CN101256177A - 中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统,包括高效液相色谱仪对物质进行检测,将检测结果输入到存储程序的数字计算机,该存储程序的数字计算机执行如下步骤:输入经高效液相色谱仪检测的正品及检品原始数据库,将正品、检品数据与标准数据进行匹配后,形成了正品指纹图谱集、正品特征指纹图谱库及检品指纹图谱集;将检品指纹图谱集与正品特征指纹图谱库中的数据进行峰匹配,形成检品指纹图谱库,计算各正品之间及检品与各正品之间的相似度,若检品相似度均值大于正品特征指纹库中的相似度均值J,则为合格产品,本发明与现有技术相比,提高了峰间可比性,做到了整体性与模糊性的科学处理,实现了图谱的数据化。
Description
技术领域
本发明属于中药指纹图谱相似度评价系统,特别属于用计算机对中药数字化指纹图谱相似度评价系统。
背景技术
随着中国经济的发展,中药及其各种产品的标准化也越来越重要,中药数字化指纹图是中药标准化的重要组成部分,但不同产地的中药其数字化指纹图谱都或多或少的存在着差别,这为不同地方的药监、药检部门如何快速的判断中药的真伪造成了困难。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种能够快速准确的对中药指纹图谱相似度评价的计算机系统。
本发明解决技术问题的技术方案为:中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统,包括高效液相色谱仪对物质进行检测,将检测结果输入存储程序的数字计算机,该存储程序的数字计算机执行如下步骤:
a)输入经高效液相色谱仪检测的正品及检品原始数据库,将样品数据按照参照样品的保留时间进行一点或多点的校正后,形成待处理正品、检品数据库,设定正品库中的一个正品为标准样品,以其数据为标准数据,将其余正品、检品数据与标准数据进行匹配后,形成了正品指纹图谱集及检品指纹图谱集;
b)在正品的指纹图谱集中,选出含量较高的n个峰做为n强峰,以不同样品所具有保留时间相同的色谱峰为共有峰,共有峰占样品总峰数的比率为共有率P,统计所有样品的共有率,设定共有率下限P限,将所有样品共有率P与共有率下限P限进行比较,若该样品的共有率P大于共有率下限P限,则保留该样品的数据,若该样品的共有率P小于共有率下限P限,则要设定n强峰出现的频率Y限,判断该样品n强峰出现频率与Y限的大小,若样品n强峰的出现频率大于标准频率Y限,则保留该样品的数据,否则将判断样品的保留时间与已知成份的保留时间是否相同,若保留时间相同,则保留该样品的数据,否则,删除此样品的数据;将数据按照保留时间重新排序,形成正品特征指纹图谱库;
c)将a步骤所生成的检品指纹图谱集与正品特征指纹图谱库中的数据进行峰匹配,形成检品指纹图谱库,计算检品与各正品之间的相似度,并计算相似度均值J样;
d)计算正品特征指纹图谱库中各个样品的相似度及相似度均值J,以正品相似度均值最小值J为阈值,判断检品相似度均值J样与特征指纹库中的相似度均值J,若检品相似度均值J样大于正品特征指纹库中的相似度均值J,,则为合格产品,并将其数据加入到正品原始数据库中,以增加正品指纹图谱库的代表性,若检品相似度均值J样小于正品特征指纹库中的相似度均值J,则为不合格产品。
所述的数据区配包括以下步骤:
在待处理正品数据库中,设定基准正品样品,以基准正品样品的保留时间,相对峰面积,n强峰,来设定设定相对保留时间α基准,相对峰面积S基准,n强峰n基准,设定标准窗口,标准窗口的步长为W,判断待处理正品数据库中的其它数据的相对保留时间α样与α基准之差的绝对值是否小于等于步长W,若该样品的相对保留时间α样与α基准之差的绝对值小于等于步长W,则该样品的相对峰面积S值添加于α基准所在行的相应样品号下,若该样品的相对保留时间α样与α基准之差的绝对值大于步长W,则在α基准所在列中增加α样,该样品的相对峰面积S值添加于α样所在行的相应样品号下,将数据库中所有正品按照相对保留时间的大小进行排序,形成了正品指纹图谱集。
将待处理的检品数据库中的样品数据,与基准正品样品进行比较,以相同的方法,形成了检品指纹图谱集。
所述的峰匹配子程序包括以下步骤:
