Spectrometer；KQ-300E型超声波清洗仪。
实施例
请参阅图1-7和表1-8，本实施例中的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪评价方法，包括以下步骤：
步骤1，制备黄芪不同极性的部位；
所述步骤1中制备黄芪不同极性的组分的具体步骤包括：
步骤1.1，取同等于黄芪建中汤复方中所含黄芪药材的量，置于圆底烧瓶中；
步骤1.2，在圆底烧瓶中加入蒸馏水，回流提取，第一次加入药材的10倍量蒸馏水，回流提取2h，第二次加入8倍量的蒸馏水，提取1.5h；
步骤1.3，滤过，合并滤液，滤液经回收溶剂，浓缩为浓度为0.5g/mL的黄芪水提液；
步骤1.4，将步骤1.3中的黄芪水提液经AB-8大孔树脂层析柱纯化，得到黄芪不同极性的部位。
所述步骤1.4中黄芪水提液经AB-8大孔树脂层析柱纯化方法，包括以下步骤：
步骤1.4.1，将浓缩到0.5g/mL的黄芪水提液通过AB-8大孔吸附树脂；
步骤1.4.2，用20倍柱体积的蒸馏水进行洗脱，获得A极性部位；
步骤1.4.3，用10倍柱体积的35％乙醇进行洗脱，获得B极性部位；
步骤1.4.4，用5倍柱体积的95％乙醇进行洗脱，获得C极性部位；
步骤1.4.5，收集各洗脱部位，经回收溶剂、真空干燥，制得干燥提取物，得到黄芪不同极性的部位。
步骤2，将步骤1所得黄芪不同极性的部位随机组合，并与黄芪建中汤中其余六味药进行配伍；分别用10倍水与8倍水的量进行回流提取，纱布过滤，合并两次提取液并加入饴糖，减压浓缩，得到不同组分配伍的黄芪建中汤；
所述步骤2将步骤1所得黄芪不同极性的部位随机组合，并与黄芪建中汤中其余六味药白芍、甘草、桂枝、生姜、大枣和饴糖进行配伍；分别用10倍水与8倍水的量进行回流提取，纱布过滤，合并两次提取液并加入饴糖，减压浓缩，得到不同组分配伍的黄芪建中汤；包括：
将所得A、B、C三个极性部位随机组合，得到A、B、C、AB、AC、BC、ABC七个不同极性部位的组合，并与白芍、甘草、桂枝、生姜、大枣和饴糖混合；分别用10倍水与8倍水的量进行回流提取，纱布过滤，合并两次提取液并加入饴糖，减压浓缩，得到不同组分配伍的黄芪建中汤。
步骤3，采用液相色谱串联质谱法建立黄芪不同极性部位配伍的黄芪建中汤指纹图谱；
所述步骤3中采用液相色谱串联质谱法建立黄芪不同极性部位配伍的黄芪建中汤指纹图谱的条件包括液相条件和质谱条件：
其中，液相条件如下：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相为：A为含0.1％甲酸的水溶液，B为乙腈；采用梯度洗脱：0-3min，1％B；3-13min，1％B-20％B；13-15min，20％B-25％B；15-18min，25％B-30％B；18-20min，30％B-40％B；20-23min，40％B-60％B；23-25min，60％B-99％B；25-27min，99％B；27-27.5min，99％B-1％B；27.5～30min，1％B；流速：0.2mL/min；柱温：35℃，进样量：2μl；
质谱条件如下：离子源：热电喷雾离子源HESI；正离子模式检测；扫描范围：m/z100-1500；扫描模式：Full Scan/dd-MS2；高离子喷射电压：+3500V；鞘气流速：35arb，辅助气流速：10arb，毛细管温度：320℃。
步骤4，通过已有黄芪化学成分数据库及文献检索，获取黄芪建中汤总离子流图，黄芪标准品的质谱图与特征碎片，将步骤3中建立的黄芪不同极性部位配伍的黄芪建中汤指纹图谱对比黄芪建中汤总离子流图，并与标准品的质谱图与特征碎片比对，找出其共有峰，得到匹配的共有峰面积数据；
所述步骤4中得到的共有峰共24个，所述24个共有峰的保留时间(tR)分别为：1.74min、17.03min、18.84min、18.92min、19.88min、20.26min、20.27min、21.41min、21.82min、21.91min、22.13min、22.61min、22.85min、23.03min、23.21min、23.77min、24min、24.38min、24.82min、24.97min、25.6min、26.1min、26.25min、26.32min；
