CN114689765B - 一种二冬汤对照提取物及其制备方法和质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二冬汤对照提取物及其制备方法和质量控制方法,属于中药检测技术领域,通过控制二冬汤方剂的药材前处理、煎煮、浓缩、冷冻干燥等工艺参数,得到质量稳定的二冬汤对照提取物冻干粉,此二冬汤对照提取物的冻干粉用于二冬汤质量研究,质量均一、稳定,检测结果可靠;其中,本发明中的特征图谱以及鉴别方法适用于二冬汤的各种剂型的定性检测,且本发明中的特征图谱构建方法,公开了一种方法中的原料易得,检测方法简便可靠的方法,为二冬汤及其制剂的定性鉴别提供有力的保障。
Description
技术领域
本发明属于中药检测技术领域,具体涉及一种二冬汤对照提取物及其制备方法和质量控制方法。
背景技术
二冬汤出自于清代程国彭的《医学心悟》卷三,具有滋阴生津、益气清热的功能,用于治疗消渴证。原书记载:“渴而多饮为上消,消谷善饥为中消,口渴小便如膏者为下消。三消之证,皆燥热结聚也。大法:治上消者,宜润其肺,兼清其胃,二冬汤主之。”处方及制法为:“天冬二钱(去心),麦冬三钱(去心),花粉一钱,黄芩一钱,知母一钱,甘草五分,人参五分,荷叶一钱。水煎服。”
按照《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求》(征求意见稿)、《古代经典名方关键信息表(7首方剂)》(征求意见稿)中的剂量、制法等考证,通过考证的结果可知二冬汤现代的煎法为:“天冬7.46g,麦冬11.19g,黄芩3.73g,知母3.73g,人参1.87g,甘草3.73g,天花粉3.73g,荷叶1.87g,水煎服”。
中药作为整个中医药产业的支柱,为人类的健康和中医药的发展提供了物质基础,多种中药组成的中医经典名方更是功不可没。从中医理论来讲,中药及其方剂可靠的疗效是多种(类)成分共同作用的结果,每一种(类)成分发挥不同的作用。且方剂煎汤后成分种类、含量的变化趋势如何,都需要从整体而不是单一成分进行把控。然而,多指标的质量评价模式却受到中药化学对照品分离难度大,单体不稳定或供应价格高等因素的制约,并且应用大量单体化学品进行质量评价时,操作过程较为复杂,检测方法也受到限制。
对照提取物是一类非单体成分对照物,系指经特定提取工艺制备的含有多种主要有效成分或指标性成分,其指标性成分含量已采用相应的对照品进行标定,是可用于中药材(含饮片)、提取物、中成药等鉴别或含量测定用的国家药品标准物质。与单体对照品相比,其制备难度较小,可减少天然植物资源的消耗,降低制备和使用成本。与对照药材相比,可避免由批间差异引起分析误差。目前在欧、美药典中使用广泛,主用于药材色谱峰定位,也应用于提取物、挥发油、流浸膏等色谱峰定位。在我国,有关于对照提取物用于中药质量评价的相关文献资料,且《中国药典》自2005年版至今也陆续收载了多个对照提取物品种,具有广泛的应用前景。但未见经典名方汤剂对照提取物用于定性鉴别的报道,中国食品药品检定研究院也没有经典名方汤剂的对照提取物,急需对其对照提取物及制备工艺进行研究。
二冬汤作为一种中药复方制剂,处方药材较多(由8味药材组成),成分非常复杂多样。现有专利文献CN110658295A(二冬汤组方中荷叶饮片指纹图谱测定方法,20191023)公开了一种鉴别二冬汤中荷叶的指纹图谱方法,另现有专利文献CN101239150A(二冬口服制剂及其制备方法,20080813)还公开了二冬汤通过常规工艺制备口服制剂的方法。其他部分文献研究基于标准汤剂参比的二冬汤颗粒提取工艺研究[J],张国青,盛华刚等。
然而,上述报道仅针对二冬汤组方中的单味药指纹图谱研究及制备工艺考察研究,而目前还没有关于二冬汤特征图谱的研究报道,对二冬汤的研究显然是不全面的,即不能对二冬汤的成分进行全面的评价,也不能体现中药复方制剂的整体性特征。
发明内容
为解决前述问题,本发明提供一种二冬汤对照提取物及其制备方法和质量控制方法,目的在于提供建立二冬汤对照提取物及制备工艺研究,对照提取物后期用于对二冬汤特征图谱的研究做对照参照,作为一种定性的作用,有效的控制中药材的质量,为二冬汤复方制剂的质量控制提供技术支持;同时提出一种二冬汤提二冬汤对照提取物取物的特征图谱、特征图谱构建方法,可以解决现有技术中不能对二冬汤的成分进行全面的评价,也不能体现中药复方制剂的整体性特征的问题;还提出了一种二冬汤对照提取物的鉴别方法,是基于本技术方案中得到的二冬汤对照提取物的特征图谱的进一步使用,具有检测全面、操作简便的特点。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种二冬汤对照提取物及其制备方法,包括以下步骤:
A、药材前处理:取药用天冬、麦冬、知母、甘草、人参、荷叶、天花粉,经过净选、润制、切制、干燥,黄芩经炮制、润制、切片、干燥后,得天冬、麦冬、知母、甘草、人参、荷叶、天花粉、黄芩饮片;
B、煎煮:按二冬汤的配方称取步骤A中的各饮片,加6-8倍量水,浸泡20-40min,煎煮20-30min,煎煮2-3次,合并药液,过滤,收集滤液;
C、浓缩:将步骤B中的滤液在温度50±2℃、负压0.080Mpa的真空度下,浓缩至相对密度为1.02-1.06,得浓缩液;
D、冷冻干燥:将步骤C中的浓缩液,先在常压下预冻,再在压力为0.0pa条件下升华干燥,再进行解析干燥后,在温度10-26℃、相对湿度40-60%环境下收粉、称重、分装于棕色西林瓶,并封口,得二冬汤对照提取物冻干粉。
进一步地,所述步骤A中,药材前处理步骤为:取药用天冬、麦冬、黄芩、知母、甘草,净选至饮片检查无泥沙、杂质、非药用部位;再取药用天花粉、荷叶、人参,以及净选后的麦冬、甘草、知母、天冬、润制至手握法检查润至透心;再切制,至饮片长度检查,异形片不得超过10%;再干燥至符合水分要求,得天花粉、荷叶、人参、麦冬、甘草、知母、天冬;且将净选后的黄芩,置沸水中煮10min或蒸30min,取出,闷透,切薄片,干燥,得炮制后的黄芩饮片。
进一步地,所述步骤D中,预冻的条件是:在常压、温度在-50℃下,维持3h。
进一步地,所述步骤D中,升华干燥的条件是:
温度-40℃,维持1h;
温度-30℃,维持1h;
温度-20℃,维持2h;
温度-10℃,维持3h;
温度0℃,维持3h。
进一步地,所述步骤D中,解析干燥的条件是:
温度10℃,维持3h,压力0.0pa;
温度20℃,维持2h,压力0.0pa;
温度30℃,维持2h,压力0.0pa;
温度45℃,维持22h,压力0.0pa。
进一步地,所述步骤A中,干燥的条件是:所述天冬、麦冬、知母、人参、甘草、天花粉、荷叶、黄芩,干燥温度为75±5℃,干燥至符合水分要求。
进一步地,所述步骤B中,按二冬汤的配方称取步骤A中的各饮片,一煎,加入8倍量水,浸泡30min,煎煮30min;二煎加入6倍量水,煎煮20min,合并药液,过滤,收集滤液。
进一步地,所述步骤B中,过滤的条件是采用200目过滤的过滤器进行过滤,再收集滤液。
