CN114965842B - 口炎清整体质量检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种口炎清整体质量检测方法及应用，属于中药质量控制技术领域。通过薄层色谱鉴别，对口炎清中全部药味进行了鉴别，并综合运用薄层色谱鉴别、特征图谱及多药味多成分含量测定等方法，构建口炎清颗粒覆盖全处方药味的整体质量检测方法，并以此进行作为质量标准，可以对口炎清颗粒的质量进行全面控制。

Description

口炎清整体质量检测方法及应用
技术领域
本发明涉及中药质量控制技术领域，特别是涉及一种口炎清整体质量检测方法及应用。
背景技术
口炎清颗粒是一款由天冬、麦冬、玄参、山银花、甘草五味中药组成的中成药，具有滋阴清热、解毒消肿的作用。现行标准收载于《中国药典》2020年版一部，标准中仅有天冬、玄参、山银花和甘草的薄层色谱鉴别以及山银花中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量测定项，标准欠完善，未能达到全药味的鉴别及实现产品质量整体控制。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种口炎清整体质量检测方法，该方法能够实现全药味的鉴别及实现产品质量整体控制。
一种口炎清整体质量检测方法，包括山银花和天冬鉴别、麦冬鉴别、甘草和玄参鉴别：
所述山银花和天冬鉴别包括以下步骤：
山银花和天冬供试品制备：取口炎清供试品，加入有机溶剂提取，提取液蒸干后的残渣加水溶解，并以水饱和正丁醇萃取，得到水饱和正丁醇萃取液，萃取液加入碱性溶液洗涤，弃去碱性溶液，再将萃取液蒸干，残渣以有机溶剂溶解，即得山银花和天冬供试品溶液；
山银花和天冬对照药材制备：分别取山银花对照药材和天冬对照药材，分别加水煎煮提取，提取液加入无水乙醇静置，滤过，取滤液以水饱和正丁醇萃取，得到水饱和正丁醇萃取液，萃取液加入碱性溶液洗涤，弃去碱性溶液，再将萃取液蒸干，残渣以有机溶剂溶解，分别得到山银花对照药材溶液和天冬对照药材溶液；
灰毡毛忍冬皂苷对照品制备：取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品，加入有机溶剂制成对照品溶液，即得灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液；
山银花和天冬薄层鉴别：分别吸取山银花和天冬供试品溶液、山银花对照药材溶液、天冬对照药材溶液和灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液，点于硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水的体积比为13︰9︰3的混合溶液的下层溶液为展开剂，展开，薄层板取出后晾干，喷以硫酸乙醇溶液，80±5℃加热显色，分别置日光和紫外光下检视天冬特征性斑点，再在105±5℃加热至斑点显色清晰，再分别置日光和紫外光下检视山银花特征性斑点；
所述麦冬鉴别包括以下步骤：
麦冬供试品制备：以所述山银花和天冬供试品溶液作为麦冬供试品溶液；
麦冬对照药材制备：取麦冬对照药材，加水煎煮提取，提取液加入无水乙醇静置，滤过，取滤液以水饱和正丁醇萃取，得到水饱和正丁醇萃取液，萃取液加入碱性溶液洗涤，弃去碱性溶液，再将萃取液蒸干，残渣以有机溶剂溶解，得到麦冬对照药材溶液；
麦冬薄层鉴别：分别吸麦冬供试品溶液和麦冬对照药材溶液，点于硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水的体积比为12︰4︰1的混合溶液的下层溶液为展开剂，展开，薄层板取出后晾干，喷以硫酸乙醇溶液，在105±5℃加热至斑点显色清晰，置紫外光下检视麦冬特征性斑点；
所述甘草和玄参鉴别包括以下步骤：
甘草和玄参供试品制备：取口炎清供试品，加入水提取，提取液用乙酸乙酯萃取，取水层，并以水饱和正丁醇萃取，得到水饱和正丁醇萃取液，用水洗涤，弃去水洗涤液，再将萃取液蒸干，残渣以有机溶剂溶解，即得甘草和玄参供试品溶液；
甘草和玄参对照药材制备：分别取甘草对照药材和玄参对照药材，分别加水煎煮提取，提取液加入无水乙醇静置，滤过，取滤液用乙酸乙酯萃取，取水层，以水饱和正丁醇萃取，得到水饱和正丁醇萃取液，萃取液以水洗涤，弃去水洗涤液，再将萃取液蒸干，残渣以有机溶剂溶解，分别得到甘草对照药材溶液和玄参对照药材溶液；
哈巴俄苷对照品制备：取哈巴俄苷对照品，加入有机溶剂制成对照品溶液，即得哈巴俄苷对照品溶液；
甘草和玄参薄层鉴别：分别吸取甘草和玄参供试品溶液、甘草对照药材溶液、玄参对照药材溶液和哈巴俄苷对照品溶液，点于硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水的体积比为12︰4︰1的混合溶液的下层溶液为展开剂，展开，薄层板取出后晾干，喷以硫酸乙醇溶液，105±5℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光下检视甘草特征性斑点；再喷以香草醛硫酸溶液，105±5℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视玄参特征性斑点。
在其中一个实施例中，所述山银花和天冬供试品制备步骤中，所述碱性溶液为体积百分浓度为40％的浓氨水；
所述麦冬鉴别步骤，麦冬供试品制备步骤中，所述碱性溶液为体积百分浓度为40％的浓氨水。上述体积百分浓度指采用市售分析纯浓氨水和水进行配制，其中浓氨水的体积占碱性溶液总体积的40％。(浓氨水400ml，加水至1000ml制成)
在其中一个实施例中，所述山银花和天冬供试品制备步骤中，取口炎清颗粒样品1袋(辅料含蔗糖的样品规格为10g，不含糖的样品规格为3g)，加入40±10ml甲醇，超声提取30±10min，滤过，提取液蒸干，加水30±10ml使残渣溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2±1次，每次30±10ml，合并正丁醇液，用碱性溶液充分洗涤2±1次，每次30±10ml，弃去碱性溶液，正丁醇液蒸干，加甲醇1±0.5ml使残渣溶解，即得山银花和天冬供试品溶液；
所述山银花和天冬对照药材制备步骤中，分别取1g山银花和天冬对照药材，加入50±10ml的水，煎煮提取60±20min，滤过，提取液加入1±0.5倍量的无水乙醇，摇匀，静置2±1小时，滤过，滤液置水浴中蒸至30±10ml，用水饱和正丁醇振摇提取2±1次，每次30±10ml，合并正丁醇液，用碱性溶液充分洗涤2±1次，每次30±10ml，弃去碱性溶液，正丁醇液蒸干，加甲醇1±0.5ml使残渣溶解，分别得到山银花对照药材溶液和天冬对照药材溶液；
所述麦冬对照药材制备步骤中，取1g麦冬对照药材，加入50±10ml的水，煎煮提取60±20min，滤过，提取液加入1±0.5倍量的无水乙醇，摇匀，静置2±1小时，滤过，滤液置水浴中蒸至30±10ml，用水饱和正丁醇振摇提取2±1次，每次30±10ml，合并正丁醇液，用碱性溶液充分洗涤2±1次，每次30±10ml，弃去碱性溶液，正丁醇液蒸干，加甲醇1±0.5ml使残渣溶解，即得麦冬对照药材溶液。
在其中一个实施例中，所述甘草和玄参供试品制备步骤中，取口炎清颗粒样品1袋(辅料含蔗糖的样品规格为10g，不含糖的样品规格为3g)，加入40±10ml水，超声提取30±10min，离心，取上清液，用乙酸乙酯萃取2±1次，取水层，用水饱和正丁醇振摇提取2±1次，每次30±10ml，合并正丁醇液，用水洗涤2±1次，每次30±10ml，弃水洗涤液，正丁醇液蒸干，加甲醇1±0.5ml使残渣溶解，即得甘草和玄参供试品溶液；
所述甘草和玄参对照药材制备步骤中，分别取1g甘草和玄参对照药材，加入50±10ml的水，煎煮提取60±20min，滤过，提取液加入1±0.5倍量的无水乙醇，摇匀，静置2±1小时，滤过，滤液置水浴中蒸至30±10ml，用乙酸乙酯萃取2±1次，每次30±10ml，取水层，用水饱和正丁醇振摇提取2±1次，每次30±10ml，合并正丁醇液，用水洗涤2±1次，每次30±10ml，弃水洗涤液，正丁醇液蒸干，加甲醇1±0.5ml使残渣溶解，分别得到甘草对照药材溶液和玄参对照药材溶液。
