CN114689773B - 一种小承气汤对照提取物及其制备方法、特征图谱和特征图谱的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小承气汤对照提取物及其制备方法、特征图谱和特征图谱的构建方法，属于中药检测技术领域，小承气汤对照提取物及其制备方法的提出，解决了现有技术中，小承气汤的质量检测成本高，检测难度大的问题；小承气汤对照提取物特征图谱和特征图谱的构建方法的提出，也适用于小承气汤其他剂型的特征图谱的构建，以及小承气汤的质量检测，通过高效液相色谱法建立小承气汤的特征图谱，包括其相应的供试品的溶液制备，对照品的选取和对照溶液的制备进行的研究，得到相应的特征图谱，实现了小承气汤的快速鉴别，填补了小承气汤及其制剂质量控制中特征图谱的研究空白，为经典名方小承气汤的质量提升提供有力保障；也利于该方剂的进一步研究。

Description

一种小承气汤对照提取物及其制备方法、特征图谱和特征图 谱的构建方法

技术领域

本发明涉及中药生产技术领域，具体涉及一种小承气汤对照提取物及其制备方法、特征图谱和特征图谱的构建方法。

背景技术

小承气汤始见于汉代医圣张仲景的《伤寒杂病论》，是一种临床常用的中药汤剂，其中大黄为君药，厚朴、枳实为臣药。该汤剂主要用于治疗阳明腑实证，可宣气除滞，清热通便，用于治疗腹涨便秘，记载的煎法为：“取大黄四两(酒洗)、厚朴二两(炙，去皮)，枳实三枚(大者，炙)，以水四升，煮取一升二合，去滓，分温二服”。

按照《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求》(征求意见稿)、《古代经典名方关键信息表(7首方剂)》(征求意见稿)中苓桂术甘汤剂量、制法等考证，通过考证的结果可知小承气汤现代的煎法为：“取大黄55.2g，厚朴27.6g，枳实三枚，加水800mL，煮取240mL，去滓，分两次温服”。

经典名方是由多味药组成的复方，由于自身成分的复杂性和影响因素的多样性，如何客观评价经典名方中质量控制也一直是中药现代化道路上的一个难题。并且化学对照品研制困难，分离难度大，单体不稳定，相应的生产成本及技术要求高，检测成本昂贵，对于一些不易获得的化学对照品供应数量更是有限，在实际应用中有诸多限制，难以推广，而目前中国食品药品检定研究院没有经典名方的对照提取物。

基于上述这些困难，对照提取物能很好的解决这些问题。中药对照提取物是一类非单体成分对照物，对照提取物于单一对照品而言易制备，价格低，稳定性好，配制操作相对简单，作为标准物质可以大大减少单体对照品的使用，从而节约中药稀有资源，降低检验成本；利用对照提取物的定性作用，可以鉴别出经典名方中药材的不同的基原以及对药材的真伪性做出评价。从而能客观的评价经典名方中药物的质量控制。

中药对照提取物已经成为我们国家中药材对照品发展的一个潮流，对对照提取物的研究已成了一种必要性和迫切性。其中，常用汤方-小承气汤的对照提取物的研究不够成熟，且加水量、煎煮时间、加水倍数和冻干工艺等关键的参数都将影响小承气汤对照提取物制备工艺，如何选取各工艺路线以及控制参数，来实现容易推广，省时省人工，还需要对整个工艺进行更多的研究。

发明内容

本发明的旨在建立小承气汤对照提取物及制备工艺研究，对照提取物对小承气汤特征图谱的研究做对照参照，作为一种定性的作用，有效的控制中药材的质量，为中药复方制剂的质量控制提供技术支持。

本发明通过下述技术方案实现：

一种小承气汤对照提取物的制备方法，包括以下步骤：

A、药材前处理：取药用大黄、厚朴和枳实，净选至饮片检查无泥沙、杂质、非药用部位；再润制至手握法检查润至透心；再切制至饮片长度检查，异形片不得超过10％；再炮制、干燥后得酒大黄、姜厚朴和麸炒枳实饮片；