进一步地,所述二冬汤的配方为,按质量份数计:天冬7.46份,麦冬11.19份,黄芩3.73份,知母3.73份,人参1.87份,甘草3.73份,天花粉3.73份,荷叶1.87份。
一种二冬汤对照提取物,根据前述二冬汤对照提取物的制备方法制得的二冬汤对照提取物,所述二冬汤对照提取物的冻干粉水分为3.9%-5.9%,棕黄色至黄棕色粉末,气微,味微甜。
一种二冬汤对照提取物的特征图谱构建方法,包括以下步骤:
a.对照品溶液的制备:取L-色氨酸、黄芩苷、甘草酸对照品,加溶剂溶解,得对照品溶液;
b.供试品溶液的制备:取前述的二冬汤对照提取物冻干粉,加溶剂,制备二冬汤对照提取物的供试品溶液;
c.将步骤a、b中得到的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测,以对照品溶液的特征图谱为参照图谱,从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰,构建二冬汤对照提取物的特征图谱。
进一步地,所述步骤a中,对照品溶液的制备方法包括:取L-色氨酸、黄芩苷、甘草酸对照品,分别加70%甲醇制成每1ml含80μg的混合溶对照品液。
进一步地,所述步骤b中,供试品溶液的制备方法包括:取二冬汤对照提取物冻干粉0.35g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25mL,密塞,称定重量,超声处理,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,得二冬汤对照提取物的供试品溶液。
进一步地,在步骤c中,所述高效液相色谱检测条件满足:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
柱温:30℃;
流速:1.0mL/min;
进样量:10μL;
检测波长:254nm;
流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸水溶液,梯度脱洗。
进一步地,所述梯度洗脱过程为:
0~35min,流动相A为2~30.5%,流动相B为98~69.5%,
35~50min,流动相A为30.5~50%,流动相B为69.5~50%,
50~65min,流动相A为50~95%,流动相B为50~5%。
进一步地,二冬汤对照提取物冻干粉的制备步骤包括:
a1:按原料重量份数计,取饮片天冬7.46份,麦冬11.19份,黄芩3.73份,知母3.73份,人参1.87份,甘草3.73份,天花粉3.73份,荷叶1.87份;
b1:将a1步骤中的全部饮片,放在煎煮容器中,一煎加8倍量水,浸泡30min,煎煮30min;第二次加6倍量水,煎煮30min,共煎煮2次,过滤,合并滤液,冷冻干燥成冻干粉。
进一步地,在步骤b1中,所述冷冻干燥工艺包括预冻、升华干燥、解析干燥。
一种二冬汤对照提取物的特征图谱,根据前述二冬汤对照提取物的特征图谱构建方法得到的特征图谱,包含19个特征峰,19个特征峰中包括:L-色氨酸、芒果苷、甘草苷、金丝桃苷、野黄芩苷、黄芩苷、异甘草苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩苷的特征峰。
一种二冬汤提取物的鉴别方法,包括以下步骤:
a2.称取待鉴定的二冬汤提取物冻干粉适量,分别制得二冬汤提取物的供试品溶液;
b2.将步骤a2中制得的供试品溶液,分别注入高效液相色谱仪检测,即得对应的待鉴定的特征色谱;
c2.将步骤b2中得到的待鉴定的特征色谱与前面所述方法构建得到的对应的特征图谱进行比对,若待鉴定的特征色谱与之对应的构建得到的特征色谱一致,则鉴别为质量合格。
本技术方案的有益效果如下:
(1)、本发明中,本二冬汤对照提取物的制备具有重要意义:首先为中国食品药品检定研究院申报对照提取物和复方制剂的质量控制提供技术支持,具有较强的创造性;其次在响应了中药多指标整体质量控制的号召的同时,避免了前处理、处方、提取、成分指认等工序的重复发生,使实验操作更为简便,并减少了资源的消耗。可为中药经典名方汤剂的质量控制提供保障,为其国际推广奠定一定的基础。
(2)、本发明中,以传统中药经典名方-二冬汤为基准,在传统煎药方法的基础上,对提取溶媒、煎煮次数、煎煮时间、加水量进行考察后,制备出相应的二冬汤对照提取物,并对其进行了特征图谱研究,可用于相应汤剂、颗粒剂、膏剂等常用制剂的定性鉴别。
(3)、本发明中,二冬汤对照提取物,以整体对照物质为对照进行质量控制,实现了真正意义上的整体质量控制,使可检测的范围和数量显著增大,几乎不增加检测成本,检测方法的重复性显著提高。且二冬汤对照提取物代表了制剂的整体内在质量,可以为后续经典名方二冬汤的相关制剂提供参考依据。
(4)、二冬汤作为临床上常用的经典处方,是后世医家在辨证论治的基础,本发明中,公开了一种二冬汤对照提取物的特征图谱、特征图谱构建方法,采用高效液相色谱法构建了二冬汤对照提取物的特征图谱,并通过此特征图谱,可实现有关二冬汤及其以二冬汤为基础方的复方制剂的快速鉴别,方法简单。本发明一方面弥补传统方剂-二冬汤及其制剂质量控制中特征图谱的研究空白,为经典名方二冬汤的质量提升提供有力保障;另一方面也为二冬汤的研究开发提供有效的研究基础。
(5)、本发明中,所采用的色谱柱能对二冬汤中的成分同时进行分析,所得指纹图谱信息量较大,能够快速、准确的鉴别样品质量优劣,有效控制二冬汤中饮片的质量,保证二冬汤质量稳定性。本方法确定了19个共有特征峰,其中指认了:L-色氨酸、芒果苷、甘草苷、金丝桃苷、野黄芩苷、黄芩苷、异甘草苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩苷等11个特征峰,为二冬汤及其制剂的定性鉴别提供有力的保障。
(6)、本发明中,以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定,具有操作简单、分离度好、精密度高、重复性好以及稳定性好等优点。
(7)、本发明中,采用本技术方案中的参数,得到的图谱基线平稳、分离度好、峰形较好、出峰较多、首次提供了对二冬汤处方药味的全面控制的特征图谱方法。
(8)、本发明中,利用得到的特征图谱,建立二冬汤对照提取物特征图谱检测方法,对二冬汤中的有效成分进行科学的鉴别和整体表征,具有检测全面、操作简便的特点。
(9)、本发明中,提供一种二冬汤特征图谱的检测方法,通过对二冬汤特征图谱的研究,开发建立一种简单易行,准确性高,重复性良好且能尽可能多地反映二冬汤所含多成分的特征图谱检测方法对于其质量控制和评价是非常必要的,弥补了现有质量控制方法的不足之处,使二冬汤的质量控制技术更为完善,科学。
附图说明
图1为实施例4中的二冬汤的吸水率曲线图。
图2为实施例9中二冬汤的对照特征图谱。
图3是实施例10中10批二冬汤对照提取物特征图谱。
图4为是实施例12中二冬汤对照提取物的对照特征图谱。
图5是实施例13中方案一的二冬汤对照提取物色谱条件考察图。
