CN113075311A - 一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法，包括供试样品的制备；包括对照品溶液、供试品溶液、全方溶液以及阴性溶液；芍药甘草汤指标成分含量测定；包括专属性试验、标准曲线绘制；冻干粉含量测定；取X批冻干粉样品，制作供试品溶液，按照色谱条件进样测定，计算芍药苷、甘草苷和甘草酸的含量，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，检测波长为237nm进行梯度洗脱；记录色谱图，统计特征峰的保留时间及相对保留时间；参考指标选择相对保留时间及相对标准偏差，选取参照峰进行归一化值处理，对X批冻干粉样品运用SPSS 22.0软件进行聚类分析，以平方Euclidean距离为指标，组间联接法聚类。

Description

一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法

技术领域

本发明涉及一种芍药甘草汤，具体为一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法。

背景技术

芍药甘草汤始载于东汉医家张仲景所著《伤寒论》，由芍药、甘草两味药组成，临床应用历史悠久，安全性高，疗效确切。该方配伍精简，具有和营散逆，舒挛止痛的功效。经典名方对药材来源、饮片炮制、配伍比例、制备工艺等进行了严格要求。由于经典名方配方多样，且成分复杂，建立经典名方的质量标准，将经典名方中有效成分量化，更有利保证传统古方的质量及疗效。

为此，提出一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法，芍药甘草汤特征图谱的建立方法包括以下步骤：

步骤一：供试样品的制备；

步骤二：芍药甘草汤指标成分含量测定；

步骤三：冻干粉含量测定；

步骤四：芍药甘草汤特征图谱的建立。

优选的，步骤一中的供试样品包括对照品溶液、供试品溶液、全方溶液以及阴性溶液；

具体的，所述对照品溶液包括芍药苷对照品溶液、甘草苷对照品溶液、甘草酸铵对照品溶液，芍药苷对照品溶液的制备方法为：

取芍药苷对照品Mmg，取甲醇3M ml，将芍药苷对照品与甲醇充分混合，即得芍药苷对照品溶液；

甘草苷对照品溶液的制备方法为：

取甘草苷对照品nμg，取70％乙醇20n ml，将甘草苷对照品与70％乙醇充分混合，即得甘草苷对照品溶液；

甘草酸对照品溶液的制备方法为：

取甘草酸铵对照品pμg，取70％乙醇200p ml，将甘草酸铵对照品与70％乙醇充分混合，即得甘草酸对照品溶液；

所述供试品溶液的制备方法包括以下步骤：

步骤S1：取芍药甘草汤冻干粉0.2-0.4g；

步骤S2：将芍药甘草汤冻干粉置于塞锥形瓶中，加入70％甲醇25-30ml，密封锥形瓶，称定重量；

步骤S3：将锥形瓶加热回流1-1.5h，放冷，再次称定重量；

步骤S4：用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

优选的，所述全方溶液的制备方法包括以下步骤：

步骤P1：取芍药55.00-60.00g，炒甘草55.00-60.00g，置1.8L-2L的砂锅中；

步骤P2：向砂锅加入去离子水600-800ml，盖上盖子，浸泡30-40分钟；

步骤P3：用电陶炉作为热源，先武火(1800w)加热至沸，后文火(600w)保持微沸煎至300-350ml，趁热滤过；

步骤P4：滤液减压浓缩至50-55ml，预冻至结冰，冷冻干燥，研细，装袋，即得全方溶液。

优选的，所述阴性溶液的制备方法为：

分别取缺少芍药或甘草的芍药甘草汤冻干粉0.2-0.4g；将缺少芍药或甘草的芍药甘草汤冻干粉置于塞锥形瓶中，加入70％甲醇25-30ml，密封锥形瓶，称定重量；将锥形瓶加热回流1-1.5h，放冷，再次称定重量；用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得阴性溶液。

优选的，步骤二中的芍药甘草汤指标成分含量测定包括专属性试验、标准曲线绘制；

具体的，所述专属性试验为：

取供试品溶液和缺少芍药的阴性溶液以及缺少甘草的阴性溶液按照色谱条件进样，记录色谱图；

所述标准曲线绘制的曲线包括芍药苷标准曲线、甘草苷标准曲线、甘草酸标准曲线，具体的芍药苷标准曲线的绘制过程包括以下：

取芍药苷对照品，称定后加甲醇制成每1ml含580μg的芍药苷试验品溶液，分别吸取芍药苷对照品溶液0.4ml、0.8ml、1.0ml、1.5ml、3.0ml置5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；