B、煎煮：按小承气汤的配方称取步骤A中的各饮片，加6-8倍量水，浸泡20-40min，煮沸后，微沸煎煮20-30min，煎煮2-3次，合并药液，过滤，收集滤液；

C、浓缩：将步骤B中的滤液在温度50±2℃、负压0.080Mpa的真空度下，浓缩至相对密度为1.02-1.06，得浓缩液；

D、冷冻干燥：将步骤C中的浓缩液，先在常压下预冻，再在压力为0.0pa条件下升华干燥，再进行解析干燥后，在温度10-26℃、相对湿度40-60％环境下快速收粉、称重、分装于棕色西林瓶，并封口，得小承气汤对照提取物冻干粉。

进一步的，所述步骤D中，升华干燥的条件是：

温度-40℃，维持1h；

温度-30℃，维持1h；

温度-20℃，维持2h；

温度-10℃，维持3h；

温度0℃，维持3h。

更进一步的，所述步骤D中，解析干燥的条件是：

温度10℃，维持3h，压力0.0pa；

温度20℃，维持2h，压力0.0pa；

温度30℃，维持2h，压力0.0pa；

温度45℃，维持22h，压力0.0pa。

进一步的，所述小承气汤的配方为大黄55.2g、姜厚朴27.6g、枳实三枚的倍数。

一种小承气汤对照提取物的特征图谱的构建方法，包括以下步骤：

a.对照品溶液的制备：取没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、和厚朴酚对照品，加70％甲醇制成每1mL含40μg各对照品的混合溶液，得对照品溶液；

b.供试品溶液的制备：取小承气汤对照提取物的冻干粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得小承气汤对照提取物的供试品溶液；

c.将步骤a、b中得到的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，以对照品溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建小承气汤对照提取物的特征图谱。

进一步的，所述高效液相色谱检测条件满足：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

柱温：30℃；

流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；

检测波长：260nm；

流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，梯度脱洗。

进一步的，所述梯度洗脱过程为：

0～20min，流动相A为5～10％，流动相B为95～90％，

20～40min，流动相A为10～15％，流动相B为90～85％，

40～80min，流动相A为15～20％，流动相B为85～80％，

80～110min，流动相A为20～30％，流动相B为80～70％；

110～130min，流动相A为30～45％，流动相B为70～55％；

130～150min，流动相A为45～90％，流动相B为55～10％。

一种小承气汤对照提取物的特征图谱的构建方法所得到的特征图谱，所述特征图谱包含24个共有峰，24个共有峰中包括没食子酸、芸香柚皮苷、柚皮苷、野漆树苷、新橙皮苷、番泻苷A、橙皮苷、肉桂酸、芦荟大黄素、大黄酸、川陈皮素、大黄素、和厚朴酚、厚朴酚、大黄酚、大黄素甲醚的特征峰。

一种小承气汤对照提取物，所述小承气汤对照提取物的冻干粉水分为4.8-6.7％，棕黄色至棕褐色粉末，气微，味微苦。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

(1)、小承气汤作为中医临床上常用的中药汤剂，也是后世医家在辨证论治的基础，本发明提供了一种小承气汤对照提取物及其制备方法、特征图谱以及特征图谱的构建方法，可以弥补现有技术中小承气汤质量控制中特征图谱的研究空白，为传统方剂的质量提升提供有力保障；另一方面也为经典名方小承气汤的研究开发提供有效的研究基础。

(2)、本发明方法通过多批小承气汤冻干粉的验证，制定了24个共有特征峰。并通过对24个特征峰的相对保留时间进行规定，可快速的鉴别供试品溶液中的大黄、姜厚朴和枳实，为小承气汤或其制剂的定性鉴别提供有力的保障。

(3)、本发明方法以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，具有操作简单、分离度好、精密度高、重复性好以及稳定性好等优点。

(4)、本发明中，用本技术方案中的参数，得到的图谱基线平稳、分离度好、峰形较好、出峰较多、首次提供了对小承气汤处方药味的全面控制的特征图谱方法。

(5)、本发明中，用小承气汤的对照提取物作为对照品，比现有技术中利用小承气汤中的某些单一化学成分对照品更容易实现，节约中药稀有资源，降低检验成本，利用对照提取物的定性作用，可以对复方制剂的质量做出较为客观的评价。

