CN113607855B - 瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱及其建立方法、应用 - Google Patents

瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱及其建立方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱及其建立方法、应用，该瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱的建立方法，以瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂为检测对象，建立了针对药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，能够全面地、快速地检测瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性，为瓜蒌薤白半夏汤制剂的质量控制提供依据。同时，该方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点，具有良好的实用性。

Description

瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱及其建立方法、应用
技术领域
本发明涉及药物分析领域，尤其涉及一种瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱及其建立方法、应用。
背景技术
经典名方瓜蒌薤白半夏汤出自《金匮要略》，由瓜蒌、薤白、半夏和米酒共煎制成，临床上广泛用于治疗心绞痛型冠心病、风湿性心脏病、室性心动过速、肋间神经痛、乳腺增生、慢性阻塞性肺病、创伤性气胸、老年咳喘、慢性支气管肺炎、慢性胆囊炎等。
由于瓜蒌薤白半夏汤中各原料药材的成分较复杂，而且各中药材的产地、生态环境、采收季节、加工方式以及贮存条件不同，其所含化学成分、质量乃至临床疗效也会有很大差异。因此，不同生产产区和不同生产厂家的汤剂在组成和含量上常常存在较大差异，导致瓜蒌薤白半夏汤的质量不稳定，直接影响其疗效。到目前为止，关于瓜蒌薤白半夏汤的质量控制的研究仍较薄弱，这直接影响了瓜蒌薤白半夏汤药物制剂的开发。
2020版《中国药典》中分别对单一的药材瓜蒌、薤白和半夏制定了质控标准，但是，通过上述单一药材的质控标准来测量或鉴别瓜蒌薤白半夏汤药物制剂，一方面不能从整体上反映经典名方瓜蒌薤白半夏汤药物制剂的质量；另一方面，通过各单一成分的质控标准的结合来测量或鉴别经典名方瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂，不仅费时、费力，而且难以广泛地应用于生产实践。
因此，建立一种能够全面地、快速地检测瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的方法，对于其全面质量检测和整体质量控制具有重要意义。
发明内容
针对目前没有关于瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂质量控制标准的缺陷，本发明提供一种瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱及其建立方法、应用，该瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱能够为瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的质量控制提供依据。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：
取瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂制备成供试品溶液；
取葫芦巴碱、尿嘧啶、黄嘌呤、腺嘌呤、尿苷、鸟苷、5-羟甲基糠醛、腺苷和香草酸对照品，用溶剂配置成混合对照品溶液；
对所述供试品溶液和混合对照品溶液进行超高效液相色谱(UPLC)检测，得供试品溶液及混合对照品溶液的液相色谱图；
色谱条件包括：以硅胶颗粒为填料的串联的反相色谱柱；流动相A：含0.1wt％甲酸和40mmol乙酸铵的水溶液，流动相B：体积比为2:1的甲醇与乙腈的混合溶液；洗脱方式为梯度洗脱。
本发明提供的瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱的建立方法，以瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂为检测对象，建立了针对药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，能够全面地、快速地检测瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性，为瓜蒌薤白半夏汤制剂的质量控制提供依据。同时，该方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点，具有良好的实用性。
