CN110895265A - 一种瓜蒌配方颗粒基源鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中药配方颗粒检测技术领域，公开了一种瓜蒌配方颗粒基源鉴定的方法，所述方法以甲醇‑0.1％甲酸水溶液为流动相，采用梯度洗脱并结合紫外荧光检测器检测的液相色谱分析得到瓜蒌配方颗粒的特征图谱，然后以5号色谱峰的香草酸色谱峰为参照峰，计算3号色谱峰与4号色谱峰相对峰面积的比值，根据两者的比值即可判定所述瓜蒌配方颗粒的基源，操作简便、高效，弥补了瓜蒌配方颗粒基源鉴定技术领域的空缺，该方法可作为栝楼配方颗粒或双边栝楼配方颗粒的专属鉴别方法。

Description

一种瓜蒌配方颗粒基源鉴定的方法
技术领域
本发明涉及中药配方颗粒检测技术领域，具体涉及一种瓜蒌配方颗粒基源鉴定的方法。
背景技术
瓜蒌为葫芦科栝楼属植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.或双边栝楼Trichosanthes rosthornii Harms的干燥成熟果实，其果皮、种子和根分别以瓜蒌皮、瓜蒌子和天花粉入药。据考证，瓜蒌始载于《神农本草经》，列为中品，为中医清热解毒的常用药物。历代所用瓜蒌的原植物为藤本、有卷须、单叶，3～5裂或不裂、果实圆形或长圆形，先端有花柱基或无，果实成熟后黄色，形态描述符合葫芦科植物的主要特征，结合葫芦科栝楼属植物在我国的分布区域，应以栝楼为药材瓜蒌的主要来源，但药材中也有双边栝楼和王瓜等同科属植物的果实同用。2015年版《中华人民共和国药典》规定瓜蒌的原植物为葫芦科栝楼属植物栝楼或双边栝楼。
现有技术对瓜蒌类药材的研究有很多，如采用紫外荧光法鉴别瓜蒌类药材，该方法将瓜蒌类药材样品的果皮、果仁粉碎后用甲醇浸泡提取，制成供试液，然后取少量供试液滴于滤纸上，再置于365nm紫外荧光灯下观察荧光的颜色，并将该结果与瓜蒌对照药材荧光的颜色进行比对，进而鉴定是否为瓜蒌真品，然而该方法只能进行瓜蒌真伪品的区分，且针对的是瓜蒌药材，无法进行瓜蒌相关剂型的鉴别。另外，由于栝楼与双边栝楼无论从形状还是临床功效上均没有明显差异，故很少有研究关注瓜蒌药材的基源问题，由此导致全瓜蒌配方颗粒领域几乎没有任何可以进行基源鉴定的方法。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术无法区分栝楼配方颗粒和双边栝楼配方颗粒的缺陷，从而提供一种瓜蒌配方颗粒基源鉴定的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种瓜蒌配方颗粒基源鉴定的方法，包括如下步骤：
采用液相色谱法对所述瓜蒌配方颗粒的供试品溶液进行分析，所得特征图谱中，5号色谱峰是香草酸的特征峰，以香草酸特征峰为参照峰，计算 3号色谱峰与4号色谱峰相对峰面积的比值。
进一步地，所述液相色谱法的色谱条件为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱，以甲醇为A相，以0.1％甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，洗脱过程为：0-2.5min，A相： 2％、B相：98％；2.5-4min，A相：2-15％、B相：98-85％；4-4.5min，A 相：15％、B相：85％；4.5-7.5min，A相：15-20％、B相85-80；7.5-8.5min， A相：20-35％、B相80-65％；8.5-10min，A相35-2％、B相：65-98％；10-12min，A相：2％、B相98％；检测波长为250nm。
更进一步地，所述色谱条件中流速为0.35mL/min，柱温为35℃，进样量为1μL。
进一步地，所述供试品溶液的制备方法为：取所述瓜蒌配方颗粒，研磨，称取0.2g，加入10mL水，超声提取25～35分钟，放冷至室温，摇匀，过滤，所得滤液即为所述瓜蒌配方颗粒的供试品溶液。