所述步骤4中得到的24个共有峰分别为：1号峰为蔗糖，2号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，3号峰为芹菜素，4号峰为红车轴草苷，5号峰为甘草苷，6号峰为芒柄花苷，7号峰为毛蕊异黄酮-7-o-葡萄糖-6”-o-乙酸盐，8号峰为3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷，9号峰为7,2'-二羟基-3,4'-二甲氧基异黄烷，10号峰为7,2'-二羟基-3,4'-二甲氧基异黄酮，11号峰为毛蕊异黄酮，12号峰为二羟基-二甲氧基异黄酮，13号峰为黄芪皂苷VII，14号峰为黄芪异黄酮葡萄糖苷，15号峰为芒柄花素-7-o-葡萄糖-6”-o-乙酸盐，16号峰为二羟基-三甲氧基-二甲氧基异黄酮，17号峰为黄芪皂苷IV，18号峰为黄芪皂苷III，19号峰为芒柄花素，20号峰为7-羟基-6,4'-二甲氧基异黄烷，21号峰为黄芪皂苷II，22号峰为异黄芪皂苷I，23号峰为华良姜素，24号峰为黄芪皂苷I。
步骤5，对实验大鼠进行慢性萎缩性胃炎模型的复制；
所述步骤5中对实验大鼠进行慢性萎缩性胃炎模型的复制的步骤包括：
步骤5.1，大鼠适应一周后随机分为空白对照组和模型组；
步骤5.2，空白对照组大鼠自由饮水与摄食；模型组大鼠给予0.1％氨水与20mmol/L脱氧胆酸钠，每日交替饮用，同时采用饥饿紊乱法造模，两天足食，一天禁食，循环实施10周，建立慢性萎缩性胃炎模型，实现慢性萎缩性胃炎大鼠模型的复制。
步骤6，以黄芪为君药的黄芪建中汤为对象，以慢性萎缩性胃炎造模的大鼠为药效评价平台进行药效评价并进行血清的代谢组学分析，得到药效活性数据和血清代谢组学数据；
所述步骤6以黄芪为君药的黄芪建中汤为对象，以慢性萎缩性胃炎造模的大鼠为药效评价平台进行药效评价并进行血清的代谢组学分析，包括:
步骤6.1，慢性萎缩性胃炎大鼠模型复制4周后，从第5周灌胃给予黄芪建中汤，给药量为10.605g生药/kg，给药周期为6周,实验期间，每三天对大鼠进行称重，记录体重，绘制体重趋势图；
步骤6.2，慢性萎缩性胃炎大鼠最后一次称重后，禁食不禁水48h进行腹主动脉取血，使用乙醚麻醉慢性萎缩性胃炎大鼠，结扎胃部贲门，大鼠储存胃液3h，缝合腹腔，皮下注射10％的水合氯醛麻醉大鼠，先结扎贲门，后腹主动脉取血，收集血液，摘出全胃，洗去表面血水，滤纸吸干，收集胃液，将所得胃液与血液均在4℃、3000rpm/min下离心15min，分别获得上清，其中部分胃液上清立即检测，获得胃液pH值，并依据南京建成试剂盒说明操作测定胃蛋白酶(PA)的活性，其余胃液与血液上清保存在-80℃待测，并通过冷冻离心机离心得到血清样本，从而得到药效活性数据；
步骤6.3，取解冻后300μL血清样本与300μL D2O混合，涡旋60s，于4℃、13,000rpm下离心10min，取550μL上清转移到直径为5mm的核磁管中进行核磁检测；
步骤6.4，利用SPSS 16.0对各组大鼠的血清差异代谢物数据进行主成分分析；根据相关矩阵、特征值与累计方差贡献率获得相应的主成分,选择方差排名靠前的主成分，保留了初始变量的大部分信息，可将其作为血清代谢组学的评价指标，从而得到血清代谢组学数据。
步骤7，将步骤4中得到的指纹图谱共有峰数据和步骤6得到的药效活性数据带入数学模型进行灰色关联分析，评价黄芪中化学成分的药效活性；
步骤8，将步骤4中得到的指纹图谱共有峰数据和步骤6得到的血清代谢组学数据带入数学模型进行灰色关联分析，评价黄芪中化学成分的药效活性；
所述步骤7和步骤8中的灰色关联分析包括如下步骤：
步骤S1，将传统药效指标与血清核磁代谢组学数据作为参考数列Y，指纹图谱中化学成分的面积作为比较数列Xi：
参考数列Y(k)，k＝1,2,3...m。
比较数列Xi(k)，i＝1,2,3...m。
步骤S2，对数据进行最大值标准化；