将芍药苷试验品溶液连同芍药苷对照品溶液一同按照色谱条件进样测定，记录峰面积；以芍药苷的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线；

甘草苷标准曲线的绘制过程包括以下：

取甘草苷对照品，称定后加70％乙醇制成每1ml含303.5μg的甘草苷试验品溶液，分别吸取甘草苷对照品溶液0.3ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、3.0ml置5ml量瓶中，用70％乙醇稀释至刻度，摇匀；

将甘草苷试验品溶液连同甘草苷对照品溶液一同按照色谱条件进样测定，记录峰面积；以甘草苷的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线；

甘草酸标准曲线的绘制过程包括以下：

取甘草酸铵对照品，称定后加70％乙醇制成每1ml含771.5μg的甘草酸试验品溶液，分别吸取甘草酸铵对照品溶液0.4ml、0.6ml、1.0ml、1.5ml、3.0ml置5ml量瓶中，用70％乙醇稀释至刻度，摇匀；

将甘草酸试验品溶液连同甘草酸铵对照品溶液一同按照色谱条件进样测定，记录峰面积；以甘草酸的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线。

优选的，冻干粉含量测定具体表现为：

取X批冻干粉样品，制作供试品溶液，按照色谱条件进样测定，计算芍药苷、甘草苷和甘草酸的含量。

优选的，所述色谱条件具体为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，检测波长为237nm进行梯度洗脱。考察不同溶剂及其体积体积分数(甲醇、70％甲醇、70％乙醇、50％甲醇、50％乙醇)对供试样品的制备的影响，通过对色谱峰峰形及分离度等综合因素的考虑，选用70％甲醇。特征图谱色谱条件考察了不同色谱柱(Inertsil ODS-SP(4.6×250mm，5μm)、COSMOSIL-5C18-MS-Ⅱ(4.6×250mm，5μm)、Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm，5μm))、柱温(柱温25℃、30℃和35℃)、流动相(0.1％磷酸水-乙腈，0.05％磷酸水-乙腈，0.01％磷酸水-乙腈)等因素。查阅中国药典2020年版各药材和制剂，芍药苷的检测波长为230nm，甘草苷和甘草酸的检测波长为237nm，比较接近，故选择237nm最为检测波长。结果显示最优的色谱条件为：Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm)色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液，进行梯度洗脱；以237nm为检测波长，柱温为30℃。

优选的，芍药甘草汤特征图谱的建立的包括以下：

取X批冻干粉样品，制作供试品溶液，按照色谱条件进样测定，记录色谱图，统计特征峰的保留时间及相对保留时间；

参考指标选择相对保留时间及相对标准偏差，选取参照峰进行归一化值处理，对X批冻干粉样品运用SPSS 22.0软件进行聚类分析，以平方Euclidean距离为指标，组间联接法聚类。

优选的，还包括精密度试验、重复性试验以及稳定性试验，具体的精密度试验为：

取3种对照品溶液，按色谱条件分别连续进样6次测定峰面积，RSD均小于2％，表明仪器具有良好的精密度；

重复性试验：

取样品6份，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，按色谱条件进样测定，计算3种指标成分的RSD，均小于2％，表明本含量测定方法的重复性良好；

稳定性试验：

按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别于0、5、10、15、20、24小时进样测定，记录峰面积；3种指标成分峰面积的RSD均小于0.5％，表明在24小时内具有稳定性良好。

优选的，芍药甘草汤特征图谱的建立的过程中包括精密度考察、稳定性考察以及重复性考察过程，具体的，精密度考察过程为：

取甘草苷对照品，连续进样6次，记录色谱峰峰面积及保留时间，并计算相对保留时间及相对峰面积RSD均小于3％，说明精密度良好。

稳定性考察：

取冻干粉，按制备方法制备得供试品溶液，分别在0、4、9、15、20、24小时进样测定，统计9个特征峰的保留时间和峰面积，以3号峰(芍药苷)为S峰，计算其余峰对S峰的相对保留时间和相对峰面积。各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，说明供试品溶液在24小时内具有良好的稳定性。