在其中一个实施例中，所述山银花和天冬薄层鉴别步骤中，所述展开剂为三氯甲烷-甲醇-水的体积比为13︰9︰3混合溶液在5～10℃放置分层的下层溶液；所述展开在相对湿度≤50％的条件下展开；所述硫酸乙醇溶液中硫酸体积百分浓度为10±2％的硫酸乙醇溶液；
所述麦冬鉴别步骤，麦冬薄层鉴别步骤中，所述展开剂为三氯甲烷-甲醇-水的体积比为12︰4︰1混合溶液在5～10℃放置分层的下层溶液；
所述甘草和玄参鉴别步骤，甘草和玄参薄层鉴别步骤中，所述展开剂为三氯甲烷-甲醇-水的体积比为12︰4︰1混合溶液在5～10℃放置分层的下层溶液。
上述硫酸的体积百分浓度指采用浓硫酸和无水无醇进行配制，其中浓硫酸的体积占硫酸乙醇溶液总体积的10％。
在其中一个实施例中，该口炎清整体质量检测方法还包括以下高效液相特征谱图检测步骤：
参照物制备：取3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品，制成参照物溶液，即得；
供试品溶液制备：取口炎清供试品，加入体积百分浓度为50±10％的甲醇水溶液，超声30±10min，过滤，滤液即为供试品溶液；
检测：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相：以乙腈为A相，体积百分浓度为0.05％的磷酸水溶液为B相，流速为1ml/min，按照以下梯度洗脱方式进行洗脱：
检测波长：210±2nm；
数据分析：以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰为参照S峰，计算得到各色谱峰的相对保留时间。
上述梯度洗脱条件为在预定时间内，流动相的变化比例，如0-25min，流动相A的体积百分数由5％匀速上升至12％，相应的，流动相B的体积百分数由95％下降到88％。
在其中一个实施例中，所述数据分析步骤中，以相对保留时间在规定值±10％之内的色谱峰为特征峰，所述规定值为：0.82(峰4)、0.99(峰5)、1.08(峰7)、1.28(峰8)、1.38(峰9)、1.43(峰10)、1.58(峰11)。
在其中一个实施例中，该口炎清整体质量检测方法还包括以下含量测定步骤：
对照品制备：取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、甘草苷、异绿原酸B、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸C、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙和甘草酸铵对照品，制成对照品溶液，即得；
供试品溶液制备：取口炎清供试品，加入体积百分浓度为50±10％的甲醇水溶液，超声30±10min，过滤，滤液即为供试品溶液；
检测：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相：以乙腈为A相，体积百分含量为0.05％的磷酸水溶液为B相，流速为1ml/min，按照以下梯度洗脱方式进行洗脱：
检测波长：210±2nm；
数据分析：根据对照品色谱峰面积，计算得到供试品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、甘草苷、异绿原酸B、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸C、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙和甘草酸铵的含量。
在其中一个实施例中，以超高效液相色谱仪进行检测，所述检测步骤采用下述条件：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相：以乙腈为A相，体积百分浓度为0.05％的磷酸水溶液为B相，流速为0.3ml/min，按照以下梯度洗脱方式进行洗脱：
检测波长：210±2nm。
本发明还公开了上述的口炎清整体质量检测方法在口炎清颗粒质量控制中的应用。
可以理解的，上述检测方法可以考虑用于口炎清方剂的不同剂型的产品中，特别是与标准制定采用同种剂型的口炎清颗粒中，具有准确、可靠的特点。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的口炎清整体质量检测方法，基于药效研究中筛选出的活性成分，综合运用薄层色谱鉴别、特征图谱及多药味多成分含量测定等方法，构建口炎清颗粒覆盖全处方药味的整体质量检测方法，并以此进行作为质量标准，可以对口炎清颗粒的质量进行全面控制。
附图说明
图1为天冬、山银花薄层鉴别色谱图。
图2为麦冬薄层鉴别色谱图。
图3为甘草、玄参薄层鉴别色谱图。
图4为对照特征图谱示意图。
图5为210nm检测波长下的液相色谱图以及各特征峰成分的200-400nm紫外扫描光谱图。
图6为不同提取条件下的液相色谱图。
图7为不同流动相条件下的液相色谱图。
图8为13个对照品的紫外光谱扫描结果示意图。
图9为高效液相检测专属性实验中的液相色谱图。
图10为超高效液相检测专属性实验中的液相色谱图。
图11为对比例1中展开剂为三氯甲烷-甲醇-水的薄层色谱图。
图12为对比例1中展开剂为二氯甲烷-无水乙醇-水的薄层色谱图。
图13为对比例1中展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸的薄层色谱图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例所用原料，如非特别说明，均为市售可得；以下实施例所用方法，如非特别说明，均为常规方法可得。
口炎清的处方为：天冬250g、麦冬250g、玄参250g、山银花300g、甘草125g。
口炎清颗粒样品：市售产品，规格：(1)每袋装10g；(2)每袋装3g(无蔗糖)。实施例中不同编号表示不同批次的产品。
实施例1
口炎清颗粒薄层色谱鉴别。
一、山银花和天冬鉴别
1、样品制备
(1)供试品制备
取口炎清颗粒供试品10g或3g(无蔗糖)，研细，加甲醇40ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，用碱性溶液充分洗涤2次，每次30ml，弃去碱性溶液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
(2)山银花和天冬对照药材制备
另取山银花对照药材和天冬对照药材各1g，分别加水50ml，煎煮60分钟，取出，放冷，滤过，滤液加一倍量的无水乙醇，摇匀，静置2小时，滤过，滤液置水浴中蒸至约30ml，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，用碱性溶液充分洗涤2次，每次30ml，弃去碱性溶液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制成对照药材溶液。
(3)对照品制备
取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
2、薄层展开
照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液6～8μl、对照药材溶液1～2μl和对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板(硅胶60预制板，Merck)上使成条带状，以三氯甲烷-甲醇-水(13︰9︰3)5～10℃放置的下层溶液为展开剂，展开。
3、显色