步骤S3，根据步骤S2所得标准化数据计算各共有峰与药效之间的关联系数，其中关联系数按以下公式计算：
i＝1,2,3,...,n；k＝1,2,3,...,m；
其中，ξi为第k个样品的比较数列Xi与参考数列Y的关联系数，
Δi(k)＝|Y(k)-Xi(k)|比较数列与参考数列差值的绝对值；
Δmin＝minminΔi(k),两极的最小差值；Δmax＝maxmaxΔi(k),两极的最大差值；
步骤S4，对步骤S3所得关联系数按以下公式进行关联度的计算：
步骤S5，对步骤S4所得关联度进行排序，以评价各共有峰的药效活性从而得到黄芪中化学成分的药效活性。
步骤9，根据步骤7和步骤8中黄芪中化学成分的药效活性得出治疗慢性萎缩性胃炎黄芪中关键的活性成分为8(3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷)、9(7,2'-二羟基-3,4'-二甲氧基异黄烷)、15(芒柄花素-7-o-葡萄糖-6”-O-乙酸盐)、22(异黄芪皂苷I)，从而完成基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价。
通过以黄芪为君药的黄芪建中汤为对象，以慢性萎缩性胃炎造模的大鼠为药效评价平台进行药效评价我们可以得到：
体重增长趋势：实验结果(见图2)表明：空白组大鼠体重仍然呈持续增长趋势，模型组大鼠体重增长缓慢。给药组干预后，大鼠体重均明显回调，且黄芪建中汤全方组的作用最为明显，缺黄芪的阴性方效果最差，其他给药组分散于全方组与阴性方组之间。
胃液pH值：实验结果(见图3)表明：与空白相比，模型组大鼠的胃液pH与值明显升高(p<0.05)，经药物治疗后，HQJZ组、ABC组与AC组大鼠的胃液pH被明显回调。
胃蛋白酶活性(PA)值：实验结果(见图4)表明：与空白相比，模型组大鼠的胃蛋白酶活性显著降低(p<0.01)，各给药组的胃蛋白酶活性均有不同程度的调节，HQJZ组的回调效果最为显著(p<0.01)。
血清核磁代谢组学：实验结果(见图5、图6、表4)表明：空白组与模型组明显的区分，给药组在空白组与模型组之间分散。OPLS-DA得分结果所示，空白组与模型组被t[1]轴明显区分，通过S-plot得分，筛选VIP>1.0且p<0.05的显著差异变量，最终获得15个与慢性萎缩性胃炎密切相关的潜在生物标志物。表5结果显示，根据特征值大于1获得8个主成分，前4个主成分的方差和占全部方差的88.73％，表明前4个主成分保留了总信息量的88.73％，可将其作为血清代谢组学的评价指标。
根据表6得分系数矩阵，通过回归算法可以获得以标准化的原始变量(X1至X15表示)表示的因子得分函数，再根据因子得分计算获得主成分矩阵与综合指数(表7)：
F1＝0.091X1+0.446X2+0.033X3-0.126X4+0.658X5-0.03X6-0.24X7+0.243X8+0.004X9+0.046X10-0.045X11-0.003X12-0.008X13+0.129X14-0.049X15
F2＝0.246X1-0.044X2-0.172X3-0.479X4+0.237X5-0.029X6-0.094X7-0.072X8+0.453X9-1.128X10-0.133X11-0.023X12+0.135X13+0.195X14-0.108X15
F3＝-0.032X1-0.157X2-0.112X3-0.048X4+0.133X5+0.256X6-0.028X7+0.16X8+0.071X9+0.024X10+0.152X11+0.758X12-0.037X13+0.486X14-0.041X15
F4＝0.031X1-0.153X2-0.022X3+0.921X4-0.203X5+0.794X6-0.189X7+0.133X8-0.224X9+0.595X10+0.024X11+0.249X12+0.208X13+0.01X14+0.118X15