附图说明

图1为实施例4中的小承气汤的吸水率曲线。

图2是实施例7中的小承气汤对照提取物冻干工艺的曲线。

图3是实施例9中小承气汤对照提取物的对照特征图谱。

图4是实施例10中考察专属性的图谱。

图5是实施例7中的小承气汤对照提取物特征图谱。

图6是小承气汤对照提取物特征图谱的对照图谱。

具体实施方式

本发明提供一种小承气汤对照提取物的特征图谱、特征图谱构建方法和鉴别方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅用以理解本发明，并不用于限定本发明。

以下通过具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例中所涉及的实验仪器及材料如下：

煎药壶：美味世家全自动分体式陶瓷煎药壶4升；

筛网：九峰筛网200目；

真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司LGJ-100F；

西林瓶压盖机：SZ20A；

2000mL不锈钢量杯若干；西林瓶：10mL，30mL，50mL若干；

高效液相色谱仪：Waters 2695-2996型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、岛津20-AD型高效液相色谱仪；

超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；

电子天平：上海方瑞仪器有限公司JY系列百分之一天平、ME204E/02、MS205DU、

XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 250×4.6mm、Kromasil C18 5μm 4.6×250mm、

Phenomenex Luna 5um C18(2)100A 4.6×250mm。

试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；

试药：没食子酸(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201005，含量以90.8％计)，

野漆树苷(北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：180205，含量以98％计)，

川陈皮素(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20031701，含量以98％计)；

肉桂酸(中国食品药品检定研究院，批号：110786-201604，含量以98.8％计)；

大黄酚(中国食品药品检定研究院，批号：110796-201922，含量以99.4％计)；大黄素(中国食品药品检定研究院，批号：110756-201512，含量以98.7％计)；

大黄酸(中国食品药品检定研究院，批号：110757-201607，含量以99.3％计)；

和厚朴酚(中国食品药品检定研究院，批号：110730-201614，含量以99.3％计)；

厚朴酚(中国食品药品检定研究院，批号：110729-201714，含量以100％计)；

芦荟大黄素(中国食品药品检定研究院，批号：110795-201710，含量以98.3％计)；

大黄素甲醚(北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：181117，含量以98％计)；

番泻苷A(中国食品药品检定研究院，批号：110824-201301，含量以94.7％计)；

柚皮苷(中国食品药品检定研究院，批号：110722-201815，含量以91.7％计)；

新橙皮苷(中国食品药品检定研究院，批号：111857-201703，含量以99.2％计)；

橙皮苷(中国食品药品检定研究院，批号：110721-201818，含量以96.2％计)；

芸香柚皮苷(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq19041908，含量以98％计)。

缺麸炒枳实对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：XCQT200911)；

缺酒洗大黄对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：XCQT200912)；

缺姜厚朴对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：XCQT200913)；

大黄(药用大黄)、厚朴(厚朴)、枳实(酸橙)(四川新绿色药业科技发展有限公司提供)；

小承气汤对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：XCQT200901，XCQT200902，XCQT200903，XCQT200904，XCQT200905，XCQT200906，XCQT200907，XCQT200908，XCQT200909，XCQT200910)

实施例1

本实施例涉及小承气汤对照提取物的制备，按原料重量份数计为：大黄55.2g、姜厚朴27.6g、枳实三枚的倍数，制成冻干粉，所述小承气汤对照提取物的冻干粉水分为4.8-6.7％，棕黄色至棕褐色粉末，气微，味微苦。

实施例2

本实施例涉及小承气汤对照提取物的具体制备方法，包括以下步骤：

A、药材前处理：取药用大黄、厚朴和枳实，净选至饮片检查无泥沙、杂质、非药用部位；再润制至手握法检查润至透心；再切制至饮片长度检查，异形片不得超过10％；再炮制、干燥后得酒大黄、姜厚朴和麸炒枳实饮片。更具体的，所述大黄：选药用大黄，除去杂质，用黄酒洗净，润透，切2-4mm的厚片，晾干；所述厚朴，刮去粗皮，洗净，润透，切5-10mm的宽丝，干燥。取待炮炙品，加姜汁(每100kg厚朴需姜汁10kg)拌匀，置锅内，用文火炒至姜汁被吸尽，或至规定的程度时，取出，晾干；所述枳实(酸橙)：除去杂质，洗净，润透，切1-2mm的薄片，干燥，先将炒制容器加热，至撒入麸皮(每100kg枳实需麸皮10kg)即刻烟起，随即投入待炮炙品，迅速翻动，炒至表面呈黄色或深黄色时，取出，筛去麸皮，放凉。