可选地，所述梯度洗脱的程序如下：
0-7.0min，100％流动相A；
7.0-13.0min，100％→95％流动相A，0-5％流动相B；
13.0-13.1min，95％→90％流动相A，5-10％流动相B；
13.1-20.0min，90％流动相A，10％流动相B；
20.0-35.0min，90％→50％流动相A，10-50％流动相B；
35.0-35.1min，50％→100％流动相A，50-0％流动相B；
35.1-45min，100％流动相A；上述百分比为体积百分比。
通过限定上述的梯度洗脱顺序，有利于提高各组分之间的分离度，提高检测的灵敏度。
可选地，以ACQUITYUPLC HSS T3色谱柱和CORTECS T3色谱柱串联。通过采用ACQUITYUPLC HSS T3和CORTECS T3色谱柱串联，可进一步显著提高各峰之间的分离效果。
可选地，所述色谱条件中还包括：柱温25-35℃，进样量为2μL，流速为0.2mL/min，检测波长为260nm。
可选地，所述瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的制备方法包括如下步骤：
取瓜蒌，薤白和半夏，加入米酒煎煮、过滤，按照常规工艺制得瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂；所述药物制剂为汤剂、膏剂或冻干粉。
可选地，瓜蒌薤白半夏汤汤剂的制备方法如下：称取瓜蒌饮片10-15g，薤白饮片7-12g，半夏饮片10-15g，加入米酒300-500mL浸透约1.5-3.5h，武火煎煮至沸腾，后改文火煎煮15-25min，趁热3-5层纱布过滤，即得瓜蒌薤白半夏汤标准汤剂，该标准汤剂可直接作为瓜蒌薤白半夏汤汤剂的供试品溶液。
取标准汤剂冷冻干燥(一般50mL标准汤剂需要冷冻干燥约24h)，即得瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂干膏粉，将该干膏粉溶于水中，过滤，即得瓜蒌薤白半夏汤干膏粉的供试品溶液；
所述干膏粉与水的质量体积比为1g：0.2-0.5mL。
可选地，所述混合对照品溶液中葫芦巴碱、5-羟甲基糠醛的浓度分别为30μg/mL，尿嘧啶、黄嘌呤、腺嘌呤的浓度分别为20μg/mL，尿苷、鸟苷的浓度分别为100μg/mL，腺苷的浓度为50μg/mL，香草酸的浓度为10μg/mL。通过限定混合对照品溶液中各对照品的浓度，有利于混合对照品溶液中各组分峰形更好，利于各峰的归属判断。
可选地，由上述的瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱的建立方法得到的瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱中共获得9个特征峰，依次为峰1、峰2、峰4-峰10，峰1为葫芦巴碱，峰2为尿嘧啶，峰4为黄嘌呤，峰5为尿苷，峰6为腺嘌呤，峰7为鸟苷，峰8为5-羟甲基糠醛，峰9为腺苷，峰10为香草酸。
可选地，所述瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱中，以峰7鸟苷为内参考峰，峰1-2、峰4-6、峰8-10的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为依次为：0.158、0.299、0.631、0.709、0.895、1.045、1.301、1.466。
本发明还提供了上述的瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱的建立方法在瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的质量检测和/或质量控制中的应用。
如下任一所述方法：
(I)一种瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的有效成分及含量测定方法，包括使用待测瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂按照上述的方法建立待测瓜蒌薤白半夏汤的指纹图谱的步骤；或
(II)一种瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的质量检测方法，包括使用待测瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂按照上述的方法建立待测瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱的步骤。
瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的有效成分选自葫芦巴碱，尿嘧啶，黄嘌呤，尿苷，腺嘌呤，鸟苷，5-羟甲基糠醛，腺苷和香草酸中的一种或几种。
