CN108195989A - 一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，通过采用现代分离技术制备黄刺玫不同极性组分的提取物；运用高效液相色谱法建立各组分提取物的指纹图谱，并标定特征峰；以血小板聚集抑制率、凝血酶原时间、凝血酶时间和部分凝血酶时间为指标评价不同提取物的抗血栓活性；将指纹图谱特征峰数据和药效活性数据带入数学模型进行谱效相关性分析，评价特征峰的药效活性。本基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，可以快速、准确地评价黄刺玫中具有抗血栓作用的化学成分，为黄刺玫的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法，为进一步开发黄刺玫治疗血栓性疾病的药物或保健品提供参考。

Description

一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法
技术领域
本发明涉及到一种评价中药化学成分药效活性的方法，特别涉及一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法。
背景技术
黄刺玫(Rosa xanthina Lindl.)又名黄刺莓，属多年生落叶灌木，是蔷薇科蔷薇属有刺野生黄刺玫的果实。广泛分布于东北、华北、西北等地区的山区和丘陵地带。据《中药大辞典》记载，野刺玫果具有健脾理气，养血调经的作用，治疗消化不良，气滞腹泻，胃痛，月经不调等病症。民间大量采食用于泡茶、泡酒等。现代研究表明，刺玫果中含有黄酮类、有机酸、三萜类、皂苷等多种生物活性成分。由此可见，天然黄刺玫是一种不可多得的食、药同源的宝贵资源。
中药指纹图谱与化学计量学相结合，通过偏最小二乘法、相关性分析、回归分析等方法进行化学模式识别的方法来评价中药的质量，已经被世界卫生组织所认可。但目前大多数中药的活性成分及其物质基础不明确，建立在中药化学成分基础上的中药指纹图谱并不能有效地表现其与药效的相关性，因此只有将指纹图谱中化学成分的含量变化与其药效变化联系起来，建立起谱效关系，才能有效地反映其内在质量。大量药理研究表明，从刺玫果中分离得到的檞皮素、山奈素、儿茶素等黄酮类化合物具有降血压、保护心肌缺血、抗血栓形成的作用。因此本发明以黄刺玫提取物的HPLC指纹图谱为基础，通过偏最小二乘法、灰色关联度分析和双变量相关分析，考察黄刺玫抗血栓药效活性的谱效关系。
发明内容
为了解决现有的问题，本发明的目的在于提供一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，可以快速、准确地评价黄刺玫中具有抗血栓作用的化学成分及活性成分筛选，为黄刺玫的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，通过建立黄刺玫不同极性提取物的HPLC指纹图谱，标定共有特征峰，通过谱效数学模型评价黄刺玫中化学成分的抗血栓作用。
一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，其步骤如下：
1)采用现代提取技术制备黄刺玫的不同极性的组分；
2)采用高效液相色谱法(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)技术建立黄刺玫指纹图谱；
3)标定共有峰，提取特征峰数据；
4)对不同极性提取物进行抗血小板聚集和抗凝血实验；
5)将指纹图谱特征峰数据和药效活性数据经化学计量学方法进行统计分析，评价黄刺玫中化学成分的药效活性。
优选的，黄刺玫提取物制备方法为：
第一步、取适量黄刺玫适当粉碎，精密称取6份粗粉，每份100g，置于圆底烧瓶中；
第二步、分别向上述圆底烧瓶中加入10倍量体积的水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和90％乙醇；
第三步、回流提取1h，提取两次；
第四步、滤过，合并滤液，滤液经回收溶剂；
第五步、真空干燥，制得干燥提取物。
优选的，黄刺玫提取物经大孔树脂层析柱纯化方法为：
第一步、称取回收溶剂干燥样品适量；
第二步、用水溶解后上大孔树脂吸附柱，分别以40％、60％、80％乙醇溶液洗脱；
第三步、收集各洗脱部位，经回收溶剂、真空干燥，制得干燥提取物。
优选的，建立黄刺玫HPLC指纹图谱的条件：色谱柱采用十八烷基键合硅胶填料；流动相为：A为乙腈，B为0.1％(v/v)磷酸溶液；采用梯度洗脱：0min→10min→26min→44min→53min→58min→63min→65min，乙腈：12％→16％→16％→28％→30％→50％→50％→12％，0.1％(v/v)磷酸溶液：88％→84％→84％→72％→70％→50％→50％→88％；流速：1.0mL/min；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：360nm；柱温：30℃；进样量：15μL。