进一步地，所述瓜蒌配方颗粒的制备方法包括如下步骤：取瓜蒌饮片，加入所述瓜蒌饮片质量13倍质量的水，沸腾提取1小时，过滤，向滤渣中加入所述滤渣质量11倍质量的水，沸腾提取1小时，过滤，合并二次滤液， 70℃下减压浓缩。
进一步地，所述瓜蒌配方颗粒的制备方法还包括：减压浓缩至料液在 55℃下的密度为1.30～1.40g/cm3，80℃下干燥，即得所述瓜蒌配方颗粒的步骤。
进一步地，所述瓜蒌配方颗粒的制备方法还包括：减压浓缩至料液在 60℃下的密度为1.10～1.15g/cm3，加入占所述瓜蒌饮片质量20％的辅料， 170～180℃下干燥，即得所述瓜蒌配方颗粒的步骤。
更进一步地，所述瓜蒌饮片由瓜蒌药材经炮制得到。
进一步地，所述鉴定方法包括如下步骤：
参照物溶液的制备
取栝楼对照药材1g，加水10mL，超声提取30分钟，放冷至室温，摇匀，过滤，所得滤液即为栝楼对照药材参照物溶液；
取双边栝楼对照药材1g，加水10mL，超声提取30分钟，放冷至室温，摇匀，过滤，所得滤液即为双边栝楼对照药材参照物溶液；
取香草酸对照品，加入甲醇，充分溶解，制成每1mL含香草酸20μg 的溶液，作为对照品参照物溶液；
供试品溶液的制备
取所述瓜蒌配方颗粒，研磨，称取0.2g，加入10mL水，超声提取30 分钟，放冷至室温，摇匀，过滤，所得滤液即为所述瓜蒌配方颗粒的供试品溶液；
液相色谱测定分析
分别吸取所述参照物溶液和所述供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行分析，并对多个图谱进行比较，选出共有特征峰，其中，5号色谱峰是香草酸的特征峰，以香草酸特征峰为参照峰，计算3号色谱峰与4号色谱峰相对峰面积的比值。
本发明的技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的瓜蒌配方颗粒基源鉴定的方法，以甲醇-0.1％甲酸水溶液为流动相，采用梯度洗脱并结合紫外荧光检测器检测的液相色谱分析得到瓜蒌配方颗粒的特征图谱，然后以5号色谱峰的香草酸特征峰为参照峰，计算3号色谱峰与4号色谱峰相对峰面积的比值，根据两者的比值即可判定所述瓜蒌配方颗粒的基源，操作简便、高效，弥补了瓜蒌配方颗粒基源鉴定技术领域的空缺，该方法可作为栝楼配方颗粒或双边栝楼配方颗粒的专属鉴别方法。
2.本发明提供的瓜蒌配方颗粒基源鉴定的方法，对照药材参照物溶液和供试品溶液均采用水提法提取得到，制备方法相同，由此得到的对照药材参照物相色谱与供试品液相色谱对比分析时更加准确，专属性更强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中栝楼与双边栝楼对照药材参照物溶液的特征图谱(其中，5号峰为香草酸S峰)；
图2是本发明实施例1中瓜蒌配方颗粒的特征图谱(其中，5号峰为香草酸S峰)。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
以下实施例中，香草酸对照品由中国食品药品检定研究院提供，纯度≥99.8％，批号：110776-201403。
实施例1
本实施例提供了一种瓜蒌配方颗粒基源鉴定的方法，包括如下步骤：
(1)确定液相色谱条件：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，填料粒径为1.7μm，柱长 100mm，内径2.1mm，柱温：35℃；
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为0.1％甲酸水溶液，流速为 0.35mL/min，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序见下表1所示：
表1流动相梯度洗脱程序
Figure RE-GDA0002364673630000061
进样量：1μL；TUV Detector紫外检测器。
(2)参照物溶液及供试品溶液的制备
取栝楼对照药材1g，加水10mL，超声提取30分钟，放冷至室温，摇匀，过滤，所得滤液即为栝楼对照药材参照物溶液。