图6是实施例13中方案二的二冬汤对照提取物色谱条件考察图。
图7是实施例13中方案三的二冬汤对照提取物色谱条件考察图。
图8是实施例14中二冬汤对照提取物不同波长色谱图。
图9是实施例15中专属性考察的特征图谱。
图10是二冬汤对照提取物特征图谱。
图11是实施例22中10批二冬汤对照提取物特征图谱。
图12是实施例22中合成后的二冬汤对照提取物特征图谱。(其中:峰1:L-色氨酸;峰2:芒果苷;峰7:甘草苷;峰8:金丝桃苷;峰9:野黄芩苷;峰10(S1):黄芩苷;峰11:异甘草苷;峰14:黄芩素;峰15(S2):甘草酸;峰17:汉黄芩苷。)
图13是实施例23中二冬汤颗粒的图谱。
具体实施方式
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例中所涉及的实验仪器及材料如下:
电子天平:上海方瑞仪器有限公司JY系列百分之一天平、ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司);
煎药壶:美味世家全自动分体式陶瓷煎药壶4升;
筛网:九峰筛网200目;
真空冷冻干燥机:北京松源华兴科技发展有限公司LGJ-100F;
西林瓶压盖机:SZ20A;
2000mL不锈钢量杯若干;西林瓶:10mL,30mL,50mL若干;
高效液相色谱仪:Waters 2695-2996型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、岛津20-AD型高效液相色谱仪;
超声波清洗器:KQ5200DB型(600W,40KHz;昆山市超声仪器有限公司);
电子天平:上海方瑞仪器有限公司JY系列百分之一天平、ME204E/02、MS205DU、
XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司);
超纯水机:细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司);
色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18 250×4.6mm、Kromasil C18 5μm 4.6×250mm、Phenomenex Luna 5um C18(2)100A 4.6×250mm。
试剂:乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯;
试药:
L-色氨酸(北京世纪奥科生物技术有限公司,批号:181218,含量以99.9%计);
黄芩苷(中国食品药品检定研究院,批号:110715-201821,含量以95.4%计);
甘草酸(四川省维克奇生物科技有限公司,批号:wkq19011705,含量以98%计);
芒果苷(中国食品药品检定研究院,批号:111607-201704,含量以98.1%计),
甘草苷(中国食品药品检定研究院,批号:111610-201607,含量以93.1%计);
金丝桃苷(中国食品药品检定研究院,批号:111521-201708,含量以95.1%计);
野黄芩苷(中国食品药品检定研究院,批号:110842-201709,含量以91.7%计);
异甘草苷(四川省维克奇生物科技有限公司,批号:wkq18042008,含量以98%计);
黄芩素(中国食品药品检定研究院,批号:111595-201808,含量以97.9%计);
汉黄芩素(中国食品药品检定研究院,批号:111514-201706,含量以98%计);
天花粉、荷叶、人参、麦冬、甘草、知母、天冬、黄芩(四川新绿色药业科技发展有限公司提供);
缺阴性样品信息:缺天冬对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:EDT200911);
缺麦冬对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:EDT200912);
缺黄芩对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:EDT200913);
缺知母对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:EDT200914);
缺人参对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:EDT200915);
缺甘草(甘草)对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:EDT200916);
缺天花粉(栝楼)对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:EDT200917);
缺荷叶对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:EDT200918);
二冬汤对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:EDT200901、EDT200902、EDT200903、EDT200904、EDT200905、EDT200906、EDT200907、EDT200908、EDT200909、EDT200910)
实施例1
本实施例涉及二冬汤对照提取物的具体制备方法,包括以下步骤
A、药材前处理:取药用天冬、麦冬、黄芩、知母、甘草,净选至饮片检查无泥沙、杂质、非药用部位;再取药用天花粉、荷叶、人参,以及净选后的麦冬、甘草、知母、天冬、润制至手握法检查润至透心;再切制,至饮片长度检查,异形片不得超过10%;再干燥至符合水分要求,得天花粉、荷叶、人参、麦冬、甘草、知母、天冬;且将净选后的黄芩,置沸水中煮10分钟或蒸30min,取出,闷透,切薄片,干燥,得炮制后的黄芩饮片;
B、煎煮:按二冬汤的配方称取步骤A中的各饮片,加6-8倍量水,浸泡20-40min,煎煮20-30min,煎煮2-3次,合并药液,过滤,收集滤液;
C、浓缩:将步骤B中的滤液在温度50±2℃、负压0.080Mpa的真空度下,浓缩至相对密度为1.02-1.06,得浓缩液;
D、冷冻干燥:将步骤C中的浓缩液,先在常压下预冻,再在压力为0.0pa条件下升华干燥,再进行解析干燥后,在温度10-26℃、相对湿度40-60%环境下收粉、称重、分装于棕色西林瓶,并封口,得二冬汤对照提取物冻干粉。
实施例2
本实施例是在实施例1上的进一步优化,所述步骤A中,天冬、麦冬、天花粉、黄芩、知母、甘草、人参、荷叶的具体的前处理方法为:
天冬:筛去泥沙、除去杂质,迅速洗净,切成1~2mm的薄片,干燥;
麦冬:筛去泥沙、除去杂质,喷淋清水2-3次,回润1-2小时,轧扁,干燥;
天花粉:取天花粉,略泡,润透,切成2~4mm厚片,干燥;
黄芩:筛去泥沙、除去杂质,取待炮制的黄芩置沸水中煮10min或蒸30min,取出,闷透,切1~2mm薄片,干燥;