优选的，共有特征峰的保留时间(tR)分别为：10.7min、11.0min、12.9min、13.4min、17.8min、20.4min、21.8min、22.9min、25.4min、26.4min、30.0min、30.8min、38.5min、40.2min、43.2min、45.2min、47.4min、51.6min、52.2min。
优选的，共有峰中9号峰为芦丁，13号峰为槲皮素-3-O-α-L鼠李糖苷，19号峰为槲皮素。
优选的，实验所用动物为SD大鼠，药效学评价指标为血小板聚集抑制率、凝血酶时间、凝血酶原时间和部分凝血酶时间。
优选的，将黄刺玫不同极性提取物的指纹图谱化学信息和药效活性信息带入数学模型进行谱效相关性分析，包括偏最小二乘法、灰色关联度分析和双变量相关分析，评价黄刺玫中化学成分的药效活性，研究其药效物质基础。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明在国内首次进行了黄刺玫指纹图谱特征和药效活性的相关性研究，利用化学模式识别方法将黄刺玫提取物在指纹图谱上所体现的化学成分的变化和药效的变化建立了相关性，为黄刺玫的质量控制提供了更为全面和准确的谱效基础。
(2)本发明在国内首次完成了黄刺玫具有抗凝血和抗血小板聚集活性组分的评价，明确了黄刺玫中与药效活性较为密切的化学成分，为黄刺玫的抗血栓药效物质基础研究提供依据，为进一步开发相关的保健品或治疗药物提供参考。
附图说明
图1为本发明的黄刺玫样品提取物HPLC指纹图谱；
图2为本发明的黄刺玫不同极性提取物匹配后HPLC指纹图谱；
图3为本发明的血小板聚集抑制率回归系数图；
图4为本发明的血小板聚集抑制率VIP图；
图5为本发明的PT时间回归系数图；
图6为本发明的PT时间VIP图；
图7为本发明的TT时间回归系数图；
图8为本发明的TT时间VIP图；
图9为本发明的APTT时间回归系数图；
图10为本发明的APTT时间VIP图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-10，本发明所采用的技术方案是：一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，通过建立黄刺玫不同极性提取物的HPLC指纹图谱，以及黄刺玫提取物的抗血栓药效活性，利用谱效数学模型评价黄刺玫的抗血栓活性成分。
一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫活性成分评价方法，其步骤如下：
第一步、供试溶液的制备：取适量黄刺玫适当粉碎，精密称取6份粗粉，每份100g，置于圆底烧瓶中，分别加入10倍量体积的水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和90％乙醇，回流提取1h，提取两次，滤过，合并滤液，滤液经回收溶剂、真空干燥，制得干燥提取物；称取回收溶剂干燥样品适量，用水溶解后上大孔树脂层析柱，分别以40％、60％、80％乙醇溶液洗脱，收集各洗脱部位，经回收溶剂、真空干燥，制得干燥提取物；
第二步、黄刺玫指纹图谱的建立：采用高效液相色谱法对步骤一所得的样品进行指纹图谱测定；色谱条件：色谱柱采用十八烷基键合硅胶填料；流动相为：A为乙腈，B为体积比浓度为0.1％磷酸溶液，采用梯度洗脱：0min→10min→26min→44min→53min→58min→63min→65min，乙腈：12％→16％→16％→28％→30％→50％→50％→12％，体积比浓度为0.1％磷酸溶液：88％→84％→84％→72％→70％→50％→50％→88％；流速：1.0mL/min；检测波长：360nm；柱温：30℃；进样量：15μL；
第三步、筛选共有特征峰，提取特征峰数据：通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》软件分析，找出其共有特征峰，得到共有峰匹配数据，19个共有峰的保留时间(tR)分别为：10.7min、11.0min、13.0min、13.4min、17.8min、20.4min、21.8min、22.9min、25.4min、26.4min、30.0min、30.8min、38.5min、40.2min、43.2min、45.2min、47.4min、51.6min、52.2min。特征峰色谱图及匹配后图谱见说明书附图1和2，经与标准品比对，得知9号峰为芦丁，13号峰为槲皮素-3-O-α-L鼠李糖苷，19号峰为槲皮素；