取双边栝楼对照药材1g，加水10mL，超声提取30分钟，放冷至室温，摇匀，过滤，所得滤液即为双边栝楼对照药材参照物溶液。
取香草酸适量，精密称定，加入甲醇，充分溶解，制成每1mL含香草酸20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
取瓜蒌药材，按常规方法进行炮制，得到瓜蒌饮片。取瓜蒌饮片，加入所述瓜蒌饮片质量13倍质量的水，沸腾提取1小时，趁热用150目滤布过滤，向滤渣中加入所述滤渣质量11倍质量的水，沸腾提取1小时，趁热用150目滤布过滤，合并二次滤液，70℃下减压浓缩至料液在55℃下的密度为1.30～1.40g/cm3，80℃下用带式干燥机干燥，干法制粒，得到瓜蒌配方颗粒，密封保存待用；或者，70℃下减压浓缩至料液在60℃下的密度为 1.10～1.15g/cm3，加入占所述瓜蒌饮片质量20％的常规辅料，170～180℃下干燥，干法制粒，得到瓜蒌配方颗粒，密封保存待用。
取上述瓜蒌配方颗粒，研磨，称取0.2g，加入10mL水，超声提取30 分钟，放冷至室温，摇匀，过滤，所得滤液即为供试品溶液。
(3)确定检测波长、鉴定方法并测定分析
确定检测波长：
吸取上述供试品溶液，按照步骤(1)的检测条件，分别在波长为250nm 和260nm下进行检测，分别记录相应的色谱图，对比两种情况下的色谱图，发现检测波长为250nm时的特征图谱信息较丰富，且峰形较好，优于现有技术中报道的260nm。因此，选定250nm作为检测波长。
确定鉴定方法：
吸取对照品参照物溶液1μL，按照步骤(1)的检测条件进行检测，记录色谱图；然后再分别吸取栝楼对照药材参照物溶液和双边栝楼对照药材参照物溶液1μL，按照步骤(1)的检测条件进行检测，记录色谱图，得到栝楼及双边栝楼的特征图谱，如图1所示。将该图谱与对照品参照物溶液的图谱进行比对，确定栝楼及双边栝楼的特征图谱中5号峰为香草酸的特征峰。栝楼及双边栝楼的特征图谱中，以香草酸(5号峰)为参照峰，分别计算其余各特征峰与参照峰的相对峰面积，并根据3号峰与4号峰相对峰面积，计算两者的比值结果见下表2所示。
表2栝楼及双边栝楼相对峰面积情况
Figure RE-GDA0002364673630000071
上表2中，栝楼对照药材参照物溶液-1由中国食品药品检定研究院提供的批号为121596-201402栝楼药材制备得到；栝楼对照药材参照物溶液 2-5以及双边栝楼对照药材参照物溶液1-4是由经企业专家鉴定的基源确定的药材制备得到。
分别取栝楼配方颗粒和双边栝楼配方颗粒，按照上述步骤(2)供试品溶液的制备方法，分别制得栝楼配方颗粒的供试品溶液和双边栝楼配方颗粒的供试品溶液。
分别吸取上述18个批次的栝楼配方颗粒的供试品溶液1μL，按照步骤 (1)的检测条件进行检测，记录色谱图，与栝楼的特征图谱进行比较，找出共有特征峰。以香草酸(5号峰)为参照峰，计算其余各特征峰与参照峰的相对峰面积，并根据3号峰与4号峰相对峰面积，计算两者的比值结果见下表3所示。
分别吸取上述4个批次双边栝楼配方颗粒的供试品溶液1μL，按照步骤(1)的检测条件进行检测，记录色谱图，与双边栝楼的特征图谱进行比较，找出共有特征峰。以香草酸(5号峰)为参照峰，计算其余各特征峰与参照峰的相对峰面积，并根据3号峰与4号峰相对峰面积，计算两者的比值结果见下表3所示。
表3栝楼及双边栝楼相对峰面积情况
Figure RE-GDA0002364673630000081
Figure RE-GDA0002364673630000091
上表3中，栝楼配方颗粒的供试品溶液1-18以及双边栝楼配方颗粒的供试品溶液1-4分别由不同批次的栝楼药材及双边栝楼药材制备得到，对应药材的产地见下表4所示。
表4栝楼药材及双边栝楼药材的产地信息
Figure RE-GDA0002364673630000092
Figure RE-GDA0002364673630000101