本发明提供的瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱的建立方法，以瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂为检测对象，建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，确认了9个共有特征峰，依次为峰1、峰2、峰4-峰10，峰1为葫芦巴碱，峰2为尿嘧啶，峰4为黄嘌呤，峰5为尿苷，峰6为腺嘌呤，峰7为鸟苷，峰8为5-羟甲基糠醛，峰9为腺苷，峰10为香草酸，选择7号峰鸟苷作为指纹图谱中的内参考峰，确定了瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的共有特征峰的相对保留时间，且结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面地、快速地检测瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。同时，该方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点。
本发明提供的瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的有效成分及含量测定方法，分离度好，可以同时测定葫芦巴碱，尿嘧啶，黄嘌呤，尿苷，腺嘌呤，鸟苷，5-羟甲基糠醛，腺苷和香草酸的含量，而且该检测方法的精密度较高、稳定性和重复性较好，因此，能够全面地、快速地检测瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂中有效成分及其含量。
附图说明
图1为实施例1中瓜蒌薤白半夏汤汤剂供试品溶液的色谱图；
图2为实施例1中混合对照品溶液的色谱图；
图3为实施例1中采用CORTECS T3色谱柱得到的瓜蒌薤白半夏汤汤剂的色谱图；
图4为实施例1中采用ACQUITYUPLC HSS T3色谱柱得到的瓜蒌薤白半夏汤汤剂的色谱图；
图5为实施例1中15批瓜蒌薤白半夏汤汤剂的色谱图；
图6为实施例1中由15批瓜蒌薤白半夏汤汤剂的色谱图拟合得到的对照特征图谱R。
附图说明：附图中的1峰为葫芦巴碱，峰2为尿嘧啶，峰3为鸟嘌呤，峰4为黄嘌呤，峰5为尿苷，峰6为腺嘌呤，峰7为鸟苷，峰8为5-羟甲基糠醛，峰9为腺苷，峰10为香草酸
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
目前，关于经典名方瓜蒌薤白半夏汤质量标准研究尚未见报道，这严重阻碍了其在临床上的广泛使用和其制剂研究，因此，亟需对瓜蒌薤白半夏汤建立一套质量标准，为其临床使用的安全性和有效性提供保障。指纹图谱是借由现代分析手段如色谱、光谱等技术，对中药进行较全面表征的技术，能够站在整体性的角度以多个成分的相对保留时间以及相对峰面积综合性的将中药的质量表征出来，《中国药典》2020版已将其作为中药质量控制标准之一。但是由于瓜蒌薤白半夏汤成分较复杂，脂溶性成分及水溶性成分均较多，色谱分离难度较大，导致其指纹图谱的构建比较困难。发明人经多年的深入研究开发了经典名方瓜蒌薤白半夏汤(汤剂)的指纹图谱的构建方法，该方法同样适用于瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂，比如膏剂、干粉剂等。
下面分多个实施例对本发明进行进一步的说明。
下表1中为以下实施例中采用的主要的药品；试剂方面，甲醇和乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
表1
Figure BDA0003224984470000061
Figure BDA0003224984470000071
本发明提供的瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂指纹图谱的构建方法适用于现有的不同类型的瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂，比如：汤剂、膏剂、粉剂等。为方便比较，以下实施例中均采用瓜蒌薤白半夏汤汤剂。
实施例1：
1.1瓜蒌薤白半夏汤汤剂的供试品溶液的制备
称取瓜蒌12.0g，薤白9.0g，半夏12.0g，加入米酒400mL浸透约2h，武火煎煮至沸腾，后改文火煎煮20min，趁热用4层纱布过滤，得供试品溶液；
1.2混合对照品溶液和各对照品定位溶液的配制
分别精密称取对照品葫芦巴碱、尿苷、5-羟甲基糠醛各5mg，分别置于10mL容量瓶，加水定容至刻度，得最终浓度分别为0.5mg/mL各对照品储备溶液；
分别精密称取对照品尿嘧啶、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、香草酸各5mg，分别置于10mL容量瓶，加入50μL 1mol/L氢氧化钠溶液进行溶解，再加水定容至刻度，得最终浓度分别为0.5mg/mL各对照品储备溶液；