知母:筛去泥沙、除去杂质,喷淋清水2-3次,回润1-2小时,切成2~4mm厚片,干燥;
甘草:筛去泥沙、除去杂质,喷淋清水2-3次,回润1-2小时,切成2~4mm厚片,干燥;
人参:去药用人参,喷淋清水2-3次,回润1-2小时,切成1~2mm的薄片,干燥;
荷叶:取荷叶,喷淋清水2-3次,稍润,切成5~10mm宽丝,干燥至水分合格。
再将上述合格饮片,送入煎药壶中,进行下一步煎煮步骤。
实施例3
本实施例是对二冬汤对照提取物性状的考察。
二冬汤对照提取物经工艺制备得到一种固体粉末。10批次二冬汤对照提取物性状、水分分别见表1和表2。
表1:10批次二冬汤对照提取物性状
2:10批次二冬汤对照提取物的水分检查
从多批次的二冬汤对照提取物的检测结果看,二冬汤对照提取物为棕黄色至黄棕色粉末;气微,味微甜;二冬汤对照提取物水分在3.9%-5.9%范围之内,平均值为5.0%。
实施例4
在中药制药技术领域中,不同饮片吸水率有差异,因此需考察二冬汤的吸水率,进而为加水量做参考。本实施例主要考察二冬汤对照提取物制备时,吸水率的变化情况。
称取处方量的饮片100g(按天冬7.46份,麦冬11.19份,黄芩3.73份,知母3.73份,人参1.87份,甘草3.73份,天花粉3.73份,荷叶1.87份的比例计),两份,分别加入6倍量(水体积:处方量饮片的重量)的水,分别在浸泡10min,20min,30min,50min,1h,1.5h,2h,4h,6h,8h,16h,24h测定,计算吸水率,结果见表3,吸水率曲线见图1。
表3:二冬汤吸水率数据
从表3与图1可知,二冬汤饮片其在前1.5h急剧吸水,2h后逐渐减小,12h吸水接近饱和,平均吸水率为210.0%。吸水率约为2倍。
再参照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》(征求意见稿)的“加水量”部分的意见:由于中药饮片的质地和吸水率相差较大,应根据不同的饮片确定加水量。加水量一般以浸过药面2~5厘米为宜,花、草类饮片或煎煮时间较长的饮片可酌量加水,再结合之前的试验,确定二冬汤制备步骤中首次加水量为饮片的8倍量,二煎加水量为6倍量。
实施例5
在实施例4的基础上,对二冬汤的加水量及提取次数进行考察,参考其吸水率,可将一煎加水倍数调整为8倍,二煎加水量定为6倍,提取2次;或将一煎加水倍数调整为7倍,二煎加水量定为6倍,提取2次,发现每次加水量控制在6-8倍量水最终的结果差距不大,但是加水量调整至9倍时,后面的浓缩工艺时长明显增长,所以定为,一煎加水倍数调整为8倍,二煎加水量定为6倍,提取2次,效率较高。
实施例6
本实施例是对二冬汤对照提取物制备工艺中,浸泡时间的考察。
取二冬汤处方量的饮片100g,两份,均加8倍水,每隔10min观察饮片的浸泡情况,直至饮片泡至内芯湿润。
结果表明:取二冬汤处方量的饮片,加8倍水,每隔10min观察饮片的浸泡情况,直至饮片泡至内芯湿润。浸泡至10min时,大部分饮片未浸泡透;浸泡至20min时大部分内芯湿润,少量较长饮片内芯未湿润;浸泡至30min时所有饮片内芯湿润,确定浸泡时间为30min。
实施例7
本实施例是对二冬汤对照提取物制备工艺中冷冻工艺的考察。
根据《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求》(征求意见稿)中要求,对其中提取物干燥过程推荐采用冷冻干燥方法制备为宜,可保证其质量的稳定、易于保存。对冷冻干燥工艺参数考察,列举了两种冻干工艺的控制条件,见表4-1、4-2所示。
表4-1:二冬汤对照提取物冻干工艺(一)
表4-2:二冬汤对照提取物冻干工艺(二)
通过上述冻干工艺,配合上述表中的控制参数,得到的两种冻干粉。两种冻干粉通过检测发现,表4-1工艺参数得到的冻干粉更疏松、干燥,更利于存放。所以最后选择表4-1的控制参数对应的工艺条件。
再将经上述工艺后得到的冻干粉,在温度10-26℃、相对湿度40-60%环境下,快速收粉、称重、分装于棕色西林瓶,并封口、贴标签。
实施例8
本实施例是对二冬汤对照提取物煎煮验证,根据前述实施中,对二冬汤对照提取物制备工艺的考察,最后确定的较优工艺为:取二冬汤处方量的饮片,加水煎煮两次,一煎加8倍水,浸泡30分钟,煮沸,保持微沸煎煮30分钟,200目筛网过滤,立即冷却至室温;二煎加6倍水,煮沸,保持微沸煎煮20分钟,200目筛网过滤,立即冷却至室温;合并水煎液,冷冻干燥,分装,即得。
采用本制备工艺,进行了10批二冬汤对照提取物煎煮,结果见表5。
表5:10批二冬汤对照提取物数据汇总
从表5可得,10批二冬汤对照提取物收粉率,平均值为28.16%。SD为1.09。平均值的70%-130%的范围为19.71%-36.61%。平均值加减3倍SD范围为24.90%-31.42%。本数据在正常范围内,可作为生产工艺的参考。
实施例9
本实施例是将本技术方案中得到的二冬汤对照提取物的冻干粉用于二冬汤对照提取物的一种特征图谱构建方法,再将得到的图谱用于二冬汤复方制剂定性检测。
a.对照品溶液的制备:取L-色氨酸、黄芩苷、甘草酸对照品分别加70%甲醇制成每1mL含80μg的混合溶液,即得。
b.供试品溶液的制备:取实施例1中得到的冻干粉末约0.35g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25mL,密塞,称定重量,超声处理(功率300W,频率25kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
c.检测:将步骤a、b中得到的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测,以对照品溶液的特征图谱为参照图谱,从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰,构建二冬汤对照提取物的特征图谱。
所述高效液相色谱检测条件满足:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm);
柱温:30℃;
流速:1.0mL/min;
进样量:10μL;
检测波长:254nm;
流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸水溶液,梯度脱洗。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。
所述梯度洗脱过程为:
0~35min,流动相A为2~30.5%,流动相B为98~69.5%,
35~50min,流动相A为30.5~50%,流动相B为69.5~50%,
50~65min,流动相A为50~95%,流动相B为50~5%。
d.以步骤c中对照品溶液的特征图谱为参照图谱,从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰,构建二冬汤对照提取物的特征图谱。