在待处理正品数据库中,选择正品特征指纹图谱集中的α值,设定标准窗口,标准窗口的步长为W,判断待处理检品数据库中数据的相对保留时间α样与α之差的绝对值是否小于等于步长W,若该样品的相对保留时间α样与α之差的绝对值小于等于步长W,则该样品的相对峰面积S值添加于α所在行的相应样品号下,若该样品的相对保留时间α样与α之差的绝对值大于步长W,则删除该样品数据,将数据库中所有检品按照相对保留时间的大小进行排序,形成了检品指纹图谱库。
d)步骤也可以为计算正品特征指纹图谱库中各个样品的差异率R,以正品差异率最大值R为阈值,计算检品与正品的差异率为检品差异率R样,判断检品差异度均值R样与特征指纹库中的差异度均值R,若检品差异率R样小于正品特征指纹库中的差异率R,,则为合格产品,并将其数据加入到正品原始数据库中,以增加品指纹图谱库的代表性,若检品差异率R样大于正品特征指纹库中的相似度均值J,则为不合格产品。
为了使特征指纹图谱库更有代表性,所述的正品原始数据库的正品原始数据为不小于10个。
在分析峰数较多的样品时,虽可选择一峰位居中的峰作内标峰,但它与两端的色谱峰保留值相差较大,此时对两端色谱峰的相对保留值的精度会产生一定的影响,从而导致定位的偏差。为此可采用多点校正,形成多个相对保留值系列,以此作为比较依据。
在数据匹配过程中,窗口W其大小根据情况选定录入,将各样品的α(相对保留时间)值和选为基准样品的α值逐一进行比较,符合条件者,该样品的α值以标准α值为准(其自身的α值去掉),s(归一化面积值)值追加到标准α值后的该样品列上。不符合条件者,将其α值追加到标准α值列中,s值随后追加到该样品上。处理完第一个样品后,第二个样品再和基准样品与第一个样品形成的“标准α值”比较,以此类推。当遇到同时有两个或两个以上的α值落于同一α值的窗口范围内时,取接近标准α值的那个数值。
本发明通过设定共有率,能够有效的去掉那些众多样品中出峰数较少的峰;设定n强峰的出现频次限度,可以保证那些在众多样品中出现频次较多的强峰不因共有率的限度而丢失,而在限度以下的强峰则被去掉。
通过录入已确定成分的α值,保证样品中已确定的成分不受其它参数设置的影响,而将始终保留在指纹谱中。
为了充分利用虽为正品但因所含个别成分含量过高或过低而被系统判为不合格品的样品,还可将正品与不合格或不合格品与不合格按一定比例混合勾兑,从而调整个别成分的含量,使外交部勾兑后的样品成为合格品。
本发明所述的相似度的按照下列公式计算:
S为两指纹图谱相似程度,一张指纹图谱色谱峰总数为n1,共有峰面积或峰高为h1t,另一张指纹图谱色谱峰数为n2,共有峰面积或峰高为h2t,两张指纹图谱的共有峰数为n。
相似度均值按照下列公式计算
差异率值按照下列公式计算
X均值-每个特征指纹峰的面积归一化值或相对面积值的平均值;
Xi-各样品中相应特征峰的面积归一化值或相对面积值;
n-特征指纹数。
本发明与现有技术相比,针对中药复杂组分的分析、鉴定,建立相似度评价系统,提高了峰间可比性,做到了整体性与模糊性的科学处理,实现了图谱的数据化。将色谱图转换成稳定而易于比较的数据表并将重叠率、检出率、差异率、特征指纹峰、归一化面积值、n强峰等一系列参数及其计算统计引入到该系统中,这些参数的引入使中药的比较鉴定更具有客观的量化数据,使该相似度评价系统能够在中药质控和质标中发挥更大的作用。
附图说明
图1为本发明的流程图。
图2为本发明数据匹配子程序的流程图。
图3为本发明峰匹配子程序的流程图。
图4为本发明C步骤为差异度判断的流程图。
图5为决明子空白溶液的指纹图谱。
图6为大决明子生品的HPLC指纹图谱。
图7为小决明子生品的HPLC指纹图谱。
图8为标准品溶液的HPLC指纹图谱。
图9为望江南生品的HPLC指纹图谱。
图10为15批大决明子的HPLC指纹图谱。
图11为22批小决明子的HPLC指纹图谱。
图12为5批小决明子清炒品的指纹图谱。
图13为10批望江南正品的指纹图谱。
在图6-9中,A1-A16大决明子生品中各种成份的吸收峰,B1-B16小决明子生品中各种成份的吸收峰,C1为芦荟大黄素,C2为大黄酸,C3为大黄素,C4为大黄酚,C5为大黄素甲醚,D1-D9为望江南生品中各种成份的吸收峰。
在图10中E1-E13为大决明子正品的指纹图谱,E14-E15为大决明子待检品中指纹图谱。
在图11中,F1-F19为小决明子正品的指纹图谱,F20-F22为小决明子待检品的指纹图谱。
在图12中G1-G5为5批小决明子清炒品的指纹图谱。