谱效相关性分析：由于数列单位不同或者量纲不同，在进行关联分析之前，需要对各数列进行无量纲化处理，以达到量纲一致性。本发明采用最大值标准化方法处理以消除量纲的差异。指纹图谱中化学成分的面积作为X，大鼠体重、胃液pH值与胃蛋白酶活性数据为Y，利用灰色关联方法，对其谱效关系进行研究。结果见表4。由表4可见，与大鼠体重有较大相关性的前12个化学成分为14>13>15>21>10>12>1>20>8>22>9>7；与胃液pH值有较大相关性的前12个化学成分为2>8>19>9>10>16>17>12>13>15>24>22；与胃蛋白酶活性有较大相关性的前12个化学成分为1>2>4>6>8>15>11>24>9>22>17>14；指纹图谱中化学成分的面积作为X，大鼠血清代谢组学获得的综合得分数据为Y，利用灰色关联方法，对其谱效关系进行研究。结果见表8。由表8可见，与血清代谢组学有较大相关性的前12个化学成分为2>8>6>15>24>22>9>17>7>19>21>11。
结果显示，与传统药效指标和血清代谢组学关联度较大的共有的化学成分有4个，分别为8(3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷)、9(7,2'-二羟基-3,4'-二甲氧基异黄烷)、15(芒柄花素-7-o-葡萄糖-6”-O-乙酸盐)、22(异黄芪皂苷I)，表明这4个化学成分为治疗慢性萎缩性胃炎的关键的活性成分。
表1梯度洗脱程序
表2动物分组与给药
表3黄芪不同极性提取物的共有峰匹配数据
表4基于1H-NMR的大鼠血清差异代谢物指认表
表5基于1H-NMR的大鼠血清差异代谢物总方差解释表
表6基于1H-NMR的大鼠血清差异代谢物的成分得分系数矩阵
表7基于1H-NMR的大鼠血清差异代谢物的主成分矩阵与综合指数
表8黄芪中24个化学成分与药效指标血清代谢组学的灰色关联度值
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，制备黄芪不同极性的部位；
步骤2，将步骤1所得黄芪不同极性的部位随机组合，并与黄芪建中汤中其余六味药进行配伍；分别用10倍水与8倍水的量进行回流提取，纱布过滤，合并两次提取液并加入饴糖，减压浓缩，得到不同组分配伍的黄芪建中汤；
步骤3，采用液相色谱串联质谱法建立黄芪不同极性部位配伍的黄芪建中汤指纹图谱；
步骤4，通过已有黄芪化学成分数据库及文献检索，获取黄芪建中汤总离子流图、黄芪标准品的质谱图与特征碎片，将步骤3中建立的黄芪不同极性部位配伍的黄芪建中汤指纹图谱对比黄芪建中汤总离子流图，并与标准品的质谱图与特征碎片比对，找出其共有峰，得到匹配的共有峰面积数据；
步骤5，对实验大鼠进行慢性萎缩性胃炎模型的复制；
步骤6，以黄芪为君药的黄芪建中汤为对象，以慢性萎缩性胃炎造模的大鼠为药效评价平台进行药效评价并进行血清的代谢组学分析，得到药效活性数据和血清代谢组学数据；
步骤7，将步骤4中得到的共有峰面积数据和步骤6得到的药效活性数据带入数学模型进行灰色关联分析，评价黄芪中化学成分的药效活性；
步骤8，将步骤4中得到的共有峰面积数据和步骤6得到的血清代谢组学数据带入数学模型进行灰色关联分析，评价黄芪中化学成分的药效活性；
步骤9，根据步骤7和步骤8中黄芪中化学成分的药效活性得出治疗慢性萎缩性胃炎黄芪中关键的活性成分为8(3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷)、9(7,2'-二羟基-3,4'-二甲氧基异黄烷)、15(芒柄花素-7-o-葡萄糖-6”-O-乙酸盐)、22(异黄芪皂苷I)，从而完成基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价。
2.根据权利要求1所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤1中制备黄芪不同极性部位的具体步骤包括：
步骤1.1，取同等于黄芪建中汤复方中所含黄芪药材量的黄芪，置于圆底烧瓶中；
步骤1.2，在圆底烧瓶中加入蒸馏水，回流提取，第一次加入药材的10倍量蒸馏水，回流提取2h，第二次加入8倍量的蒸馏水，提取1.5h；
步骤1.3，滤过，合并滤液，滤液经回收溶剂，浓缩为浓度为0.5g/mL的黄芪水提液；