第四步、对不同极性提取物进行药效学试验：通过体外ADP诱导SD大鼠血小板聚集抑制实验考察黄刺玫提取物对血小板聚集的影响；通过凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和部分凝血酶时间(APTT)实验考察黄刺玫提取物对凝血时间的影响。
第五步、谱效相关性分析：将步骤三所得特征峰数据和步骤四所得的药效学数据代入谱效数学模型进行分析，包括偏最小二乘法、灰色关联度和双变量相关分析，评价各特征峰所代表的的化学成分对药效活性的贡献大小。
根据本发明的方法，其中步骤五中，所述偏最小二乘法步骤包括如下步骤：
以均值化处理的指纹图谱中各特征峰峰面积为自变量X，药效指标为因变量为Y，进行偏最小二乘法拟合模型，经系统分析选取有意义的成分，计算各个色谱峰的回归系数。其中回归系数绝对值反映色谱峰对药效指标贡献的大小，绝对值越大，说明相关性越大；回归系数的符号反映与药效指标的相关变化方向(即正、负相关)。作为优选，所述偏最小二乘法在SIMCA-P11.5软件中，通过分析(Analysis)项目下自动模型拟合(Autofit)模块实现。
根据本发明的方法，其中步骤5中，所述灰色关联度步骤包括如下步骤：
1)将不同极性样品的药效学指标组成母序列，将各样品的指纹图谱共有峰峰面积组成子序列；
2)对上述序列进行均值化处理；
3)根据步骤2)所得均值化数据计算各共有峰与药效之间的关联度；
4)对步骤3)所得关联度进行排序，以评价各共有峰的药效活性；
更具体来说，在计算关联度的过程中，关联系数可以按以下本行业专业人员常用公式计算：
其中，ξi为第k个样品的子序列xi与母序列x0的关联系数，x0(k)表示母序列，xi(k)表示子序列，ρ表示分辨系数，在计算中是为了削弱最大绝对差值而引起的失真，其目的是提高关联系数之间差异显著性，其取值区间为ρ∈(0，1)，通常取0.5。而关联度是关联系数的算术平均数。
根据本发明的方法，其中步骤5中，所述双变量相关分析步骤包括如下步骤：
以均值化处理的指纹图谱中各特征峰峰面积为自变量X，药效指标为因变量为Y，进行双变量相关分析，计算各个色谱峰的相关系数，例如Pearson相关系数，以评价共有峰的药效活性。作为优选，所述双变量相关分析通过SPSS 22.0软件，在分析(Analyze)项下相关(Correlate)-双变量(Bivariate)模块实现。
根据本发明的方法，对黄刺玫抗血栓活性化学成分评价的结果显示：对血小板聚集抑制率对用明显的为P4、P6、P7、P8、P9、P12共有峰，其中P9峰为芦丁；对延长PT、TT、APTT时间贡献较大的峰为P4、P6、P8、P12。同时通过相关性分析发现，P6、P8和P12色谱峰的相对峰面积较大、关联度强，可作为评价黄刺玫质量的指标，但其反映的化学成分还需进一步研究。
本发明采用的实验材料和仪器的相关信息如下：
1.材料与试剂
野生黄刺玫果样品，鉴定为蔷薇科植物：黄刺玫Rosa xanthina Lindl.；芦丁对照品，批号100080-201409，中国食品药品检定研究院；槲皮素-3-O-α-L鼠李糖苷对照品，纯度≥98％，槲皮素对照品，纯度≥98％，乙腈为色谱纯，磷酸、95％乙醇为分析纯，水为实验室自制超纯水。
ADP试剂，规格250mg，质控血浆，规格1mL；PT试剂，规格5mL，批号STY50101-98，TT试剂，规格2mL，批号STY50301-59，APTT试剂，规格2mL，批号STY20201-65，CaCl2试剂，规格2mL，批号STY20202-65；氯化钠注射液，规格250mL，批号1605073401。
2.实验动物
SD大鼠，雄性，体重250g-300g。
3仪器
Agilent 1200型高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器；LG-PABER-I型半自动凝血分析仪；AB104.N型电子天平；UPHW-I-90T型优普系列超纯水系统；XA-1型多功能粉碎机；MH-500型电子调温电热套；RE-2000B型旋转蒸发器。
实施例1
1实验方法
1.1指纹图谱的建立
1.1.1供试品的制备
取适量黄刺玫适当粉碎，精密称取6份粗粉，每份100g，置于圆底烧瓶中，分别加入10倍量体积的水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和90％乙醇，回流提取1h，提取两次，滤过，合并滤液，滤液经回收溶剂、真空干燥，制得干燥提取物，样品记为S1～S5，备用。称取样品S4适量，用水溶解后上大孔树脂层析柱，分别以40％、60％、80％乙醇溶液洗脱，收集各洗脱部位，减压浓缩至干浸膏，备用，样品编号为S6～S8。