在图13中H1-H10为10批望江南正品的指纹图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细的说明。
实施例1:
如图1所示:
在步骤101-106中,输入经高效液相色谱仪检测的正品及检品原始数据库,将样品数据按照参照样品的保留时间进行一点或多点的校正后,形成正品、检品待处理数据库,设定正品库中的一个正品为标准样品,以其数据为标准数据,将其余正品、检品数据与标准数据进行数据匹配后,形成了正品指纹图谱集及检品指纹图谱集;
在步骤107-110中,在正品的指纹图谱集中,选出含量较高的n个峰做为n强峰,以不同样品所具有保留时间相同的色谱峰为共有峰,共有峰占样品总峰数的比率为共有率P,统计所有样品的共有率,设定共有率下限P限,将所有样品共有率P与共有率下限P限进行比较,若该样品的共有率P大于共有率下限P限,则保留该样品的数据,若该样品的共有率P小于共有率下限P限,则转到步骤130-133,设定n强峰出现的频率Y限,判断该样品n强峰出现频率与Y限的大小,若样品n强峰的出现频率大于标准频率Y限,则转到步骤110,否则将判断样品的保留时间与已知成份的保留时间是否相同,若保留时间相同,则转到步骤110,否则,删除此样品的数据;在步骤111-112中,将数据按照保留时间重新排序,形成正品特征指纹图谱库。;
在步骤120-123中,将步骤105所生成的检品指纹图谱集与正品特征指纹图谱库中的数据进行峰匹配,形成检品指纹图谱库,计算检品与各正品之间的相似度,并计算相似度均值J样;
在步骤113-117中,计算正品特征指纹图谱库中各个样品的相似度及相似度均值J,以正品相似度均值最小值J为阈值,判断检品相似度均值J样与特征指纹库中的相似度均值J,若检品相似度均值J样大于正品特征指纹库中的相似度均值J,,则为合格产品,并将其数据加入到正品原始数据库中,以增加品指纹图谱库的代表性,若或检品相似度均值J样小于正品特征指纹库中的相似度均值J,则为不合格产品。
如图2所示,在步骤201-209中,在待处理正品数据库中,设定基准正品样品,以基准正品样品的保留时间,相对峰面积,n强峰,来设定设定相对保留时间α基准,相对峰面积S基准,n强峰n基准,设定标准窗口,标准窗口的步长为W,判断待处理正品数据库中的其它数据的相对保留时间α样与α基准之差的绝对值是否小于等于步长W,若该样品的相对保留时间α样与α基准之差的绝对值小于等于步长W,则该样品的相对峰面积S值添加于α基准所在行的相应样品号下,若该样品的相对保留时间α样与α基准之差的绝对值大于步长W,则在α基准所在列中增加α样,该样品的相对峰面积S值添加于α样所在行的相应样品号下,将数据库中所有正品按照相对保留时间的大小进行排序,形成了正品指纹图谱集。
在步骤201-210中,将待处理的检品数据库中的样品数据,设定标准窗口,标准窗口的步长为W,判断待处理检品数据库中数据的相对保留时间α样与α基 准之差的绝对值是否小于等于步长W,若该样品的相对保留时间α样与α基准之差的绝对值小于等于步长W,则该样品的相对峰面积S值添加于α基准所在行的相应样品号下,若该样品的相对保留时间α样与α基准之差的绝对值大于步长W,则在α基准所在列中增加α样,该样品的相对峰面积S值添加于α样所在行的相应样品号下,将数据库中所有检品按照相对保留时间的大小进行排序,形成检品指纹图谱集。
如图3所示,在步骤301-308中,在待处理正品数据库中,选择正品特征指纹图谱集中的α值,设定标准窗口,标准窗口的步长为W,判断待处理检品数据库中数据的相对保留时间α样与α之差的绝对值是否小于等于步长W,若该样品的相对保留时间α样与α之差的绝对值小于等于步长W,则该样品的相对峰面积S值添加于α所在行的相应样品号下,若该样品的相对保留时间α样与α之差的绝对值大于步长W,则删除该样品数据,将数据库中所有检品按照相对保留时间的大小进行排序,形成了检品指纹图谱库。
实施例2:
除步骤113-117变为步骤401-406外,其余与实施例1相同。
在步骤401-406中,计算正品特征指纹图谱库中各个样品的差异率R,以正品差异率最大值R为阈值,计算检品与正品的差异率为检品差异率R样,判断检品差异度均值R样与特征指纹库中的差异度均值R,若检品差异率R样小于正品特征指纹库中的差异率R,,则为合格产品,并将其数据加入到正品原始数据库中,以增加正品指纹图谱库的代表性,若检品差异率R样大于正品特征指纹库中的相似度均值J,则为不合格产品。