分别量取上述各对照品储备液适量，经稀释混合后，加入0.1mol/L的盐酸调PH至6.5-7.0，得到混合对照品储备溶液，于4℃存放备用，测定前使用0.22μm微孔滤膜滤过。该混合对照品储备溶液中各对照品的浓度分别为葫芦巴碱30μg/mL、尿嘧啶20μg/mL、黄嘌呤20μg/mL、腺嘌呤20μg/mL、尿苷100μg/mL、鸟苷100μg/mL、5-羟甲基糠醛30μg/mL、腺苷50μg/mL、香草酸10μg/mL。
各对照品定位溶液的配制：精密称取上述葫芦巴碱、尿苷和5-羟甲基糠醛对照品储备溶液适量，分别用水稀释成每1mL约含葫芦巴碱30μg、尿苷100μg、5-羟甲基糠醛30μg的溶液，即得葫芦巴碱、尿苷及5-羟甲基糠醛对照品定位溶液；
精密称取上述尿嘧啶、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟苷、腺苷和香草酸对照品储备溶液适量，分别用1mol/L氢氧化钠溶液稀释成每1mL约含尿嘧啶30μg、黄嘌呤20μg、腺嘌呤20μg、鸟苷100μg、腺苷50μg、香草酸10μg的溶液，即得尿嘧啶、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟苷、腺苷及香草酸对照品定位溶液。
1.3UPLC色谱条件
色谱柱：ACQUITYUPLC CORTECS T3(规格为2.1×100mm，1.6μm)色谱柱和HSS T3(规格为2.1×100mm，1.8μm)色谱柱串联，ACQUITYUPLC CORTECS T3色谱柱在前，HSS T3色谱柱在后。
流动相A：水(含0.1wt％甲酸和40mmol乙酸铵)，流动相B：甲醇与乙腈体积比为2/1；
进样量：2μL；流速：0.2mL/min；波长：260nm；柱温30℃；
梯度洗脱条件如下表2所示。
表2洗脱梯度
时间(min) A(％) B(％)
0.0 100 0
7.0 100 0
13 95 5
13.1 90 10
20 90 10
35 50 50
35.1 100 0
45 100 0
1.4测定
精密吸取1按照1.1项下方法配置的供试品溶液、1.2项下配置的混合对照品溶液及各对照品定位溶液各2μL注入超高效液相色谱仪，按照上述1.3项下的超高效液相色谱法测定，记录色谱图，图1为供试品溶液的色谱图，图2为混合对照品溶液的色谱图。
1.5色谱分析条件的确定
1.5.1流动相成分的选择
除流动相B不同外，其他条件与1.3项下的色谱条件相同，以流动相B作为变量，取同一份瓜蒌薤白半夏汤汤剂的供试品溶液，分析采用不同的流动相B：甲醇、乙腈、甲醇与乙腈体积比为1:1、甲醇与乙腈体积比为2:1、甲醇与乙腈体积比为1:2和甲醇与乙腈体积比为1:3下的色谱图，以色谱峰数量、峰高和分离度作为指标，最终确定甲醇与乙腈体积比为2:1作为流动相B；
除流动相A不同外，其他条件与1.3项下的色谱条件相同，以流动相A作为变量，取同一份瓜蒌薤白半夏汤汤剂的供试品溶液，分析采用不同的流动相A：含0.1wt％甲酸水溶液、含0.2wt％甲酸水溶液、含0.3wt％甲酸水溶液、含40mmol乙酸铵水溶液、含30mmol乙酸铵水溶液、含20mmol乙酸铵水溶液、含10mmol乙酸铵水溶液、含0.1wt％甲酸和40mmol乙酸铵的水溶液、含0.1wt％甲酸和30mmol乙酸铵的水溶液、含0.1wt％甲酸和20mmol乙酸铵的水溶液、含0.1wt％甲酸和10mmol乙酸铵的水溶液下的色谱图，以色谱峰数量、峰高和分离度作为指标，最终确定以含0.1wt％甲酸和40mmol乙酸铵的水溶液作为流动相A。
1.5.2色谱柱的选择
除色谱柱外，其他条件与1.3项下的色谱条件相同，以色谱柱作为变量。取同一份瓜蒌薤白半夏汤汤剂的供试品溶液，考察了实验室中现有的色谱柱：ACQUITYUPLC HSS T3、CORTECS T3、ZORBAX-HILIC Plus
Figure BDA0003224984470000091
ACQUITYUPLC HSS T3与ACQUITYUPLC HSS T3串联、CORTECS T3与CORTECS T3串联、ACQUITYUPLC HSS T3与CORTECS T3串联(HSS T3在前，CORTECS T3在后)、CORTECS T3与ACQUITYUPLC HSS T3(CORTECS T3在前，ACQUITYUPLC HSST3在后)串联，其中，ACQUITYUPLC HSS T3的规格为2.1×100mm，1.8μm；CORTECS T3的规格为2.1×100mm，1.6μm，ZORBAX-HILIC Plus
Figure BDA0003224984470000092
的规格为4.6×100mm，3.5μm。其中，采用CORTECS T3色谱柱对应的色谱图如图3，采用ACQUITYUPLC HSS T3色谱柱对应的色谱图如图4，不同色谱柱的色谱图之间对比可知，ACQUITYUPLC HSS T3与CORTECS T3串联后对瓜蒌薤白半夏汤汤剂的分离效果较好。
