CN109828059B - 桂枝芍药知母汤的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种桂枝芍药知母汤的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：1)参照物溶液的制备：取没食子酸、芒果苷、芍药苷、升麻素苷、甘草苷、5‑O‑甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸和甘草酸铵对照品，分别加甲醇溶解，作为参照物溶液；2)供试品溶液的制备：取桂枝芍药知母汤冻干粉，加甲醇溶解，即得供试品溶液；3)分别吸取参照物溶液和供试品溶液注入液相色谱仪。本发明方法不仅可用于检测没食子酸、芒果苷、芍药苷、升麻素苷、甘草苷、5‑O‑甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸和甘草酸铵，还能实现桂枝芍药知母汤的整体质量控制，进一步还能为桂枝芍药知母汤物质基础的研究提供方法依据，具备推广应用价值。
Description
技术领域
本发明具体涉及桂枝芍药知母汤的检测方法。
背景技术
桂枝芍药知母汤出自《金匮要略·中风历节病脉证治篇》，由桂枝、芍药、知母、甘草、防风、白术、麻黄、生姜、麻黄九味药组成，是治疗痹症的经典名方，具有祛风除湿、温经散寒、滋阴清热的功效。类风湿关节炎(RA)属于中医痹症范畴，现代临床和药理研究发现桂枝芍药知母汤用于治疗RA有确切的疗效。RA的发病机制目前尚未清楚，但有研究表明在RA患者和模型动物血清和关节液中自由基水平升高，自由基在RA疾病的关节软骨损伤中起重要作用，桂枝芍药知母汤能有效清除自由基的作用。
目前对桂枝芍药知母汤的研究主要集中于其药效学研究，对其物质基础研究鲜有报道，如董运茁.HPLC同时测定桂枝芍药知母汤中7个有效成分的含量，也仅仅只能分析其中7种成分，且具有明显活性成分的肉桂酸还不能被检测出，不能有效反映出桂枝芍药知母汤的质量。现阶段公开的检测方法，也都不能使桂枝芍药知母汤的质量得到有效控制。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种桂枝芍药知母汤的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：
1)参照物溶液的制备：取没食子酸、芒果苷、芍药苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸和甘草酸铵对照品，分别加甲醇溶解，作为参照物溶液；
2)供试品溶液的制备：取待测样品，加甲醇溶液溶解，即得供试品溶液；
3)分别吸取参照物溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以0.1％甲酸水为流动相A，以0.1％甲酸乙腈为流动相B梯度洗脱；梯度洗脱程序如下：
4)分析特征图谱。
进一步地，步骤2)所述待测样品为桂枝芍药知母汤或桂枝芍药知母汤冻干粉。
更进一步地，所述桂枝芍药知母汤冻干粉制备方法如下：
取桂枝芍药知母汤原方饮片，加水浸泡，煎煮，过滤，滤液冷却后定容，冷冻干燥，得桂枝芍药知母汤物质基准，取桂枝芍药知母汤物质基准加水溶解，再加乙醇溶液沉淀，取上清液真空冷冻干燥，制得桂枝芍药知母汤干粉。
更进一步地，所述饮片与水的质量体积比为93g：1400ml；所述浸泡30min；所述煎煮是武火煮沸，文火微沸55min；所述过滤是用200目纱布双层过滤；所述定容至饮片的4.3倍量(v/w，ml/g)。
更进一步地，所述桂枝芍药知母汤物质基准与水的质量体积比为4g：50ml；所述乙醇溶液为95-100％乙醇，优选95％乙醇；所述加乙醇溶液至溶液醇浓度为75％；所述沉淀时间为24-30h，优选24h。
进一步地，步骤2)所述甲醇溶液为50-100％甲醇，优选50％甲醇；所述待测样品与甲醇溶液的质量体积比为0.02-0.05g:1ml，优选0.02g:1ml。
进一步地，步骤3)所述注入液相色谱仪的溶液体积为10～20μl，优选20μl。
进一步地，步骤3)所述色谱条件的检测波长为254nm，流动相流速1mL/min，柱温为30-40℃，优选32℃。