将本发明实施例1用于决明子及其炮制品、代用品望江南的HPLC指纹相似度评价。
决明子为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子。秋季采收成熟果实,晒干,打下种子,除去杂质。前者全国各地多有栽培,产量大,主产于江苏、安微、四川等地,习称大决明子;后者多为野生,产量较小,主产于广西、安徽、云南等省区,习称小决明子。有清热明目,润肠通便之功效。望江南子Semen Cassia occidentalis呈扁平状近圆形,一端略长,长3.5~4.5mm,宽2.5~3.5mm,厚1~1.5mm。表面灰绿色或灰棕色,在两平面中央有椭圆形凹斑。质坚硬,不易破碎,横切面可见灰白色胚乳与两片平直紧贴的黄色子叶,味淡,有小毒。张铁军等对全国21个省(市)进行实地调查,结果表明:目前作决明子药用的除正品决明子外,还有望江南,仅在广东潮州一带,又称圆决明。
1.实验材料、仪器与试剂
1.1实验材料
本实验所用大决明子生药正品13批、小决明子生药正品19批、大决明子生药待检品2批,小决明子生药待检品3批,望江南生药正品10批,上述药材均为商品药材。
1.2仪器与试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪(包括Agilent1100四元泵,Agilent 1100二极管阵列检测器,Agilent 1100色谱化学工作站);
FA 2004电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司);
BK 14-C20孔玻璃仪器快速烘干器〔郑州长城科工贸有限公司);
超声波清洗机(上海必能信超声有限公司);
ZFQ 85A型旋转蒸发器(上海医械专机厂);
芦荟大黄素对照品(批号:766-200210)、大黄素对照品(批号:756-200110)、大黄酸对照品(批号:774-200311)、大黄酚对照品(批号:796-200204)、大黄素甲醚对照品(批号:758-2004080)均购自中国药品生物制品检定所。乙腈、甲醇为色谱纯,盐酸、磷酸及氯仿为分析纯。
2.实验方法
2.1供试品制备
2.1.1决明子炮制品
取小决明子生药正品19批中的一批,按下列方法制备炮制品,每种炮制品制备5批。
清炒品:生品以文火炒至微有爆裂声并有香气。
酒炙品:生品加酒泡过夜,文火炒干。
盐炙品:生品加盐水拌匀,闷透,文火炒干。
醋炙品:生品加醋闷润过夜,文火炒干。
醋蒸品:生品加醋闷润过夜,蒸2h,晾干。
2.1.2对照品溶液
称取芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、大黄酚对照品适量,以甲醇为溶剂,配制成20μg/ml的芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、大黄酚五种成分的对照品溶液及其混合对照品溶液。
2.1.3供试品溶液
取决明子样品,粉碎,过80目筛,称取2.0g,加1.5mol/L的盐酸溶液30ml,加热回流1.5h,放冷,加氯仿25ml,回流20min,取出,分取氯仿层,酸水层再加氯仿25ml,回流20min,分取氯仿层,同上法操作,加氯仿再回流提取二次,合并四次氯仿提取液,加水20ml振摇洗脱,弃去水层,将氯仿液蒸干,残渣加甲醇15ml使溶解,过滤,定量转移至25ml容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,经0.45μm微孔滤膜过滤,即得。
2.2色谱条件
色谱柱:Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm,5μm),保护柱:Zorbax SB-C18柱(4.6mm×12.5mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)作梯度洗脱,0min,10%A-90%B;5min,15%A-85%B;10min,40%A-60%B;40min,70%A-30%B;41min后100%A。流速:1.0ml/min;柱温:室温;检测波长:278nm,参比波长:550nm;光谱数据记录范围220~500nm,波长间隔2nm;色谱记录时间0~50min;进样量10μl。
2.3色谱指纹峰标定