重复性考察：

取冻干粉，按制备方法制备得供试品溶液，共6份，按色谱条件进样测定，分别统计9个特征峰的保留时间和峰面积，以3号峰(芍药苷)为S峰，计算其余峰对S峰的相对保留时间和相对峰面积。各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，说明本方法的重复性良好。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明采用电陶炉作为热源，电陶炉是电阻丝炉的升级产品，有耐热面板将电阻丝进行隔离，更美观，使用更安全。以煎煮时间滤液颜色气味、药渣状态及出膏率作为研究指标，最终确定以电陶炉为最佳热源，能够更安全，可控的且有效的模拟古法煎煮工艺。浓缩最佳参数选择的原则是最小程度破坏成分，且兼顾浓缩效率。减压浓缩具有温度低、效率高的特点，为制药工业普遍采用。以甘草苷、甘草酸、芍药苷等有效成分为指标确定浓缩的最佳工艺。以冷冻干燥的干燥方法，最大程度上减少有效成分的损失，以达到传统汤剂的疗效。另外通过现代化的分析手段，对煎液中的有效成分等进行分析，采用古今结合的煎煮分析方式，使传统经典名方的现代化生产更具科学性、合理性。

2、由于中药复方成分的复杂性，在含量测定及特征图谱中选择梯度洗脱更能体现复方中有效成分。考察不同溶剂及其体积体积分数(甲醇、70％甲醇、70％乙醇、50％甲醇、50％乙醇)对供试样品的制备的影响，通过对色谱峰峰形及分离度等综合因素的考虑，选用70％甲醇。特征图谱色谱条件考察了不同色谱柱(Inertsil ODS-SP(4.6×250mm，5μm)、COSMOSIL-5C18-MS-Ⅱ(4.6×250mm，5μm)、Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm，5μm))、柱温(柱温25℃、30℃和35℃)、流动相(0.1％磷酸水-乙腈，0.05％磷酸水-乙腈，0.01％磷酸水-乙腈)等因素。查阅中国药典2020年版各药材和制剂，芍药苷的检测波长为230nm，甘草苷和甘草酸的检测波长为237nm，比较接近，故选择237nm最为检测波长。结果显示最优的色谱条件为：Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm)色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液，进行梯度洗脱；以237nm为检测波长，柱温为30℃。

3、本发明设定了精密度试验、重复性试验以及稳定性试验，以及在芍药甘草汤特征图谱的建立的过程中包括精密度考察、稳定性考察以及重复性考察过程，保证的试验的准确性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法的原理框图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1所示，一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法，芍药甘草汤特征图谱的建立方法包括以下步骤：