B、煎煮：按小承气汤的配方称取步骤A中的各饮片，一煎加8倍量水，浸泡30min，二煎加6倍量水，煎煮2次，合并药液，过滤，收集滤液；

C、浓缩：将步骤B中的滤液在温度50±2℃、负压0.080Mpa的真空度下，浓缩至相对密度为1.02-1.06，得浓缩液；

D、冷冻干燥：将步骤C中的浓缩液，先在常压下预冻，再在压力为0.0pa条件下升华干燥，再进行解析干燥后，在温度10-26℃、相对湿度40-60％环境下快速收粉、称重、分装于棕色西林瓶，并封口，得小承气汤对照提取物冻干粉。

实施例3

本实施例是对小承气汤对照提取物性状的考察。

小承气汤对照提取物经工艺制备得到一种固体粉末。10批次小承气汤对照提取物性状、水分分别见表1和表2。

表1：10批次小承气汤对照提取物性状

表2：10批小承气汤对照提取物的水分

从多批次的小承气汤对照提取物的检测结果看，小承气汤对照提取物为棕黄色至棕褐色粉末，气微，味微苦；提取物的水分实测值为4.8-6.7％，平均值为5.5％。

实施例4

在中药制药技术领域中，不同饮片吸水率有差异，因此需考察小承气汤的吸水率，进而为加水量做参考。本实施例主要考察小承气汤对照提取物制备时，吸水率的变化情况。

称取处方量的饮片100g(按大黄55.2g，厚朴27.6g，枳实3枚的比例)，两份，分别加入8倍量(水体积：处方量饮片的重量)的水，分别在浸泡10min，20min，30min，50min，1h，1.5h，2h，4h，6h，8h，16h，24h测定，计算吸水率，结果见表3，吸水率曲线见图1。

表3：

从小承气汤的吸水率曲线可知：其在前1.5h急剧吸水，2h后逐渐减小，12h吸水接近饱和，平均吸水率为213.2％。吸水率约为2倍。

实施例5

参照《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求》(征求意见稿)相关规定。对小承气汤对照提取物煎煮加水量进行考察。结合之前的实验，取小承气汤处方量的饮片(大黄55.20g，厚朴27.60g，枳实3枚)于煎药壶。参考其吸水率，可将一煎加水倍数定为8倍，二煎加水量定为6倍；或者提取2次，每次加水量控制在6-8倍量水即可，在这个范围内对最终结果影响不明显。

实施例6

取小承气汤处方量的饮片，加8倍水，每隔10min观察饮片的浸泡情况，直至饮片泡至透心。

结果表明：取小承气汤处方量的饮片，加8倍水，每隔10min观察饮片的浸泡情况，直至饮片泡至内芯湿润。浸泡至10min时，大部分饮片未浸泡透；浸泡至20min时大部分内芯湿润，少量较长饮片内芯未湿润；浸泡至30min时所有饮片内芯湿润，确定浸泡时间为30min。

实施例7

本实施例是对冷冻工艺的考察

根据《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求》(征求意见稿)中要求，对其中提取物干燥过程推荐采用冷冻干燥方法制备为宜，可保证其质量的稳定、易于保存。最后确定的冷冻干燥工艺参数见表4与图2所示。

表4：小承气汤对照提取物冻干工艺

综上，确定小承气对照提取物制备工艺为：取小承气汤处方量的饮片，加水煎煮两次，一煎加8倍水，浸泡30分钟，煮沸，保持微沸煎煮30分钟，200目筛网过滤，立即冷却至室温；二煎加6倍水，煮沸，保持微沸煎煮20分钟，200目筛网过滤，立即冷却至室温；合并水煎液，冷冻干燥，分装，即得。