供试品特征图谱中应呈现19个特征峰,其中峰1、峰10、峰15应分别与L-色氨酸、黄芩苷、甘草酸对照品参照物峰保留时间相对应。与黄芩苷参照物峰相应的峰作为S1峰,计算峰2~峰12与S1峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±8%范围之内。规定值为0.629(峰2)、0.653(峰3)、0.740(峰4)、0.762(峰5)、0.794(峰6)、0.826(峰7)、0.837(峰8)、0.858(峰9)、1.025(峰11)、1.143(峰12)。与甘草酸参照物峰相应的峰作为S2峰,计算峰13~峰19与S2峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±8%范围之内。规定值为0.916(峰13)、0.935(峰14)、1.017(峰16)、1.089(峰17)、1.150(峰18)、1.214(峰19)。图谱见图2所示。其中,峰1:L-色氨酸;峰2:芒果苷;峰7:甘草苷;峰8:金丝桃苷;峰9:野黄芩苷;峰10(S1):黄芩苷;峰11:异甘草苷;峰14:黄芩素;峰15(S2):甘草酸;峰17:汉黄芩苷。
实施例10
二冬汤对照提取物特征图谱验证
根据上述二冬汤对照提取物特征图谱检测方法对10批(EDT200901、EDT200902、EDT200903、EDT200904、EDT200905、EDT200906、EDT200907、EDT200908、EDT200909、EDT200910)二冬汤对照提取物进行特征图谱验证,结果见图3所示。
采用特征图谱,可以从整体上对对照提取物进行质量控制,以保证质量均一性和稳定性;结果表明10批二冬汤对照提取物的质量均一、稳定。
实施例11
一种二冬汤对照提取物的特征图谱构建方法,涉及中成药生产技术领域,包括以下步骤:
a.对照品溶液的制备:取L-色氨酸、黄芩苷、甘草酸对照品,加溶剂溶解,得对照品溶液;
b.供试品溶液的制备:取实施例1中得到的二冬汤对照提取物冻干粉,加溶剂,制备二冬汤对照提取物的供试品溶液;
c.将步骤a、b中得到的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测,以对照品溶液的特征图谱为参照图谱,从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰,构建二冬汤对照提取物的特征图谱。
实施例12
本实施例是实施例11基础上的更具体的制备方法,一种二冬汤对照提取物的特征图谱构建方法,涉及中成药生产技术领域,包括以下步骤:
a.取L-色氨酸、黄芩苷、甘草酸对照品分别加70%甲醇制成每1ml含80μg的混合溶液,即得;
b.供试品溶液的制备:取二冬汤冻干粉0.35g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25ml,密塞,称定重量,超声处理(功率300W,频率25kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
c.测定:将步骤a、b中得到的对照品溶液和供试品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪中进行检测,以对照品溶液的特征图谱为参照图谱,从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰,构建二冬汤对照提取物的特征图谱。
进一步地,在步骤c中,所述高效液相色谱检测条件满足:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm),以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱;柱温为30℃;流速为每分钟1.0ml;检测波长:254nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。
进一步地,所述梯度洗脱过程为:
0~35min,流动相A为2~30.5%,流动相B为98~69.5%,
35~50min,流动相A为30.5~50%,流动相B为69.5~50%,
50~65min,流动相A为50~95%,流动相B为50~5%。
d.以步骤c中对照品溶液的特征图谱为参照图谱,从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰,构建二冬汤对照提取物的特征图谱。构建的二冬汤对照提取物的特征图谱共有19个特征峰,其中峰1、峰10、峰15应分别与L-色氨酸、黄芩苷、甘草酸对照品参照物峰保留时间相对应。与黄芩苷参照物峰相应的峰作为S1峰,计算峰2~峰12与S1峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±8%范围之内。规定值为0.629(峰2)、0.653(峰3)、0.740(峰4)、0.762(峰5)、0.794(峰6)、0.826(峰7)、0.837(峰8)、0.858(峰9)、1.025(峰11)、1.143(峰12)。与甘草酸参照物峰相应的峰作为S2峰,计算峰13~峰19与S2峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±8%范围之内。规定值为0.916(峰13)、0.935(峰14)、1.017(峰16)、1.089(峰17)、1.150(峰18)、1.214(峰19)。如图4所示。
本实施例中,二冬汤对照提取物冻干粉的制备步骤包括:
a1:按原料重量份数计,取饮片天冬7.46份,麦冬11.19份,黄芩3.73份,知母3.73份,人参1.87份,甘草3.73份,天花粉3.73份,荷叶1.87份;
b1:将a1步骤中的全部饮片,放在煎煮容器中,一煎加8倍量水,浸泡30min,煎煮30min;第二次加6倍量水,煎煮30min,共煎煮2次,过滤,合并滤液,冷冻干燥成冻干粉。
实施例13
本实施例是对实施例12中二冬汤对照提取物特征图谱构建中,对色谱条件与系统适用性试验-梯度洗脱条件的考察。
结合传统的二冬汤的高效液相色谱检测条件,以及二冬汤中有效成分的特性,设计有三种色谱条件。方案一:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm),以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸水溶液为流动相B,按下表6中的规定进行梯度洗脱;柱温为30℃;流速为每分钟1.0ml;检测波长:254nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。见图5。
表6:
在该色谱条件下,从图5中可看出,色谱峰分离度与对称性较差,故根据现有梯度,对色谱条件再进行考察。
