CN112773831A - 一种芍药甘草药物组合物的制备方法及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种芍药甘草药物组合物的制备方法,所述制备方法为:取白芍、炙甘草,通过加水煎煮,滤过,滤液低温真空浓缩、冷冻干燥,收集干膏粉即用,或收集干膏粉后加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型。本发明制备方法进一步提高了芍药苷、甘草酸的含量及产品的出膏率。通过对药物组合物检测方法进行摸索,确定了最佳的检测方法,更好的控制了产品的质量。
Description
技术领域
本发明涉及制药及药品检测领域,具体涉及一种芍药甘草药物组合物的制备方法及其检测方法。
背景技术
芍药甘草汤出自东汉时期张仲景的《伤寒杂病论》辨太阳病脉证并治太阳病变证篇,由白芍、(炙)甘草两味药物组成。原文记载煎煮方法为:“芍药、甘草各四两,上两味,以水三升,煮取一升五合,去渣,分温再服。”依据《历代度量衡》及《中国历代度、量、衡制演变简表》对芍药甘草汤中“制法及用法”中的数据单位同现代的数据单位进行换算。一两为现今的15克,一升为现今的200mL,即芍药甘草汤煎煮工艺的“制法”可描述为取白芍、(炙)甘草饮片各60g,加水600mL,浸泡50min,加热煎煮至药液为300mL,滤弃药渣即得。根据经典名方目录中记载的方法,结合卫生部、国家中医药管理局《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药发〔2009〕3号)进行煎煮制备“芍药甘草汤物质基准”,“芍药甘草汤物质基准”的制备应贴近传统、遵循古方原则,本发明对芍药甘草组合物进行了研究,以期进一步提高有效成分的含量及更好的控制产品的质量。
本发明取白芍、炙甘草,以电子煎药罐加热,加水煎煮,滤过,滤液低温真空浓缩、冷冻干燥,收集干膏粉即用,或收集干膏粉后加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型。本发明制备方法进一步提高了芍药苷、甘草酸的含量及产品的出膏率。通过对药物组合物检测方法进行摸索,确定了最佳的检测方法,更好的控制了产品的质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种芍药甘草药物组合物的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种芍药甘草药物组合物的检测方法。
本发明所述芍药甘草药物组合物的制备方法如下:取白芍200~400份、炙甘草200~400 份,置于电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水2500~3300ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5~3h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为45℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.04MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在预冻温度: -20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型。
优选的,本发明所述芍药甘草药物组合物的制备方法如下:取白芍300份、炙甘草300份,置于电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水3000ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为55℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.06MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型。
本发明所述的药学上可接受的制剂为固体制剂或液体制剂。
本发明所述固体制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、冻干粉针剂。
本发明所述液体制剂为注射制剂、口服液。
本发明所述辅料没有限制,药学上接收即可。
本发明所述检测方法为:
性状:本品为黄色至棕黄色粉末,气微香,味微苦甜、酸而特殊;
鉴别:1)取本品粉末0.2~0.8g,加乙醇5~15ml,振摇3~8分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为供试品溶液,另取芍药苷对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液,照通则0502薄层色谱法试验,吸取供试品溶液、对照品溶液各3-10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以比例为40:5:10:0.2的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5~10%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝紫色斑点;
2)取本品及缺炙甘草阴性冻干粉0.5~l.5g,加水30~50ml,超声20~40分钟,滤过,用乙醚振摇提取2-3次,每次8~12ml,弃去乙醚液,水液用水饱和的正丁醇溶液振摇提取2~ 4次,每次15~25ml,合并正丁醇液,用氨试液振摇提取2~3次,每次20~40ml,合并氨试液,用盐酸调节pH值至3~4,再用乙酸乙酯振摇提取2~3次,每次20~40ml,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液,另取甘草饮片lg,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,同法制成对照药材溶液,再取甘草苷对照品,加60~80%乙醇制成每lml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液,照通则0502薄层色谱法试验,吸取供试品溶液、缺炙甘草阴性溶液、对照药材溶液、对照品溶液各5~10μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以比例为13:7:2三氯甲烷-甲醇-水为展开剂,展开,取出,晾干,喷以 5~10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色淸晰,置日光及365nm紫外光灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材、对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点及荧光斑点;
检查:水分通则0832第二法不得过12.0%;
浸出物:照中国药典2015版四部通则2201项醇溶性浸出物测定法下热浸法测定,浸出物为 15.0%~82.0%;
指纹图谱:照中国药典2015年版四部通则0512高效液相色谱法测定;
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱:
InertSustain-AQ-C18,以乙腈为流动相A,以0.1~0.5%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000;按规定的洗脱程序进行梯度洗脱,梯度洗脱程序如下:
梯度洗脱程序
参照物溶液的制备取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每 1ml含芍药苷60ug、甘草苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备取本品0.1-0.5g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇 15~25ml,称定重量,在功率240W,频率45kHz下超声处理20~40分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,记录 100min的色谱图,即得;
供试品指纹图谱中应分别呈现相应的参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算,供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.900;对照指纹图谱见图1。
含量测定:白芍、甘草照《中国药典》2015年版四部通则0512高效液相色谱法测定;
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相A,以 0.1~0.5%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为208~240nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000;按规定的梯度洗脱程序进行梯度洗脱;
梯度洗脱程序
对照品溶液的制备取芍药苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含芍药苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备取本品约0.1~0.3g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇10~30ml,称定重量,在功率240W,频率45kHz下超声处理20~40分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10uL,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品按干燥品计算,含芍药苷(C23H28O11)不低于34.00mg/g,甘草酸(C42H62O 16)不低于 16.00mg/g。
优选的,本发明所述的检测方法如下:
鉴别1)取本品粉末0.5g,加乙醇10ml,振摇5分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为供试品溶液,另取芍药苷对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液,照通则0502薄层色谱法试验,吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以比例为40:5:10:0.2的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝紫色斑点;
优选的,本发明所述的检测方法如下:
鉴别2)取品及缺炙甘草阴性冻干粉各lg,加水40ml,超声30分钟,滤过,用乙醚振摇提取2次,每次10ml,弃去乙醚液,水液用水饱和的正丁醇溶液振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用氨试液振摇提取2次,每次30ml,合并氨试液,用盐酸调节pH值至3~4,再用乙酸乙酯振摇提取2次,每次30ml,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液及缺炙甘草阴性冻干粉溶液,另取甘草饮片lg,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,同法制成对照药材溶液,再取甘草苷对照品,加70%乙醇制成每lml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液,照通则0502薄层色谱法试验,吸取上述供试品溶液、缺炙甘草阴性溶液、对照药材溶液、对照品溶液各10μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以比例为13:7:2三氯甲烷-甲醇-水为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色淸晰,置日光及365nm紫外光灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材、对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点及荧光斑点;
优选的,本发明所述指纹图谱的方法如下:
指纹图谱:照中国药典2015年版四部通则0512高效液相色谱法测定;
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱:
InertSustain-AQ-C18,以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000;按规定的程序进行梯度洗脱,梯度洗脱程序如下:
梯度洗脱程序
参照物溶液的制备取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每 1ml含芍药苷60ug、甘草苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备取本品约0.1g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇20ml,称定重量,在功率240W,频率45kHz下超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,记录 100min的色谱图,即得;
供试品指纹图谱中应分别呈现相应的参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算,供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.900;对照指纹图谱见图1。
本发明所述含量测定的方法如下:
含量测定:白芍、甘草照中国药典2015年版四部通则0512高效液相色谱法测定;
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000;按规定的程序进行梯度洗脱,梯度洗脱程序如下:
梯度洗脱程序
对照品溶液的制备取芍药苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含芍药苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备取本品约0.1g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇20ml,称定重量,在功率240W,频率45kHz下超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10uL,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品按干燥品计算,含芍药苷(C23H28O11)不低于34.00mg/g,甘草酸(C42H62O 16)不低于 16.00mg/g。
本发明与现有技术相比,具有以下有益效果:
1、本发明取白芍、炙甘草,以电子煎药罐加热,加水煎煮,滤过,滤液低温真空浓缩、冷冻干燥,收集干膏粉即用,或收集干膏粉后加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型。本发明制备方法进一步提高了芍药苷、甘草酸的含量及产品的出膏率。通过对药物组合物检测方法进行摸索,确定了最佳的检测方法,更好的控制了产品的质量。
2、本发明对明火及电子煎药罐两种加热方式进行考察,确定了以电子煎药罐进行加热,煎煮方便,芍药苷均值5187.58mg,甘草酸均值1895.92mg,出膏率9.52%。
3、本发明通过对煎煮时间的考察,确定了煎煮时间为1-3h,最佳煎煮时间为1.5h,提取液芍药苷含量达到了2.4234mg/mL,提取液甘草酸含量达到了1.0191mg/mL;转移率芍药苷 35.16%,转移率甘草酸30.11%,含固率66.67mg/mL。指标性成分的含量较高,转移率和含固率较好。
4、本发明通过对滤过方法考察,优选200目滤布过滤,澄明度澄清。
5、通过对浓缩方法考察,优选真空浓缩浓缩,优选药液与饮片总饮片量比为1﹕3的浸膏,提取液芍药苷含量达到了13.6049mg/mL,提取液甘草酸含量达到了8.2234mg/mL;转移率芍药苷29.3438%,转移率甘草酸27.7076%,含固率13.01%。含量及转移率高。