2.3.1特征峰选定按2.1.3供试品溶液的制备方法做空白试验,结果见图5。检出峰中峰面积最大值及峰高最大值分别在200毫吸收度及5毫吸收度以下,因此选取面积阈值(Area Reject)=200,峰高阈值(Height Reject)=5对所有供试品进行积分,选取有积分值的峰做为决明子的特征峰。取决明子生品的供试品溶液按选定色谱条件测定,记录其色谱图,按规定方法积分,结果见图6、图7。
2.3.2部分特征峰确认取芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚纯组分对照品溶液和混合对照品溶液按上述色谱条件测定,见图8。比较各对照品溶液的色谱图与供试品溶液的色谱图,根据色谱保留时间,初步确定图6、图7中的A12、B12、A15、B15和A16、B16号峰分别为大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰,大黄酚峰所在峰在所选定的特征峰中,其峰高值居中。
3.内标峰的确定
本实验决明子特征指纹谱的建立以大黄酚为内参照峰,在分析望江南样品时,以大黄素甲醚为内参照峰。
4.指纹图谱。
4.1指纹图谱
取大、小决明子、小决明子的炮制品、望江南的供试品溶液按选定色谱条件测定,记录其色谱图。
以大黄酚为内参照峰,分别计算E1~E15大决明子样品、F1~F22小决明子样品、小决明的5种炮制品的相对保留时间α1及归一化面积值Ar1。的相对保留时间α及归一化面积值Ar。
以大黄素甲醚为内参照峰,计算E1~E13大决明子样品、F1~F19小决明子样品、H1~H10望江南样品的相对保留时间α2及归一化面积值Ar2。计算的相对保留时间α及归一化面积值Ar。
4.1.1大决明子的特征指纹图谱库
4.1.1.1大决明子的特征指纹图谱库
以E1正品为基准样品,共有峰窗口为0.02,n强峰数为8,共有率要求≥80%,n强峰出现频次要求≥8,对其余的E1~E13大决明子正品的α1、Ar1进行数据处理,得13批大决明子的特征指纹图谱库、n强峰、n强峰出现频次表、相似度表。大决明子的特征指纹图谱库有16个特征峰,相似度阈值为0.745。
4.1.1.2对E14、E15大决明子样品的验证
将E14、E15大决明子样品的α1、Ar1和大决明子的特征指纹图谱库进行比较。E14、E15样品的相似度低于阈值0.745,因此其应为不合格品。
4.1.1.3小决明子与大决明子特征指纹图谱库的比较
以大决明子的特征指纹图谱库为标准,以F1~F19小决明子正品为待鉴样品(相对保留时间为α1,归一化面积值为Ar1),对小决明子进行分析。结果显示所有小决明子的相似度值均低于大决明子的相似度阈值0.745。
4.1.2小决明子的特征指纹图谱库
4.1.2.1小决明子的特征指纹图谱库
以F1样品为基准样品,共有峰窗口限度为0.02,n强峰数为8,共有率要求≥80%,n强峰出现频次要求≥8,对其余18批小决明子正品的α1、Ar1进行数据处理,得19批小决明子的特征指纹图谱库、n强峰、n强峰出现频次表、相似度表。小决明子的特征指纹图谱库有13个特征峰,相似度阈值为0.816。
4.1.2.2对F20、F21、F22小决明子的验证
将F20、F21、F22小决明子样品的α1、Ar1和小决明子的特征指纹图谱库进行比较,三者的相似度均低于相似度阈值0.816,因此判定这三种样品为不合格品。
4.1.2.3大决明子与小决明子特征指纹图谱库的比较
以小决明子的特征指纹图谱库为标准,以E1~E13大决明子正品为待鉴样品,对大决明子进行分析。结果显示所有大决明子的相似度值均低于小决明子的相似度阈值0.816。
4.1.3决明子综合指纹图谱库
以F1小决明子正品为基准样品,共有峰窗口限度为0.02,n强峰数为8,共有率要求≥80%,n强峰出现频次要求≥8,对E1~E13大决明子样品及F1~F19号批小决明子样品进行数据处理,得决明子的综合特征指纹图谱库,库中共有特征峰12个,相似度阈值为0.641。
4.1.4炮制品与决明子特征指纹图谱库的比较
4.1.4.1炮制品与小决明子特征指纹图谱库的比较
因炮制品系由小决明子制得,因此以小决明子的特征指纹图谱库为标准,对炮制品进行分析。各炮制品与小决明子特征指纹图谱库的比较,结果显示各炮制品的相似度值均低于小决明子特征指纹图谱库的相似度阈值0.816。
4.1.4.2炮制品与决明子综合特征指纹图谱库的比较