方案二::以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm),以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸水溶液为流动相B,按下表7中的规定进行梯度洗脱;柱温为30℃;流速为每分钟1.0ml;检测波长:254nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。见图6。
表7:
在该色谱条件下,从图6中可看出,该色谱条件峰分离度,对称因子有所改善,故继续梯度的优化。
方案三:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm),以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸水溶液为流动相B,按下表8中的规定进行梯度洗脱;柱温为30℃;流速为每分钟1.0ml;检测波长:254nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。见图7。
在该色谱条件下,从图7中可看出,该色谱条件与系统适用性试验方法条件下色谱峰多,且理论板数、分离度、对称性均更好,故选择该色谱条件作为二冬汤对照提取物测定方法的流动相。
实施例14
本实施例是对实施例12中二冬汤对照提取物特征图谱构建中,对色谱条件-波长的考察。
根据实施例12、13拟定的实验条件基础上,利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波长扫描,并在不同波长下获取数据,经比较,254nm波长下色谱图最好,故检测波长定为210nm。见附图8。
实施例15
本实施例是对实施例12中二冬汤对照提取物特征图谱构建中,对方法学-专属性的考察。
供试品溶液的制备:按实施例12中的实验条件,制备二冬汤对照提取物供试品溶液。
对照品参照物溶液的制备:取L-色氨酸、芒果苷、甘草苷、金丝桃苷、野黄芩苷、黄芩苷、异甘草苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素分别加70%甲醇制成每1ml含80μg的混合溶液,即得。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件(供试品溶液的制备的条件),制备缺二冬汤对照提取物阴性对照溶液。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺天冬对照提取物阴性对照溶液。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺麦冬对照提取物阴性对照溶液。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺黄芩对照提取物阴性对照溶液。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺知母对照提取物阴性对照溶液。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺人参对照提取物阴性对照溶液。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺甘草(甘草)对照提取物阴性对照溶液。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺天花粉(栝楼)对照提取物阴性对照溶液。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺荷叶对照提取物阴性对照溶液。
对二冬汤对照提取物特征图谱峰进行定位。见图9、图10。
结果表明,阴性对照溶液对待测峰的测定无干扰,表明该方法专属性好。
图10中,峰1:L-色氨酸;峰2:芒果苷;峰7:甘草苷;峰8:金丝桃苷;峰9:野黄芩苷;峰10(S1):黄芩苷;峰11:异甘草苷;峰14:黄芩素;峰15(S2):甘草酸;峰17:汉黄芩苷。
实施例16
本实施例是对实施例12中二冬汤对照提取物特征图谱构建中,对方法学-精密度的考察。
取二冬汤对照提取物(批号EDT2009011)供试品溶液,按拟定实验方法连续进样6次,每次10μL,计算保留时间及峰面积。表9-1、表9-2、表10-1、10-2。
表9-1:精密度考察—特征峰保留时间
表9-2:精密度考察—特征峰保留时间(续)
表10-1:精密度考察—特征峰峰面积
表10-2:精密度考察—特征峰峰面积(续)
结果表明,该仪器精密度良好。
实施例7
本实施例是对实施例12中二冬汤对照提取物特征图谱构建中,对方法学-重复性的考察。
精密称取二冬汤对照提取物(批号EDT200901)6份,按拟定实验方法进行制备及测定。见表11-1、表11-2、表12-1、表12-2。
表11-1:重复性考察—特征峰相对保留时间比值
表11-2:重复性考察—特征峰相对保留时间比值(续)
表12-1:重复性考察—特征峰相对峰面积比值
表12-2:重复性考察—特征峰相对峰面积比值(续)
结果表明,该方法重复性良好。
实施例18
本实施例是对实施例12中二冬汤对照提取物特征图谱构建中,对方法学-中间精密度-不同制备人员和不同制备时间考察。
在以上拟定的实验条件基础上,分别在不同人员(A、B)和不同时间(T1、T2)条件下精密称取二冬汤对照提取物(批号EDT200901)各两份,制备供试品,进行测定。见表13-1、表13-2、表14-1、表14-2。
表13-1:不同人员和时间考察—特征峰相对保留时间
表13-2:不同人员和时间考察—特征峰相对保留时间(续)
表14-1:不同人员和时间考察—特征峰相对峰面积
表14-2:不同人员和时间考察—特征峰相对峰面积(续)
结果表明,由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定,方法稳定性较好。
实施例19
本实施例是对实施例12中二冬汤对照提取物特征图谱构建中,对方法学-中间精密度-不同仪器考察。
在以上拟定(实施例12中)的实验条件基础上,分别精密称取二冬汤对照提取物(批号EDT200901)一份,制备供试品溶液,分别在岛津LC-20AD型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters 2695-2996型高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为Agilent ZORBAX SB-AQ 250×4.6mm)。见表15-1、表15-2,表16-1、表16-2。
表15-1:不同仪器考察—特征峰相对保留时间
表15-2:不同仪器考察—特征峰相对保留时间(续)
表16-1:不同仪器考察—特征峰相对峰面积比值
表16-2:不同仪器考察—特征峰相对峰面积比值(续)