进一步地，步骤3)所述色谱柱规格：4.6×250mm，5μm。
进一步地，所述检测方法得到的特征图谱中应呈现26个特征峰，其中8个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与芒果苷参照物相应的峰为S峰，与没食子酸参照物相应的峰为峰4，与芍药苷参照物相应的峰为峰14，与升麻素苷参照物相应的峰为峰15，与甘草苷参照物相应的峰为峰17，与5-O-甲基维斯阿米醇苷参照物相应的峰为峰19，与肉桂酸参照物相应的峰为峰23，与甘草酸铵参照物相应的峰为峰25，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±3％之内。规定值为：峰1：0.123、峰2：0.233、峰3：0.338、峰4：0.347、峰5：0.36、峰6：0.538、峰7：0.565、峰8：0.649、峰9：0.676、峰10：0.752、峰11：0.899、峰12S峰：1、峰13：1.029、峰14：1.068、峰15：1.102、峰16：1.204、峰17：1.231、峰18：1.24、峰19：1.292、峰20：1.302、峰21：1.4、峰22：1.444、峰23：1.512、峰24：1.662、峰25：1.732、峰26：1.781。
本发明的桂枝芍药知母汤特征图谱检测方法，可以同时检测没食子酸、芒果苷、芍药苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸和甘草酸铵，还可用于桂枝芍药知母汤的整体质量控制，也为进一步深入研究桂枝芍药知母汤物质基础提供了研究依据，具有广阔的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1混合对照品溶液HPLC图谱(4.没食子酸；12.芒果苷；14.芍药苷；15.升麻素苷；17.甘草苷；19.5-O-甲基维斯阿米醇苷；23.肉桂酸；25.甘草酸铵)
图2桂枝芍药知母汤HPLC指纹图谱及共有模式
图3桂枝芍药知母汤物质基准不同极性部位自由基清除率
图4桂枝芍药知母汤乙酸乙酯部位与抗坏血酸自由基清除率
具体实施方式
实施例1桂枝芍药知母汤的特征图谱
1)参照物溶液的制备：分别取没食子酸、芒果苷、芍药苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸和甘草酸铵对照品，精密称定，加甲醇，分别制成2.342、1.048、0.561、1.857、0.945、1.086、0.503、1.114g·L-1对照品储备液。分别精密吸取上述8个对照品储备液适量，混合，加甲醇制成浓度分别为0.1171、0.1048、0.0561、0.1857、0.0945、0.1086、0.0503、0.1114g·L-1的混合对照品溶液。
2)供试品溶液的制备：
桂枝芍药知母汤物质基准冻干粉：按《金匮要略》桂枝芍药知母汤原方(即：桂枝四两，芍药三两，甘草二两，麻黄二两，生姜五两，白术五两，知母四两，防风四两，附子(炮)二枚或二两)，以1两等于3g计，称取饮片共93g，加纯净水1400mL，浸泡30min。武火煮沸，文火微沸55min，200目纱布双层过滤，冷却后定容至400mL，真空冷冻干燥，制得桂枝芍药知母汤物质基准冻干粉，
桂枝芍药知母汤供试品冻干粉：取桂枝芍药知母汤物质基准冻干粉4g加50ml水溶解后，加95％乙醇至75％，放置24h后，取上清液真空冷冻干燥，即得；
供试品溶液：取供试品冻干粉加入50％甲醇，制得浓度约为0.02mg/mL的供试品溶液，进样前用0.45μm滤膜滤过，取续滤液进样分析。
3)分别吸取20μL参照物溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波254nm；柱温为32℃；流速为1mL/min；流动相：以0.1％甲酸水为流动相A，以0.1％甲酸乙腈为流动相B梯度洗脱；梯度洗脱程序如下：
4)分析特征图谱