以32批决明子的综合特征指纹图谱库为标准,对炮制品进行分析,显示各炮制品的相似度值均高于决明子综合特征指纹图谱库的相似度阈值0.641。
4.1.5望江南与大、小决明子及决明子综合特征指纹图谱库的比较
4.1.5.1望江南与大决明子特征指纹图谱库的比较
以E1号大决明子样品为基准样品,共有峰窗口限度为0.02,n强峰数为8,共有率要求≥80%,n强峰出现频次要求≥8,对E1~E13大决明子样品的α2、Ar2进行数据处理,得13批大决明子的特征指纹图谱库并对望江南进行分析。结果显示望江南的相似度在0.151~0.189之间,远小于大决明子特征指纹图谱库的相似度阈值0.720。
4.1.5.2望江南与小决明子特征指纹图谱库的比较
以F1小决明子样品为基准样品,共有峰窗口限度为0.02,n强峰数为8,共有率要求≥80%,n强峰出现频次要求≥8,对F1~F19小决明子样品的α2、Ar2进行数据处理,得19批小决明子的特征指纹图谱库并对望江南进行分析。结果显示望江南的相似度在0.203~0.251之间,远小于小决明子特征指纹图谱库的相似度阈值0.813。
4.1.5.3望江南与决明子综合特征指纹图谱库的比较
以F1小决明子样品为基准样品,共有峰窗口限度为0.02,n强峰数为8,共有率要求≥80%,n强峰出现频次要求≥8,对E1~E13大决明子样品及F1~F19号小决明子样品(相对保留时间为α2,归一化面积值为Ar2)进行数据处理,得32批决明子的综合特征指纹图谱库并对望江南进行分析。结果显示望江南的相似度在0.202~0.242之间,远小于决明子综合特征指纹图谱库的相似度阈值0.699。
以往的文献报道中均采用大黄酚为测定指标来控制决明子及其制剂的质量,但在大、小决明子的特征指纹图谱中大黄酚并非为含量最高成分且含量分布并不均匀。在13批大决明子的8强峰中,9批大决明子含有大黄酚,列第5的有1个,第6的有3个,第7的有4个,第8的有1个;在19批小决明子的8强峰中,19批小决明子均含大黄酚,列第4的有7个,第5的有8个,第6的有2个,第7、第8的各1个。
13批大决明子的特征指纹图谱库的相似度阈值为0.745,19批小决明子的特征指纹图谱库的相似度阈值为0.816。大、小决明子间的特征峰不相同,大决明子的特征峰为16个,其中相对保留时间为0.374、0.529、0.553、0.563的四个峰在小决明子的特征指纹图谱库中没有;小决明子的特征峰为13个,其中相对保留时间为0.666的峰在大决明子的特征指纹图谱库中没有。
决明子综合特征指纹图谱库中,大、小决明子的检出峰数、检出率、重叠峰数、重叠率均相同,但相似度却仅为0.641,说明大、小决明子特征成分间的含量差异较大。
以小决明子生品为基准样品,采集小决明子生品和其炮制品指纹图谱共17个特征峰的相对峰比值数据,其中一个峰(α=0.669)为生品所特有,三个峰(α=0.372,0.446,0.564)为炮制品所特有,说明药材炮制前后其内在质量发生了很大变化,其层次聚类树图也说明了这一点。
代用品望江南和大、小决明子及其综合特征指纹图谱库相比较,各项评价指标均相差较大,不可作为决明子的代用品。
将本发明实施例1用于不同温度的决明子袋泡剂指纹相似度评价。
决明子含蒽醌类化合物和萘骈吡喃酮类等多种化学成分,具有清肝明目、润肠通便的功效,已开发出多种制剂,采用梯度洗脱的高效液相色谱法来表征决明子袋泡剂的色谱指纹特征。
5.仪器与试药
5.1仪器
惠普1100高效液相色谱仪,包括Agilent 1100四元泵,惠普1100二极管阵列检测器,惠普色谱化学工作站。超声波清洗机(上海必能信超声有限公司);ZFQ85A型旋转蒸发器(上海医械专机厂)。
5.2样品与试剂
5批大决明子生药样品符合《中华人民共和国药典》2005版规定。芦荟大黄素对照品(批号:766-200210)、大黄素对照品(批号:756-200110)、大黄酸对照品(批号:774-200311)、大黄酚对照品(批号:796-200204)、大黄素甲醚对照品(批号:758-2004080)均购自中国药品生物制品检定所。乙腈、甲醇为色谱纯,盐酸、磷酸为分析纯。
6.方法与结果
6.1样品制备
6.1.1决明子袋泡剂的制备取决明子生品,粉碎,过80目筛,称取2g,用滤纸袋包装,制备决明子袋泡剂。