取S1～S5样品各1g(相当于原料10g)，取S6～S8样品各0.1g(相当于原料10g)，精密称定，分别置于10mL量瓶中，加适量甲醇溶解，250W功率(频率40kHz)超声20min，放冷后稀释至刻度，摇匀，经0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为HPLC供试品，备用。
1.1.2色谱条件
Athena-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流速：1.0mL/min；检测波长：360nm；柱温：30℃；进样量：15μL。流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(见表1)，采集前60min色谱图。
表1梯度洗脱程序
1.2体外ADP诱导大鼠血小板聚集抑制实验
1.2.1血浆的制备
取SD大鼠，戊巴比妥麻醉后腹腔动脉取血，3.2％枸橼酸钠抗凝剂与大鼠全血以9:1比例抗凝，混匀。以1000rpm，离心10min，取上层液体即富血小板血浆(PRP)；取剩余部分血液以3000rpm，离心10min，取上层液体即贫血小板血浆(PPP)。
1.2.2样品的制备
取S1～S5样品的干燥提取物1g(相当于原材料10g)，S6～S8样品的干燥提取物0.1g(相当于原材料10g)，用生理盐水溶解至10mL容量瓶，制备成浓度为100g/L和10g/L的提取物溶液，过滤后备用。
1.2.3实验方法
取PPP 295μL，蒸馏水5μL，置于凝血杯中，按照半自动凝血仪操作说明进行操作，对测定通道依次调零。设置空白对照组和样品组，样品组加入PRP 295μL，不同提取物样品溶液5μL，空白组加入PRP 295μL，生理盐水5μL，37℃预温1min，加15μL诱导剂ADP溶液(0.5mg/mL)，每组3个平行样本，用半自动凝血仪测定10min内血小板的最大聚集率，并计算血小板聚集抑制率。
1.3谱效关系分析方法
本实施例经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》软件分析，找出其共有特征峰，得到共有峰面积匹配数据。采用偏最小二乘法、灰色关联度和双变量相关分析等方法进行综合分析，揭示一个因变量与多个自变量之间的关联性，用于明确中药的药效物质基础。偏最小二乘法通过SIMCA-P11.5软件，分析(Analysis)项目下自动模型拟合(Autofit)模块实现；灰色关联度法通过Excel进行公式编辑计算实现；双变量相关分析通过SPSS22.0软件，在分析(Analyze)项下相关(Correlate)中双变量(Bivariate)模块实现。
2实验结果
2.1指纹图谱的建立
按上述发明的方法，将S1～S8供试品溶液进行HPLC测定，建立黄刺玫样品的指纹图谱。样品图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》软件分析，找出其共有特征峰共19个，获得共有峰面积匹配数据(见表2)，色谱图见图1、图2。经与标准品比对，得知9号峰为芦丁，13号峰为槲皮素-3-O-α-L鼠李糖苷，19号峰为槲皮素。19个共有峰的保留时间(tR)分别为：10.7min、11.0min、12.9min、13.4min、17.8min、20.4min、21.8min、22.9min、25.4min、26.4min、30.0min、30.8min、38.5min、40.2min、43.2min、45.2min、47.4min、51.6min、52.2min。
表2黄刺玫提取物的共有峰匹配数据
2.2抗血小板聚集实验
实验结果(见表3)表明：与空白组相比，S1～S8黄刺玫提取物可以明显抑制大鼠血小板聚集，差异有统计学意义(P<0.01)。
表3黄刺玫提取物对大鼠血小板聚集率的影响
与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01
2.3谱效相关性分析
由于数列单位不同或者量纲不同，在进行关联分析之前，需要对各数列进行无量纲化处理，以达到量纲一致性。本发明采用均值化变换，即分别求出各个序列数据的平均值，再用平均值去除以对应序列中的各个原始数据，所得到的商为新的数据列，即均值化数列。指纹图谱数据和血小板聚集抑制率结经均值化处理后的结果见表4。
表4数据均值化结果
2.3.1偏最小二乘法(PLSR)