桂枝芍药知母汤特征图谱中呈现26个特征峰，其中8个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与芒果苷参照物相应的峰为S峰，与没食子酸参照物相应的峰为峰4，与芍药苷参照物相应的峰为峰14，与升麻素苷参照物相应的峰为峰15，与甘草苷参照物相应的峰为峰17，与5-O-甲基维斯阿米醇苷参照物相应的峰为峰19，与肉桂酸参照物相应的峰为峰23，与甘草酸铵参照物相应的峰为峰25，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±3％之内。规定值为：0.123(峰1)、0.233(峰2)、0.338(峰3)、0.347(峰4)、0.36(峰5)、0.538(峰6)、0.565(峰7)、0.649(峰8)、0.676(峰9)、0.752(峰10)、0.899(峰11)、1(峰12S峰)、1.029(峰13)、1.068(峰14)、1.102(峰15)、1.204(峰16)、1.231(峰17)、1.24(峰18)、1.292(峰19)、1.302(峰20)、1.4(峰21)、1.444(峰22)、1.512(峰23)、1.662(峰24)、1.732(峰25)、1.781(峰26)。
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果：
试验例1
1材料
UPH-I-10T优普超纯水器(成都超纯科技有限公司)；FA1204C电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；SHZ-D(III)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；岛津LC-2030C3 D高效液相色谱仪(日本岛津公司)；色谱柱：Shim-pack GIST C18(5μm，4.6×250mm)；Emax Plus酶标仪(Biochrom Ltd Cambridge)；XK96-3型微量振荡器(上海化科实验器材有限公司)96孔细胞培养板(依科赛生物科技有限公司)；Emax Plus酶标仪；XK96-3型微量振荡器。
乙腈(色谱纯，Sigma公司)；其他试剂均为分析纯；试验用水为超纯水；肉桂酸对照品(批号：170621)购于成都普菲德生物技术有限公司；芒果苷对照品(111607-201704)、没食子酸对照品(110831-201605)、芍药苷对照品(110736-201842)、升麻素苷对照品(111522-201712)、甘草苷对照品(111610-201607)、甘草酸铵(110731-201619)对照品和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品(111523-201610)均购于中国食品药品检定研究院。DPPH(Sigma公司),L(+)-抗坏血酸(批号：2018120301，成都市科隆化学品有限公司)。
饮片均购自新荷花中药饮片有限公司，生姜购自成都市场，经成都中医药大学卢先明教授鉴定，按照《中国药典》方法检测，药材均为符合《中国药典》2015年版的规定品种。
2方法与结果
2.1对照品溶液制备
分别取没食子酸、芒果苷、芍药苷、升麻素苷、甘草苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸和甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成对照品储备液。分别精密吸取上述8个对照品储备液适量，混合，加甲醇制成混合得的对照品溶液。
2.2供试品溶液制备
桂枝芍药知母汤物质基准冻干粉：按《金匮要略》桂枝芍药知母汤原方(即：桂枝四两，芍药三两，甘草二两，麻黄二两，生姜五两，白术五两，知母四两，防风四两，附子(炮)二枚或二两)，以1两等于3g计，称取饮片，加纯净水1400mL,浸泡30min。武火煮沸，文火微沸55min，200目纱布双层过滤，冷却后定容至400mL，制得桂枝芍药知母汤物质基准。
供试品溶液：取桂枝芍药知母汤物质基准冻干粉加水溶解后，加95％乙醇至75％，放置24h后，取上清液浓缩至无醇味，制得桂枝芍药知母汤供试品冻干粉。取冻干粉加入50％甲醇，制得浓度约为0.02mg/mL的供试品溶液，进样前用0.45μm滤膜滤过，取续滤液进样分析。
2.3指纹图谱色谱条件
Shimadsu GL-science C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)梯度洗脱，梯度洗脱程序为:
0-5min,1％B；5-10min,1％-2％B；10-25min,2％-10％B；25-35min,10％B；35-40min,10％-12％B；40-45min,12％B；45-55min,12％-18％B；55-60min,18％-20％B；60-70min,20％-30％B；70-95min,30％-45％B；95-105min,45％B；检测波长254nm,柱温为32℃,进样量为20μL。
2.4方法学考察
2.4.1精密度试验
精密称取桂枝芍药知母汤冻干粉0.1200g，加50％甲醇溶液制备供试品溶液，色谱条件同2.3项，连续6次进行HPLC分析，结果各共有峰的保留时间、峰面积的RSD分别＜1％，3％，表明仪器精密度良好。
2.4.2稳定性试验
取同一批供试品溶液，同2.3项下色谱条件分别于0,2,4,8,12,16,24h进行测定，结果各共有峰的保留时间、峰面积的RSD分别＜1％，4％，表明样品在24h内稳定。
2.4.3重复性试验、
取同一批供试品溶液，同2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.3项下色谱条件进行测定，结果各共有峰的保留时间、峰面积的RSD分别＜2％，5％，表明本方法的重复性良好。
2.5指纹图谱及共有峰的标定
以建立之色谱条件，对10批样品进行测定，得到桂枝芍药知母汤高效液相指纹图谱，见图1；桂枝芍药知母汤所含成分色谱峰于105min内洗脱完全，26个共有峰，生成对照指纹图谱。
2.6指纹图谱的建立及相似度计算
同2.2项下方法分别制备桂枝芍药知母汤供试品溶液S1～S10，按2.3项下色谱条件进行测定，记录色谱图。对10批样品数据进行分析，采用多点校正方式(时间窗宽度为0.1min)，平均数法生成指纹图谱和对照指纹图谱。分析10桂枝芍药知母汤HPLC色谱图，知母作为桂枝芍药知母汤臣药，其所含芒果苷亦是桂枝芍药知母汤主要活性成分之一，且12号峰与相邻峰分离较好，其含量较高且比较稳定。因此，以12号峰(芒果苷)为参照峰(S峰)，记录各色谱峰保留时间、峰面积及同一图谱中S峰保留时间、峰面积，计算10批桂枝芍药知母汤方指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间与相对峰面积，确定桂枝芍药知母汤方中26个色谱峰为其共有峰，见图1，图2。
2.7相似度评价
基于《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》，对10样本指纹图谱进行匹配，相似度在0.929～0.998。见表1～3。
表1 10批桂枝芍药知母汤HPLC指纹图谱共有峰相对峰面积(以芒果苷峰作为参照)
表2 10批桂枝芍药知母汤HPLC指纹图谱相似度
表3 10批桂枝芍药知母汤HPLC指纹图谱共有峰相对出峰时间(以芒果苷峰作为参照)
2.8DPPH自由基清除法测定桂枝芍药知母汤及其不同溶剂部位的抗氧化作用
2.8.1DPPP溶液及系列样品溶液的配置
精密称取DPPH15.08mg，加甲醇定容至100mL,避光保存；称取S1-S10桂枝芍药知母汤物质基准冻干粉样品按照2.2项下制备桂枝芍药知母汤供试品冻干粉，精密称取冻干粉样品各33mg，定加入50％甲醇容至5mL作为储备液，逐级稀释成666.7,333.3，166.7，83.3，41.7，20.8，10.4mg·L-1的系列质量浓度；精密称取抗坏血酸11.99mg，加入50％甲醇定容至100mL，避光保存，作为母液，逐级稀释成0.1199、0.0600、0.0300、0.0150、0.0075、0.0037、0.0019g·L-1。
2.8.2不同溶剂部位样品溶液的制备
取样品S6冻干粉10g，用适量热水溶解，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，将各部位萃取液分别旋蒸至干；分别取各萃取部位30mg，用50％甲醇溶解，得3.0g·L-1各萃取部位溶液作为母液，逐级稀释成1.500、0.750、0.375、0.186、0.094、0.047、0.023g·L-1。
2.8.3桂枝芍药知母汤物质基准DPPH清除率试验