取出薄层板，晾干，喷以10％(v/v)硫酸乙醇溶液，在80℃加热约2分钟，分别置日光和紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与天冬对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。再在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与山银花对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。
上述为山银花(皂苷)和天冬的薄层色谱鉴别，分别以山银花对照药材、灰毡毛忍冬皂苷乙对照品、天冬对照药材为对照。结果显示供试品色谱中，在与山银花对照药材、灰毡毛忍冬皂苷乙对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，且山银花阴性对照无干扰；在与天冬对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，且天冬阴性对照无干扰，薄层色谱图见图1。
其中，编号表示：1.2号口炎清颗粒样品；2.1号口炎清颗粒样品；3.3号口炎清颗粒样品；4.4号口炎清颗粒样品；5.天冬对照药材(中检院：121139-201605)；6.山银花对照药材(中检院：121595-201202)；7.川续断皂苷乙对照品(中检院：111813-201202)；8.灰毡毛忍冬皂苷乙对照品(中检院：111814-201102)；9.天冬阴性对照；10.山银花阴性对照。
其中1-1和1-2分别为10％(v/v)硫酸乙醇溶液分别在日光和紫外光灯(365nm)下观察所见，1-3和1-4分别为再在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365nm)下观察所见。
4、条件筛选
比较不同品牌硅胶G预制薄层板的层析效果，结果表明烟台、Merck和MN品牌的五种薄层板均能满足鉴别的要求。
比较在不同相对湿度(31％、50％和72％)条件下展开的薄层效果，结果表明在高湿度(72％)条件下，色谱斑点易扩散，因此建议环境湿度控制在50％以下。
比较在不同温度(26℃和5℃)条件下展开的薄层效果，结果表明在此两种温度条件下展开对薄层色谱效果影响不大。
二、麦冬鉴别
1、样品制备
(1)麦冬对照药材制备
取麦冬对照药材1g，加水50ml，煎煮60分钟，取出，放冷，滤过，滤液加一倍量的无水乙醇，摇匀，静置2小时，滤过，滤液置水浴中蒸至约30ml，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，用碱性溶液充分洗涤2次，每次30ml，弃去碱性溶液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制成对照药材溶液。
2、薄层展开
照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述供试品溶液6～8μl，上述麦冬对照药材溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板(硅胶预制板DC-Fertigplatten DURASIL-25，MN)上使成条带状，以三氯甲烷-甲醇-水(12︰4︰1)5～10℃放置的下层溶液为展开剂，展开约12cm。
3、显色
取出薄层板，晾干，喷以10％(v/v)硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与麦冬对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
上述为麦冬的薄层色谱鉴别，以麦冬对照药材为对照。结果显示供试品色谱中，在与麦冬对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，且麦冬阴性对照无干扰，薄层色谱图见图2。
其中，编号表示：1.2号口炎清颗粒样品；2.1号口炎清颗粒样品；3.3号口炎清颗粒样品；4.麦冬对照药材(中检院：121013-201711)；5.麦冬阴性对照。
4、条件筛选
比较不同品牌硅胶G预制薄层板的层析效果，结果表明烟台、Merck和MN品牌的三种薄层板均能满足鉴别的要求。
比较在不同相对湿度(31％、50％和72％)条件下展开的薄层效果，结果表明在此三种相对湿度条件下展开对薄层色谱效果影响不大。
比较在不同温度(24℃和5℃)条件下展开的薄层效果，结果表明在此两种温度条件下展开对薄层色谱效果影响不大。
三、甘草和玄参的鉴别
1、样品制备
(1)供试品制备
取口炎清颗粒供试品10g或3g(无蔗糖)，研细，置具塞锥形瓶中，加水40ml，超声处理30分钟，离心(3500转/分钟，5分钟)，取上清液，用乙酸乙酯振摇提取2次，分取水液，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次30ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
(2)甘草和玄参对照药材制备
另取甘草对照药材和玄参对照药材各1g，分别加水50ml，煎煮60分钟，放冷，滤过，滤液加一倍量的无水乙醇，摇匀，静置2小时，滤过，滤液置水浴中蒸至约30ml，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30ml，弃去乙酸乙酯液，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次30ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制成对照药材溶液。
(3)对照品制备
取哈巴俄苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
2、薄层展开
照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液2～4μl、对照药材溶液与对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板(硅胶60预制板，Merck)上，以三氯甲烷-甲醇-水(12︰4︰1)5-10℃放置的下层溶液为展开剂，展开。
3、显色
取出薄层板，晾干，喷以10％(v/v)硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与甘草对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。再喷以5％(v/v)香草醛硫酸溶液，在105℃加热1分钟，放置10分钟后在日光下检视。供试品色谱中，在与玄参对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
上述为甘草和玄参的薄层色谱鉴别，分别以甘草对照药材、玄参对照药材、哈巴俄苷对照品为对照。按方法操作，结果显示供试品色谱中，在与甘草对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，且甘草阴性对照无干扰；在与玄参对照药材色谱、哈巴俄苷对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，且玄参阴性对照无干扰，薄层色谱图见图3。
其中，编号表示：1.5号口炎清颗粒样品；2.2号口炎清颗粒样品；3.3号口炎清颗粒样品；4.甘草对照药材(中检院：120904-201519)；5.甘草(胀果甘草)对照药材(中检院：121303-201003)；6.甘草阴性对照；7.玄参对照药材(中检院：121008-201609)；8.哈巴俄苷对照品(中检院：111730-201508)；9.玄参阴性对照。
其中3-1和3-2分别为10％(v/v)硫酸乙醇溶液分别在日光和紫外光灯(365nm)下观察所见，3-3为5％香草醛硫酸溶液显色在日光下观察所见。
4、条件筛选
比较不同品牌硅胶G预制薄层板的层析效果，结果表明烟台和Merck两品牌的薄层板均能满足鉴别的要求。