6、本发明通过对浓缩真空度的考察,真空度为-0.08MPa~-0.04MPa,优选为真空度为 -0.08MPa~-0.06MPa,提取液芍药苷含量达到了32.22mg/mL,提取液甘草酸含量达到了 8.2375mg/mL;转移率芍药苷27.82%,转移率甘草酸26.49%,含固率11.67%。含量及转移率高。
7、本发明通过对浓缩温度的考察,确定浓缩温度为:45℃~60℃,优选浓缩温度为:55℃~ 60℃,提取液芍药苷含量达到了16.4343mg/mL,提取液甘草酸含量达到了8.0583mg/mL;转移率芍药苷35.45%,转移率甘草酸26.53%,含固率26.53%。含量及转移率高。
8、本发明通过对干燥方式进行考察,优选冷冻干燥方式,冻干粉不发泡不融化、干膏粉质地疏松。
9、本发明通过对白芍鉴别项进行方法摸索,确定了最佳的鉴别方法,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝紫色斑点,阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点。通过对低温低湿、常温、高温高湿环境及不同厂家的硅胶G薄层板进行耐用性考察,结果不同影响因素下,此白芍薄层鉴别条件耐用性良好。
10、本发明通过对甘草进行薄层色谱方法的摸索,确定了最佳的鉴别方法,供试品色谱中,在与甘草对照药材和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,无斑点拖尾严重现象。通过对低温低湿、常温、高温环境进行耐用性考察,结果不同影响因素下,此薄层鉴别条件耐用性良好。
11、本发明通过对指纹图谱方法进行摸索,确定各峰之间的分离效果较好,精密度、稳定性、重复性等良好。
12、从指纹图谱上分析,峰2、3、7为白芍色谱峰,峰1、5、6、8、9、10为甘草色谱峰。暂以3号峰为参照峰计算相对保留时间,结果表明、药材、饮片、提取液、干膏粉色谱图中共有峰,其相对保留时间RSD小于2.0%,故所确定的物质基准制备工艺稳定可行。
附图说明
图1对照指纹图谱(10个共有峰中峰3(S):芍药苷;峰6:甘草苷;峰10:甘草酸)。
图2芍药甘草汤物质基准工艺验证指纹图谱对比图(1、SYGCT-20181201T;2、SYGCT-20181202T; 3、SYGCT-20181203T;4、SYGCT-20181201N;5、SYGCT-20181202N;6、SYGCT-20181203N;7、 SYGCT-20181201D;8、SYGCT-20181202D;9、SYGCT-20181203D;10、白芍药材溶液;11、甘草药材溶液;12、白芍饮片溶液;13、芍药苷、甘草酸混合对照品)。
图3不同批次对应实物(冻干粉)性状。
图4指纹图谱色谱图-1。
图5指纹图谱色谱图-2。
图6指纹图谱色谱图-3。
图7指纹图谱色谱图-4。
图8不同提取溶媒指纹图谱测定结果(S1:乙醇提取;S2:甲醇提取;S3:稀乙醇提取;S4:空白)。
图9指纹图谱饮片归属色谱图(S1:芍药甘草汤物质基准;S2:甘草饮片;S3:白芍饮片; S4:芍药苷、甘草苷、甘草酸混合对照品;S5:空白溶剂)。
图10整体性考察色谱图(S1:供试品溶液;S2:混合对照品溶液;S3:空白溶剂)。
图11指纹图谱精密度测定色谱图。
图12指纹图谱稳定性测定色谱图(S1:SYGCT-20180504D-0h;S2:SYGCT-20180504D-3h; S3:SYGCT-20180504D-6h;S4:SYGCT-20180504D-9h;S5:SYGCT-20180504D-12h; S6:SYGCT-20180504D-24h)。
图13指纹图谱重复性测定色谱图(S1:SYGCT-20180504D-1;S2:SYGCT-20180504D-2;
S3:SYGCT-20180504D-3;S4:SYGCT-20180504D-4;S5:SYGCT-20180504D-5;
S6:SYGCT-20180504D-6)。
图14不同批次物质基准指纹图谱共有模式图-1(R对照图谱;S2、SYGCT-20180501D;S3、 SYGCT-20180502D;S4、SYGCT-20180503D;S5、SYGCT-20180504D;S6、SYGCT-20180505D;S7、 SYGCT-20180506D;S8、SYGCT-20180507D;S9、SYGCT-20180508D;
S10、SYGCT-20180509D;S11、SYGCT-20180510D;S12、SYGCT-20180511D;S13、SYGCT-20180512D;S14、SYGCT-20180513D;S15、SYGCT-20180514D;S16、SYGCT-20180515D)。图15专属性考察色谱图(S1:芍药苷、甘草酸铵、甘草苷混合对照品;S2:供试品溶液;S3:缺白芍阴性样品;S4:缺甘草阴性样品)。
具体实施方式
下面通过具体实施例,对本发明的技术方案作进一步地具体说明。
实施例1制备方法
取白芍300g、炙甘草300g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水3000ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为55℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.06MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1~1:4) 混合均匀,制成颗粒,即得颗粒剂。
实施例2制备方法
取白芍300g、炙甘草300g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水3000ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为55℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.06MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1~1:4) 混合均匀,装入胶囊,即得胶囊剂。
实施例3制备方法
取白芍300g、炙甘草300g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水3000ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为55℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.06MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1~1:4) 混合均匀,压片,即得片剂。
实施例4制备方法
取白芍300g、炙甘草300g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水3000ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为55℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.06MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1~1:4) 混合均匀,干燥,制成丸剂。
实施例5制备方法
取白芍300g、炙甘草300g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水3000ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为55℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.06MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入30倍量的注射用水,混匀,过滤,灭菌,得注射剂。
实施例6制备方法
取白芍200g、炙甘草400g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水2500ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为45℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.06MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1~1: 4)混合均匀,制成颗粒,即得颗粒剂。
实施例7制备方法
取白芍200g、炙甘草400g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水2500ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为45℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.06MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1~1:4)混合均匀,装入胶囊,即得胶囊剂。
实施例8制备方法
取白芍200g、炙甘草400g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水2500ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为45℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.06MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1~1: 4)混合均匀,压片,即得片剂。
实施例9制备方法
取白芍200g、炙甘草400g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水2500ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为45℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.06MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1~1: 4)混合均匀,干燥,制成丸剂。
实施例10制备方法
取白芍200g、炙甘草400g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水2500ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为45℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.06MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入33倍量的注射用水,混匀,过滤,灭菌,得注射剂。
实施例11制备方法
取白芍400g、炙甘草200g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水3300ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮3h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为45℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.04MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1~1:4) 混合均匀,制成颗粒,即得颗粒剂。
实施例12制备方法
取白芍400g、炙甘草200g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水3300ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮3h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为45℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.04MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1~1:4) 混合均匀,装入胶囊,即得胶囊剂。
实施例13制备方法
取白芍400g、炙甘草200g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水3300ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮3h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为45℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.04MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1~1:4) 混合均匀,压片,即得片剂。
实施例14制备方法
取白芍400g、炙甘草200g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水3300ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮3h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为45℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.04MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1~1:4) 混合均匀,干燥,制成丸剂。
实施例15制备方法
取白芍400g、炙甘草200g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水3300ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮3h,200目滤布趁热滤过,滤液低温真空(温度为45℃~60℃、真空度:-0.08MPa~-0.04MPa)浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入31倍量的注射用水,混匀,过滤,灭菌,得注射剂。
实施例1-15按以下实施例任一检测方法检测:
实施例16
【性状】本品为黄色至棕黄色粉末,气微香,味微苦甜、酸而特殊。
【鉴别】(1)取本品粉末0.5g,加乙醇10ml,振摇5分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取芍药苷对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验,吸取上述两种溶液各10ul,分别点于同一硅胶G 薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝紫色斑点。
(2)取本品及缺甘草阴性冻干粉lg,加水40ml,超声30分钟,滤过,用乙醚振摇提取2次,每次10ml,弃去乙醚液,水液用水饱和的正丁醇溶液振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用氨试液振摇提取2次,每次30ml,合并氨试液,用盐酸调节pH值至3~4,再用乙酸乙酯振摇提取2次,每次30ml,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液及缺甘草阴性冻干粉溶液。另取甘草饮片lg,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,同法制成对照药材溶液。再取甘草苷对照品,加70%乙醇制成每lml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验,吸取上述四种溶液各10μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色淸晰,置日光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材、对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点及荧光斑点。