首先采用血小板聚集抑制率作为药效指标(Y)与色谱峰面积(X)进行PLSR分析。将数据导入SIMCA-P11.5软件，经过计算系统选取了2个有意义的成分，它可以解释88.67％的Y变量。由标准化的回归系数图(图3)和VIP图(图4)可以看出，大部分色谱峰都与血小板聚集抑制率呈正相关，即它们所对应的化学成分含量增加，血小板聚集能力将会减弱。其中P4、P7、P8、P6、P12、P1、P9、P11特征峰所对应的化学成分都对抑制血小板聚集起主要作用，其他峰因其置信区间过零点，无显著性意义。
2.3.2灰色关联度分析
由表5可见，各个自变量所代表的化学成分与血小板聚集抑制作用之间的关联度排序如下：
P7>P8>P4>P12>P6>P14>P3>P1>P10>P9>P13>P15>P11>P5>P18>P2>P16>P19>P17。其中P7、P8、P4、P12、P6、P14、P3所对应的化学成分与药效间的关联度大于0.8，表明该物质与抑制血小板聚集作用高度关联。其他特征峰所对应的化学成分也都与血小板聚集抑制作用有较高的关联度(关联度在0.65以上)，表明这些成分与抑制血小板聚集作用具有协同作用。
表5血小板聚集抑制率灰色关联度分析结果
2.3.3双变量相关分析
从表6中Pearson系数分析结果可见，P4、P6、P7、P8、P9、P12、P13、P14色谱峰对血小板聚集抑制具有正作用且贡献较大，其中P6、P7、P8对血小板聚集抑制作用的贡献最显著(P<0.01)，表明这些特征峰所对应的化学成分与血小板聚集抑制作用高度关联。而P2的相关系数为负值，说明其对应的化学成分可能对血小板聚集起促进作用，但因相关系数没有显著性意义，因此需结合另外两种方法综合考虑才能确定哪些成分为有效成分或有害成分。
表6血小板聚集抑制率双变量相关分析结果
相关系数显著性：*P<0.05，**P<0.01。
由以上可知，黄刺玫抗血栓作用是其有效组分共同作用的结果，各特征峰代表的化学成分与血小板聚集抑制作用的关联度虽大小不一，但都起了一定的作用。通过偏最小二乘法、灰色关联度和双变量相关分析相结合，基本能够反映黄刺玫指纹图谱与血小板聚集抑制率这一指标之间的相关性：P4、P6、P7、P8、P9、P12对血小板聚集抑制作用具有较大贡献，是主要活性成分，其中P9为芦丁。
综合以上三种方法的分析结果，黄刺玫中具有抗血小板聚集活性的主要成分可能为P4、P6、P7、P8、P9、P12号色谱峰所对应的化学物质。通过偏最小二乘法、灰色关联度和双变量相关分析三种化学模式相互结合，能够较全面地反映黄刺玫的指纹图谱与其抗血小板聚集药效活性之间的关系，明确其中的药效活性物质基础。
实施例2
1实验方法
1.1指纹图谱的建立
1.1.1样品的制备
取适量黄刺玫适当粉碎，精密称取6份粗粉，每份100g，置于圆底烧瓶中，分别加入10倍量体积的水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和90％乙醇，回流提取1h，提取两次，滤过，合并滤液，滤液经回收溶剂，真空干燥，获得干燥提取物，样品记为S1～S5，备用。称取样品S4适量，用水溶解后上大孔树脂层析柱，分别以40％、60％、80％乙醇溶液洗脱，收集各洗脱部位，减压浓缩至干浸膏，备用，样品编号为S6～S8。
取S1～S5样品各1g(相当于原料10g)，取S6～S8样品各0.1g(相当于原料10g)，精密称定，分别置于10mL量瓶中，加适量甲醇溶解，250W功率(频率40kHz)超声20min，放冷后稀释至刻度，摇匀，经0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为HPLC供试品，备用。
1.1.2色谱条件
Athena-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流速：1.0mL/min；检测波长：360nm；柱温：30℃；进样量：15μL。流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)，梯度洗脱(见表7)，采集前60min色谱图。
表7梯度洗脱程序
1.2抗凝血酶实验
1.2.1样品的制备
取S1～S5样品的干燥提取物1.6g(相当于原材料16g)，S6～S8样品的干燥提取物0.16g(相当于原材料16g)，用生理盐水溶解至10mL容量瓶，制备成浓度为160g/L和16g/L的提取物溶液，过滤后备用。
1.2.2凝血酶原时间(PT)的测定
取质控血浆45μL，S1～S8样品溶液各5μL，置于凝血杯中，37℃预热3min后加入PT试剂100μL，空白对照给予等量生理盐水，经半自动凝血仪依次测定不同样品的凝固时间，每组重复3次。
1.2.3凝血酶时间(TT)的测定
取质控血浆94μL，S1～S8样品溶液各6μL，置于凝血杯中，37℃预热3min后加入TT试剂50μL，空白对照给予等量生理盐水，经半自动凝血仪依次测定不同样品的凝固时间，每组重复3次。