比较在不同相对湿度(33％和74％)条件下展开的薄层效果，结果表明在此两种湿度条件下展开对薄层色谱效果影响不大。
比较在不同温度(26℃和5℃)条件下展开的薄层效果，结果表明在此两种温度条件下展开对薄层色谱效果影响不大。
实施例2
口炎清颗粒特征图谱建立。
1、供试液制备
参照物溶液的制备：取3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含20μg溶液，即得。
供试品溶液的制备：取口炎清颗粒供试品，混匀，取适量，研细，取约2.0g或约0.6g(无蔗糖)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率380W，频率37kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2、色谱检测
测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)。
流动相：以乙腈为A相，0.05％(v/v)的磷酸水溶液为B相，流速为1ml/min，按照以下梯度洗脱方式进行洗脱：
表1.梯度洗脱条件
检测波长：210±2nm；
数据分析：以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰为参照S峰，计算得到各色谱峰的相对保留时间。
3、结果判定
供试品色谱中应呈现11个特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的±10％之内。规定值为0.82(峰4)、0.99(峰5)、1.08(峰7)、1.28(峰8)、1.38(峰9)、1.43(峰10)、1.58(峰11)。
具体如图4所示，图4为对照特征图谱示意图，其中各成分为：峰1：新绿原酸；峰2：绿原酸，峰3：隐绿原酸，峰4：甘草苷，峰5：异绿原酸B，峰6：3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸，峰7：异绿原酸C，峰8：哈巴俄苷，峰9：灰毡毛忍冬皂苷乙；峰10：川续断皂苷乙，峰11：甘草酸。
本品处方中五味药(山银花、天冬、麦冬、甘草和玄参)成分主要有黄酮类、有机酸类、皂苷类、苯丙素类等，采用高效液相色谱法建立了口炎清颗粒的特征图谱，图谱中涵盖了处方中山银花、甘草和玄参三味药的主要成分，天冬与麦冬的成分在本色谱条件下未能检出，也可能与本品采用水煮醇沉工艺、天冬与麦冬特有成分含量极低等因素有关。
4、条件筛选
(1)检测波长的选择
取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，采用二极管阵列检测器，考察不同检测波长下的液相色谱图，结果如图5所示，图中色谱峰大图为Thermo Hypersil Gold C18柱210nm下口炎清颗粒HPLC色谱图。编号为1-11的小图分别表示新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、甘草苷、异绿原酸B、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸C、哈巴俄苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙和甘草酸在200-400nm范围的紫外扫描光谱图。结果显示在210nm±2nm波长下，供试品色谱中呈现较多峰高相对适宜的色谱峰，且各色谱峰的分离良好，故选择210nm作为检测波长。
(2)供试品溶液提取条件的考察
取供试品，采用不同的提取条件，考察不同提取条件下的液相色谱图，结果如图6所示，其中A、B、C、D、E、F分别为采用甲醇超声、乙醇超声、乙醇(50％，v/v)超声、水超声、50％甲醇超声、50％甲醇加热回流各30分钟的口炎清颗粒HPLC色谱图。
结果显示，采用50％甲醇和水作为溶剂，各成分的提取效果比较好，出于易过滤与对照品溶解的难易程度考虑，最终选择50％甲醇作为提取溶剂，且超声处理与加热回流的提取效果相当，故选择较为简便的超声处理方法。
5、色谱峰的指认与归属
取供试品溶液、山银花投料药材、甘草投料药材、玄参投料药材、山银花阴性溶液、甘草阴性溶液、玄参阴性溶液，参照物溶液，新绿原酸对照品溶液、绿原酸对照品溶液、隐绿原酸对照品溶液、甘草苷对照品溶液、异绿原酸B对照品溶液、异绿原酸C对照品溶液、安格洛苷C对照品溶液、肉桂酸对照品溶液、哈巴俄苷对照品溶液、灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液、川续断皂苷乙对照品溶液和甘草酸铵对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按步骤2的色谱条件测定，记录色谱图。
结果显示供试品色谱中呈现13个与参照物溶液及各对照品溶液色谱保留时间相同的色谱峰，分别为新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，甘草苷，异绿原酸B，3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸，异绿原酸C，安格洛苷C，肉桂酸，哈巴俄苷，灰毡毛忍冬皂苷乙，川续断皂苷乙，甘草酸。研究过程中发现安格洛苷C在不同色谱柱中的保留时间差异较大，多数情况下在异绿原酸C后出峰，但在某些色谱柱中会出现在异绿原酸C前出峰的情况，容易造成出峰顺序混乱；另外，肉桂酸色谱峰响应较低，因此暂不将安格洛苷C和肉桂酸列为特征图谱的特征色谱峰。最终确定的11个特征色谱峰指认与归属药味见下表，峰号为按照出分时间由快到慢排序。
表2各色谱峰指认与归属
峰号 色谱峰指认 归属药味 峰号 色谱峰指认 归属药味
峰1 新绿原酸 山银花 峰7 异绿原酸C 山银花
峰2 绿原酸 山银花 峰8 哈巴俄苷 玄参
峰3 隐绿原酸 山银花 峰9 灰毡毛忍冬皂苷乙 山银花
峰4 甘草苷 甘草 峰10 川续断皂苷乙 山银花
峰5 异绿原酸B 山银花 峰11 甘草酸 甘草
峰6 3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸 山银花
6.S峰的确定
3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸是本品抗炎活性的核心成分，色谱峰响应较好，中检院可提供对照品，而且在现色谱条件下，3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰的保留时间适中，与相邻色谱峰的分离良好，因此选择3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸作为口炎清颗粒对照特征图谱中的S峰。
7.耐用性试验
(1)不同色谱柱的考察
分别采用不同品牌的色谱柱(规格均为250×4.6mm,5μm)，在同一高效液相色谱仪(Agilent 1260)测定同一供试品溶液，记录各色谱峰的保留时间，以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰(峰6)为S峰，计算各色谱峰的相对保留时间，结果见下表。
表3不同色谱柱中各色谱峰的保留时间(分钟)
表4不同色谱柱中各色谱峰的相对保留时间(与S峰比较)
结果显示，供试品色谱中峰1～3在不同色谱柱中的相对保留时间差异较大，峰4～11在不同色谱柱中保留时间的差异较小。由表4可见供试品色谱中峰4～11在三根相同规格不同品牌色谱柱中相对保留时间的相对标准偏差(RSD)均在6％以内，峰1～3相对保留时间的相对标准偏差(RSD)在9.8％～13.2％之间。为保证色谱峰出峰时间的相对稳定以及各色谱峰间的分离度，故确定采用C18色谱柱，规格为250×4.6mm，5μm。
(2)稳定性试验