步骤一：供试样品的制备；

步骤二：芍药甘草汤指标成分含量测定；

步骤三：冻干粉含量测定；

步骤四：芍药甘草汤特征图谱的建立。

其中，步骤一中的供试样品包括对照品溶液、供试品溶液、全方溶液以及阴性溶液；

具体的，所述对照品溶液包括芍药苷对照品溶液、甘草苷对照品溶液、甘草酸铵对照品溶液，芍药苷对照品溶液的制备方法为：

取芍药苷对照品Mmg，取甲醇3M ml，将芍药苷对照品与甲醇充分混合，即得芍药苷对照品溶液；

甘草苷对照品溶液的制备方法为：

取甘草苷对照品nμg，取70％乙醇20n ml，将甘草苷对照品与70％乙醇充分混合，即得甘草苷对照品溶液；

甘草酸铵对照品溶液的制备方法为：

取甘草酸铵对照品pμg，取70％乙醇200p ml，将甘草酸铵对照品与70％乙醇充分混合，即得甘草酸铵对照品溶液；

所述供试品溶液的制备方法包括以下步骤：

步骤S1：取芍药甘草汤冻干粉0.2-0.4g；

步骤S2：将芍药甘草汤冻干粉置于塞锥形瓶中，加入70％甲醇25-30ml，密封锥形瓶，称定重量；

步骤S3：将锥形瓶加热回流1-1.5h，放冷，再次称定重量；

步骤S4：用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

其中，所述全方溶液的制备方法包括以下步骤：

步骤P1：取芍药55.00-60.00g，炒甘草55.00-60.00g，置1.8L-2L的砂锅中；

步骤P2：向砂锅加入去离子水600-800ml，盖上盖子，浸泡30-40分钟；

步骤P3：用电陶炉作为热源，先武火(1800w)加热至沸，后文火(600w)保持微沸煎至300-350ml，趁热滤过；

步骤P4：滤液减压浓缩至50-55ml，预冻至结冰，冷冻干燥，研细，装袋，即得全方溶液。

其中，电陶炉是电阻丝炉的升级产品，有耐热面板将电阻丝进行隔离，更美观，使用更安全。以煎煮时间滤液颜色气味、药渣状态及出膏率作为研究指标，最终确定以电陶炉为最佳热源，能够更安全，可控的且有效的模拟古法煎煮工艺。浓缩最佳参数选择的原则是最小程度破坏成分，且兼顾浓缩效率。减压浓缩具有温度低、效率高的特点，为制药工业普遍采用。以甘草苷、甘草酸、芍药苷等有效成分为指标确定浓缩的最佳工艺。以冷冻干燥的干燥方法，最大程度上减少有效成分的损失，以达到传统汤剂的疗效。另外通过现代化的分析手段，对煎液中的有效成分等进行分析，采用古今结合的煎煮分析方式，使传统经典名方的现代化生产更具科学性、合理性。

其中，所述阴性溶液的制备方法为：

分别取缺少芍药或甘草的芍药甘草汤冻干粉0.2-0.4g；将缺少芍药或甘草的芍药甘草汤冻干粉置于塞锥形瓶中，加入70％甲醇25-30ml，密封锥形瓶，称定重量；将锥形瓶加热回流1-1.5h，放冷，再次称定重量；用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得阴性溶液。

其中，步骤二中的芍药甘草汤指标成分含量测定包括专属性试验、标准曲线绘制；

具体的，所述专属性试验为：

取供试品溶液和缺少芍药的阴性溶液以及缺少甘草的阴性溶液按照色谱条件进样，记录色谱图；

所述标准曲线绘制的曲线包括芍药苷标准曲线、甘草苷标准曲线、甘草酸标准曲线，具体的芍药苷标准曲线的绘制过程包括以下：

取芍药苷对照品，称定后加甲醇制成每1ml含580μg的芍药苷试验品溶液，分别吸取芍药苷对照品溶液0.4ml、0.8ml、1.0ml、1.5ml、3.0ml置5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；

将芍药苷试验品溶液连同芍药苷对照品溶液一同按照色谱条件进样测定，记录峰面积；以芍药苷的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线；

甘草苷标准曲线的绘制过程包括以下：

取甘草苷对照品，称定后加70％乙醇制成每1ml含303.5μg的甘草苷试验品溶液，分别吸取甘草苷对照品溶液0.3ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、3.0ml置5ml量瓶中，用70％乙醇稀释至刻度，摇匀；

将甘草苷试验品溶液连同甘草苷对照品溶液一同按照色谱条件进样测定，记录峰面积；以甘草苷的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线；

甘草酸标准曲线的绘制过程包括以下：

取甘草酸铵对照品，称定后加70％乙醇制成每1ml含771.5μg的甘草酸试验品溶液，分别吸取甘草酸铵对照品溶液0.4ml、0.6ml、1.0ml、1.5ml、3.0ml置5ml量瓶中，用70％乙醇稀释至刻度，摇匀；

将甘草酸试验品溶液连同甘草酸铵对照品溶液一同按照色谱条件进样测定，记录峰面积；以甘草酸的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线。

其中，冻干粉含量测定具体表现为：

取X批冻干粉样品，制作供试品溶液，按照色谱条件进样测定，计算芍药苷、甘草苷和甘草酸的含量。

其中，所述色谱条件具体为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，检测波长为237nm进行梯度洗脱；

梯度洗脱如下表1：

表1

其中，芍药甘草汤特征图谱的建立的包括以下：

取X批冻干粉样品，制作供试品溶液，按照色谱条件进样测定，记录色谱图，统计特征峰的保留时间及相对保留时间；

参考指标选择相对保留时间及相对标准偏差，选取参照峰进行归一化值处理，对X批冻干粉样品运用SPSS 22.0软件进行聚类分析，以平方Euclidean距离为指标，组间联接法聚类。