1.5.3最终色谱条件
与1.3项下的色谱条件相同。
1.6共有峰的确认
按照表1中瓜蒌薤白半夏汤各原料，将组方中每味药材根据批次不同按随机组合成15批次(记为S1-S15)，组合情况见表3。
表3组合情况
供试品 瓜蒌 薤白 半夏 米酒
S1 SDX20191001 20190501 BX201807091 20201201-1
S2 SDX20191002 20190502 BX201807092 20201201-2
S3 SDX20191003 20190503 BX201807093 20201201-3
S4 SDX20191004 20190504 BX201807094 20201201-4
S5 SDX20191005 20190505 BX201807095 20201201-5
S6 20181001 XB180321 20190801 20200927-1
S7 20181002 XB180322 20190802 20200927-2
S8 20181003 XB180323 20190803 20200927-3
S9 20181004 XB180324 20190804 20200927-4
S10 20181005 XB180325 20190805 20200927-5
S11 GL20200501 1709061 20191101 20201201-1
S12 GL20200502 1709062 20191101 20201201-2
S13 GL20200503 1709063 20191101 20201201-3
S14 GL20200504 1709064 20191101 20201201-4
S15 GL20200505 1709065 20191101 20201201-5
按上述1.1项下供试品溶液的制备操作制备各供试品溶液，然后按照上述1.3项下超高效液相色谱条件进样检测，不同组合批次的瓜蒌薤白半夏汤汤剂的图谱如图5所示。
将15批供试品的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012)，生成对照指纹图谱R，如图6所示，对瓜蒌薤白半夏汤汤剂的特征图的检测结果进行分析、比较。由图5可知，瓜蒌薤白半夏汤汤剂的HPLC特征指纹图谱共有色谱峰22个，经与对照品对比，确定了其中10个峰的成分，1号峰为葫芦巴碱，来源于瓜蒌和薤白，2、3、4、5、6、7、9号峰分别为尿嘧啶、鸟嘌呤、黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷，来源于瓜蒌、薤白、半夏和米酒，8号峰为5-羟甲基糠醛，来源于瓜蒌和米酒，10号峰为香草酸，来源于瓜蒌。由于鸟嘌呤色谱峰分离度不够，因此，选取其中的葫芦巴碱、尿嘧啶、黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、5-羟甲基糠醛和香草酸共9个峰作为指纹图谱中的特征峰，如图6所示。以7号峰鸟苷为内参考峰(S峰)，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.158(峰1)、0.299(峰2)、0.631(峰4)、0.709(峰5)、0.895(峰6)、1.045(峰8)、1.301(峰9)、1.466(峰10)。经相似度计算，15批样品与对照指纹图谱R的相似度数据如表4所示。
表4 15批供试品溶液与对照指纹图谱R的相似度比较
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 R
S1 1 0.997 0.994 0.994 0.996 0.992 0.998 0.996 0.996 0.998 0.973 0.994 0.995 0.984 0.993 0.998
S2 0.997 1 0.996 0.997 0.997 0.994 0.993 0.991 0.997 0.997 0.985 0.993 0.992 0.996 0.99 0.990
S3 0.994 0.996 1 0.998 0.996 0.997 0.997 0.996 0.992 0.992 0.992 0.995 0.989 0.993 0.995 0.990
S4 0.994 0.997 0.998 1 0.996 0.998 0.996 0.995 0.995 0.996 0.991 0.993 0.992 0.997 0.991 0.990
S5 0.996 0.997 0.996 0.996 1 0.996 0.993 0.992 0.992 0.997 0.997 0.995 0.994 0.981 0.994 0.991
S6 0.992 0.994 0.997 0.998 0.996 1 0.996 0.995 0.993 0.998 0.993 0.995 0.992 0.997 0.991 0.990
S7 0.998 0.993 0.997 0.996 0.993 0.996 1 0.999 0.994 0.996 0.993 0.995 0.971 0.990 0.993 0.988