1.2.4部分凝血酶时间(APTT)的测定
取质控血浆46μL，样品溶液4μL，置于凝血杯中，37℃预热1min后加入APTT试剂50μL，温育3min后加入CaCl2试剂50μL，空白对照给予等量生理盐水，经半自动凝血仪依次测定不同样品的凝固时间，每组重复3次。
1.3谱效关系分析方法
本实施例采用偏最小二乘法、灰色关联度和双变量相关分析等方法进行综合分析，揭示一个因变量与多个自变量之间的关联性，用于明确中药的药效物质基础。偏最小二乘法通过SIMCA-P11.5软件，分析(Analysis)项目下自动模型拟合(Autofit)模块实现；灰色关联度法通过Excel进行公式编辑计算实现；双变量相关分析通过SPSS 22.0软件，在分析(Analyze)项下相关(Correlate)中双变量(Bivariate)模块实现。
2实验结果
2.1指纹图谱的建立
按上述发明的方法，将S1～S8供试品溶液进行HPLC测定，建立黄刺玫样品的指纹图谱。样品图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》软件分析，找出其共有特征峰共19个，获得共有峰面积匹配数据(见表8)，色谱图见图1、图2。经与标准品比对，得知9号峰为芦丁，13号峰为槲皮素-3-O-α-L鼠李糖苷，19号峰为槲皮素。19个共有峰的保留时间(tR)分别为：10.7min、11.0min、12.9min、13.4min、17.8min、20.4min、21.8min、22.9min、25.4min、26.4min、30.0min、30.8min、38.5min、40.2min、43.2min、45.2min、47.4min、51.6min、52.2min。
表8黄刺玫提取物的共有峰匹配数据
2.2凝血酶时间测定
实验结果(见表9)表明：与空白组相比，除S1样品外，黄刺玫提取物S2～S8样品均可明显延长PT，S1～S8均可明显延长TT和APTT，差异有统计学意义(P<0.05)。
表9黄刺玫提取物对正常人血浆PT、TT、APTT的影响
与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01
2.3谱效相关分析
由于数列单位不同或者量纲不同，在进行关联分析之前，需要对各数列进行无量纲化处理，以达到量纲一致性。本发明采用均值化变换，即分别求出各个序列数据的平均值，再用平均值去除以对应序列中的各个原始数据，所得到的商为新的数据列，即均值化数列。指纹图谱数据和药效指标数据经均值化处理后的结果见表10。
表10数据均值化结果
2.3.1 PT测定结果分析
2.3.1.1偏最小二乘法(PLSR)
将均值化处理的数据导入SIMCA-P11.5软件，经过计算系统选取了2个有意义的成分，它可以解释83.46％的Y变量。由标准化的回归系数图(图5)和VIP图(图6)可以看出，大部分色谱峰都与PT呈正相关，即它们所对应的化学成分含量增加，PT将会延长。其中P12、P6、P9、P11、P14特征峰所对应的化学成分都对延长PT起主要作用，其他峰因其置信区间过零点，无显著性意义。
2.3.1.2灰色关联度分析
由表11可见，各个自变量所代表的化学成分与PT之间的关联度排序如下：
P12>P13>P6>P7>P9>P11>P14>P8>P4>P16>P17>P19>P5>P15>P1>P18>P10>P3>P2。其中P12、P13、P6所对应的化学成分与药效间的关联度大于0.8，表明该物质与PT高度关联。其他特征峰所对应的化学成分也都与PT有较高的关联度(关联度在0.65以上)，表明这些成分与延长PT具有协同作用。
表11PT灰色关联度分析结果
2.3.1.3双变量相关分析
从表12中Pearson系数分析结果可见，P12、P6、P8、P9、P4色谱峰对延长PT具有显著性贡献(P<0.05)，表明这些特征峰所对应的化学成分与PT高度关联，表明这些成分含量增高可明显延长PT。而P2和P18的相关系数虽为负值，但其相关系数没有显著性意义。
表12PT双变量相关分析结果
相关系数显著性：*P<0.05，**P<0.01。
由以上可知，黄刺玫抗血栓作用是其有效组分共同作用的结果，各特征峰代表的化学成分与PT的关联度虽大小不一，但都起了一定的作用。通过偏最小二乘法、灰色关联度和双变量相关分析相结合，基本能够反映黄刺玫指纹图谱与PT这一指标之间的相关性：P4、P6、P8、P9、P12、P13对延长PT具有较大贡献，是主要活性成分，其中P9为芦丁，P13为槲皮素-3-O-鼠李糖苷。
2.3.2 TT测定结果分析
2.3.2.1偏最小二乘法