【检查】水分不得过12.0%(通则0832第二法)。
【浸出物】照醇溶性浸出物测定法(《中国药典》2015版四部通则2201)项下热浸法测定,浸出物为15.0%~82.0%。
【指纹图谱】照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱:InertSustain-AQ-C18,以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000。按规定的梯度洗脱程序进行洗脱。
梯度洗脱程序
参照物溶液的制备取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每 1ml含芍药苷60ug、甘草苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。
供试品溶液的制备取本品约0.1g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,记录 100min的色谱图,即得。
供试品指纹图谱中应分别呈现相应的参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算,供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.900,对照指纹图谱见图1。
【含量测定】白芍、甘草照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相A,以 0.1%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000。按下规定的梯度洗脱程序进行洗脱。
梯度洗脱程序
对照品溶液的制备取芍药苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含芍药苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。
供试品溶液的制备取本品约0.1g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10uL,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品按干燥品计算,含芍药苷(C23H28O11)不低于34.00mg/g,甘草酸(C42H62O 16)不低于 16.00mg/g。
【包装】真空包装袋密封。
【贮存】置阴凉干燥处贮存。
实施例17
【性状】本品为黄色至棕黄色粉末,气微香,味微苦甜、酸而特殊。
【鉴别】(1)取本品粉末0.2g,加乙醇5ml,振摇3分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1ml 使溶解,作为供试品溶液。另取芍药苷对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验,吸取上述两种溶液各10ul,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝紫色斑点。
(2)取本品及缺甘草阴性冻干粉各0.5g,加水30ml,超声20分钟,滤过,用乙醚振摇提取2次,每次8ml,弃去乙醚液,水液用水饱和的正丁醇溶液振摇提取2次,每次20ml,合并正丁醇液,用氨试液振摇提取2次,每次20ml,合并氨试液,用盐酸调节pH值至3~4,再用乙酸乙酯振摇提取2次,每次20ml,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液及缺甘草阴性冻干粉溶液。另取甘草饮片lg,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,同法制成对照药材溶液。再取甘草苷对照品,加70%乙醇制成每lml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验,吸取上述四种溶液各10μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色淸晰,置日光及紫外光灯(365nm) 下检视。供试品色谱中,在与对照药材、对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点及荧光斑点。
【检查】水分不得过12.0%(通则0832第二法)。
【浸出物】照醇溶性浸出物测定法(《中国药典》2015版四部通则2201)项下热浸法测定,浸出物为15.0%~82.0%。
【指纹图谱】照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱:InertSustain-AQ-C18,以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000。按下规定的梯度洗脱程序进行洗脱。
梯度洗脱程序
参照物溶液的制备取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每 1ml含芍药苷60ug、甘草苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。
供试品溶液的制备取本品约0.1g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)20分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,记录 100min的色谱图,即得。
供试品指纹图谱中应分别呈现相应的参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算,供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.900,对照指纹图谱见图1。
【含量测定】白芍、甘草照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相A,以 0.1%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为208nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000。按规定的梯度洗脱程序进行洗脱。
梯度洗脱程序
对照品溶液的制备取芍药苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含芍药苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。
供试品溶液的制备取本品约0.1g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇10ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10uL,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品按干燥品计算,含芍药苷(C23H28O11)不低于34.00mg/g,甘草酸(C42H62O 16)不低于 16.00mg/g。
【包装】真空包装袋密封。
【贮存】置阴凉干燥处贮存。
实施例18
【性状】本品为黄色至棕黄色粉末,气微香,味微苦甜、酸而特殊。
【鉴别】(1)取本品粉末0.8g,加乙醇15ml,振摇8分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取芍药苷对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验,吸取上述两种溶液各3μl,分别点于同一硅胶G 薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝紫色斑点。
(2)取本品及缺甘草阴性冻干粉各1.5g,加水50ml,超声40分钟,滤过,用乙醚振摇提取3次,每次12ml,弃去乙醚液,水液用水饱和的正丁醇溶液振摇提取4次,每次25ml,合并正丁醇液,用氨试液振摇提取3次,每次40ml,合并氨试液,用盐酸调节pH值至3~4,再用乙酸乙酯振摇提取3次,每次40ml,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液及缺甘草阴性冻干粉溶液。另取甘草饮片lg,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,同法制成对照药材溶液。再取甘草苷对照品,加70%乙醇制成每lml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验,吸取上述四种溶液各5μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色淸晰,置日光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材、对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点及荧光斑点。
【检查】水分不得过12.0%(通则0832第二法)。
【浸出物】照醇溶性浸出物测定法(《中国药典》2015版四部通则2201)项下热浸法测定,浸出物为15.0%~82.0%。
【指纹图谱】照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱:InertSustain-AQ-C18,以乙腈为流动相A,以0.5%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000。按规定的梯度洗脱程序进行洗脱。
梯度洗脱程序
参照物溶液的制备取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每 1ml含芍药苷60ug、甘草苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。
供试品溶液的制备取本品约0.5g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)40分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,记录 100min的色谱图,即得。
供试品指纹图谱中应分别呈现相应的参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算,供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.900。对照指纹图谱见图1。
【含量测定】白芍、甘草照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相A,以0.5%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为248nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000。按规定进行梯度洗脱。
梯度洗脱程序
对照品溶液的制备取芍药苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含芍药苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。
供试品溶液的制备取本品约0.3g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇30ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)40分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10uL,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品按干燥品计算,含芍药苷(C23H28O11)不低于34.00mg/g,甘草酸(C42H62O 16)不低于 16.00mg/g。
【包装】真空包装袋密封。
【贮存】置阴凉干燥处贮存。
为了进一步验证本发明可行性,发明人进行了一系列的试验,具体如下:
1芍药甘草汤物质基准研究
1.1工艺描述和流程图
1.1.1处方
白芍60g,(炙)甘草60g
1.1.2物质基准的制法
以上两味药,将处方量放大五倍,即白芍300g,(炙)甘草300g,加水3000ml,浸泡50min,煎煮1.5h,200目滤布过滤,滤液低温真空浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,低温冷冻干燥,即得物质基准对应实物,置低温干燥处储存。
1.1.4操作过程
1.1.4.1煎煮次数及每煎饮片量
依据原文记载,煎煮次数为一次,煎煮饮片量为日处方量的五倍。为保持与古籍记载工艺的一致性,确定煎煮次数为一次,每煎饮片量为日处方量的五倍。
1.1.4.2饮片前处理
芍药甘草汤处方中含有两味药,分别为白芍、甘草。方中白芍饮片规格为2mm的薄片,(炙) 甘草饮片规格为2~5mm的厚片,小火烤至焦黄褐色。
1.1.4..3煎煮过程
(1)加热方式考察
以提取液中的芍药苷、甘草酸的提取总量及出膏率为考察指标,对明火和电子煎药罐两种加热方式进行单因素对比试验研究。从煎煮时间、出膏率、指标成分总量综合分析,两种加热方式存在差异。
(2)煎煮时间考察
由于处方原文中煎煮终点为提取液体积,而以提取液体积作为煎煮终点在煎煮过程中操作不便,同时以固定加热方式,故对煎煮时间代替提取液体积作为煎煮终点进行研究。
1.1.4..4滤过、浓缩与干燥工艺考察
对提取液采用常压滤过工艺考察,以药液澄明度为指标。结果:提取液采用200目滤布趁热过滤,滤液澄清,无杂质。确定滤过方式为:200目滤布常压趁热过滤。
由于提取液体积约为1500ml,故对提取液采用常压浓缩和减压浓缩进行考察,以浓缩液中芍药苷、甘草酸的总量及转移率为考察指标。结果:含量无显著差异,减压浓缩略微比常压浓缩含量及转移率偏高一点。确定浓缩方式为:减压浓缩,浓缩至药液与饮片总饮片量比为1 ﹕3的浸膏。
对浓缩液进行冷冻干燥,浓缩液经过冷冻干燥后,能够收集到疏松的干膏粉,冷冻干燥方式可行。
1.1.4..5包装
内包材真空密封袋,密封;
1.1.4..6贮存
置阴凉库保存。
1.1.5工艺参数确定的依据
根据经典名方目录中记载的方法:白芍四两、(炙)甘草四两,右二味(口服)咀,以水三升,煮取一升半,去滓,分温再服之。本研究采用电子煎药罐煎煮,以出膏率、芍药苷、甘草酸提取总量、指纹图谱为指标,研究物质基准饮片前处理、加热方式、煎煮时间、滤过及干燥等工艺相关参数,从而确定芍药甘草汤物质基准工艺。
1.1.5.1前处理
芍药甘草汤处方中含有两味药,分别为白芍、(炙)甘草,均为饮片规格,适合汤剂的煎煮,煎煮前将甘草用小火烤至焦黄褐色,后进行煎煮。
1.1.5.2煎煮过程
工艺研究考察明火及电子煎药罐两种加热方式,结果从煎煮时间、出膏率、芍药苷、甘草酸总量综合分析,两种加热方式差异不大,由于电子煎药罐更为便捷,故选择加热方式为电子煎药罐。对煎煮时间代替提取液体积作为煎煮终点进行研究,确定芍药甘草汤物质基准煎煮时间为优选为1.5h。
1.1.5.3滤过、浓缩、干燥过程
确定固液分离采用200目滤布趁热滤过。提取液体积约为1500ml,减压浓缩,浓缩至药液与饮片总饮片量比为1﹕3的浸膏,浓缩液经过冷冻干燥(预冻温度:-20~-45℃,冷冻干燥温度-50~-70℃,真空度<300Pa)后,能够收集到疏松的干膏粉,确定优选冷冻干燥方式可行。
1.1.5.4工艺验证过程
通过对三批物质基准相应批次的药材、饮片、提取液、浓缩液、物质基准取样,测定指标成分含量及指纹图谱,从芍药苷、甘草酸总量上分析,三批验证提取液与物质基准数据均基本平行,且工艺过程中物质传递损失较小,从指纹图谱上分析,药材、饮片、提取液、物质基准色谱图中共有峰,其相对保留时间RSD小于2.0%。
1.1.5.5包装
内包材真空密封袋,密封。
1.1.5.6贮存
置阴凉库保存。
1.1.6主要设备及型号
表1设备型号
1.2工艺研究
1.2.1前处理