6.1.2对照品溶液的制备称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量,以甲醇为溶剂,配制成200μg·mL-1的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚纯组分对照品溶液和五种对照品的混合溶液。
6.1.3供试品溶液制备将袋泡剂加入沸水35mL,置盖分别保温20、40min,将袋取出,浸出液加盐酸4.7mL,加热回流1.5h,放冷,加氯仿25mL,回流20min,取出,分取氯仿层,酸水层再加氯仿25mL,回流20min,分取氯仿层,同上法操作,加氯仿再回流提取二次,合并四次氯仿提取液,加水20mL振摇洗脱,弃去水层,将氯仿液蒸干,残渣加甲醇微热使溶解,定量转移至10mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。放置,取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤。
6.2色谱条件
色谱柱:Zorbax Eclipse XDB-C18(4.0mm×250mm,5μm),保护柱:ScienhomeC18柱(3.0mm×20mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)作梯度洗脱,0min,10%A~90%B;5min,15%A~85%B;10min,40%A~60%B;40min,70%A~30%B;41min后100%A;流速:1.0mL·min-1;柱温:室温;检测波长:278nm,参比波长:550nm;进样量10μL。分析时间为50min。
6.3决明子袋泡剂指纹特征的测定及技术参数
制备决明子袋泡剂10批,分别获得其保温20min和保温40min的供试品溶液,1-10号为保温40分钟的供试品溶液,11-20号为保温20分钟的供试品溶液,以第1号决明子袋泡剂为基准样品,共有峰窗口限度为0.02,n强峰数为8,共有率要求≥80%,n强峰出现频次要求≥8,对决明子袋泡剂样品的相对保留时间(α)和相对峰面积(Ar)进行数据处理,得1-20号决明子袋泡剂提取液的特征指纹图谱库。结果显示,决明子袋泡剂保温40min的提取液(1~10号)的检出峰数为15个,检出率为100%,重叠峰数为15个,重叠率为100%;而决明子袋泡剂保温20min的提取液(11~20号)的检出峰数为11~12个,检出率为73.33%~80%,重叠峰数为11~12,重叠率为84.62%~88.89%。
以决明子袋泡剂保温40min提取液(1~10号)建立的特征指纹图谱库,其相似度阈值为0.746。决明子袋泡剂保温20min提取液(11~10号)的特征指纹图谱与指纹图谱库相比较,其相似度在0.513~0.627之间,低于决明子袋泡剂保温40min提取液(1~10号)的相似度阈值0.746。
6.4不同产地决明子袋泡剂HPLC指纹图谱的比较
分别取产地为河北、安徽、江苏、浙江、上海的5批决明子生药样品,每批制备保温40min的袋泡剂提取液10份(31~40号)和20min的袋泡剂提取液10份(41~51号),按6.3决明子袋泡剂指纹特征的测定及技术参数项进行测定,结果显示,不同产地的决明子袋泡剂保温40min的提取液(31~40号)的检出峰数为15个,检出率为100%,重叠峰数为15个,重叠率为100%;而不同产地的决明子袋泡剂保温20min的提取液(41~50号)的检出峰数为12~13个,检出率为80%~86.67%,重叠峰数为12~13,重叠率为88.88%~92.86%。以不同产地决明子袋泡剂保温40min提取液(31~40号)建立的特征指纹图谱库,其相似度阈值为0.736。不同产地决明子袋泡剂保温20min提取液(41~50号)的特征指纹图谱与指纹图谱库相比较,其相似度在0.513~0.629之间,低于不同产地的决明子袋泡剂保温40min提取液(31~40号)的相似度阈值0.736。可见,保温时间不同,决明子袋泡剂提取液的检出峰数、检出率、重叠峰数、重叠率则不同;保温时间对决明子袋泡剂有效成分的浸出量有较大影响,采用相似度评价可有效地控制不同产地的决明子袋泡剂在不同保温时间下的内在质量。
Claims (5)
1、中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统,包括高效液相色谱仪对物质进行检测,将检测结果输入到存储程序的数字计算机,其特征在于:该存储程序的数字计算机执行如下步骤:
a)输入经高效液相色谱仪检测的正品及检品原始数据库,将样品数据按照参照样品的保留时间进行一点或多点的校正后,形成待处理正品、检品数据库,设定正品库中的一个正品为标准样品,以其数据为标准数据,将其余正品、检品数据与标准数据进行匹配后,形成了正品指纹图谱集及检品指纹图谱集;
b)在正品的指纹图谱集中,选出含量较高的n个峰做为n强峰,以不同样品所具有相同保留时间的色谱峰为共有峰,共有峰占样品总峰数的比率为共有率P,统计所有样品的共有率,设定共有率下限P限,设定n强峰出现的频率Y限。将所有样品共有率P与共有率下限P限进行比较,若该样品的共有率P大于共有率下限P限,则保留该样品的数据,若该样品的共有率P小于共有率下限P限,则进行n强峰出现的频率比较,判断该样品n强峰出现频率与Y限的大小,若样品n强峰的出现频率大于标准频率Y限,则保留该样品的数据,否则将判断样品的保留时间与已知成份的保留时间是否相同,若保留时间相同,则保留该样品的数据,否则,删除此样品的数据;将数据按照保留时间重新排序,形成正品特征指纹图谱库;
c)将a步骤所生成的检品指纹图谱集与正品特征指纹图谱库中的数据进行峰匹配,形成检品指纹图谱库,计算检品与各正品之间的相似度,并计算相似度均值J样;
d)计算正品特征指纹图谱库中各个样品的相似度及相似度均值J,以正品相似度均值最小值J为阈值,判断检品相似度均值J样与特征指纹库中的相似度均值J,若检品相似度均值J样大于正品特征指纹库中的相似度均值J,,则为合格产品,并将其数据加入到正品原始数据库中,以增加正品指纹图谱库的代表性,若检品相似度均值J样小于正品特征指纹库中的相似度均值J,则为不合格产品。
2、根据权利要求1所述的中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统,其特征在于:
所述的数据区配包括以下步骤:
在待处理正品数据库中,设定基准正品样品,设定标准窗口,标准窗口的步长为W,判断待处理正品数据库中的其它数据的相对保留时间α样与α基准之差的绝对值是否小于等于步长W,若该样品的相对保留时间α样与α基准之差的绝对值小于等于步长W,则该样品的相对峰面积S值添加于α基准所在行的相应样品号下,若该样品的相对保留时间α样与α基准之差的绝对值大于步长W,则在α基准所在列中增加α样,该样品的相对峰面积S值添加于α样所在行的相应样品号下,将数据库中所有正品按照相对保留时间的大小进行排序,形成了正品指纹图谱集;
将待处理的检品数据库中的样品数据,与基准正品样品进行比较,以相同的方法,形成了检品指纹图谱集。
3、根据权利要求1所述的中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统,其特征在于:
所述的峰匹配子程序包括以下步骤:
在待处理正品数据库中,选择正品特征指纹图谱集中的α值,设定标准窗口,标准窗口的步长为W,判断待处理检品数据库中数据的相对保留时间α样与α之差的绝对值是否小于等于步长W,若该样品的相对保留时间α样与α之差的绝对值小于等于步长W,则该样品的相对峰面积S值添加于α所在行的相应样品号下,若该样品的相对保留时间α样与α之差的绝对值大于步长W,则删除该样品数据,将数据库中所有检品按照相对保留时间的大小进行排序,形成了检品指纹图谱库。
4、根据权利要求1所述的中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统,其特征在于:
d)步骤也可以为计算正品特征指纹图谱库中各个样品的差异率R,以正品差异率最大值R为阈值,计算检品与正品的差异率为检品差异率R样,判断检品差异度均值R样与特征指纹库中的差异度均值R,若检品差异率R样小于正品特征指纹库中的差异率R,,则为合格产品,并将其数据加入到正品原始数据库中,以增加正品指纹图谱库的代表性,若检品差异率R样大于正品特征指纹库中的相似度均值J,则为不合格产品。
5、根据权利要求1所述的中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统,其特征在于:所述的正品原始数据库的正品原始数据不小于10个正品的数据。
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