实施例8

10批小承气汤对照提取物煎煮验证

采用实施例6中最后确认的方法，进行了10批小承气汤对照提取物煎煮，结果见表5。

表5：10批小承气汤对照提取物数据汇总

由表5可得，10批小承气汤对照提取物收粉率，平均值为11.56％。SD为1.08。平均值的70％-130％的范围为8.09％-15.03％。平均值加减3倍SD范围为8.32％-14.80％。

实施例9

本实施例涉及小承气汤对照提取物的特征图谱建立，具体包括以下步骤：

a.对照品溶液的制备：取没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、和厚朴酚对照品，加70％甲醇制成每1mL含40μg各对照品的混合溶液，得对照品溶液；

b.供试品溶液的制备：取小承气汤对照提取物的冻干粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得小承气汤对照提取物的供试品溶液；

c.检测：将步骤a、b中得到的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，以对照品溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建小承气汤对照提取物的特征图谱。

所述高效液相色谱检测条件满足：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

柱温：30℃；

流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；

检测波长：260nm；

流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，梯度脱洗。

所述梯度洗脱过程为：

0～20min，流动相A为5～10％，流动相B为95～90％，

20～40min，流动相A为10～15％，流动相B为90～85％，

40～80min，流动相A为15～20％，流动相B为85～80％，

80～110min，流动相A为20～30％，流动相B为80～70％；

110～130min，流动相A为30～45％，流动相B为70～55％；

130～150min，流动相A为45～90％，流动相B为55～10％。

d.以步骤c中对照品溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建小承气汤对照提取物的特征图谱。小承气汤对照提取物特征图谱中应呈现24个特征峰，其中峰1、峰8、峰12、峰21应分别与没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、和厚朴酚对照品参照物峰保留时间相对应。与柚皮苷参照物峰相应的峰作为S1峰，计算峰2～峰7与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％范围之内。规定值为0.512(峰2)、0.614(峰3)、0.730(峰4)、0.817(峰5)、0.845(峰6)、0.906(峰7)。与橙皮苷参照物峰相应的峰作为S2峰，计算峰9～峰15与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％范围之内。规定值为0.921(峰9)、0.925(峰10)、0.939(峰11)、1.171(峰13)、1.215(峰14)、1.320(峰15)。与和厚朴酚参照物峰相应的峰作为S3峰，计算峰16～峰24与S3峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％范围之内。规定值为0.872(峰16)、0.916(峰17)、0.925(峰18)、0.935(峰19)、0.986(峰20)、1.001(峰22)、1.018(峰23)、1.037(峰24)，如图3所示。

本实施例中使用的图谱构建方法，同样适用于小承气汤的其他制剂，比如以口服液、水煎液为例的液体制剂，以片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂为例的固体制剂。

实施例10

本实施例涉及鉴别缺某味或者多味药材的“小承气汤对照提取物”的鉴别。具体步骤如下：

对照品溶液的制备：取没食子酸、野漆树苷、川陈皮素、肉桂酸、大黄酚、大黄素、大黄酸、和厚朴酚、厚朴酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚、番泻苷A、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、芸香柚皮苷分别加70％甲醇制成每1mL含40μg的混合溶液，即得。

阴性对照溶液的制备：

按以上拟定的实验条件，制备缺小承气汤对照提取物阴性对照溶液。

按以上拟定的实验条件，制备缺麸炒枳实对照提取物阴性对照溶液。

按以上拟定的实验条件，制备缺酒洗大黄对照提取物阴性对照溶液。

按以上拟定的实验条件，制备缺姜厚朴对照提取物阴性对照溶液。

对小承气汤对照提取物特征图谱峰进行定位。结果如图4。其中，A为小承气汤对照提取物；B为缺姜厚朴阴性对照；C为缺麸炒枳实阴性对照；D为缺酒洗大黄阴性对照；E为缺小承气汤对照提取物对照；F为对照品混标。

由图4可知，其中，和厚朴酚、厚朴酚所在峰是厚朴特有峰；肉桂酸、大黄酚、大黄素、大黄酸，芦荟大黄素、大黄素甲醚，没食子酸，番泻苷A所在峰是大黄特有峰；野漆树苷、川陈皮素、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、芸香柚皮苷所在峰是枳实特有峰。