根据古籍原文及考证结果,本处方所用饮片由药材按相应的炮制标准制得,白芍饮片规格为2mm的薄片,甘草饮片规格为2~5mm的厚片,甘草小火烤至焦黄褐色,研究用饮片信息见表2。
表2研究用饮片信息
1.2.2煎煮
1.2.2.1吸水性考察
因白芍药用部位为根,(炙)甘草药用部位为根及根茎部分,都为极易吸水,故进行药材吸水性试验。
实验方法:取白芍饮片、(炙)甘草饮片各60g,混合均匀,加10倍量的水(即1200ml),定时过滤,称量并记录过滤药材的重量,计算不同时间混合药材的吸水重量。结果见表3:
表3吸水性试验考察表
试验结果表明:混合药材的浸泡时间在50min后吸水重量趋于稳定,故将芍药甘草汤药材的提取浸泡时间定为50min。
1.2.2.2加热方式考察
古代煎煮方式为明火煎煮,现拟用电炉作为明火加热方式,同时考虑到电子煎药罐加热方式通过功率控制加热效率,其控制火力作用更稳定,故拟采用出膏率、芍药苷、甘草苷、甘草酸总量为指标,考察明火与电子煎药罐加热方式,若两种加热方式结果无差异,则优先选择电子煎药罐作为加热方式。
称取4份五倍日处方量饮片(白芍300g,(炙)甘草300g),加水3000ml,置于9L电子煎药罐中,加盖煎煮,武火煎煮至沸,文火煎煮至1500ml,提取液用200目滤布滤过,记录提取液体积;明火和电子煎药罐(武火为2200W,文火为400W)煎煮均制备两份提取液,按照指标成分的测定方法,测定提取液中芍药苷、甘草酸含量、出膏率,考察明火和电子煎药罐(武火为2200W,文火为400W)加热方式对指标性成分的影响。结果见表4。中间体(提取液)出膏率测定方法:精密量取提取液20ml,置已干燥至恒重的蒸发皿W1中,在水浴上蒸干后,于105℃干燥3小时,置干燥器中冷却30分钟,迅速精密称定重量W2。
表4加热方式考察结果
试验结果表明,明火及电子煎药罐两种加热方式,含量测定指标测定总量无显著性差异,但煎煮时间明火较电子煎药罐时间短,出膏率有差别,综合分析,两种加热方式存在差异较小,基于煎煮方便,优先选择电子煎药罐煎煮。
1.2.2.3煎煮时间的考察
芍药甘草汤出自东汉时期张仲景的《伤寒杂病论》辨太阳病脉证并治太阳病变证篇,由白芍、(炙)甘草两味药物组成。原文记载煎煮方法为:“芍药、甘草各四两,上两味,以水三升,煮取一升五合,去渣,分温再服。”依据《历代度量衡》及《中国历代度、量、衡制演变简表》对芍药甘草汤中“制法及用法”中的数据单位同现代的数据单位进行换算。一两为现今的15克,一升为现今的200mL,即芍药甘草汤煎煮工艺的“制法”可描述为取白芍、(炙) 甘草饮片各60g,加水600mL,浸泡50min,加热煎煮至药液为300mL,滤弃药渣即得。根据经典名方目录中记载的方法,结合卫生部、国家中医药管理局《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药发〔2009〕3号)进行煎煮制备“芍药甘草汤物质基准”,“芍药甘草汤物质基准”的制备应贴近传统、遵循古方原则。加热煎煮容器以电子煎药罐为宜,遵循古方的煎煮方法,已规定加水量及煎煮次数,故对煎煮时间进行考察。
将原处方量放大五倍,分别取白芍饮片(BS-MC-2017112201Y)、(炙)甘草饮片(GC-ZY-2017110301Y)各300g,按煎煮时间因素表进行试验,见表5:
表5煎煮时间因素表
各因素的取值以芍药苷和甘草酸的转移率作为考察指标,详细结果见表6:
表6煎煮时间转移率考察
结论:综上提取液含量、转移率、含固率可知,煎煮1.5h药液中指标性成分的含量较高,转移率和含固率较好,且原文记载的煎煮方法(煎煮至加水体积的一半)与煎煮1.5h煎液的体积量相接近,故芍药甘草汤最佳煎煮时间为1.5h。
1.2.2.4煎煮工艺总结
综上,暂定芍药甘草汤物质基准煎煮工艺为:取白芍300g,(炙)甘草300g加水3000ml,置于9L电子煎药罐中,加盖煎煮,武火煎煮至沸,文火煎煮1.5h,200目滤布滤过,即得。
1.2.3滤过、浓缩与干燥
1.2.3.1滤过方法考察
为避免有效成分在工业生产中的损失,故对过滤方法进行考察。
试验方法:分别取3份白芍饮片(BS-MC-2017112201Y)、(炙)甘草饮片(GC-ZY-2017110301Y) 各300g,加水3000ml,浸泡50min,加热煎煮1.5h(即药液为加水体积的一半),分别不过滤、2层纱布过滤、200目滤布过滤,分别计算3种药液的含固率,结果见表7:
表7过滤实验结果
结论:过滤的方法对药液澄明度无显著差异,但因原液和2层纱布过滤的溶液易沉淀,故“芍药甘草汤物质基准”的最佳过滤方法选用200目滤布过滤。
8.2.3.2浓缩方法考察
为保证药液中的有效成分损失最小,参阅《中药提取液浓缩工艺和设备现状及问题分析》,结合环保节能降耗及企业的实际情况,故采用常压加热浓缩和真空低温浓缩两种方法进行考察。
实验方法:分别取2份白芍饮片(BS-MC-2017112201Y)、(炙)甘草饮片(GC-ZY-2017110301Y) 各300g,加水3000ml,浸泡50min,加热煎煮1.5h(药液为加水量的一半),分别过滤,将两份滤液分别用常压和真空两种方法进行浓缩,浓缩至200mL(总饮片量的三分之一),以便于下一步工序的操作。分别计算2种浓缩液的含固率及芍药苷和甘草酸的含量,各因素的取值以芍药苷和甘草酸的转移率作为考察指标,结果见表8:
表8浓缩方法考察数据
试验结果表明:常压浓缩与真空浓缩相比较,真空浓缩略微比常压浓缩含量及转移率偏高一点。两份浓缩液的含固率真空浓缩方法的略高于常压浓缩,而常压浓缩所需时间为10h,真空浓缩所需时间为3h,因考虑到浓缩时间及环保节能,故采用真空的方法进行浓缩,浓缩至药液与饮片总饮片量比为1﹕3的浸膏为最佳浓缩方式。
1.2.3.3浓缩真空度的考察
在确定了浓缩方法为低温真空浓缩之后,真空度的高低是否会对有效成分产生影响,所以现对真空度进行考察,进一步确定浓缩工艺参数,结合环保节能降耗和企业实际情况,确保浓缩过程中有效成分损失最小,故采用减压旋蒸浓缩法对“芍药甘草汤物质基准”进行浓缩,对浓缩的真空度进行考察。
实验方法:分别取3份白芍饮片(BS-MC-2017112201Y)、(炙)甘草饮片(GC-ZY-2017110301Y) 各300g,加水3000ml,浸泡50min,加热煎煮1.5h(药液为加水量的一半),分别过滤,三份滤液分别采用真空度为-0.04MPa、-0.06MPa和-0.08MPa三种方法进行浓缩,浓缩至200mL (总饮片量的三分之一),以便于下一步工序的操作。分别计算3种浓缩液的含固率及芍药苷和甘草酸的含量,各因素的取值以芍药苷和甘草酸的转移率作为考察指标,结果见表9:
表9浓缩真空度考察数据
试验结果表明:真空度对含固率无显著影响,真空度-0.04MPa、-0.06MPa和-0.08MPa的浓缩所用时间分别为7h、4h和3h,真空度越大所用时间就越少。芍药苷的含量和转移率最大为-0.06MPa,甘草酸的含量和转移率在-0.08MPa时含量和转移率为最大,且都比-0.04MPa的要高,因考虑到浓缩时间及环保节能和有效成分最大程度的保留,故优选采用真空度为 -0.08MPa~-0.06MPa的方法进行浓缩,浓缩至药液与饮片总饮片量比为1﹕3的浸膏。
1.2.3.4浓缩温度的考察
减压旋蒸浓缩法在浓缩过程中,浓缩温度的高低是否会对有效成分产生影响,对浓缩过程的耗能影响有多大都需要进一步进行考察,所以现对真空浓缩过程中的浓缩温度进行考察,进一步确定浓缩工艺参数,低温浓缩对有效成分的保留具有重要的意义,故本试验确定45℃、 50℃、55℃和60℃为考察温度界限值。
实验方法:分别取4份白芍饮片(BS-MC-2017112201Y)、(炙)甘草饮片(GC-ZY-2017110301Y) 各300g,加水3000ml,浸泡50min,加热煎煮1.5h(药液为加水量的一半),分别过滤,将所得4份滤液分别采用温度为45℃、50℃、55℃和60℃四种方法进行浓缩,浓缩至200mL(总饮片量的三分之一),以便于下一步工序的操作。分别计算4种浓缩液的含固率及芍药苷和甘草酸的含量,各因素的取值以芍药苷和甘草酸的转移率作为考察指标,结果见表10:
表10浓缩温度考察数据
试验结果表明:温度对含固率无显著影响,温度为45℃、50℃、55℃和60℃的浓缩所用时间分别为8h、6h、4h和3h,温度越低所用时间越长。浓缩温度对芍药苷和甘草酸的含量也无显著影响。所以,在低温真空浓缩条件下时间越短越好,故采用温度为55℃~60℃的方法进行浓缩,浓缩至药液与饮片总饮片量比为1﹕3的浸膏为最佳。
1.2.3.5干燥
取浓缩工艺考察液进行冷冻干燥,(预冻温度:-20~-50℃,冷冻干燥温度-45~-60℃,真空度<300Pa),观察干燥情况,结果见表11。
表11物质基准工艺考察结果
综上所述:暂定芍药甘草汤物质基准最佳制备工艺为:取白芍300g、(炙)甘草300g,置于9L电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水3000ml,加盖煎煮,武火煮沸转为文火煎煮保持微沸,煎煮1.5h,200目滤布趁热滤过,浓缩真空度为-0.08MPa~-0.06MPa,浓缩温度为 55℃~60℃,浓缩至药液与饮片总饮片量比为1﹕3的浸膏,经冷冻干燥,收集干膏粉,即得。
1.2.3.6相关工艺参数
根据“经典名方物质基准”制作的各工序步骤,将“芍药甘草汤物质基准”制备的相关质量控制参数汇总如下表12。
表12质量控制参数
“芍药甘草汤物质基准”的制备工艺参数、质量控制指标详见上表,芍药甘草汤大生产过程中的工艺参数与质量控制指标均参照以上数据进行调整。
1.2.4关键工艺步骤和中间体
1.2.4.1工艺验证样品制备
平行称取3份饮片白芍300g白芍饮片(BS-MC-2017112201Y)、(炙)甘草饮片(GC-ZY-2017110301Y),加水3000ml,置于9L电子煎药罐中,加盖煎煮,武火煎煮至沸,文火煎煮时间1.5h,煎煮至约1500ml,200目滤布趁热滤过,滤液留样50ml,其余滤液减压浓缩,浓缩液留样50ml,其余浓缩液经冷冻干燥。(预冻温度:-20~-45℃,冷阱温度:-50~ -70℃,真空度:<300Pa),收集干膏粉,计算出膏率。取样,测定干膏粉中水分、浸出物、芍药苷、甘草酸含量,并分别计算工艺过程中含量转移率。另按照上述工艺,进行单味饮片及药材提取液制备,进行指纹图谱测定。
1.2.4.2工艺验证样品测定
结果见表13~14,图2:
表13芍药甘草汤物质基准工艺验证检测结果
表14芍药甘草汤物质基准工艺验证相对保留时间结果
样品名称 | l | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
白芍药材 | / | 0.996 | 0.995 | / | / | / | 0.997 | / | / | / |
甘草药材 | 1.002 | / | / | / | 0.993 | 0.992 | / | 0.996 | 0.995 | 1.001 |
白芍饮片 | / | 0.992 | 0.993 | / | / | / | 0.996 | / | / | / |
提取液1 | 1.003 | 1.000 | 1.000 | 0.983 | 0.985 | 0.989 | 0.982 | 0.978 | 0.986 | 1.003 |
提取液2 | 1.003 | 1.000 | 1.000 | 0.994 | 0.995 | 0.995 | 0.991 | 0.989 | 0.994 | 1.003 |
提取液3 | 1.003 | 1.001 | 1.000 | 0.993 | 0.994 | 0.995 | 0.990 | 0.988 | 0.993 | 1.003 |
浓缩液1 | 1.002 | 1.001 | 1.000 | 0.987 | 0.989 | 0.993 | 0.986 | 0.982 | 0.990 | 1.002 |
浓缩液2 | 1.002 | 1.001 | 1.000 | 0.987 | 0.989 | 0.992 | 0.985 | 0.982 | 0.989 | 1.002 |
浓缩液3 | 1.002 | 1.001 | 1.000 | 0.986 | 0.988 | 0.992 | 0.984 | 0.981 | 0.988 | 1.002 |
物质基准1 | 1.001 | 1.000 | 1.000 | 0.995 | 0.996 | 0.997 | 0.993 | 0.993 | 0.995 | 1.001 |
物质基准2 | 1.001 | 1.001 | 1.000 | 0.993 | 0.995 | 0.996 | 0.992 | 0.992 | 0.994 | 1.001 |
物质基准3 | 1.001 | 1.001 | 1.000 | 0.991 | 0.993 | 0.995 | 0.991 | 0.990 | 0.994 | 1.001 |
平均值 | 1.002 | 0.999 | 0.999 | 0.990 | 0.992 | 0.994 | 0.990 | 0.987 | 0.992 | 1.002 |
RSD(%) | 0.08 | 0.27 | 0.24 | 0.40 | 0.35 | 0.23 | 0.47 | 0.58 | 0.31 | 0.08 |
1.2.4.3工艺确定
从煎煮体积角度分析,三批工艺验证中间体体积均值为1263ml,与原文考证终点1500ml 接近,证明工艺煎煮时间确定合理。
从芍药苷、甘草酸总量上分析,三批验证提取液与干膏粉数据均基本平行,且工艺过程中物质传递损失较小;从浸出物、水分上分析,三批验证干膏粉无明显差异。
从指纹图谱上分析,峰2、3、7为白芍色谱峰,峰1、5、6、8、9、10为甘草色谱峰。暂以3号峰为参照峰计算相对保留时间,结果表明、药材、饮片、提取液、干膏粉色谱图中共有峰,其相对保留时间RSD小于2.0%,故所确定的物质基准制备工艺稳定可行。
综上,确定最佳物质基准工艺为:取白芍300g、(炙甘草)300g,置于9L电子煎药罐中,加水3000ml,加热煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5h,200目滤布趁热滤过,滤液在温度为55℃~60℃、真空度为-0.08MPa~-0.06MPa条件下真空浓缩至与饮片量比为1:3的浸膏,浸膏经冷冻干燥(预冻温度:-20~-50℃,冷冻干燥温度-50~-70℃,真空度<300Pa),收集干膏粉即得。
1.2.4.4多批次物质基准的制备
目前饮片以5个产地,不少于15个批次为原则进行收集;处方中白芍收集安徽省涡阳县、利辛县、蒙城县、谯城区大寺镇、谯城区十九里镇,甘草收集甘肃定西、甘肃兰州、甘肃张掖、新疆哈密和内蒙东胜5个产地,每个产地3批,制备15批次物质基准。15批饮片排序组合结果见下表15。
表15不同批次物质基准投料汇总
编号 | 白芍饮片批号 | 浸出物测定值(%) | (炙)甘草饮片批号 |
1 | BS-GY-2017112101Y | 31.0 | GC-DX-2017110401Y |
2 | BS-GY-2017112102Y | 34.1 | GC-DX-2017110402Y |
3 | BS-GY-2017112103Y | 33.2 | GC-DX-2017110403Y |
4 | BS-DS-2017112101Y | 33.1 | GC-ZY-2017110301Y |
5 | BS-DS-2017112102Y | 32.1 | GC-ZY-2017110302Y |
6 | BS-DS-2017112103Y | 30.1 | GC-ZY-2017110303Y |
7 | BS-SJL-2017112101Y | 31.0 | GC-LZ-2017103101Y |
8 | BS-SJL-2017112102Y | 34.2 | GC-LZ-2017103102Y |
9 | BS-SJL-2017112103Y | 31.9 | GC-LZ-2017103103Y |
10 | BS-MC-2017112201Y | 27.6 | GC-DS-2017110801Y |
11 | BS-MC-2017112202Y | 27.6 | GC-DS-2017110802Y |
12 | BS-MC-2017112203Y | 28.7 | GC-DS-2017110803Y |
13 | BS-LX-2017112201Y | 36.0 | GC-HM-2017110601Y |
14 | BS-LX-2017112202Y | 34.7 | GC-HM-2017110602Y |
15 | BS-LX-2017112203Y | 34.4 | GC-HM-2017110603Y |
注:编号1~15,即为15个组合方式