步骤1.4，将步骤1.3中的黄芪水提液经AB-8大孔树脂层析柱纯化，得到黄芪不同极性的部位。
3.根据权利要求2所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤1.4中黄芪水提液经AB-8大孔树脂层析柱纯化方法，包括以下步骤：
步骤1.4.1，将浓缩到0.5g/mL的黄芪水提液通过AB-8大孔吸附树脂；
步骤1.4.2，用20倍柱体积的蒸馏水进行洗脱，获得A极性部位；
步骤1.4.3，用10倍柱体积的35％乙醇进行洗脱，获得B极性部位；
步骤1.4.4，用5倍柱体积的95％乙醇进行洗脱，获得C极性部位；
步骤1.4.5，收集各洗脱部位，经回收溶剂、真空干燥，制得干燥提取物，得到黄芪不同极性的部位。
4.根据权利要求3所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤2中将步骤1所得黄芪不同极性的部位随机组合，并与黄芪建中汤中其余六味药白芍、甘草、桂枝、生姜、大枣和饴糖进行配伍；分别用10倍水与8倍水的量进行回流提取，纱布过滤，合并两次提取液并加入饴糖，减压浓缩，得到不同组分配伍的黄芪建中汤；包括：
将所得A、B、C三个极性部位随机组合，得到A、B、C、AB、AC、BC、ABC七个不同极性部位的组合，并与白芍、甘草、桂枝、生姜、大枣和饴糖混合；分别用10倍水与8倍水的量进行回流提取，纱布过滤，合并两次提取液并加入饴糖，减压浓缩，得到不同组分配伍的黄芪建中汤。
5.根据权利要求4所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤3中采用液相色谱串联质谱法建立黄芪不同极性部位配伍的黄芪建中汤指纹图谱的条件包括液相条件和质谱条件：
其中，液相条件如下：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相为：A为含0.1％甲酸的水溶液，B为乙腈；采用梯度洗脱：0-3min，1％B；3-13min，1％B-20％B；13-15min，20％B-25％B；15-18min，25％B-30％B；18-20min，30％B-40％B；20-23min，40％B-60％B；23-25min，60％B-99％B；25-27min，99％B；27-27.5min，99％B-1％B；27.5～30min，1％B；流速：0.2mL/min；柱温：35℃，进样量：2μl；
质谱条件如下：离子源：热电喷雾离子源HESI；正离子模式检测；扫描范围：m/z100-1500；扫描模式：Full Scan/dd-MS2；高离子喷射电压：+3500V；鞘气流速：35arb，辅助气流速：10arb，毛细管温度：320℃。
6.根据权利要求5所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤4中得到的共有峰共24个，所述24个共有峰的保留时间(tR)分别为：1.74min、17.03min、18.84min、18.92min、19.88min、20.26min、20.27min、21.41min、21.82min、21.91min、22.13min、22.61min、22.85min、23.03min、23.21min、23.77min、24min、24.38min、24.82min、24.97min、25.6min、26.1min、26.25min、26.32min；
7.根据权利要求6所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤4中得到的24个共有峰分别为：1号峰为蔗糖，2号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，3号峰为芹菜素，4号峰为红车轴草苷，5号峰为甘草苷，6号峰为芒柄花苷，7号峰为毛蕊异黄酮-7-o-葡萄糖-6”-o-乙酸盐，8号峰为3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷，9号峰为7,2'-二羟基-3,4'-二甲氧基异黄烷，10号峰为7,2'-二羟基-3,4'-二甲氧基异黄酮，11号峰为毛蕊异黄酮，12号峰为二羟基-二甲氧基异黄酮，13号峰为黄芪皂苷VII，14号峰为黄芪异黄酮葡萄糖苷，15号峰为芒柄花素-7-o-葡萄糖-6”-o-乙酸盐，16号峰为二羟基-三甲氧基-二甲氧基异黄酮，17号峰为黄芪皂苷IV，18号峰为黄芪皂苷III，19号峰为芒柄花素，20号峰为7-羟基-6,4'-二甲氧基异黄烷，21号峰为黄芪皂苷II，22号峰为异黄芪皂苷I，23号峰为华良姜素，24号峰为黄芪皂苷I。