其中，还包括精密度试验、重复性试验以及稳定性试验，具体的精密度试验为：

取3种对照品溶液，按色谱条件分别连续进样6次测定峰面积，RSD均小于2％，表明仪器具有良好的精密度；

重复性试验：

取样品6份，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，按色谱条件进样测定，计算3种指标成分的RSD，均小于2％，表明本含量测定方法的重复性良好；

稳定性试验：

按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别于0、5、10、15、20、24小时进样测定，记录峰面积；3种指标成分峰面积的RSD均小于0.5％，表明在24小时内具有稳定性良好。

其中，芍药甘草汤特征图谱的建立的过程中包括精密度考察、稳定性考察以及重复性考察过程，具体的，精密度考察过程为：

取甘草苷对照品，连续进样6次，记录色谱峰峰面积及保留时间，并计算相对保留时间及相对峰面积RSD均小于3％，说明精密度良好。

稳定性考察：

取冻干粉，按制备方法制备得供试品溶液，分别在0、4、9、15、20、24小时进样测定，统计9个特征峰的保留时间和峰面积，以3号峰(芍药苷)为S峰，计算其余峰对S峰的相对保留时间和相对峰面积。各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，说明供试品溶液在24小时内具有良好的稳定性。

重复性考察：

取冻干粉，按制备方法制备得供试品溶液，共6份，按色谱条件进样测定，分别统计9个特征峰的保留时间和峰面积，以3号峰(芍药苷)为S峰，计算其余峰对S峰的相对保留时间和相对峰面积。各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，说明本方法的重复性良好。

上述公式均是去量化取其数值计算，公式是由采集大量数据进行软件模拟得到最近真实情况的一个公式，公式中的预设参数由本领域的技术人员根据实际情况设定。

本发明的工作原理：一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法，包括供试样品的制备；包括对照品溶液、供试品溶液、全方溶液以及阴性溶液；芍药甘草汤指标成分含量测定；包括专属性试验、标准曲线绘制；冻干粉含量测定；取X批冻干粉样品，制作供试品溶液，按照色谱条件进样测定，计算芍药苷、甘草苷和甘草酸的含量，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，检测波长为237nm进行梯度洗脱；取X批冻干粉样品，制作供试品溶液，按照色谱条件进样测定，记录色谱图，统计特征峰的保留时间及相对保留时间；参考指标选择相对保留时间及相对标准偏差，选取参照峰进行归一化值处理，对X批冻干粉样品运用SPSS 22.0软件进行聚类分析，以平方Euclidean距离为指标，组间联接法聚类。

在本发明所提供的实施例中，应该理解到，所揭露的设备，装置和方法，可以通过其它的方式实现。例如，以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，例如，所述模块的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式；所述作为分离部件说明的模块可以是或者也可以不是物理上分开的，作为模块显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方法的目的。

另对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。

因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化涵括在本发明内。不应将权利要求中的任何附关联图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，显然“包括”一词不排除其他单元或步骤，单数不排除复数。系统权利要求中陈述的多个单元或装置也可以由一个单元或装置通过软件或者硬件来实现。第二等词语用来表示名称，而并不表示任何特定的顺序。

最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方法而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方法进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方法的精神和范围。

Claims (8)

1.一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法，其特征在于，芍药甘草汤特征图谱的建立方法包括以下步骤：

步骤一：供试样品的制备；

步骤二：芍药甘草汤指标成分含量测定；

步骤三：冻干粉含量测定；

步骤四：芍药甘草汤特征图谱的建立。

2.根据权利要求1所述的一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法，其特征在于：步骤一中的供试样品包括对照品溶液、供试品溶液、全方溶液以及阴性溶液；

具体的，所述对照品溶液包括芍药苷对照品溶液、甘草苷对照品溶液、甘草酸铵对照品溶液，芍药苷对照品溶液的制备方法为：

取芍药苷对照品M mg，取甲醇3M ml，将芍药苷对照品与甲醇充分混合，即得芍药苷对照品溶液；

甘草苷对照品溶液的制备方法为：

取甘草苷对照品nμg，取70％乙醇20n ml，将甘草苷对照品与70％乙醇充分混合，即得甘草苷对照品溶液；

甘草酸铵对照品溶液的制备方法为：

取甘草酸铵对照品pμg，取70％乙醇200p ml，将甘草酸铵对照品与70％乙醇充分混合，即得甘草酸铵对照品溶液；

所述供试品溶液的制备方法包括以下步骤：

步骤S1：取芍药甘草汤冻干粉0.2-0.4g；

步骤S2：将芍药甘草汤冻干粉置于塞锥形瓶中，加入70％甲醇25-30ml，密封锥形瓶，称定重量；

步骤S3：将锥形瓶加热回流1-1.5h，放冷，再次称定重量；

步骤S4：用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

3.根据权利要求2所述的一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法，其特征在于：所述全方溶液的制备方法包括以下步骤：