按照确定工艺,采用5倍日处方量进行投料,提取、浓缩、冷冻干燥。得到15批物质基准对应实物,15批次物质基准出膏率测定结果见下表16,测定范围为6.72%~10.88%,平均值为8.19%,确定物质基准出膏率范围为4.00%~12.00%。
表16多批次物质基准批次信息
1.3.3.2分析方法的验证
列入标准项目的分析方法学验证,按照现行版《中国药典》中有关的指导原则执行,方法学验证资料如下:
(1)性状
通过对15批对应实物(干膏粉)的实际性状观察,记录,结果见表16,图3:
表16性状鉴别结果结论:根据15批次对应实物(干膏粉)样品的实际观察情况,暂定本品为黄色粉末,气
微香,味微苦甜、酸而特殊。
(2)鉴别
本品由两味中药组成,系用水煎煮工艺制成的复方制剂,选用了专属性强,快速、简便、重现性好的薄层鉴别方法,对方中白芍、甘草的主要特征成分进行鉴别试验研究。结果概述如下:
①白芍
白芍中主要含有单萜及其苷类、三萜类、黄酮、鞣质、多糖、挥发油等。主要含有芍药苷,根据以上化学成分对白芍进行如下薄层摸索实验。
a建立薄层色谱方法
方法一:参照《中国药典》2015版一部白芍【鉴别】项进行方法摸索
取本品粉末0.5g,加乙醇10ml,振摇5分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为供试品溶液。取缺白芍阴性样品0.5g,照供试品溶液同法制得阴性样品溶液。另取白芍对照药材1g,同法制成对照药材溶液。再取芍药苷对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015版四部通则0502)试验。吸取上述各种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)
为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰。
结果分析:供试品色谱中,在与对照药材、对照品相应的位置上,显相同的斑点,且阴性无干扰。以芍药苷为对照品,以白芍对照药材溶液作为对照,在日光下检视,方法可行,但供试品、对照品及对照药材溶液斑点较浅,故下一步对供试品、对照品及对照药材溶液点样量进行摸索。
方法二:点样量摸索
吸取“方法一”制备的三种样品溶液,将芍药苷对照品溶液、白芍饮片溶液的点样量增加至10μl,阴性样品的点样量为5μl,供试品点样量变为3μl,5μl和10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)为展开剂展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰。
结果表明,芍药苷对照品溶液与白芍饮片点样量均为10μl,供试品溶液点样量为10μl,相应位置下的显色斑点均清晰可见,没有出现拖尾现象,故确定芍药苷对照品浓度为1mg/ml 点样量10μl,白芍对照药材溶液0.5g/ml点样量10μl,供试品溶液点样量10μl。
综合分析,确定薄层鉴别方法为:取本品粉末0.5g,加乙醇10ml,振摇5分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为供试品溶液。取缺白芍阴性样品0.5g,照供试品溶液同法制得芍药甘草汤阴性样品溶液。另取白芍饮片1g,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,同法制成对照药材溶液。再取芍药苷对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015版四部通则0502)试验。吸取上述各种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝紫色斑点,阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点。
b耐用性考察
按上述确定方法进行耐用性实验,考察自制板与机制板(青岛海洋化工厂),不同展开温度及相对湿度的影响。
结论:通过对低温低湿、常温、高温高湿环境及不同厂家的硅胶G薄层板进行耐用性考察,结果不同影响因素下,此白芍薄层鉴别条件耐用性良好。故将此薄层鉴别方法列入正文。
c方法确定
取本品粉末0.5g,加乙醇10ml,振摇5分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为供试品溶液。取缺白芍阴性样品0.5g,照供试品溶液同法制得芍药甘草汤阴性样品溶液。另取白芍对照药材1g,同法制成对照药材溶液。再取芍药苷对照品,加乙醇制成每1ml含1mg 的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015版四部通则0502)试验。吸取上述各种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40: 5:10:0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝紫色斑点,阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点。
d不同批次对应实物(干膏粉)薄层鉴别
分别称取不同批次的对应实物(干膏粉)0.5g,同上述供试品制备方法制成供试品溶液。进行薄层鉴别。结论:供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝紫色斑点,阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点。
②(炙)甘草
甘草主要化学成分为三萜类和黄酮类,除此之外还含有多糖、有机酸和香豆素等。根据以上化学成分对甘草进行如下薄层色谱的摸索实验。
a建立薄层色谱方法
方法一:参考《中国药典》2015年版一部“甘草”项下薄层鉴别方法
取对应实物(冻干粉)及缺甘草阴性冻干粉1g,加水40ml,超声30分钟,滤过,用乙醚振摇提取2次,每次10ml,弃去乙醚液,水液用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用氨试液振摇提取2次,每次30ml,合并氨试液,用盐酸调pH值至3~4。再用乙酸乙酯振摇提取2次,每次30ml,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取炙甘草饮片1g,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,同法制成对照药材溶液。取甘草苷对照品适量,加70%乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法2015版四部(通则0502)试验,吸取上述四种溶液各5μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)10℃放置的下层液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色淸晰,置日光及紫外光灯(365nm) 下检视。
结论:供试品色谱中,在与甘草对照药材、对照品色谱相应的位置上,显示相同颜色的斑点,但斑点显色不清晰,分离效果较差,5μl的点样量较小,定量较难且不准确,故进行点样量摸索。
方法二:点样量摸索
吸取上述四种溶液各10μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)5~10℃放置的下层液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色淸晰,置日光及紫外光灯(365nm)下检视。
结果分析:供试品色谱中,在与甘草对照药材和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,无斑点拖尾严重,故确定供试品溶液和对照品、对照药材溶液的点样量均为10μl。
综合分析确定薄层鉴别方法:取对应实物(冻干粉)及缺甘草阴性冻干粉1g,加水40ml,超声30分钟,滤过,用乙醚振摇提取2次,每次10ml,弃去乙醚液,水液用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用氨试液振摇提取2次,每次30ml,合并氨试液,用盐酸调pH值至3~4。再用乙酸乙酯振摇提取2次,每次30ml,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取炙甘草饮片1g,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,同法制成对照药材溶液。取甘草苷对照品适量,加70%乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法2015版四部(通则0502)试验,吸取上述三种溶液各10μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)5~10℃放置的下层液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色淸晰,置日光及紫外光灯(365nm)下检视。
b耐用性考察
按上述确定方法进行耐用性试验,考察自制板与机制板(青岛海洋化工厂)以及不同展开温湿度等影响因素。
结论:通过对低温低湿、常温、高温环境进行耐用性考察,结果不同影响因素下,此薄层鉴别条件耐用性良好。
c方法确定
取对应实物(冻干粉)及缺(炙)甘草阴性样品1g,加水40ml,超声30分钟,滤过,用乙醚振摇提取2次,每次20ml,弃去乙醚液,水液用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用氨试液振摇提取2次,每次30ml,合并氨试液,用盐酸调pH值至3~4。再用乙酸乙酯振摇提取2次,每次30ml,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取(炙)甘草饮片1g,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,同法制成对照药材溶液。取甘草苷对照品适量,加70%乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验,吸取上述三种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)5~10℃放置的下层液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色淸晰,置日光及紫外光灯(365nm)下检视,供试品色谱中,在与对照品、对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点或荧光斑点。
d不同批次对应实物(冻干粉)薄层鉴别
分别称取不同批次的对应实物(冻干粉)0.5g,同上述供试品制备方法制成供试品溶液。进行薄层鉴别。
结论:不同批次物质基准的供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点或荧光斑点。
(3)检查
①水分
照水分测定法(《中国药典》2015年版四部通则0832第二法),测定15批次物质基准水分,结果见表17。
表17水分检查结果
结果表明:15批次物质基准水分范围为4.52%~9.90%,平均值为6.88%,暂定本品水分不得过12.0%。
(4)浸出物
中药材中的化学成分或大类成分多数可以在水或醇中溶出,进而进行浸出物测定。由于芍药甘草汤物质基准是水提取,选择水为溶剂建立浸出物测定意义不大,难以反映内在质量,故选溶剂时,要考虑大类成分的溶解度,选择乙醇进行浸出物测定,以控制物质基准的质量
照浸出物测定法(《中国药典》2015年版四部通则2201醇溶性热浸法)测定:取本品约 2g,精密称定,置100ml的锥形瓶中,精密加乙醇50ml,密塞,称定重量,静置1小时后,连接回流冷凝管,加热至沸腾,并保持微沸1小时。放冷后,取下锥形瓶,密塞,再称定重量,用乙醇补足减失的重量,摇匀,用干燥滤器滤过,精密量取滤液25ml,置已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后,于105℃干燥3小时,置干燥器中冷却30分钟,迅速精密称定重量。计算供试品中醇溶性浸出物的含量(%)。测定15批经典名方物质基准中浸出物的含量,结果见表18。
表18不同批次物质基准浸出物测定结果
结果表明:经不同批次饮片制成的15批物质基准浸出物最小值为30.8%,最大值为66.4%,平均值为48.3%,平均值的±70%为14.5%~82.2%。考虑到实际生产过程中的各种影响因素等,暂定本品醇溶性浸出物的含量为15.0%~82.0%。
(5)指纹图谱
由于单纯的指标成分的定性鉴别和定量分析,难以反映物质基准质量的优劣。作为衡量物质基准对应实物是否与物质基准基本一致的标准参照物,其质量应加强专属性鉴别和多成分、整体质量控制。因而物质基准质量控制要重视以指纹图谱为主的整体质量控制。
①仪器与试药
液相色谱仪:赛默飞-U3000
色谱柱:InertSustain-AQ-C18(250mm×4.6,5μm)
试剂:乙腈为色谱纯;水为超纯水;0.1%磷酸;其他试剂均为分析纯。
样品:15批“芍药甘草汤物质基准”
对照品:芍药苷对照品(批号:110736-201539)、甘草苷(批号:111610-201607)、甘草酸铵(批号:110731-201418),均购自中国食品药品检定研究院
②色谱条件的摸索方法一:参照文献“HPLC波长切换法对芍药甘草汤中不同极性部位化学成分的比较研究”
色谱条件与系统适用性试验 InertSustain-AQ-C18为色谱柱;以乙腈为流动相A,以0.05%磷酸溶液为流动相B,按下表进行梯度洗脱;流速为1mL/min,检测波长为230nm,流动相梯度洗脱见表19。
表19流动相梯度洗脱表
参照物溶液的制备取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每 1ml含芍药苷60μg、甘草苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。
供试品溶液的制备取本品约0.1g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,加稀乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)30min,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,记录 100min的色谱图,即得。见图4。
方法二:参考文献“高效液相色谱法检测加味芍药甘草颗粒中芍药苷、甘草酸的含量”更改流动相浓度及梯度,其他条件不变,具体梯度如下表20,见图5。
表20流动相梯度洗脱表
方法三:参考文献“不同产地白芍的HPLC指纹图谱及芍药苷和芍药内脂苷含量的比较研究”更改流动相浓度及梯度,其他条件不变,具体梯度如下表21,图6。
表21流动相梯度洗脱表
结果分析:方法一、二、三流动相梯度洗脱,色谱图效果分离效果均不理想,故参考方法一、二、三对其流动相进行改进。
方法四:参考方法一、二、三对其流动相比例及时间进行调整,其他条件不变,具体梯度如下表22,图7。
表22流动相梯度洗脱表
实验分析:在该梯度条件下,色谱峰之间的分离度良好,因此选择该流动相体系。
③供试品溶液制备方法的选择
参照文献“HPLC波长切换法对芍药甘草汤中不同极性部位化学成分的比较研究”、“HPLC 法测定芍药甘草汤总有效部位中4个活性成分的含量”
a、供试品溶液的制备方法:取芍药甘草汤物质基准约0.1g,精密称定,置于锥形瓶中,加入乙醇20ml,称定重量,超声处理(100W,40kHz)30min,放冷,摇匀,过滤,取续滤液,即得。
b、供试品溶液的制备方法:取芍药甘草汤物质基准约0.1g,精密称定,置于锥形瓶中,加入甲醇20ml,称定重量,超声处理(100W,40kHz)30min,放冷,摇匀,过滤,取续滤液,即得。
c、供试品溶液的制备方法:取芍药甘草汤物质基准约0.1g,精密称定,置于锥形瓶中,加入稀乙醇20ml,称定重量,超声处理(100W,40kHz)30min,放冷,摇匀,过滤,取续滤液,即得。
按照上述色谱条件,记录同一色谱条件下不同提取方法色谱图,结果见图8。
结果表明:从上述色谱图可知,前两个方法检测色谱峰分离效果均不理想,方法三各峰之间的分离效果较好,因此选择方法三作为供试品的制备方法。
④峰归属及参照物的选择
a药味归属