由图1的特征图谱可知，双边栝楼的特征图谱中4号峰与3号峰的峰面积差异较大，而栝楼的特征图谱中4号峰与3号峰的峰面积接近。结合上表3中的数据可知，栝楼特征图谱中，3号峰与4号峰的相对峰面积比值为0.634～0.890，而双边栝楼特征图谱中，3号峰与4号峰的相对峰面积比值为0.119～0.145。18批栝楼配方颗粒的供试品溶液的图谱中，3号峰与4 号峰的相对峰面积比值为0.603～1.402，而双边栝楼配方颗粒的供试品溶液的图谱中，3号峰与4号峰的相对峰面积比值为0.175～0.177。因此，瓜蒌配方颗粒的特征图谱中，3号峰与4号峰的相对峰面积比值是否不小于0.6 成为栝楼与双边栝楼的鉴别点。
测定分析：
精密吸取上述参照物溶液1μL，按照步骤(1)的检测条件进行检测，记录色谱图。再精密吸取上述供试品溶液1μL，按照步骤(1)的检测条件进行检测，记录色谱图。将该图谱与参照物溶液的图谱进行比较，找出共有特征峰，得到瓜蒌配方颗粒的特征图谱，如图2所示。该特征图谱中呈现5个特征峰，其中5号峰与相应的香草酸特征峰保留时间一致；以香草酸(5号峰)为参照峰，计算其余各特征峰与参照峰的相对峰面积，结果表明，1号峰、2号峰、3号峰及4号峰的相对保留时间RSD值在2％以内，符合特征图谱分析要求。根据3号峰与4号峰相对峰面积，计算两者的比值，进而判断该配方颗粒来源于栝楼药材或双边栝楼药材，若两者的比值≥0.6，则为栝楼药材；反之，则为双边栝楼药材。
实验例1精密度考察试验
取瓜蒌配方颗粒(批号：DF180209-062550-18)，按照实施例1步骤(2) 的方法制成供试品溶液，连续进样6次，每次1μL，按照实施例1步骤(1) 的色谱条件进行检测，记录色谱图，找出共有特征峰，得到特征图谱。以5 号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD值。结果见下表5和6所示。
表5保留时间及相对保留时间表
Figure RE-GDA0002364673630000111
表6峰面积及相对峰面积表
Figure RE-GDA0002364673630000121
由上表中的数据可知，各特征峰的相对保留时间RSD在0.03％～1.25％范围内，相对峰面积的RSD在0.65％～2.39％范围内，表明该特征图谱的精密度较好。
实验例2稳定性考察试验
取瓜蒌配方颗粒(批号：DF180209-062550-18)，按照实施例1步骤(2) 的方法制成供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12h吸取1μL，按实施例1步骤(1)的检测条件进样检测，记录色谱图，以5号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。结果见下表7和8所示。
表7保留时间及相对保留时间表
Figure RE-GDA0002364673630000131
表8峰面积及相对峰面积表
Figure RE-GDA0002364673630000132
由上表中的数据可知，各特征峰的相对保留时间RSD在0.00％～0.76％范围内，相对峰面积比值RSD在1.02％～2.06％范围内，表明供试品溶液的化学成分在12小时稳定性良好。
实验例3重复性考察试验
取瓜蒌配方颗粒(批号：DF180209-062550-18)6份，按照实施例1步骤(2)的方法制成供试品溶液，按照步骤(1)的检测条件进行检测，记录色谱图，以5号峰为参照峰，计算其它峰的相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。结果见下表9和10所示。
表9保留时间及相对保留时间表
Figure RE-GDA0002364673630000141
表10峰面积及相对峰面积表
Figure RE-GDA0002364673630000151