实施例11

精密度试验

取小承气汤对照提取物(批号XCQT200901)供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μL，计算保留时间及峰面积。如表6、表7。

表6：精密度考察—特征峰保留时间

续表6

表7：精密度考察—特征峰峰面积

续表7(1)

续表7(2)

续表7(3)

结果表明，该仪器精密度良好。

实施例12

重复性考察

精密称取小承气汤对照提取物(批号XCQT200901)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表8、表9。

表8：重复性考察—特征峰相对保留时间比值

续表8

表9：重复性考察—特征峰相对峰面积比值

/>

续表9

结果表明，该方法重复性良好。

实施例13

中间精密度考察

不同制备人员和不同制备时间考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别在不同人员(A、B)和不同时间(T1、T2)条件下精密称取小承气汤对照提取物(批号XCQT200901)各两份，制备供试品，进行测定。见表10、表11。

表10：不同人员和时间考察—特征峰相对保留时间

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续10

表11：不同人员和时间考察—特征峰相对峰面积

续11

实施例14

不同仪器考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取小承气汤对照提取物(批号XCQT200901)两份，制备供试品溶液，分别在岛津LC-20AD型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters 2695-2996型高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为AgilentZORBAX SB-C18 250×4.6mm)。见表12、13。

表12：不同仪器考察—特征峰相对保留时间

续表12

表13：不同仪器考察—特征峰相对峰面积比值

续表13

结果表明，不同仪器条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.75％～3.21％；各特征峰相对峰面积的RSD在5.06％～30.72％。

实施例15

耐用性考察

色谱柱耐用性考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 250×4.6mm、Phenomenex Luna 5um C18(2)100A 4.6×250mm、Kromasil 100-5-C18 5μm 250×4.6mm时进行考察。见表14、15。

表14：色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间

续表14

表15：色谱柱耐用性考察—特征峰相对峰面积比值

续表15

结果表明，用上述3种色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在0.21％～3.62％，特征峰相对峰面积的RSD在5.13％～28.72％。

实施例16

稳定性考察

在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，4h、8h，12h，18h，24h时测定。见表16、17。

表16：24小时稳定性考察—特征峰保留时间

续16

表17：24小时稳定性考察—特征峰峰面积比值

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表17(续1)

表17(续2)

表17(续3)

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结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.70％～2.38％，样品溶液在24小时内较稳定。

综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述24个特征峰纳入后续考察。

实施例17

特征峰的确定及对照图谱的建立

采用拟定的方法对本品10批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。见图5，表18、19。S1～S10为：XCQT200901、XCQT200902、XCQT200903、XCQT200904、XCQT200905、XCQT200906、XCQT200907、XCQT200908、XCQT200909、XCQT200910。

表18：10批小承气汤对照提取物相对保留时间

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续表18

表19：10批小承气汤对照提取物相对峰面积

续表19

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根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出原则，共选择了24个重复性较好的峰作为特征峰。

最终选定：供试品特征图谱中应呈现24个特征峰，其中峰1、峰8、峰12、峰21应分别与没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、和厚朴酚对照品参照物峰保留时间相对应。与柚皮苷参照物峰相应的峰作为S1峰，计算峰2～峰7与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％范围之内。规定值为0.512(峰2)、0.614(峰3)、0.730(峰4)、0.817(峰5)、0.845(峰6)、0.906(峰7)。与橙皮苷参照物峰相应的峰作为S2峰，计算峰9～峰15与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％范围之内。规定值为0.921(峰9)、0.925(峰10)、0.939(峰11)、1.171(峰13)、1.215(峰14)、1.320(峰15)。与和厚朴酚参照物峰相应的峰作为S3峰，计算峰16～峰24与S3峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％范围之内。规定值为0.872(峰16)、0.916(峰17)、0.925(峰18)、0.935(峰19)、0.986(峰20)、1.001(峰22)、1.018(峰23)、1.037(峰24)。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对10批小承气汤对照提取物进行合成，建立了小承气汤对照提取物特征图谱的对照图谱。见图6。其中：峰1：没食子酸；峰7：芸香柚皮苷；峰8(S1)：柚皮苷；峰9：野漆树苷；峰10：新橙皮苷；峰11：番泻苷A；峰12(S2)：橙皮苷；峰13：肉桂酸；峰16：芦荟大黄素；峰17：大黄酸；峰18：川陈皮素；峰20：大黄素；峰21(S3)：和厚朴酚；峰22：厚朴酚；峰23：大黄酚；峰24：大黄素甲醚。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种小承气汤对照提取物特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.对照品溶液的制备：取没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、和厚朴酚对照品，加70%甲醇制成每1mL含40μg各对照品的混合溶液，得对照品溶液；