按照物质基准制备方法,制备单味药材的冻干粉及缺单味药的阴性样品冻干粉,按照确定的指纹图谱供试品溶液制备方法制备供试品溶液,按照确定的色谱条件进行测定,确定冻干粉指纹图谱中各个色谱峰归属于哪味饮片,见图9和表23。
表23药味归属表
实验结论:物质基准色谱峰主要为白芍及甘草特征峰,流动相空白无干扰。
b参照物的选择
其中芍药苷色谱峰保留时间适中,响应值较高,达到基线分离,故选择芍药苷作为对照品参照峰,并将对芍药苷标记为峰S,同时将芍药苷对照品作为参照物。
⑤方法的初步确定
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;色谱柱:InertSustain-AQ-C18,以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000,具体梯度见下表24。
表24流动相梯度洗脱表
参照物溶液的制备取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml 含芍药苷60ug、甘草苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量 /1.0207)。
供试品溶液的制备取本品约0.1g,精密称定,置三角锥瓶中,加稀乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)30min,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,记录 100min的色谱图,即得。
⑥方法学考察
a专属性及整体性试验
为考察空白溶剂是否有干扰,结果空白溶剂无干扰。同时也对供试品整体性进行了考察,结果基本满足了信息量最大的原则(见表25,图10)
表25流动相梯度洗脱表
结果分析:通过空白溶剂图谱和供试品溶液色谱峰的比较发现空白无干扰。
b精密度试验
取本品约(批号:SYGCT-20180504D)0.1g,精密称定,按正文供试品溶液的制备和测定法项下操作,连续进样6次,对其相对保留时间及相对峰面积进行计算,其相对保留时间及相对峰面积具体测定结果见表26~表27,图11。
表26指纹图谱精密度相对保留时间计算结果
表27指纹图谱精密度相对峰面积汇总结果
c稳定性试验
取本品约(批号:SYGCT-20180504D)0.1g,精密称定,按正文供试品溶液的制备和测定法项下操作,分别在制备后放置0、3、6、9、12、24小时进样测定,对其相对保留时间及相对峰面积进行计算,其相对保留时间及相对峰面积具体测定结果如下表28~表29,图12。
表28指纹图谱稳定性相对保留时间计算结果
表29指纹图谱稳定性相对峰面积汇总结果
结果表明,相对保留时间差异不大,RSD<2.0%;相对峰面积RSD<10.0%。说明供试品溶液中在24小时内稳定性良好。
d重复性实验
取本品(批号:SYGCT-20180504D)约0.5g,(共6份),精密称定,按正文供试品溶液制备和测定法项下进行操作。对其相对保留时间及相对峰面积进行计算,其相对保留时间及相对峰面积具体测定结果如下表30~表31,图13。
表30指纹图谱重复性相对保留时间计算结果
31指纹图谱重复性相对峰面积汇总结果
结果表明,相对保留时间差异不大,RSD<2.0%;相对峰面积RSD<10.0%,说明本方法的重复性良好。
⑦指纹图谱的建立
a共有峰的标定
采用正文【指纹图谱】项下的方法对15批供试品色谱峰进行测定,并对所得指纹图谱进行分析,选择15批样品指纹图谱中稳定性较好、响应值适宜的色谱峰为共有峰,共标定了10 个共有峰。结果见图14。
b对照图谱的建立
采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统2012年版》,根据 15批次物质基准指纹图谱测定结果,以标出的10个共有峰进行校正,生成如下对照指纹图谱 R。结果见图1。
c相似度的计算
采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统,以共有峰对15批样品与对照指纹图谱的相似度进行计算,结果见表32。
表32十五批物质基准相似度评价结果
R对照图谱S2~S16依次为:SYGCT-20180501D、SYGCT-20180502D、SYGCT-20180503D、 SYGCT-20180504D、SYGCT-20180505D、SYGCT-20180506D SYGCT-20180507D、SYGCT-20180508D、 SYGCT-20180509D、SYGCT-20180510D、SYGCT-20180511D、SYGCT-20180512D、SYGCT-20180513D、 SYGCT-20180514D、SYGCT-20180515D
以上15批次芍药甘草汤对应实物(冻干粉)指纹图谱生成对照指纹图谱R,以此比较15批次对应实物(冻干粉)相似度均大于0.85,不同批次间对应实物(冻干粉)的相似度良好。暂定供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.85。
(6)含量测定
结合处方功效主治及处方药味在处方中的位置,综合确定含量测定指标。由于工艺研究确定水为溶剂,故芍药甘草汤物质基准中水溶性成分较多,其中君药白芍主要成分为单萜及其苷类成分,因此可测定其苷类成分芍药苷的含量。臣药甘草主要含有黄酮类、皂苷类等,虽为臣药,但其药理作用与芍药甘草汤物质基准的功效相关,故对甘草中甘草酸含量进行测定,以综合评价物质基准质量。
白芍、甘草
照高效液相色谱法《中国药典》2015年版四部(通则0512)测定
a仪器与试药
液相色谱仪:赛默飞-U3000;
色谱柱:InertSustain-AQ-C18(250mm×4.6,5μm);
试剂:乙腈为色谱纯,水为超纯水;0.1%磷酸及其他试剂均为分析纯。
对照品:芍药苷对照品(批号:110736-201539)、甘草酸铵(批号:111610-201607),均购自中国食品药品检定研究院。
b色谱条件的选择
a)检测波长的选择
取芍药苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含60μg的溶液,在190~400nm波长下进行扫描,可见芍药苷在225nm处有最大吸收峰。
取甘草酸铵对照品适量,精密称定,加70%乙醇制成每1ml含0.2mg的溶液,在190~400nm 波长下进行扫描,可见甘草酸在245nm处有最大吸收峰。
总结说明:芍药苷在225nm处有最大吸收峰,甘草酸铵在245nm处有最大吸收峰,药典芍药苷检测波长为230nm、甘草酸铵检测波长为237nm,芍药苷和甘草酸铵的最大吸收峰包含药典芍药苷、甘草酸铵的检测波长,为兼顾芍药苷和甘草酸铵的测定及参考相关文献的色谱条件,故选用230nm 作为检测波长。
b)流动相的选择方法一:参照文献“HPLC波长切换法对芍药甘草汤中不同极性部位化学成分的比较研究”
色谱条件与系统适用性试验InertSustain-AQ-C18为色谱柱;以乙腈为流动相A,以0.05%磷酸溶液为流动相B,按下表进行梯度洗脱;流速为1mL/min,检测波长为230nm,流动相梯度洗脱见表33。
表33流动相梯度洗脱
参照物溶液的制备取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml 含芍药苷60ug、甘草苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。
供试品溶液的制备取本品约0.1g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,加稀乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)30min,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,记录100min 的色谱图,即得。见图4。
方法二:参考文献“高效液相色谱法检测加味芍药甘草颗粒中芍药苷、甘草酸的含量”更改流动相浓度及梯度,其他条件不变,具体梯度如下表34,图5。
表34流动相梯度洗脱表
方法三:参考文献“不同产地白芍的HPLC指纹图谱及芍药苷和芍药内脂苷含量的比较研究”更改流动相浓度及梯度,其他条件不变,具体梯度如下表35,图6。
表35流动相梯度洗脱表
结果分析:方法一、二、三流动相梯度洗脱,色谱图效果分离效果均不理想,故参考方法一、二、三对其流动相进行改进。
方法四:参考方法一、二、三对其流动相比例及时间进行调整,其他条件不变,具体梯度如下表36。图7。
表36流动相梯度洗脱表
实验分析:在该梯度条件下,色谱峰之间的分离度良好,因此选择该流动相体系。
c供试品溶液制备方法考察
a)提取方式的考察
取本品(批号:SYGCT-20180504D)约0.1g(共2组),精密称定,分置具塞锥形瓶中,精密加入稀乙醇20ml,密塞,称定重量,分别超声处理(功率240W,频率45kHz)30分钟、回流提取 30分钟,取出,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。精密吸取续滤液10μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得。结果见表37。
表37提取方式考察的结果
结果表明,不同的提取方式样品的含量相差不大,考虑提取方便,故选择超声提取。
b)提取溶媒的考察
取本品(批号:SYGCT-20180504D)约0.1g(共3组),精密称定,分置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇、乙醇、稀乙醇20ml,密塞,称定重量,分别超声处理(功率240W,频率45kHz)30分钟,取出,放冷,再称定重量,分别用甲醇、乙醇、稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。精密吸取续滤液10μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得。结果如下表38。
表38提取溶媒考察的结果
结果表明:用稀乙醇提取,芍药苷和甘草酸的含量较高于甲醇和乙醇提取样品的含量,故选择稀乙醇为提取溶媒。
c)提取时间的考察
取本品(批号:SYGCT-20180504D)约0.1g(共3组),精密称定,分置具塞锥形瓶中,精密加入稀乙醇20ml,密塞,称定重量,分别超声处理20分钟、30分钟、40分钟,取出,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。精密吸取续滤液10μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得。结果见表39。
表39提取时间考察的结果
结果表明:超声提取30分钟的含量高于20分钟和40分钟,故选择超声提取30分钟。
d含量测定方法的初步确定
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱:
InertSustain-AQ-C18,以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000。按下表40中的规定进行梯度洗脱。
表40梯度洗脱表
对照品溶液的制备取芍药苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含芍药苷 60ug、甘草酸铵60μg的溶液,即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)
供试品溶液的制备取本品约0.1g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)30min,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,记录100min 的色谱图,即得。
e方法学考察
a)专属性试验
芍药苷、甘草酸作为芍药甘草汤指标性成分,为考察药材之间是否相互干扰,按处方比列取药材同法制成阴性样品(批号:SYGCT-20180504D),按供试品的处理方法制备缺白芍、缺甘草的阴性样品溶液进样记录色谱图。结果表明,
阴性色谱中在与芍药苷、甘草酸相应的保留时间没有色谱峰,表明两味药之间测定无干扰,以本法测定本品中芍药苷、甘草酸的含量具有专属性。(见图15)。
结果表明,阴性色谱中在与芍药苷、甘草酸相应的保留时间没有色谱峰,表明两味药之间测定无干扰,以本法测定本品中芍药苷、甘草酸的含量具有专属性。
b)线性关系考察
精密吸取对照品溶液2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL进样,记录色谱图,测得峰面积,以峰面积(A)对进样量(C)进行回归,得标准曲线。结果如下表41。
表41芍药苷线性关系
芍药苷回归方程:y=5.0765x+0.1907,芍药苷相关系数:r=0.9999,芍药苷在0.4124μg~4.1240 μg范围内线性良好。
表42甘草酸线性关系
甘草酸回归方程:y=1.3174x+0.0439,甘草酸相关系数:r=1,结果表明,甘草酸在0.406μg~ 4.056μg范围内线性良好。
c)仪器精密度
取芍药苷、甘草酸混合对照品溶液,按正文测定法项下操作,连续进样6次,测定结果见表43。
表43仪器精密度试验结果(n=6)
d)稳定性试验
取本品(批号:SYGCT-20180504D)约0.1g,精密称定,按确定供试品溶液的制备和测定法项下操作,分别在制备后放置0、2、4、8、12、24小时进样测定,测定结果见下表44。
表44稳定性试验结果
e)重复性试验
取本品(批号:SYGCT-20180504D)约0.1g(共6份),精密称定,按正文供试品溶液制备和测定法项下进行操作。结果见下表45。
表45重复性试验结果(n=6)
f)加样回收试验
取本品(批号:SYGCT-20180504D),精密称取约0.05g,共6份,分别精密加入芍药苷和甘草酸对照品,按供试品溶液的制备方法制备样品溶液,依法测定,结果见下表46。
表46加样回收试验结果(n=6)
f含量测定方法确认
以上的研究结果试验表明,芍药甘草汤对应实物(冻干粉)中芍药苷、甘草酸的含量测定方法的专属性强,精密度、稳定性、重复性、加样回收等均符合规定,故此液相色谱条件可以用于芍药甘草汤对应实物(冻干粉)中的芍药苷、甘草酸的含量测定,具体测定条件如下:
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱:
InertSustain-AQ-C18,以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000。按下表47中的规定进行梯度洗脱。
表47流动相梯度洗脱
对照品溶液的制备取芍药苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含芍药苷 60ug、甘草酸铵60μg的溶液,即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。
供试品溶液的制备取本品约0.1g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)30min,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,记录100min 的色谱图,即得。
g多批次对应实物(冻干粉)含量测定
按正文供试品溶液的制备和测定法项下操作,测定15批次对应实物(冻干粉)中芍药苷、甘草酸的含量,结果见表48。
表48不同批次对应实物(冻干粉)中芍药苷、甘草酸含量测定结果
由上表可知:
芍药苷含量的最小值为38.97mg/g,最大值为70.23mg/g,平均值为56.53mg/g,SD值为7.44,均值减3倍SD值为34.21mg/g,均值加3倍SD值为78.84mg/g。
甘草酸含量的最小值为16.66mg/g,最大值为32.24mg/g,平均值为23..7148mg/g,SD值为3.96,均值减3倍SD值为11.84mg/g,均值加3倍SD值为35.59mg/g。
结合生产实际需要,故暂定芍药苷含量的范围为34.0mg/g~79.0mg/g,甘草酸的含量范围为 12.0mg/g~36.0mg/g。
1.3.4对应实物的质量分析
1.3.4.1对应实物制备
将处方中药味,分别以浸出物含量高低顺序进行排序,并按照确定工艺,详见“8.2工艺研究”,将处方中各15批合格饮片进行物质基准的制备,每批投料5倍日处方量,约600g,平行制备15 批次物质基准,具体制备结果如下。
表49十五批物质基准
1.3.4.2对应实物测定方法
(1)出膏率测定:测定方法详见“8.2工艺研究”。