S8 0.996 0.991 0.996 0.995 0.992 0.995 0.999 1 0.997 0.995 0.994 0.996 0.998 0.991 0.994 0.997
S9 0.996 0.997 0.992 0.995 0.992 0.993 0.994 0.997 1 0.992 0.993 0.995 0.997 0.991 0.995 0.993
S10 0.998 0.997 0.992 0.996 0.997 0.998 0.996 0.995 0.992 1 0.997 0.993 0.991 0.992 0.990 0.991
S11 0.973 0.985 0.992 0.991 0.997 0.993 0.993 0.994 0.993 0.997 1 0.994 0.996 0.995 0.998 0.992
S12 0.994 0.993 0.995 0.993 0.995 0.995 0.995 0.996 0.995 0.993 0.994 1 0.995 0.995 0.992 0.990
S13 0.995 0.992 0.989 0.992 0.994 0.992 0.971 0.998 0.997 0.991 0.996 0.995 1 0.997 0.994 0.991
S14 0.984 0.996 0.993 0.997 0.981 0.997 0.990 0.991 0.991 0.992 0.995 0.995 0.997 1 0.996 0.995
S15 0.993 0.990 0.995 0.991 0.994 0.991 0.993 0.994 0.995 0.99 0.998 0.992 0.994 0.996 1 0.993
R 0.998 0.990 0.990 0.990 0.991 0.990 0.988 0.997 0.993 0.991 0.992 0.990 0.991 0.995 0.993 1
由上表中的数据可知，15批瓜蒌薤白半夏汤标准汤剂与对照指纹图谱的相似度均＞0.90，表明各批次瓜蒌薤白半夏汤标准汤剂具有较好的一致性。
实施例2建立指纹图谱的色谱条件的方法学验证
精密度：取1.1项下配制的供试品溶液，按上述1.3项下的超高效液相色谱条件测定，连续进样6次，色谱图中以鸟苷为参照峰(S)，以各主要色谱峰的相对峰面积及相对保留时间的RSD值来评价精密度。
重复性：取同一瓜蒌薤白半夏汤汤剂供试品溶液，按1.1项下供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液，按上述1.3项下超高效液相色谱条件测定，色谱图中以鸟苷为参照峰(S)，以各主要色谱峰的相对峰面积及相对保留时间的RSD值来评价重复性。
稳定性：取1.1项下配制的供试品溶液，分别在0，1，4，6，12，24h按上述1.3项下的超高效液相色谱条件进行测定，色谱图中以鸟苷为参照峰(S)，以各主要色谱峰的相对峰面积及相对保留时间的RSD值来评价供试液稳定性。
精密度、重复性和稳定性试验的测试结果见表5。
表5建立指纹图谱的色谱条件方法学考察结果(n＝6)
Figure BDA0003224984470000121
由上表精密度试验结果显示，以鸟苷为参照峰(S)，各特征共有峰相对保留时间的RSD均小于1％，相对峰面积的RSD均小于5％，表明所用仪器精密度良好。重复性试验结果显示，以鸟苷为参照峰(S)，各特征共有峰相对保留时间的RSD均小于1％，相对峰面积的RSD均小于5％，表明本方法重复性良好。稳定性试验结果显示，以鸟苷为参照峰(S)，各特征共有峰相对保留时间的RSD均小于1％，相对峰面积的RSD均小于5％，表明供试品稳定性良好。
线性：精密吸取1.2项下混合对照品储备溶液适量，用水稀释至不同浓度，按1.3项下的色谱条件测定，记录各成分的色谱峰面积，以色谱峰面积积分值(Y)为纵坐标，对照品溶液的质量浓度(X，μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线。结果如下表所示。
表6 9个特征峰组分的线性方程、相关系数及范围
Figure BDA0003224984470000131
注：LLOQ为定量下限。
由上表中的结果可知，9个特征峰组分的线性线性良好。
上述各项方法学验证选取了响应较高、保留时间适当、分离度较好的色谱峰(共9个)作为代表进行了方法学验证。选择的上述色谱峰可以很好地代表瓜蒌薤白半夏汤汤剂中的22个色谱峰，完全可以证明本发明提供的瓜蒌薤白半夏汤汤剂的指纹图谱构建方法的可靠性。
实施例3含量测定
将表3中不同产地、不同批号的药材组合的15批次的瓜蒌薤白半夏汤，分别按照1.1项下供试品溶液的制备方法制得15批供试品溶液，然后分别按1.3项下的色谱条件进样测定，记录260nm波长下9个特征峰的色谱峰面积，带入实施例2中的各组分的线性标准曲线进行计算，结果如下表所示。
表7 15批瓜蒌薤白半夏汤汤剂供试品溶液含量结果(μg/g)