取同一批样品，按上述方法制备供试品溶液，在室温放置0、2、4、8、12、24、36和48小时后分别进样，依法测定，记录各色谱峰的保留时间，以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰(峰6)为S峰，计算各色谱峰的相对保留时间结果见下表，11个色谱峰的保留时间及相对保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于2％(n＝8)，结果表明供试品溶液在48小时内测定结果稳定。
表5不同测定时间各色谱峰的保留时间(分钟)
峰号 0小时 2小时 4小时 8小时 12小时 24小时 36小时 48小时 RSD(％)
1 12.232 11.858 11.872 11.778 11.776 11.958 12.052 12.014 1.3
2 19.578 19.239 19.253 19.155 19.152 19.370 19.469 19.407 0.8
3 20.963 20.648 20.671 20.562 20.556 20.775 20.872 20.810 0.8
4 43.381 43.254 43.284 43.183 43.258 43.666 43.766 43.666 0.6
5 52.970 52.985 53.010 52.902 52.971 53.261 53.326 53.251 0.4
6 53.641 53.644 53.670 53.550 53.615 53.898 53.964 53.891 0.3
7 58.039 58.061 58.077 57.964 58.024 58.260 58.317 58.256 0.3
8 68.892 68.915 68.901 68.884 68.984 69.155 69.215 69.163 0.3
9 74.157 74.196 74.173 74.205 74.332 74.475 74.538 74.489 0.3
10 77.146 77.186 77.165 77.209 77.341 77.490 77.554 77.500 0.3
11 85.387 85.429 85.443 85.475 85.537 85.598 85.634 85.612 0.2
表6不同测定时间各色谱峰的相对保留时间
8、重复性试验
取同一批号样品约2.0g，精密称取6份，按上述方法测定，记录各色谱峰的保留时间，以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰(峰6)为S峰，计算各色谱峰的相对保留时间。
结果见下表，11个色谱峰的保留时间及相对保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于1％(n＝6)，结果表明方法重复性良好。
表7重复性试验中各色谱峰的保留时间(分钟)
峰号 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 RSD(％)
1 11.978 12.013 12.078 12.059 12.058 12.077 0.4
2 19.382 19.438 19.481 19.462 19.455 19.481 0.2
3 20.796 20.856 20.895 20.869 20.864 20.888 0.2
4 43.603 43.726 43.729 43.732 43.718 43.760 0.2
5 53.151 53.241 53.237 53.252 53.244 53.279 0.1
6 53.794 53.881 53.875 53.890 53.884 53.916 0.1
7 58.163 58.228 58.229 58.244 58.237 58.263 0.1
8 69.093 69.138 69.145 69.141 69.135 69.137 0.1
9 74.479 74.515 74.535 74.501 74.488 74.479 0.1
10 77.500 77.535 77.552 77.522 77.505 77.498 0.1
11 85.588 85.610 85.621 85.619 85.619 85.621 0.1
表8重复性试验中各色谱峰的相对保留时间
峰号 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 平均相对保留时间 RSD(％)
1 0.222 0.223 0.224 0.224 0.224 0.224 0.224 0.3
2 0.360 0.361 0.362 0.361 0.361 0.361 0.361 0.2
3 0.387 0.387 0.388 0.387 0.387 0.387 0.387 0.2
4 0.811 0.812 0.812 0.812 0.811 0.812 0.811 0.1
5 0.988 0.988 0.988 0.988 0.988 0.988 0.988 0.1
6 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0
7 1.081 1.081 1.081 1.081 1.081 1.081 1.081 0.1
8 1.284 1.283 1.283 1.283 1.283 1.282 1.283 0.1
9 1.385 1.383 1.383 1.382 1.382 1.381 1.383 0.1
10 1.441 1.439 1.439 1.439 1.438 1.437 1.439 0.1
11 1.591 1.589 1.589 1.589 1.589 1.588 1.589 0.1
9、口炎清颗粒对照特征图谱的建立
按照上述方法进行检测，测定了15个批次的口炎清颗粒样品。结果显示，以峰6 3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸为S峰，在规定规格的色谱柱(柱长25cm，内径4.6mm，粒径5μm)中，各特征峰与S峰的相对保留时间比较稳定，方法学验证结果良好。因特征峰1、峰2和峰3与S峰的相对保留时间在不同色谱柱中的差异较大，故暂不规定特征峰1、峰2和峰3与S峰的相对保留时间及偏差。对于特征图谱项具体规定为供试品特征图谱中应有11个特征峰，其中应有1个色谱峰与参照物峰(S峰)保留时间相同，规定特征峰4、5、7、8、9、10和11与S峰的相对保留时间，峰4为0.82，峰5为0.99，峰7为1.08，峰8为1.28，峰9为1.38，峰10为1.43，峰11为1.58，偏差范围应在规定值的±10％之内。
10、口炎清颗粒与各中间体特征图谱的相关性研究
取5个批次样品及其中间体，比较口炎清颗粒与对应各中间体(流膏和总混前颗粒)的特征图谱，结果显示三者的特征图谱相关性良好，中间体特征图谱中的色谱峰均在口炎清颗粒特征图谱中呈现。由表9和10可见，5批中间体(流膏和总混前颗粒)色谱图中均呈现有11个特征峰，其中峰6与参照物3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品色谱峰(S峰)保留时间相同，峰4、5、7、8、9、10和11与S峰的相对保留时间均在标准规定值的±10％范围内。
表9流膏中各色谱峰的相对保留时间
表10总混前颗粒中各色谱峰的相对保留时间
批次序号 峰1 峰2 峰3 峰4 峰5 峰6 峰7 峰8 峰9 峰10 峰11
1 0.222 0.359 0.386 0.808 0.988 1.000 1.081 1.282 1.381 1.437 1.589
2 0.223 0.360 0.386 0.807 0.988 1.000 1.082 1.284 1.384 1.440 1.591
3 0.224 0.361 0.387 0.807 0.988 1.000 1.081 1.283 1.382 1.438 1.589
4 0.223 0.360 0.386 0.807 0.988 1.000 1.081 1.283 1.383 1.439 1.590