(2)水分测定:参照《中国药典》2015年版四部通则0832水分测定第二法,对不同批次物质基准水分进行检测,取供试品2g,平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中,厚度不超过5mm,疏松供试品不超过10mm,精密称定,开启瓶盖在105℃干燥5小时,将瓶盖盖好,移置干燥器中,放冷30 分钟,精密称定,再在上述温度干燥1小时,放冷,称重,至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量,计算供试品中含水量小于12(%)。
(3)浸出物测定:参照2015年版《中国药典》通则2201醇溶性热浸法测定:取本品适量,研细,取约2g,精密称定,置100ml的锥形瓶中,精密加乙醇50ml,密塞,称定重量,静置1小时后,采用热浸法进行浸出物测定,精密量取滤液25ml置已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后,于105℃干燥3小时,置干燥器中冷却30分钟,迅速精密称定重量。计算供试品中醇溶性浸出物的含量15.0%~82.0%(%)。
(4)指纹图谱测定:药材、饮片、中间体、对应实物测定方法详见“8.4质量标准正文”,根据15批次物质基准指纹图谱测定结果,标出10个共有峰,并生成对照指纹图谱,计算相似度。药材、饮片、中间体供试品制备方法如下:
白芍饮片溶液:按处方称取白芍饮片60g,加水300ml,按处方工艺煎煮60分钟,提取液趁热过200目滤布,滤液过0.45μm滤膜,即得。或按处方比例折算进行煎煮。
甘草饮片溶液:按处方称取甘草饮片60g,加水300ml,按处方工艺煎煮60分钟,提取液趁热过200目滤布,滤液过0.45μm滤膜,即得。或按处方比例折算进行煎煮。
提取液:精密量取提取液5ml置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)30min,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
(5)含量测定:对应实物芍药苷、甘草苷、甘草酸测定方法详见“8.4质量标准正文”。中间体供试品制备方法如下:
①芍药苷、甘草酸含量测定
提取液:精密量取提取液5ml置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)30min,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
1.3.4.3测定结果
结果汇总表如下表50。
1.3.4.4对应实物关键质量属性范围的确定
(1)出膏率
15批次物质基准出膏率范围6.72~10.88%,平均出膏率8.19%,均在3SD浮动范围4.14~12.24%;均值±70%浮动范围5.73%~10.64%。暂定出膏率范围为4.00~12.00%。
(2)水分
15批次物质基准水分范围4.52%~9.90%,平均水分6.88%,均值±3SD值范围为1.38%~12.37%,故暂定水分不得过12.0%。
(3)浸出物
15批次物质基准浸出物范围30.8%~66.4%,平均浸出物48.3%,暂定浸出物范围为15.0%~ 82.0%。
(4)指纹图谱
15批次芍药甘草汤物质基准指纹图谱生成对照指纹图谱,依次比较15批次物质基准相似度均大于0.85,不同批次间物质基准的相似度良好,暂定指纹图谱相似度限度为≥0.85。
(5)含量测定
15批物质基准芍药苷范围38.97mg/g~70.23mg/g,平均含量56.53mg/g,均在±30%及3SD范围内;参照±30%及3SD浮动范围,同时考虑到实际生产过程中的各种影响因素等,暂定本品按干燥品计算,每1g含白芍以芍药苷(C23H28O11)计,应为34.0mg/g~70.0mg/g。
15批物质基准甘草酸范围16.66mg/g~32.34mg/g,平均含量23.71mg/g,均在3SD范围内,参照±30%及3SD浮动范围,同时考虑到实际生产过程中的各种影响因素等,暂定本品按干燥品计算,每1g含甘草以甘草酸(C42H62O16)计,应为12.0mg/g~36.0mg/g。
1.4芍药甘草药物组合物物质基准正文及起草说明
1.4.1芍药甘草汤物质基准起草说明
1.4.1.1处方
本方出自汉·张仲景《伤寒杂病论》。详细研究见“处方考证及历史沿革资料”。
1.4.1.2制法
根据经典名方目录中记载的方法进行煎煮。采用电子煎药罐(容量9L)煎煮,以出膏率、芍药苷、甘草酸提取总量、指纹图谱为指标,研究物质基准饮片前处理、加热方式、煎煮时间、滤过及干燥工艺等进行研究相关参数,从而确定芍药甘草汤物质基准工艺。按照确定工艺,将处方量放大五倍进行投料,提取15批煎液,经滤过、浓缩、干燥。得到15批物质基准对应实物,结果显示物质基准制备工艺稳定、可行。
芍药甘草汤物质基准制法为:芍药300g,甘草300g,以上两味药,加水3000ml,电子煎药罐加盖煎煮1.5h,滤过,滤液低温真空浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏(即200mL),低温冷冻干燥,即得。(具体研究见“工艺研究”)
1.4.1.3性状
根据多批次样品的实际观察情况,暂定本品为黄色至棕黄色粉末,气微香,味微苦甜、酸而特殊。
1.4.1.4鉴别
本品由两味中药制成,系用水煎煮工艺制成的复方制剂,选用了专属性强,快速、简便、重现性好的薄层鉴别方法,对方中白芍、甘草的主要特征成分进行鉴别试验研究,确定以白芍、甘草纳入质量标准。
(1)白芍
白芍中主要含有单萜及其苷类、三萜类、黄酮、鞣质、多糖、挥发油等。主要含有芍药苷,根据以上化学成分对白芍进行如下薄层摸索实验。
确定薄层鉴别方法:取本品粉末0.5g,加乙醇10ml,振摇5分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为供试品溶液。取缺白芍阴性样品0.5g,照供试品溶液同法制得芍药甘草汤阴性样品溶液。另取白芍饮片1g,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,同法制成对照药材溶液。再取芍药苷对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015 版四部通则0502)试验。吸取上述各种溶液各10ul,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷- 乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝紫色斑点,阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点。
通过对低温、常温、高湿环境及不同厂家的硅胶G薄层板进行耐用性考察,结果不同影响因素下,此白芍薄层鉴别条件耐用性良好。不同批次物质基准的供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上,显相同颜色斑点。故将此薄层方法列入正文。
(2)甘草
甘草主要化学成分为三萜类和黄酮类,除此之外还含有多糖、有机酸和香豆素等。根据以上化学成分对甘草进行薄层色谱的摸索实验,确定方法。
确定薄层鉴别方法:取对应实物(冻干粉)及缺甘草阴性冻干粉lg,加水40ml,超声30分钟,滤过,用乙醚振摇提取2次,每次10ml,弃去乙醚液,水液用水饱和的正丁醇溶液振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用氨试液振摇提取2次,每次30ml,合并氨试液,用盐酸调节pH值至 3~4,再用乙酸乙酯振摇提取2次,每次30ml,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取甘草饮片lg,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,同法制成对照药材溶液。再取甘草苷对照品,加70%乙醇制成每lml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则 0502)试验,吸取上述三种溶液各10μl,分别点于硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7: 2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色淸晰,置日光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材、对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点及荧光斑点。
通过对低温、常温、高湿环境及不同厂家的硅胶G薄层板进行耐用性考察,结果不同影响因素下,此炙甘草薄层鉴别条件耐用性良好。不同批次物质基准的供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上,显相同颜色斑点。故将此薄层方法列入正文。
1.4.1.5检查
(1)水分
照水分测定法(《中国药典》2015年版四部通则0832第二法),测定15批次物质基准水分, 15批次物质基准最大值为9.90%,平均值为6.88%,暂定本品水分不得过12.0%。
1.4.1.6浸出物
中药材中的化学成分或大类成分多数可以在水或醇中溶出,进而进行浸出物测定。由于芍药甘草汤物质基准是水提取,选择水为溶剂建立浸出物测定意义不大,难以反映内在质量,故选溶剂时,要考虑大类成分的溶解度,选择乙醇进行浸出物测定,以控制物质基准的质量。
照浸出物测定法(《中国药典》2015年版四部通则2201醇溶性热浸法)测定15批芍药甘草汤物质基准中浸出物的含量,15批物质基准浸出物最小值为30.8%,平均值为48.3%,平均值的±3SD 值为14.9%~81.8%。考虑到实际生产过程中的各种影响因素等,暂定本品醇溶性浸出物的含量为 15.0%~82.0%。
1.4.1.7指纹图谱
由于单纯的指标成分的定性鉴别和定量分析,难以反映物质基准质量的优劣。作为衡量物质基准对应实物是否与物质基准基本一致的标准参照物,其质量应加强专属性鉴别和多成分、整体质量控制。因而物质基准质量控制要重视以指纹图谱为主的整体质量控制。
对方法流动相组成及梯度、供试品制备方法进行摸索,并对物质基准指纹图谱中各色谱峰进行药味归属、峰指认及参照物的选择(选择保留时间适中,响应值较高,达到基线分离的芍药苷作为参照物),初步确定指纹图谱测定方法。
对初步确定的指纹图谱方法进行方法学验证,方法的专属性良好,空白溶剂无干扰,同时基本满足了信息量最大的原则,且方法精密度、重复性、稳定性(24小时内)均符合规定(各色谱峰相对保留时间RSD小于2%),色谱图中各共有峰峰型尖锐,对称,分离度良好,故将此方法确定为指纹图谱测定方法列入标准正文:
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱:
InertSustain-AQ-C18,以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000,梯度洗脱见下表51:
表51梯度洗脱表
参照物溶液的制备取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml 含芍药苷60ug、甘草苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。
供试品溶液的制备取本品约0.1g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,记录100min 的色谱图,即得。
按照上述确定方法对15批物质基准进行测定,并对所得指纹图谱进行分析,选择15批物质基准指纹图谱中稳定性较好、响应值适宜的色谱峰为共有峰,共标定了10个共有峰。采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统2012年版》,以15批芍药甘草汤物质基准对应实物(干膏粉)HPLC图谱色谱峰进行自动匹配,形成共有模式图,并建立对照图谱。以共有峰对15批样品与对照指纹图谱的相似度进行计算,均大于0.85,故选择指纹图谱作为芍药甘草汤物质基准的评价标准,暂定本品与芍药甘草汤物质基准对照指纹图谱比较,其相似度不得低于0.85。
1.4.1.8含量测定
结合处方功效主治及处方药味在处方中的位置,综合确定含量测定指标。由于工艺研究确定水为溶剂,故芍药甘草汤物质基准中水溶性成分较多,其中君药白芍主要成分为单萜及其苷类成分,因此可测定其苷类成分芍药苷的含量。臣药甘草主要含有黄酮类、皂苷类等,虽为臣药,但其药理作用与芍药甘草汤物质基准的功效相关,故对甘草中甘草酸含量进行测定,以综合评价物质基准质量。
白芍、甘草
对芍药苷、甘草酸测定方法流动相组成及比例、供试品制备方法、检测波长进行摸索,初步确定含量测定方法。
对初步确定的方法进行方法学验证,方法的专属性良好,缺甘草阴性样品无干扰,目标峰纯度合格,芍药苷在进样量为0.4124μg~4.1240μg的范围内线性良好。且方法精密度(RSD<2.0%)、重复性(RSD<3.0%)、稳定性(24小时内RSD<3.0%)、准确度(平均回收率为98.76%,RSD为 1.94%)均符合规定,甘草酸铵在进样量为0.414μg~4.14μg的范围内线性良好。且方法精密度 (RSD<2.0%)、重复性(RSD<3.0%)、稳定性(24小时内RSD<3.0%)准确度(平均回收率为98.62%, RSD为1.81%)均符合规定。色谱条件的耐用性良好。故此液相色谱条件可以用于芍药甘草汤对应实物(冻干粉)中的芍药苷的含量测定,具体测定条件如下:
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱:
InertSustain-AQ-C18,以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000,梯度洗脱见下表52。
表52梯度洗脱
对照品溶液的制备取芍药苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含芍药苷 60ug、甘草酸铵60μg的溶液,即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)
供试品溶液的制备取本品约0.1g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率240W,频率45kHz)30min,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,记录100min 的色谱图,即得。
15批物质基准芍药苷范围38.97mg/g~70.23mg/g,平均含量56.53mg/g,同时考虑到实际生产过程中的各种影响因素等,暂定本品按干燥品计算,每1g含白芍以芍药苷(C23H28O11)计,应为 34.0mg/g~79.0mg/g。
15批物质基准甘草酸范围16.66mg/g~32.34mg/g,平均含量23.71mg/g,同时考虑到实际生产过程中的各种影响因素等,暂定本品按干燥品计算,每1g含甘草以甘草酸(C42H62O16)计,应为 12.0mg/g~36.0mg/g。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作出一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种芍药甘草药物组合物的制备方法,其特征在于,所述制备方法如下:取白芍200~400份、炙甘草200~400份,置于电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水2500~3300ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5~3h,200目滤布趁热滤过,滤液在温度为45℃~60℃、真空度-0.08MPa~-0.06MPa条件下浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法如下:取白芍300份、炙甘草300份,置于电子煎药罐中,以电子煎药罐加热,加水3000ml,加盖煎煮,武火煮沸转为小火煎煮保持微沸,煎煮1.5h,200目滤布趁热滤过,滤液在温度为55℃~60℃、真空度-0.08MPa~-0.04MPa条件下浓缩至与饮片量比为1﹕3的浸膏,浸膏在在预冻温度:-20~-50℃、冷冻干燥温度-50~-70℃、真空度<300Pa的条件下冷冻干燥,收集干膏粉即得,或收集干膏粉后加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型。