结果表明,不同仪器条件下,各特征峰相对保留时间的RSD在0.39%~3.30%;各特征峰相对峰面积的RSD在3.19%~21.26%。
实施例20
本实施例是对实施例12中二冬汤对照提取物特征图谱构建中,对方法学-耐用性-色谱柱耐用性考察。
在以上拟定的实验条件基础上,分别对色谱柱为Agilent ZORBAX SB-AQ 250×4.6mm、Phenomenex Luna 5um C18(2)100A 4.6×250mm、Kromasil 100-5-C18 5μm 250×4.6mm时进行考察。见表17-1、表17-2,、表18-1、表18-2。
表17-1:色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间
表17-1:色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间(续)
表18-1:色谱柱耐用性考察—特征峰相对峰面积比值
表18-2:色谱柱耐用性考察—特征峰相对峰面积比值(续)
结果表明,用上述3种色谱柱对样品进行检测,特征峰相对保留时间的RSD在0.06%~0.84%,特征峰相对峰面积的RSD在1.36%~11.33%。结果表明该方法的耐用性良好。
实施例21
本实施例是对实施例12中二冬汤对照提取物特征图谱构建中,对方法学-稳定性考察。
在实施例12中的实验条件基础上,取同一供试品溶液,分别于0h,4h、8h,12h,18h,24h时测定。见表19-1、表19-2、表20-1、表20-2。
表19-1:24小时稳定性考察—特征峰保留时间
表19-2:24小时稳定性考察—特征峰保留时间(续)
表20-1:24小时稳定性考察—特征峰峰面积比值
表20-2:24小时稳定性考察—特征峰峰面积比值(续)
结果表明,其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.99%~3.93%,样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述,各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求,该方法良好。将上述19个特征峰纳入后续考察。
实施例22
本实施例是在实施例12-21的基础上,特征峰的进一步确定及对照图谱的建立。
采用拟定的方法对本品10批样品进行特征图谱的测定,计算相对保留时间、相对峰面积。见图11、表21-1、表21-2、表22-1、表22-2。在图11中,S1~S10为:EDT200901、EDT200902、EDT200903、EDT200904、EDT200905、EDT200906、EDT200907、EDT200908、EDT200909、EDT200910。
表21-1:10批二冬汤对照提取物相对保留时间
表21-1:10批二冬汤对照提取物相对保留时间(续)
表22-1:10批二冬汤对照提取物相对峰面积
表22-2:10批二冬汤对照提取物相对峰面积(续)
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出原则,共选择了19个重复性较好的峰作为特征峰。
供试品特征图谱中应呈现19个特征峰,其中峰1、峰10、峰15应分别与L-色氨酸、黄芩苷、甘草酸对照品参照物峰保留时间相对应。与黄芩苷参照物峰相应的峰作为S1峰,计算峰2~峰12与S1峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±8%范围之内。规定值为0.629(峰2)、0.653(峰3)、0.740(峰4)、0.762(峰5)、0.794(峰6)、0.826(峰7)、0.837(峰8)、0.858(峰9)、1.025(峰11)、1.143(峰12)。与甘草酸参照物峰相应的峰作为S2峰,计算峰13~峰19与S2峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±8%范围之内。规定值为0.916(峰13)、0.935(峰14)、1.017(峰16)、1.089(峰17)、1.150(峰18)、1.214(峰19)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对10批二冬汤对照提取物进行合成,建立了二冬汤对照提取物特征图谱的对照图谱。见图12。图12中,峰1:L-色氨酸;峰2:芒果苷;峰7:甘草苷;峰8:金丝桃苷;峰9:野黄芩苷;峰10(S1):黄芩苷;峰11:异甘草苷;峰14:黄芩素;峰15(S2):甘草酸;峰17:汉黄芩苷。得到的图示12与实施例12中的得到的图示4一致,证明图谱的建立方法可行。
实施例23
本实施例是在实施例12得到二冬汤提取物的特征图谱的基础上,用于鉴别二冬汤提取物的具体检测方法,包括以下步骤:
a2.称取适量本公司自行研发的二冬汤颗粒,批号为2012001,2012002,2012003的二冬汤颗粒各1份,分别制得二冬汤颗粒的供试品溶液,待鉴定;
b2.将步骤a2中制得的供试品溶液,分别注入高效液相色谱仪检测,即得对应的待鉴定的特征色谱;
c2.将步骤b2中得到的图谱,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批枇杷清肺饮对照提取物进行合成,得到该二冬汤颗粒的图谱,见附图13,将图13与图4进行比对,可以得出枇杷清肺饮颗粒的图谱的相对保留时间在此范围,即该待检测品的处方中,该项检测合格。
得到的待鉴定的特征色谱与实施例12所述方法构建得到的对应的特征图谱进行比对,若待鉴定的特征色谱与之对应的构建得到的特征色谱一致,则鉴别为质量合格,可作进一步检测。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明做任何形式上的限制,凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化,均落入本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种二冬汤提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
a.对照品溶液的制备:取L-色氨酸、黄芩苷、甘草酸对照品,加溶剂溶解,得对照品溶液;
b.供试品溶液的制备:取二冬汤对照提取物冻干粉,加溶剂,制备二冬汤对照提取物的供试品溶液;
c.将步骤a、b中得到的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测,以对照品溶液的特征图谱为参照图谱,从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰,构建二冬汤对照提取物的特征图谱;
在步骤c中,所述高效液相色谱检测条件满足:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
柱温:30℃;