8.根据权利要求7所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤5中对实验大鼠进行慢性萎缩性胃炎模型的复制的步骤包括：
步骤5.1，大鼠适应一周后随机分为空白对照组和模型组；
步骤5.2，空白对照组大鼠自由饮水与摄食；模型组大鼠给予0.1％氨水与20mmol/L脱氧胆酸钠，每日交替饮用，同时采用饥饿紊乱法造模，两天足食，一天禁食，循环实施10周，建立慢性萎缩性胃炎模型，实现慢性萎缩性胃炎大鼠模型的复制。
9.根据权利要求8所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤6以黄芪为君药的黄芪建中汤为对象，以慢性萎缩性胃炎造模的大鼠为药效评价平台进行药效评价并进行血清的代谢组学分析得到药效活性数据和血清代谢组学数据，包括:
步骤6.1，慢性萎缩性胃炎大鼠模型复制4周后，从第5周灌胃给予黄芪建中汤，给药量为10.605g生药/kg，给药周期为6周,实验期间，每三天对大鼠进行称重，记录体重，绘制体重趋势图；
步骤6.2，慢性萎缩性胃炎大鼠最后一次称重后，禁食不禁水48h进行腹主动脉取血，使用乙醚麻醉慢性萎缩性胃炎大鼠，结扎胃部贲门，大鼠储存胃液3h，缝合腹腔，皮下注射10％的水合氯醛麻醉大鼠，先结扎贲门，后腹主动脉取血，收集血液，摘出全胃，洗去表面血水，滤纸吸干，收集胃液，将所得胃液与血液均在4℃、3000rpm/min下离心15min，分别获得上清，其中部分胃液上清立即检测，获得胃液pH值，并依据南京建成试剂盒说明操作测定胃蛋白酶(PA)的活性，其余胃液与血液上清保存在-80℃待测，并通过冷冻离心机离心得到血清样本，从而得到药效活性数据；
步骤6.3，取解冻后300μL血清样本与300μL D2O混合，涡旋60s，于4℃、13,000rpm下离心10min，取550μL上清转移到直径为5mm的核磁管中进行核磁检测；
步骤6.4，利用SPSS16.0对各组大鼠的血清差异代谢物数据进行主成分分析；根据相关矩阵、特征值与累计方差贡献率获得相应的主成分,选择方差排名靠前的主成分，保留了初始变量的大部分信息，可将其作为血清代谢组学的评价指标，从而得到血清代谢组学数据。
10.根据权利要求1-9任一项所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤7和步骤8中的灰色关联分析包括如下步骤：
步骤S1，将传统药效指标与血清核磁代谢组学数据作为参考数列Y，指纹图谱中化学成分的面积作为比较数列Xi：
参考数列Y(k)，k＝1,2,3...m
比较数列Xi(k)，i＝1,2,3...m
步骤S2，对数据进行最大值标准化；
步骤S3，根据步骤S2所得标准化数据计算各共有峰与药效之间的关联系数，其中关联系数按以下公式计算：
i＝1,2,3,...,n；k＝1,2,3,...,m；
其中，ξi为第k个样品的比较数列Xi与参考数列Y的关联系数，
Δi(k)＝|Y(k)-Xi(k)|比较数列与参考数列差值的绝对值；
Δmin＝minminΔi(k),两极的最小差值；Δmax＝maxmaxΔi(k),两极的最大差值；
步骤S4，对步骤S3所得关联系数按以下公式进行关联度的计算：
步骤S5，对步骤S4所得关联度进行排序，以评价各共有峰的药效活性，从而得到黄芪中化学成分的药效活性。
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