3.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法,其特征在于,所述的药学上可接受的制剂为固体制剂或液体制剂。
4.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述固体制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、冻干粉针剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述所述液体制剂为注射制剂、口服液。
6.一种芍药甘草药物组合物的检测方法,其特征在于,该检测方法用于检测权利要求1-2任一项或权利要求3或权利要求4-5任一项所述制备方法制出的产品,具体检测方法为:
性状:本品为黄色至棕黄色粉末,气微香,味微苦甜、酸而特殊;
鉴别:1)取本品粉末0.2~0.8g,加乙醇5~15ml,振摇3~8分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为供试品溶液,另取芍药苷对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液,照通则0502薄层色谱法试验,吸取供试品溶液、对照品溶液各3-10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以比例为40:5:10:0.2的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5~10%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝紫色斑点;
2)取本品及缺炙甘草阴性冻干粉0.5~l.5g,加水30~50ml,超声20~40分钟,滤过,用乙醚振摇提取2-3次,每次8~12ml,弃去乙醚液,水液用水饱和的正丁醇溶液振摇提取2~4次,每次15~25ml,合并正丁醇液,用氨试液振摇提取2~3次,每次20~40ml,合并氨试液,用盐酸调节pH值至3~4,再用乙酸乙酯振摇提取2~3次,每次20~40ml,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液及缺炙甘草阴性冻干粉溶液,另取甘草饮片lg,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,同法制成对照药材溶液,再取甘草苷对照品,加60~80%乙醇制成每lml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液,照通则0502薄层色谱法试验,吸取供试品溶液、缺炙甘草阴性溶液、对照药材溶液、对照品溶液各5~10μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以比例为13:7:2三氯甲烷-甲醇-水为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5~10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色淸晰,置日光及365nm紫外光灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材、对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点及荧光斑点;
检查:水分 通则0832第二法不得过12.0%;
浸出物:照中国药典2015版四部通则2201项醇溶性浸出物测定法下热浸法测定,浸出物为15.0%~82.0%;
指纹图谱:照中国药典2015年版四部通则0512高效液相色谱法测定;
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱:InertSustain-AQ-C18,以乙腈为流动相A,以0.1~0.5%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000;按规定的洗脱程序进行梯度洗脱,梯度洗脱程序如下:
梯度洗脱程序
参照物溶液的制备 取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含芍药苷60ug、甘草苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备 取本品0.1~0.5g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇15~25ml,称定重量,在功率240W,频率45kHz下超声处理20~40分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,记录100min的色谱图,即得;
供试品指纹图谱中应分别呈现相应的参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算,供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.900;对照指纹图谱见图1。
含量测定:白芍、甘草 照《中国药典》2015年版四部通则0512高效液相色谱法测定;
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相A,以0.1~0.5%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为208~240nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000;按规定的梯度洗脱程序进行梯度洗脱;
梯度洗脱程序
对照品溶液的制备 取芍药苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含芍药苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备 取本品约0.1~0.3g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇10~30ml,称定重量,在功率240W,频率45kHz下超声处理20~40分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10uL,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品按干燥品计算,含芍药苷不低于34.00mg/g,甘草酸不低于16.00mg/g。
7.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述鉴别1)的检测方法如下:
鉴别1)取本品粉末0.5g,加乙醇10ml,振摇5分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1ml使溶解,作为供试品溶液,另取芍药苷对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液,照通则0502薄层色谱法试验,吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以比例为40:5:10:0.2的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝紫色斑点。
8.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述鉴别2)的检测方法如下:
鉴别2)取本品及缺炙甘草阴性冻干粉各lg,加水40ml,超声30分钟,滤过,用乙醚振摇提取2次,每次10ml,弃去乙醚液,水液用水饱和的正丁醇溶液振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用氨试液振摇提取2次,每次30ml,合并氨试液,用盐酸调节pH值至3~4,再用乙酸乙酯振摇提取2次,每次30ml,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液,另取甘草饮片lg,加水50ml,煎煮30分钟,滤过,同法制成对照药材溶液,再取甘草苷对照品,加70%乙醇制成每lml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液,照通则0502薄层色谱法试验,吸取上述供试品溶液、缺炙甘草阴性溶液、对照药材溶液、对照品溶液各10μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以比例为13:7:2三氯甲烷-甲醇-水为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色淸晰,置日光及365nm紫外光灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材、对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点及荧光斑点。
9.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述指纹图谱的方法如下:
指纹图谱:照中国药典2015年版四部通则0512高效液相色谱法测定;
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱:InertSustain-AQ-C18,以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000;按规定的程序进行梯度洗脱,梯度洗脱程序如下:
梯度洗脱程序
参照物溶液的制备 取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含芍药苷60ug、甘草苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备 取本品约0.1g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇20ml,称定重量,在功率240W,频率45kHz下超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,记录100min的色谱图,即得;
供试品指纹图谱中应分别呈现相应的参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算,供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.900;对照指纹图谱见图1。
10.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述含量测定的方法如下:
含量测定:白芍、甘草 照中国药典2015年版四部通则0512高效液相色谱法测定;
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,流速为1mL/min,检测波长为230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000;按规定的程序进行梯度洗脱,梯度洗脱程序如下:
梯度洗脱程序
对照品溶液的制备 取芍药苷、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含芍药苷60μg、甘草酸铵60μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备 取本品约0.1g,精密称定,置50mL三角锥瓶中,精密加入稀乙醇20ml,称定重量,在功率240W,频率45kHz下超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10uL,注入液相色谱仪,测定,即得;
本品按干燥品计算,含芍药苷不低于34.00mg/g,甘草酸不低于16.00mg/g。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113075311A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-07-06 | 安徽济人药业有限公司 | 一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法 |
CN113267578A (zh) * | 2021-05-17 | 2021-08-17 | 中国中医科学院中药研究所 | 芍药甘草汤的质量控制方法 |
CN115444825A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-12-09 | 神威药业集团有限公司 | 芍药甘草汤冻干粉的制备方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103330758A (zh) * | 2013-07-11 | 2013-10-02 | 康美药业股份有限公司 | 一种芍药甘草汤配方颗粒及其制备方法和检测方法 |
CN110464746A (zh) * | 2019-08-28 | 2019-11-19 | 贵州景诚制药有限公司 | 一种苓桂术甘药物组合物、制备方法及检测方法 |
CN111624271A (zh) * | 2020-06-10 | 2020-09-04 | 厦门中药厂有限公司 | 检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法、标准指纹图谱和应用 |
-
2020
- 2020-12-21 CN CN202011523287.8A patent/CN112773831A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103330758A (zh) * | 2013-07-11 | 2013-10-02 | 康美药业股份有限公司 | 一种芍药甘草汤配方颗粒及其制备方法和检测方法 |
CN110464746A (zh) * | 2019-08-28 | 2019-11-19 | 贵州景诚制药有限公司 | 一种苓桂术甘药物组合物、制备方法及检测方法 |
CN111624271A (zh) * | 2020-06-10 | 2020-09-04 | 厦门中药厂有限公司 | 检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法、标准指纹图谱和应用 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
PENGFEI LU等: "Chemical profiling by LC–MS/MS and HPLC fingerprint combined with chemometrics and simultaneous determination of 16 characteristic ingredients for the quality consistency evaluation of Shaoyao‐Gancao Decoction", 《BIOMEDICAL CHROMATOGRAPHY》 * |
何利等: "芍药甘草汤HPLC指纹图谱的建立和7种成分含量测定", 《中药材》 * |
唐晓章等: "经典名方芍药甘草汤的物质基准量值传递分析", 《中国实验方剂学杂志》 * |
李妍等: "白芍-甘草药对不同配伍比例提取物中有效成分溶出规律的研究", 《中草药》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113075311A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-07-06 | 安徽济人药业有限公司 | 一种芍药甘草汤特征图谱的建立方法 |
CN113267578A (zh) * | 2021-05-17 | 2021-08-17 | 中国中医科学院中药研究所 | 芍药甘草汤的质量控制方法 |
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