Figure BDA0003224984470000132
Figure BDA0003224984470000141
由上表中的数据可知，葫芦巴碱(瓜蒌和薤白中的成分)在汤剂中含量范围为8.08-16.11μg/g，各批次间含量差异不大；在瓜蒌、薤白、米酒中都含有的尿嘧啶、黄嘌呤、腺嘌呤在汤剂中含量范围分别为3.73-11.40μg/g，3.29-9.22μg/g，2.66-9.98μg/g，尿嘧啶、黄嘌呤和腺嘌呤在瓜蒌和薤白药材中含量较少，在米酒中含量较高，各批次间尿嘧啶、黄嘌呤、腺嘌呤成分的含量差异跟米酒相关。在瓜蒌、薤白和米酒中也都含有尿苷、鸟苷和腺苷，并且含量较大，在汤剂中含量范围分别为21.13-59.53μg/g，19.77-53.05μg/g，15.20-33.64μg/g，尿苷、鸟苷和腺苷是汤剂中的主要成分，因此，可以认为核苷类成分是瓜蒌薤白半夏汤的主要活性成分。5-羟甲基糠醛是米酒和瓜蒌中的成分，食品法典委员会规定，蜂蜜中的5-羟甲基糠醛含量不得高于80mg/kg，过量食用5-羟基甲基糠醛可能会导致中毒和动物内脏损伤，因此，瓜蒌薤白半夏汤中5-羟甲基糠醛含量是保证瓜蒌薤白半夏汤的药效及质量关键之一，香草酸是瓜蒌中的成分，在汤剂中含量范围为1.80-2.58μg/g，各批次间差异不大。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
取瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂制备成供试品溶液；
取葫芦巴碱、尿嘧啶、黄嘌呤、腺嘌呤、尿苷、鸟苷、5-羟甲基糠醛、腺苷和香草酸对照品，用溶剂配置成混合对照品溶液；
对所述供试品溶液和混合对照品溶液进行超高效液相色谱检测，得供试品溶液及混合对照品溶液的液相色谱图；
色谱条件包括：以硅胶颗粒为填料的串联的反相色谱柱；流动相A：含0.1wt%甲酸和40mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B：体积比为2:1的甲醇与乙腈的混合溶液；洗脱方式为梯度洗脱；
以ACQUITYUPLC HSS T3色谱柱和CORTECS T3 色谱柱串联；
所述梯度洗脱的程序如下：
0-7.0min，100%流动相A；
7.0-13.0min，100%→95%流动相A，0-5%流动相B；
13.0-13.1min，95%→90%流动相A，5-10%流动相B；
13.1-20.0min，90%流动相A，10%流动相B；
20.0-35.0min，90%→50%流动相A，10-50%流动相B；
35.0-35.1min，50%→100%流动相A，50-0%流动相B；
35.1-45min，100%流动相A；上述百分比为体积百分比；
所述瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的制备方法包括如下步骤：
取瓜蒌，薤白和半夏，加入米酒煎煮、过滤，按照常规工艺制得瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂；所述药物制剂为标准汤剂或干膏粉；所述标准汤剂可直接作为供试品溶液；所述干膏粉溶于水中，过滤，即得供试品溶液。
2.根据权利要求1所述的瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述色谱条件中还包括：柱温25-35℃，进样量为2μL，流速为0.2mL/min，检测波长为260nm。
3.根据权利要求1所述的瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述混合对照品溶液中葫芦巴碱、5-羟甲基糠醛的浓度分别为30μg/mL，尿嘧啶、黄嘌呤、腺嘌呤的浓度分别为20μg/mL，尿苷、鸟苷的浓度分别为100μg/mL，腺苷的浓度为50μg/mL，香草酸的浓度为10μg/mL。
4.权利要求1-3任一项所述的方法在瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的质量检测和/或质量控制中的应用。
5.如下任一所述方法：
(I)一种瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的有效成分及含量测定方法，包括使用待测瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂按照权利要求1-3任一所述的方法建立待测瓜蒌薤白半夏汤的指纹图谱的步骤；或
(II)一种瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的质量检测方法，包括使用待测瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂按照权利要求1-3中任一所述的方法建立待测瓜蒌薤白半夏汤的药物制剂的指纹图谱的步骤。
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