步骤P1：取芍药55.00-60.00g，炒甘草55.00-60.00g，置1.8L-2L的砂锅中；

步骤P2：向砂锅加入去离子水600-800ml，盖上盖子，浸泡30-40分钟；

步骤P3：用电陶炉作为热源，先武火(1800w)加热至沸，后文火(600w)保持微沸煎至300-350ml，趁热滤过；

步骤P4：滤液减压浓缩至50-55ml，预冻至结冰，冷冻干燥，研细，装袋，即得全方溶液。

4.根据权利要求2所述的一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法，其特征在于：所述阴性溶液的制备方法为：

分别取缺少芍药或甘草的芍药甘草汤冻干粉0.2-0.4g；将缺少芍药或甘草的芍药甘草汤冻干粉置于塞锥形瓶中，加入70％甲醇25-30ml，密封锥形瓶，称定重量；将锥形瓶加热回流1-1.5h，放冷，再次称定重量；用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得阴性溶液。

5.根据权利要求1所述的一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法，其特征在于：步骤二中的芍药甘草汤指标成分含量测定包括专属性试验、标准曲线绘制；

具体的，所述专属性试验为：

取供试品溶液和缺少芍药的阴性溶液以及缺少甘草的阴性溶液按照色谱条件进样，记录色谱图；

所述标准曲线绘制的曲线包括芍药苷标准曲线、甘草苷标准曲线、甘草酸标准曲线，具体的芍药苷标准曲线的绘制过程包括以下：

取芍药苷对照品，称定后加甲醇制成每1ml含580μg的芍药苷试验品溶液，分别吸取芍药苷对照品溶液0.4ml、0.8ml、1.0ml、1.5ml、3.0ml置5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；

将芍药苷试验品溶液连同芍药苷对照品溶液一同按照色谱条件进样测定，记录峰面积；以芍药苷的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线；

甘草苷标准曲线的绘制过程包括以下：

取甘草苷对照品，称定后加70％乙醇制成每1ml含303.5μg的甘草苷试验品溶液，分别吸取甘草苷对照品溶液0.3ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、3.0ml置5ml量瓶中，用70％乙醇稀释至刻度，摇匀；

将甘草苷试验品溶液连同甘草苷对照品溶液一同按照色谱条件进样测定，记录峰面积；以甘草苷的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线；

甘草酸标准曲线的绘制过程包括以下：

取甘草酸铵对照品，称定后加70％乙醇制成每1ml含771.5μg的甘草酸铵试验品溶液，分别吸取甘草酸铵对照品溶液0.4ml、0.6ml、1.0ml、1.5ml、3.0ml置5ml量瓶中，用70％乙醇稀释至刻度，摇匀；

将甘草酸试验品溶液连同甘草酸铵对照品溶液一同按照色谱条件进样测定，记录峰面积；以甘草酸的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线。

6.根据权利要求1所述的一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法，其特征在于：冻干粉含量测定具体表现为：

取X批冻干粉样品，制作供试品溶液，按照色谱条件进样测定，计算芍药苷、甘草苷和甘草酸的含量。

7.根据权利要求6所述的一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法，其特征在于：所述色谱条件具体为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，检测波长为237nm进行梯度洗脱。

8.根据权利要求1所述的一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法，其特征在于：芍药甘草汤特征图谱的建立的包括以下：

取X批冻干粉样品，制作供试品溶液，按照色谱条件进样测定，记录色谱图，统计特征峰的保留时间及相对保留时间；

参考指标选择相对保留时间及相对标准偏差，选取参照峰进行归一化值处理，对X批冻干粉样品运用SPSS 22.0软件进行聚类分析，以平方Euclidean距离为指标，组间联接法聚类。

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