分别移取系列样品溶液0.1mL至96孔板中，每个浓度平行3份。每个孔分别等量加入0.1mLDPPH溶液。避光震荡，室温避光反应60min后，用酶标仪测定517nm处的吸光度。DPPH清除率公式如下：
清除率＝{[1-(Ai-Aj)]/AO}×100％
其中，Ai为样品溶液0.1mL+DPPH溶液0.1mL的吸光度；Aj为样品溶液0.1mL+甲醇0.1mL的吸光度；AO为50％甲醇溶液0.1mL+DPPH溶液0.1mL的吸光度。
应用SPPS19.0软件，采用probit模型计算样品溶液清除DPPH自由基的半数清除率(IC50)，见表4。
表4桂枝芍药知母汤物质基准清除自由基活性测定
2.8.4抗坏血酸DPPH清除率试验
将2.8.1项下制备的抗坏血酸样品按照2.8.3项下操作进行测定，结果见表5。
表5抗坏血酸清除自由基活性测定
2.8.5桂枝芍药知母汤物质基准不同极性部位自由基清除率试验
将2.8.2项下制备的各不同极性萃取部位的系列样品按照2.8.3项下操作进行测定。结果见表6和图3～图4。
桂枝芍药知母汤物质基准不同极性部位对自由基均有清除能力，清除能力大到小为乙酸乙酯部位＞二氯甲烷部位＞石油醚部位＞正丁醇部位。乙酸乙酯部位的抗氧化活性(IC50＝0.042g·L-1)远大于其他部位抗氧化活性，稍弱于抗坏血酸(IC50＝0.033g·L-1)。
表6桂枝芍药知母汤物质基准不同极性部位清除自由基活性测定
2.9桂枝芍药知母汤清除自由基谱效关系
将桂枝芍药知母汤物质基准指纹图谱中26个共有峰峰面积标准化处理(即：分別求出各个序列数据的平均值，再用平均值去除对应序列中的各个原始数据，所得到的商为新的数据列，即均值化数列)后，与DPPH自由基IC50值进行双变量皮尔逊双变量(pearson)相关系数分析，结果见表7。
表7特征指纹峰与抗氧化活性的相关系数
表7结果显示，14(芍药苷)、20、12(芒果苷)、13、23(肉桂酸)、11、4(没食子酸)、18、19(5-O-甲基维斯阿米醇苷)号峰含量变化与DPPH自由基清除活性呈负相关。
3讨论
桂枝芍药知母汤中含有多种化学物质，如芒果苷、没食子酸、芍药苷、升麻素苷及其衍生物等，成分较为复杂，确定较为理想的洗脱条件是相关研究开展的关键。本次研究中，分别采用乙腈-水、乙腈-甲酸水、甲醇-水等不同浓度、不同梯度条件下进行试验，考察峰型、分离度等因素，发现酸性条件下，指纹图谱拥有较令人满意的峰型。其中，0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈进行梯度洗脱时，桂枝芍药知母汤中各组分可较好分离。考察230，210，254，278nm等不同波长处基线色谱峰数目、峰型、信号强度及基线平稳等因素，确定测定波长为254nm条件为最佳。同时，比较柱温为25，28，30，32，35℃时的峰分离情况，结果显示柱温32℃时，峰分离度良好。
本试验采用HPLC-DAD法对桂枝芍药知母汤进行分析。10批次桂枝芍药知母汤HPLC指纹图谱虽然存在一定差别，但均可找到共有的色谱峰，拥有近似的指纹图谱概貌，且通过单次进样便可获得大量色谱特征峰，具有较好的稳定性与可控性。通过对照品比对法，指认出了没食子酸、芒果苷、芍药苷、甘草苷、升麻素苷、甘草酸铵、肉桂酸和5-O-甲基维斯阿米醇苷8个成分。
本实验通过SPPS软件采用皮尔逊双变量相关对“谱效”关系进行分析，结果发现桂枝芍药知母汤中芍药苷、芒果苷、肉桂酸含量的高低与DPPH自由基清除活性呈负相关性，进一步确认了芍药苷、芒果苷、肉桂酸是桂枝芍药知母汤中用于治疗RA的重要活性成分，更进一步验证了本发明检测方法的准确性。
本发明方法不仅可用于检测没食子酸、芒果苷、芍药苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸和甘草酸铵，还能实现桂枝芍药知母汤的整体质量控制，进一步还能为桂枝芍药知母汤物质基础的研究提供方法依据，具备推广应用价值。
Claims (10)
1.一种桂枝芍药知母汤的检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：