将均值化处理的数据导入SIMCA-P11.5软件，经过计算系统选取了2个有意义的成分，它可以解释81.77％的Y变量。由标准化的回归系数图(图7)和VIP图(图8)可以看出，大部分色谱峰都与TT呈正相关，即它们所对应的化学成分含量增加，TT将会延长。其中P6、P12、P9、P14、P11特征峰所对应的化学成分都对延长TT起主要作用，其他峰因其置信区间过零点，无显著性意义。
2.3.2.2灰色关联度分析
由表13可见，各个自变量所代表的化学成分与TT之间的关联度排序如下：
P12>P6>P7>P13>P14>P8>P4>P9>P11>P5>P15>P18>P1>P16>P17>P3>P10>P19>P2。其中P12、P6、P7、P13、P14、P8、P4所对应的化学成分与药效间的关联度大于0.8，表明该物质与TT高度关联。其他特征峰所对应的化学成分也都与TT有较高的关联度(关联度在0.65以上)，表明这些成分与延长TT具有协同作用。
表13 TT灰色关联度分析结果
2.3.2.3双变量相关分析
从表14中Pearson系数分析结果可见，P6、P8、P7、P12、P4、P9色谱峰对延长TT具有显著性贡献(P<0.05)，表明这些特征峰所对应的化学成分与TT高度关联,表明这些成分含量增高可明显延长TT。而P2和P18的相关系数虽为负值，但其相关系数没有显著性意义。
表14TT双变量相关分析结果
相关系数显著性：*P<0.05，**P<0.01。
由以上可知，黄刺玫抗血栓作用是其有效组分共同作用的结果，各特征峰代表的化学成分与TT的关联度虽大小不一，但都起了一定的作用。通过偏最小二乘法、灰色关联度和双变量相关分析相结合，基本能够反映黄刺玫指纹图谱与TT这一指标之间的相关性：P4、P6、P8、P9、P12、P14对延长TT具有较大贡献，是主要活性成分，其中P9为芦丁。
2.3.3 APTT测定结果分析
2.3.3.1偏最小二乘法
将均值化处理的数据导入SIMCA-P11.5软件，经过计算系统选取了2个有意义的成分，它可以解释78.01％的Y变量。由标准化的回归系数图(图9)和VIP图(图10)可以看出，大部分色谱峰都与APTT呈正相关，即它们所对应的化学成分含量增加，APTT将会延长。其中P1、P4、P12、P8、P6特征峰所对应的化学成分都对延长APTT起主要作用，其他峰因其置信区间过零点，无显著性意义。
2.3.3.2灰色关联度分析
由表15可见，各自变量所代表的化学成分与APTT之间的关联度排序如下：
P4>P12>P8>P7>P6>P14>P13>P1>P18>P3>P9>P10>P16>P5>P15>P17>P11>P2>P19。其中P12、P6、P7、P13、P14、P8、P4所对应的化学成分与药效间的关联度大于0.8，表明该物质与APTT高度关联，表明这些成分含量增高可明显延长APTT。其他特征峰所对应的化学成分也都与APTT有较高的关联度(关联度在0.65以上)，表明这些成分与延长APTT具有协同作用。
表15APTT灰色关联度分析结果
2.3.3.3双变量相关分析
从表16中Pearson系数分析结果可见，P4、P12、P8、P6色谱峰对延长APTT时间具有显著性贡献(P<0.05)，表明这些特征峰所对应的化学成分与APTT高度关联,表明这些成分含量增高可明显延长APTT。而P2和P18的相关系数虽为负相关，但其相关系数没有显著性意义。
表16黄刺玫S1～S8样品双变量相关分析结果
相关系数显著性：*P<0.05，**P<0.01
由以上可知，黄刺玫抗血栓作用是其有效组分共同作用的结果，各特征峰代表的化学成分与APTT的关联度虽大小不一，但都起了一定的作用。通过偏最小二乘法、灰色关联度和双变量相关分析相结合，基本能够反映黄刺玫指纹图谱与APTT这一指标之间的相关性：P4、P6、P8、P12对延长APTT具有较大贡献，是主要活性成分。
综合以上三种方法的分析结果，黄刺玫中具有抗凝血活性的主要成分可能为P4、P6、P8、P12色谱峰所对应的化学物质。通过偏最小二乘法、灰色关联度和双变量相关分析三种化学模式相互结合，能够较全面地反映黄刺玫的指纹图谱与其抗凝血药效活性之间的关系，明确其中的药效活性物质基础。
综上所述，本发明提出的基于抗血栓谱效关系的黄刺玫活性成分评价方法，本发明通过黄刺玫中有效成分的指纹特征与抗血栓药效活性之间的相关性开展研究，在指纹图谱和药学效研究的基础上，获得黄刺玫HPLC指纹图谱19个特征峰数据与抗血小板聚集、抗凝血的量化数据，通过偏最小二乘法、灰色关联度和双变量相关分析三种化学识别模式，综合考察了黄刺玫HPLC指纹图谱特征所代表的化学成分对抗血栓药效指标贡献的大小程度，明确黄刺玫中与药效关系较为密切的化学成分，较全面的反映了黄刺玫谱效之间的相关性，为其药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法，为进一步开发黄刺玫治疗血栓性疾病的药物或保健品提供参考，可以快速、准确地评价黄刺玫中具有抗血栓作用的化学成分及活性成分筛选，为黄刺玫的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法，在开发利用黄刺玫的保健和药用价值方面具有重要意义。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，其特征在于，通过建立黄刺玫不同极性提取物的HPLC指纹图谱，标定共有特征峰，通过谱效数学模型评价黄刺玫中化学成分的抗血栓作用。