5 0.223 0.360 0.386 0.808 0.988 1.000 1.081 1.282 1.381 1.436 1.589
相对保留时间平均值 0.22 0.36 0.39 0.81 0.99 1.00 1.08 1.28 1.38 1.44 1.59
RSD(％) 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1 0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.1
实施例3
口炎清颗粒含量测定。
现有质量标准中，含量测定指标成分为绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙，均来自山银花药味。根据本处方全药味全成分分析前期研究获得的抗炎活性成分群结果，结合口炎清颗粒样品的实际情况以及覆盖处方中尽可能多药味的原则，本实施例采用与实施例2相同的色谱条件，新建HPLC法同时测定口炎清颗粒中13种成分的含量，涉及处方中山银花、玄参和甘草三味药。
1、检测条件筛选验证
(1)流动相的选择
比较乙腈-水、乙腈-0.05％(v/v)磷酸溶液以及乙腈-0.05％(v/v)甲酸溶液等不同流动相系统，结果如图7所述，其中A、B、C分别为流动相为乙腈-水、乙腈-0.05％(v/v)甲酸、乙腈-0.05％(v/v)磷酸的HPLC色谱图，结果显示采用乙腈-0.05％(v/v)磷酸溶液，色谱峰的分离度与色谱图的整体效果最好。
(2)检测波长的选择
对13个对照品进行紫外光谱扫描，结果如图8所示，最终选择检测波长为210nm。
2、系统适用性试验
色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18柱(250×4.6mm，5μm，SN：10601838)；以乙腈为流动相A，以0.05％(v/v)磷酸溶液为流动相B，按实施例2的条件进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为210nm；进样量为10μl。理论板数按绿原酸峰计算，不低于30000。
3、专属性试验
分别精密吸取山银花阴性对照溶液、甘草阴性对照溶液、玄参阴性对照溶液、供试品溶液、新绿原酸对照品溶液、绿原酸对照品溶液、隐绿原酸对照品溶液、甘草苷对照品溶液、异绿原酸B对照品溶液、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品溶液、异绿原酸C对照品溶液、安格洛苷C对照品溶液、肉桂酸对照品溶液、哈巴俄苷对照品溶液、灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液、川续断皂苷乙对照品溶液与甘草酸铵对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，依法测定，结果显示山银花阴性对照溶液色谱图中，在与新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸C、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙对照品色谱峰相应的位置上，未见相应的色谱峰；甘草阴性对照溶液色谱图中，在与甘草苷与甘草酸铵对照品色谱峰相应的位置上，未见相应的色谱峰；玄参阴性对照溶液色谱图中，在与安格洛苷C、肉桂酸与哈巴俄苷对照品色谱峰相应的位置上，未见相应的色谱峰，表明处方中的其他药味对山银花、甘草与玄参的测定无干扰，液相色谱图见图9，其中，A、B、C、D分别为供试品、山银花阴性、甘草阴性、玄参阴性的HPLC色谱图。
4.耐用性试验
(1)不同提取溶剂的比较
取供试品口炎清颗粒，混匀，取适量，研细，取约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、50％甲醇、乙醇、稀乙醇(50％，v/v)和水25ml(每种溶剂各两份)，密塞，称定重量，超声处理(功率380W，频率37kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述条件测定，结果见下表。
表11.不同提取溶剂的比较(n＝2)
结果显示采用50％甲醇和水作为溶剂，各成分的提取效果比较好，出于易过滤与对照品溶解的难易程度考虑，最终选择50％甲醇作为提取溶剂。
(2)不同提取方法的比较
取供试品口炎清颗粒，混匀，取适量，研细，取约2.0g，精密称定，共4份，分别置具塞锥形瓶和平底烧瓶中(各两份)，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，分别采用超声处理(功率380W，频率37kHz)30分钟和加热回流30分钟的方法处理，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件测定，结果见下表。
表12不同提取方法的比较(n＝2)
结果显示超声处理与加热回流的提取效果相当，故选择较为简便的超声处理方法。
(3)不同提取时间的比较
取供试品口炎清颗粒，混匀，取适量，研细，取约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率380W，频率37kHz)15分钟、30分钟、45分钟和60分钟(每个时间点各两份)，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件测定，结果见下表。
表13不同提取时间的比较(n＝2)
结果显示不同提取时间的提取效果差别不大，考虑到不同批次样品、有糖型与无糖型样品的差异，选择超声处理30分钟。
(4)稳定性试验
取口炎清颗粒供试品溶液，放置不同时间后按照上述方法检测，结果如下表所示。
表14供试品溶液稳定性考察结果
结果显示供试品溶液在48小时内测定结果稳定。
5、线性考察
配制系列浓度的各对照品溶液，分别精密吸取系列浓度的对照品溶液②～⑧各10μl，对照品溶液①10μl和20μl，对照品溶液⑨10μl和5μl，注入液相色谱仪，按标准正文色谱条件测定，分别以各对照品的进样量(μg)为横坐标，相应峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。
结果表明新绿原酸在0.005～4.954μg范围内，绿原酸在0.016～16.766μg范围内，隐绿原酸在0.006～6.386μg范围内，甘草苷在0.002～1.848μg范围内，异绿原酸B在0.005～5.142μg范围内，3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸在0.004～3.722μg范围内，异绿原酸C在0.006～6.62μg范围内，安格洛苷C在0.001～0.894μg范围内，肉桂酸在0.001～0.868μg范围内，哈巴俄苷在0.001～0.808μg范围内，灰毡毛忍冬皂苷乙在0.022～22.614μg范围内，川续断皂苷乙在0.021～21.236μg范围内，甘草酸在0.004～4.264μg范围内，其进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系，具体见下表。
表15各对照品标准曲线及相关系数
对照品名称 标准曲线 相关系数r
新绿原酸 y＝1770417.8774x-13604.7342 0.9999
绿原酸 y＝1861233.0147x-14864.0868 1.0000
隐绿原酸 y＝1888110.4690x-21513.1943 0.9999
甘草苷 y＝3509069.5192x-7859.9885 1.0000
异绿原酸B y＝2150002.6908x-7758.6056 1.0000
3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸 y＝2581742.9440x-14123.0925 0.9999