1）参照物溶液的制备：取没食子酸、芒果苷、芍药苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸和甘草酸铵对照品，分别加甲醇溶解，作为参照物溶液；
2）供试品溶液的制备：取待测样品，加50%甲醇溶液溶解，即得供试品溶液；
3）分别吸取参照物溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以0.1%甲酸水为流动相A，以0.1%甲酸乙腈为流动相B梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温为32℃；流动相流速1mL/min；梯度洗脱程序如下：
。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2）所述待测样品为桂枝芍药知母汤或桂枝芍药知母汤冻干粉；所述待测样品与50%甲醇溶液的质量体积比为0.02-0.05g:1ml。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述待测样品与50%甲醇溶液的质量体积比为0.02g:1ml。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述桂枝芍药知母汤冻干粉制备方法如下：
取桂枝芍药知母汤原方饮片，加水浸泡，煎煮，过滤，滤液冷却后定容，冷冻干燥，得桂枝芍药知母汤物质基准，取桂枝芍药知母汤物质基准加水溶解，再加乙醇溶液沉淀，取上清液真空冷冻干燥，制得桂枝芍药知母汤冻干粉。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述饮片与水的质量体积比为93g：1400ml；所述浸泡30min；所述煎煮是武火煮沸，文火微沸55min；所述过滤是用200目纱布双层过滤；所述定容至饮片的4.3倍量v/w，ml/g。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述桂枝芍药知母汤物质基准与水的质量体积比为4g：50ml；所述乙醇为95-100%乙醇；所述加乙醇溶液至溶液醇浓度为75%；所述沉淀时间为24-30h。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述乙醇为95%乙醇；所述沉淀时间为24h。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3）所述注入液相色谱仪的溶液体积为10～20μl；所述色谱柱规格为4.6×250mm，5μm。
9.据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：步骤3）所述注入液相色谱仪的溶液体积为20μl。
10. 根据权利要求1~9任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法得到的特征图谱中应呈现26个特征峰，其中8个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与芒果苷参照物相应的峰为S峰，与没食子酸参照物相应的峰为峰4，与芍药苷参照物相应的峰为峰14，与升麻素苷参照物相应的峰为峰15，与甘草苷参照物相应的峰为峰17，与5-O-甲基维斯阿米醇苷参照物相应的峰为峰19，与肉桂酸参照物相应的峰为峰23，与甘草酸铵参照物相应的峰为峰25，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±3％之内；规定值为：峰1：0.123、峰2：0.233、峰3：0.338、峰4：0.347、峰5：0.36、峰6：0.538、峰7：0.565、峰8：0.649、峰9：0.676、峰10：0.752、峰11：0.899、峰12 S峰：1、峰13：1.029、峰14：1.068、峰15：1.102、峰16：1.204、峰17：1.231、峰18：1.24、峰19：1.292、峰20：1.302、峰21：1.4、峰22：1.444、峰23：1.512、峰24：1.662、峰25：1.732、峰26：1.781。
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