由上表中的数据可知，各特征峰的相对保留时间RSD在0.01％～0.06％范围内，相对峰面积的RSD在1.82％～3.3％范围内，表明该特征图谱的重复性较好。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种瓜蒌配方颗粒基源鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用液相色谱法对所述瓜蒌配方颗粒的供试品溶液进行分析，所得特征图谱中，5号色谱峰是香草酸的特征峰，以香草酸特征峰为参照峰，计算3号色谱峰与4号色谱峰相对峰面积的比值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱法的色谱条件为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱，以甲醇为A相，以0.1％甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，洗脱过程为：0-2.5min，A相：2％、B相：98％；2.5-4min，A相：2-15％、B相：98-85％；4-4.5min，A相：15％、B相：85％；4.5-7.5min，A相：15-20％、B相85-80；7.5-8.5min，A相：20-35％、B相80-65％；8.5-10min，A相35-2％、B相：65-98％；10-12min，A相：2％、B相98％；检测波长为250nm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述色谱条件中流速为0.35mL/min，柱温为35℃，进样量为1μL。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法为：取所述瓜蒌配方颗粒，研磨，称取0.2g，加入10mL水，超声提取25～35分钟，放冷至室温，摇匀，过滤，所得滤液即为所述瓜蒌配方颗粒的供试品溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述瓜蒌配方颗粒的制备方法包括如下步骤：取瓜蒌饮片，加入所述瓜蒌饮片质量13倍质量的水，沸腾提取1小时，过滤，向滤渣中加入所述滤渣质量11倍质量的水，沸腾提取1小时，过滤，合并二次滤液，70℃下减压浓缩。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述瓜蒌配方颗粒的制备方法还包括：减压浓缩至料液在55℃下的密度为1.30～1.40g/cm3，80℃下干燥，即得所述瓜蒌配方颗粒的步骤。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述瓜蒌配方颗粒的制备方法还包括：减压浓缩至料液在60℃下的密度为1.10～1.15g/cm3，加入占所述瓜蒌饮片质量20％的辅料，170～180℃下干燥，即得所述瓜蒌配方颗粒的步骤。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
参照物溶液的制备
取栝楼对照药材1g，加水10mL，超声提取30分钟，放冷至室温，摇匀，过滤，所得滤液即为栝楼对照药材参照物溶液；
取双边栝楼对照药材1g，加水10mL，超声提取30分钟，放冷至室温，摇匀，过滤，所得滤液即为双边栝楼对照药材参照物溶液；
取香草酸对照品，加入甲醇，充分溶解，制成每1mL含香草酸20μg的溶液，作为对照品参照物溶液；
供试品溶液的制备
取所述瓜蒌配方颗粒，研磨，称取0.2g，加入10mL水，超声提取30分钟，放冷至室温，摇匀，过滤，所得滤液即为所述瓜蒌配方颗粒的供试品溶液；
液相色谱测定分析
分别吸取所述参照物溶液和所述供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行分析，并对多个图谱进行比较，选出共有特征峰，其中，5号色谱峰是香草酸的特征峰，以香草酸特征峰为参照峰，计算3号色谱峰与4号色谱峰相对峰面积的比值。
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