流速:1.0mL/min;
进样量:10μL;
检测波长:254nm;
流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸水溶液,梯度脱洗;
所述梯度洗脱过程为:
0~35min,流动相A为2~30.5%,流动相B为98~69.5%,
35~50min,流动相A为30.5~50%,流动相B为69.5~50%,
50~65min,流动相A为50~95%,流动相B为50~5%;
所述二冬汤对照提取物的制备方法,包括以下步骤:
A、药材前处理:取药用天冬、麦冬、知母、甘草、人参、荷叶、天花粉,经过净选、润制、切制、干燥,黄芩经炮制、润制、切片、干燥后,得天冬、麦冬、知母、甘草、人参、荷叶、天花粉、黄芩饮片;
B、煎煮:按二冬汤的配方称取步骤A中的各饮片,加6-8倍量水,浸泡20-40min,煎煮20-30min,煎煮2-3次,合并药液,过滤,收集滤液;
C、浓缩:将步骤B中的滤液在温度50±2℃、负压0.080Mpa的真空度下,浓缩至相对密度为1.02-1.06,得浓缩液;
D、冷冻干燥:将步骤C中的浓缩液,先在常压下预冻,再在压力为0.0pa条件下升华干燥,再进行解析干燥后,在温度10-26℃、相对湿度40-60%环境下收粉、称重、分装于棕色西林瓶,并封口,得二冬汤对照提取物冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种二冬汤提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,所述步骤A中,药材前处理步骤为:取药用天冬、麦冬、黄芩、知母、甘草,净选至饮片检查无泥沙、杂质、非药用部位;再取药用天花粉、荷叶、人参,以及净选后的麦冬、甘草、知母、天冬、润制至手握法检查润至透心;再切制,至饮片长度检查,异形片不得超过10%;再干燥至符合水分要求,得天花粉、荷叶、人参、麦冬、甘草、知母、天冬;且将净选后的黄芩,置沸水中煮10min或蒸30min,取出,闷透,切薄片,干燥,得炮制后的黄芩饮片。
3.根据权利要求2所述的一种二冬汤提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,所述步骤D中,预冻的条件是:在常压、温度在-50℃下,维持3h。
4.根据权利要求3所述的一种二冬汤提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,所述步骤D中,升华干燥的条件是:
温度-40℃,维持1h;
温度-30℃,维持1h;
温度-20℃,维持2h;
温度-10℃,维持3h;
温度0℃,维持3h。
5.根据权利要求4所述的一种二冬汤提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,所述步骤D中,解析干燥的条件是:
温度10℃,维持3h,压力0.0pa;
温度20℃,维持2h,压力0.0pa;
温度30℃,维持2h,压力0.0pa;
温度45℃,维持22h,压力0.0pa。
6.根据权利要求5所述的一种二冬汤提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,所述步骤A中,干燥的条件是:所述天冬、麦冬、知母、人参、甘草、天花粉、荷叶、黄芩,干燥温度为75±5℃,干燥至符合水分要求。
7.根据权利要求6所述的一种二冬汤提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,所述步骤B中,按二冬汤的配方称取步骤A中的各饮片,一煎,加入8倍量水,浸泡30min,煎煮30min;二煎加入6倍量水,煎煮20min,合并药液,过滤,收集滤液。
8.根据权利要求7所述的一种二冬汤提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,所述步骤B中,过滤的条件是采用200目过滤的过滤器进行过滤,再收集滤液。
9.根据权利要求1-8任一种二冬汤提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,所述二冬汤的配方为,按质量份数计:天冬7.46份,麦冬11.19份,黄芩3.73份,知母3.73份,人参1.87份,甘草3.73份,天花粉3.73份,荷叶1.87份。
10.一种二冬汤对照提取物,其特征在于:根据权利要求9的二冬汤对照提取物的制备方法制得的二冬汤对照提取物,所述二冬汤对照提取物的冻干粉水分为3.9%-5.9%,棕黄色至黄棕色粉末,气微,味微甜。
11.根据权利要求1所述的一种二冬汤提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,所述步骤a中,对照品溶液的制备方法包括:取L-色氨酸、黄芩苷、甘草酸对照品,分别加70%甲醇制成每1ml含80μg的混合溶对照品液。
12.根据权利要求1所述的一种二冬汤提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,所述步骤b中,供试品溶液的制备方法包括:取二冬汤对照提取物冻干粉0.35g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25mL,密塞,称定重量,超声处理,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,得二冬汤对照提取物的供试品溶液。
13.根据权利要求1所述的一种二冬汤提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,二冬汤对照提取物冻干粉的制备步骤包括:
a1:按原料重量份数计,取饮片天冬7.46份,麦冬11.19份,黄芩3.73份,知母3.73份,人参1.87份,甘草3.73份,天花粉3.73份,荷叶1.87份;
b1:将a1步骤中的全部饮片,放在煎煮容器中,一煎加8倍量水,浸泡30min,煎煮30min;第二次加6倍量水,煎煮30min,共煎煮2次,过滤,合并滤液,冷冻干燥成冻干粉。
14.根据权利要求13所述的一种二冬汤提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,在步骤b1中,所述冷冻干燥工艺包括预冻、升华干燥、解析干燥。
15.一种二冬汤提取物的鉴别方法,其特征在于,包括以下步骤:
a2.称取待鉴定的二冬汤提取物冻干粉适量,分别制得二冬汤提取物的供试品溶液;
b2.将步骤a2中制得的供试品溶液,分别注入高效液相色谱仪检测,即得对应的待鉴定的特征色谱;
c2.将步骤b2中得到的待鉴定的特征色谱与权利要求1所述方法构建得到的对应的特征图谱进行比对,若待鉴定的特征色谱与之对应的构建得到的特征色谱一致,则鉴别为质量合格。
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