2.如权利要求1所述的一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，其特征在于，其步骤如下：
1)采用现代提取技术制备黄刺玫的不同极性的组分；
2)采用高效液相色谱法(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)技术建立黄刺玫指纹图谱；
3)标定共有峰，提取特征峰数据；
4)对不同极性提取物进行抗血小板聚集和抗凝血实验；
5)将指纹图谱特征峰数据和药效活性数据经化学计量学方法进行统计分析，评价黄刺玫中化学成分的药效活性。
3.如权利要求1所述的一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，其特征在于，黄刺玫提取物制备方法为：
第一步、取适量黄刺玫适当粉碎，精密称取6份粗粉，每份100g，置于圆底烧瓶中；
第二步、分别向上述圆底烧瓶中加入10倍量体积的水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和90％乙醇；
第三步、回流提取1h，提取两次；
第四步、滤过，合并滤液，滤液经回收溶剂；
第五步、真空干燥，制得干燥提取物。
4.如权利要求1-3任一项所述的一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，其特征在于，黄刺玫提取物经大孔树脂层析柱纯化方法为：
第一步、称取回收溶剂干燥样品适量；
第二步、用水溶解后上大孔树脂吸附柱，分别以40％、60％、80％乙醇溶液洗脱；
第三步、收集各洗脱部位，经回收溶剂、真空干燥，制得干燥提取物。
5.如权利要求1或2所述的一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，其特征在于，建立黄刺玫HPLC指纹图谱的条件：色谱柱采用十八烷基键合硅胶填料；流动相为：A为乙腈，B为0.1％(v/v)磷酸溶液；采用梯度洗脱：0min→10min→26min→44min→53min→58min→63min→65min，乙腈：12％→16％→16％→28％→30％→50％→50％→12％，0.1％(v/v)磷酸溶液：88％→84％→84％→72％→70％→50％→50％→88％；流速：1.0mL/min；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：360nm；柱温：30℃；进样量：15μL。
6.如权利要求2所述的一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，其特征在于，共有特征峰的保留时间(tR)分别为：10.7min、11.0min、12.9min、13.4min、17.8min、20.4min、21.8min、22.9min、25.4min、26.4min、30.0min、30.8min、38.5min、40.2min、43.2min、45.2min、47.4min、51.6min、52.2min。
7.如权利要求2所述的一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，其特征在于，共有峰中9号峰为芦丁，13号峰为槲皮素-3-O-α-L鼠李糖苷，19号峰为槲皮素。
8.如权利要求2所述的一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，其特征在于，实验所用动物为SD大鼠，药效学评价指标为血小板聚集抑制率、凝血酶时间、凝血酶原时间和部分凝血酶时间。
9.如权利要求2所述的一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法，其特征在于，将黄刺玫不同极性提取物的指纹图谱化学信息和药效活性信息带入数学模型进行谱效相关性分析，包括偏最小二乘法、灰色关联度分析和双变量相关分析，评价黄刺玫中化学成分的药效活性，研究其药效物质基础。
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