异绿原酸C y＝2410219.8820x-11352.4672 1.0000
安格洛苷C y＝1566625.2424x-1245.3235 1.0000
肉桂酸 y＝4894235.4043x-4950.0602 1.0000
哈巴俄苷 y＝1811523.2011x-521.7679 1.0000
灰毡毛忍冬皂苷乙 y＝147044.3241x-1388.3458 1.0000
川续断皂苷乙 y＝201607.3914x+858.8201 1.0000
甘草酸 y＝170985.7375x+965.2301 1.0000
6.重复性试验
取口炎清颗粒供试品约2.0g，精密称定，共6份，按上述方法制备供试品溶液，依法测定，结果见下表。
表16重复性试验结果
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7、准确度(以加样回收率表示)
取已知含量的样品约1.0g，精密称定，共6份，分别精密加入新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、甘草苷、异绿原酸B、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸C、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙和甘草酸铵对照品混合溶液25ml，称定重量，按上述方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率。
新绿原酸平均回收率为96.8％，RSD为1.7％(n＝6)；绿原酸平均回收率为96.6％，RSD为1.8％(n＝6)；隐绿原酸平均回收率为96.7％，RSD为1.8％(n＝6)；甘草苷平均回收率为97.2％，RSD为1.1％(n＝6)；异绿原酸B平均回收率为97.1％，RSD为1.5％(n＝6)；3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸平均回收率为98.1％，RSD为1.6％(n＝6)；异绿原酸C平均回收率为97.7％，RSD为1.7％(n＝6)；安格洛苷C平均回收率为99.6％，RSD为1.8％(n＝6)；肉桂酸平均回收率为98.9％，RSD为1.8％(n＝6)；哈巴俄苷平均回收率为98.3％，RSD为1.7％(n＝6)；灰毡毛忍冬皂苷乙平均回收率为96.5％，RSD为2.0％(n＝6)；川续断皂苷乙平均回收率为97.5％，RSD为2.0％(n＝6)；甘草酸平均回收率为97.6％，RSD为1.1％(n＝6)。
8、小结
本实施例同时测定了口炎清颗粒中13种成分的含量，涉及处方中山银花、玄参和甘草三味药材，其中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙三种成分来源于山银花药味，为原质量标准含量测定指标，其余10种成分为本次新增加的抗炎活性成分指标。
实施例4
口炎清颗粒的超高效液相色谱特征图谱。
本实施例采用超高效液相色谱进行特征谱图的建立，由于由常规高效液相色谱法转换成超高效液相色谱法，色谱柱改为小粒径短柱，与常规液相色谱柱差异较大，因此有必要比较不同小粒径短柱对测定结果的影响，具体研究情况如下：
仪器与试剂：Agilent 1290Infinity II超高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(50×2.1mm，1.8μm，SN：USDAY48385)；
流动相组成、检测波长：以乙腈为流动相A，以0.05％(v/v)磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.3mL/min；检测波长为210nm；进样量为2μl。理论板数按绿原酸峰计算，应不低于50000。
表17.梯度洗脱程序
1、色谱柱筛选
分别采用不同品牌的色谱柱(1号色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18(50×2.1mm,1.8μm)，2号色谱柱为Dikma Endeavorsil C18(50×2.1mm,1.8μm)，3号色谱柱为Agilent Poroshell 120SB-C18(50×2.1mm,2.7μm)，4号色谱柱为Agilent Extend C18(50×2.1mm,1.8μm))，按超高效液相色谱条件在同一超高效液相色谱仪(Agilent1290Infinity II)测定同一供试品溶液，记录各色谱峰的保留时间，以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰(峰6)为S峰，计算各色谱峰的相对保留时间，结果见下表。
表18不同色谱柱中各色谱峰的保留时间(分钟)
表19不同色谱柱中各色谱峰的相对保留时间(与S峰比较)
结果显示四根不同色谱柱在上述色谱条件下，供试品色谱中均呈现11个特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间均在规定值的±10％之内，均符合规定。因此，测定方法由常规高效液相色谱法转换成超高效液相色谱法，色谱柱相应改为小粒径短柱对各特征峰与S峰的相对保留时间影响小，方法可行。
实施例5
口炎清颗粒的超高效液相色谱仪含量测定。
本实施例以超高效液相色谱仪对口炎清颗粒进行含量测定，因常规高效液相色谱仪与超高效液相色谱仪在使用色谱柱填料粒径、系统体积等方法存在较大差异，常规高效液相色谱法转换成超高效液相色谱法时，方法不能简单套用，需要调整流速、进样量、梯度洗脱程序等，调整后的方法需要对专属性、重复性、稳定性、线性范围、准确度等进行验证。检测条件同实施例4，具体验证情况如下：
1、专属性试验
分别精密吸取山银花阴性对照溶液、甘草阴性对照溶液、玄参阴性对照溶液、供试品溶液、混合对照品溶液(过0.22μm滤膜)各2μl，注入高效液相色谱仪，依法测定，结果显示山银花阴性对照溶液色谱图中，在与新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸C、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙对照品色谱峰相应的位置上，未见相应的色谱峰；甘草阴性对照溶液色谱图中，在与甘草苷与甘草酸铵对照品色谱峰相应的位置上，未见相应的色谱峰；玄参阴性对照溶液色谱图中，在与安格洛苷C、肉桂酸与哈巴俄苷对照品色谱峰相应的位置上，未见相应的色谱峰，表明处方中的其他药味对山银花、甘草与玄参的测定无干扰，液相色谱图见图10，其中A为混合对照品HPLC色谱图，B为供试品HPLC色谱图，C为山银花阴性HPLC色谱图，D为甘草阴性HPLC色谱图，E为玄参阴性HPLC色谱图。
2、耐用性试验
(1)色谱柱的考察
分别采用不同品牌的色谱柱(1号色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18柱(50×2.1mm，1.8μm)SN：USDAY48385，2号色谱柱为Dikma Endeavorsil C18柱(50×2.1mm，1.8μm)SN：7506876，3号色谱柱为Agilent Extend C18柱(50×2.1mm，1.8μm)SN：USHBD05525，4号色谱柱为Agilent Poroshell 120SB-C18柱(50×2.1mm，2.7μm)SN：USDCN02643)，按上述色谱条件测定同一供试品溶液，结果见下表。
表20不同色谱柱的测定结果比较(n＝2)
/>
结果显示所选用的四根色谱柱均可用于本品中13种成分的含量测定。理论板数按绿原酸峰计算，应不低于50000。
(2)稳定性试验
取同一批号供试品，按上述方法制备供试品溶液(过0.22μm滤膜)，在室温条件下放置0、2、4、8、12、24、36和48小时后分别进样，依法测定。