b.供试品溶液的制备：取小承气汤对照提取物的冻干粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得小承气汤对照提取物的供试品溶液；

c.将步骤a、b中得到的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，以对照品溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建小承气汤对照提取物的特征图谱，

其中，高效液相色谱仪的检测条件满足：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

柱温：30℃；

流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；

检测波长：260nm；

流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液，梯度脱洗；

所述梯度洗脱过程为：

0～20min，流动相A为5～10%，流动相B为95～90%，

20～40min，流动相A为10～15%，流动相B为90～85%，

40～80min，流动相A为15～20%，流动相B为85～80%，

80～110min，流动相A为20～30%，流动相B为80～70%；

110～130min，流动相A为30～45%，流动相B为70～55%；

130～150min，流动相A为45～90%，流动相B为55～10%；

d. 以步骤 c 中对照品溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建小承气汤对照提取物的特征图谱，小承气汤对照提取物特征图谱中应呈现 24个特征峰，24个共有峰中包括没食子酸、芸香柚皮苷、柚皮苷、野漆树苷、新橙皮苷、番泻苷A、橙皮苷、肉桂酸、芦荟大黄素、大黄酸、川陈皮素、大黄素、和厚朴酚、厚朴酚、大黄酚、大黄素甲醚的特征峰，其中峰1、峰8、峰12、峰21 应分别与没食子酸、柚皮苷、橙皮苷、和厚朴酚对照品参照物峰保留时间相对应。

2.根据权利要求1所述的一种小承气汤对照提取物特征图谱的构建方法，其特征在于，所述小承气汤对照提取物的制备方法包括以下步骤：

A、药材前处理：取药用大黄、厚朴和枳实，净选至饮片检查无泥沙、杂质、非药用部位；再润制至手握法检查润至透心；再切制至饮片长度检查，异形片不得超过10%；再炮制、干燥后得酒大黄、姜厚朴和麸炒枳实饮片；

B、煎煮：按小承气汤的配方称取步骤A中的各饮片，加6-8倍量水，浸泡20-40min，煎煮20-30min，煎煮2-3次，合并药液，过滤，收集滤液；

C、浓缩：将步骤B中的滤液在温度50±2℃、负压0.080Mpa的真空度下，浓缩至相对密度为1.02-1.06，得浓缩液；

D、冷冻干燥：将步骤C中的浓缩液，先在常压下预冻，再在压力为0.0pa条件下升华干燥，再进行解析干燥后，在温度10-26℃、相对湿度40-60%环境下收粉、称重、分装于棕色西林瓶，并封口，得小承气汤对照提取物冻干粉。

3.根据权利要求2所述的一种小承气汤对照提取物特征图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤D中，升华干燥的条件是：

温度-40℃，维持1h；

温度-30℃，维持1h；

温度-20℃，维持2h；

温度-10℃，维持3h；

温度0℃，维持3h。

4.根据权利要求3所述的一种小承气汤对照提取物特征图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤D中，解析干燥的条件是：

温度10℃，维持3h，压力0.0pa；

温度20℃，维持2h，压力0.0pa；

温度30℃，维持2h，压力0.0pa；

温度45℃，维持22h，压力0.0pa。

5.根据权利要求1-4任一项所述的一种小承气汤对照提取物特征图谱的构建方法，其特征在于：所述小承气汤对照提取物的冻干粉水分为4.8-6.7%，棕黄色至棕褐色粉末，气微，味微苦。