结果为：新绿原酸的平均含量为3.8mg/袋，RSD为0.8％(n＝8)；绿原酸的平均含量为10.8mg/袋，RSD为0.3％(n＝8)；隐绿原酸的平均含量为3.9mg/袋，RSD为0.8％(n＝8)；甘草苷的平均含量为1.2mg/袋，RSD为0.9％(n＝8)；异绿原酸B的平均含量为3.6mg/袋，RSD为0.9％(n＝8)；3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的平均含量为2.8mg/袋，RSD为1.1％(n＝8)；异绿原酸C的平均含量为5.4mg/袋，RSD为0.9％(n＝8)；安格洛苷C的平均含量为0.43mg/袋，RSD为0.7％(n＝8)；肉桂酸的平均含量为0.08mg/袋，RSD为0.7％(n＝8)；哈巴俄苷的平均含量为0.17mg/袋，RSD为1.4％(n＝8)；灰毡毛忍冬皂苷乙的平均含量为21.9mg/袋，RSD为0.4％(n＝8)；川续断皂苷乙的平均含量为5.7mg/袋，RSD为0.6％(n＝8)；甘草酸的平均含量为2.5mg/袋，RSD为0.5％(n＝8)，结果表明供试品溶液在48小时内测定结果稳定。
3、线性考察
配制系列浓度的各对照品溶液，分别精密吸取系列浓度的对照品溶液①～⑨各2μl，注入高效液相色谱仪，按上述条件测定，分别以各对照品的进样量(μg)为横坐标，相应峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。
结果表明新绿原酸在0.0020～0.4972μg范围内，绿原酸在0.0082～2.1036μg范围内，隐绿原酸在0.0028～0.7000μg范围内，甘草苷在0.0008～0.1790μg范围内，异绿原酸B在0.0020～0.5434μg范围内，3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸在0.0016～0.3936μg范围内，异绿原酸C在0.0026～0.6550μg范围内，安格洛苷C在0.0004～0.0818μg范围内，肉桂酸在0.0004～0.0806μg范围内，哈巴俄苷在0.0004～0.0832μg范围内，灰毡毛忍冬皂苷乙在0.0084～2.1832μg范围内，川续断皂苷乙在0.0080～2.0386μg范围内，甘草酸在0.0016～0.4424μg范围内，其进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系，具体见下表。
表21各对照品标准曲线及相关系数
对照品名称 标准曲线 相关系数r
新绿原酸 y＝5711.9587x+1.3447 1.0000
绿原酸 y＝6119.8635x+47.9121 0.9999
隐绿原酸 y＝6059.9026x+0.2051 1.0000
甘草苷 y＝11321.7618x–1.3509 1.0000
异绿原酸B y＝6988.6743x+1.1382 1.0000
3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸 y＝8102.8706x+0.0886 1.0000
异绿原酸C y＝7721.5311x+1.1434 1.0000
安格洛苷C y＝4767.7851x+0.0876 1.0000
肉桂酸 y＝15203.6851x+0.6162 1.0000
哈巴俄苷 y＝5688.9379x+0.0990 1.0000
灰毡毛忍冬皂苷乙 y＝463.8747x+3.6714 0.9999
川续断皂苷乙 y＝643.0961x+4.7255 0.9999
甘草酸 y＝525.5939x+0.0508 1.0000
4、重复性试验
取同一批号样品约2.0g，精密称定，共6份，按上述方法制备供试品溶液(过0.22μm滤膜)，依法测定。
结果为：新绿原酸的平均含量为3.9mg/袋，RSD为0.7％(n＝6)；绿原酸的平均含量为11.1mg/袋，RSD为1.7％(n＝6)；隐绿原酸的平均含量为4.0mg/袋，RSD为2.1％(n＝6)；甘草苷的平均含量为1.2mg/袋，RSD为1.3％(n＝6)；异绿原酸B的平均含量为3.6mg/袋，RSD为1.3％(n＝6)；3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的平均含量为2.8mg/袋，RSD为1.0％(n＝6)；异绿原酸C的平均含量为5.4mg/袋，RSD为1.0％(n＝6)；安格洛苷C的平均含量为0.45mg/袋，RSD为2.3％(n＝6)；肉桂酸的平均含量为0.07mg/袋，RSD为2.6％(n＝6)；哈巴俄苷的平均含量为0.17mg/袋，RSD为2.2％(n＝6)；灰毡毛忍冬皂苷乙的平均含量为21.9mg/袋，RSD为0.7％(n＝6)；川续断皂苷乙的平均含量为5.6mg/袋，RSD为1.4％(n＝6)；甘草酸的平均含量为2.5mg/袋，RSD为2.2％(n＝6)。
5、准确度(以加样回收率表示)
取已知含量的样品(各成分含量见重复性试验)约1.0g，精密称定，共6份，分别精密加入新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、甘草苷、异绿原酸B、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸C、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙和甘草酸铵对照品混合溶液25ml，称定重量，按上述方法制备供试品溶液(过0.22μm滤膜)，依法测定，计算回收率。
结果为：新绿原酸平均回收率为103.3％，RSD为1.1％(n＝6)；绿原酸平均回收率为102.3％，RSD为0.7％(n＝6)；隐绿原酸平均回收率为101.2％，RSD为2.2％(n＝6)；甘草苷平均回收率为98.3％，RSD为0.9％(n＝6)；异绿原酸B平均回收率为99.6％，RSD为1.8％(n＝6)；3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸平均回收率为100.5％，RSD为1.3％(n＝6)；异绿原酸C平均回收率为99.0％，RSD为0.9％(n＝6)；安格洛苷C平均回收率为100.5％，RSD为1.7％(n＝6)；肉桂酸平均回收率为99.6％，RSD为0.7％(n＝6)；哈巴俄苷平均回收率为100.2％，RSD为1.6％(n＝6)；灰毡毛忍冬皂苷乙平均回收率为101.9％，RSD为1.6％(n＝6)；川续断皂苷乙平均回收率为99.5％，RSD为0.6％(n＝6)；甘草酸平均回收率为98.1％，RSD为1.6％(n＝6)。
6、常规高效液相色谱法与超高效液相色谱法含量测定结果比较
4批口炎清颗粒常规高效液相色谱法与超高效液相色谱法含量测定结果的比较见下表。
表22样品含量测定结果比较
结果显示两种方法测得4批样品中13种成分的含量差异在8％以内，综合专属性、重复性、稳定性、准确度等考察结果，表明两种方法均可用于本品中13种成分的含量测定。
对比例1
口炎清颗粒薄层色谱鉴别对比。(与实施例1中薄层图谱样品一致)
以下例举了本发明在前期研发过程中少量对展开剂进行摸索的实验过程。
1、展开剂为三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)实验
采用实施例1相同的薄层板和样品，三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)5～10℃以下放置12小时的下层溶液作为展开剂展开，喷以10％(v/v)硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，UV365nm下检视。
结果如图11所示，图中编号1-8样本分别为：2号口炎清颗粒样品，3号口炎清颗粒样品，麦冬对照药材，天冬对照药材，2号口炎清颗粒样品，3号口炎清颗粒样品，麦冬对照药材，天冬对照药材样本。结果显示特征斑点不明显，对应性不好。
2、展开剂为二氯甲烷-无水乙醇-水(14：9：1.3)实验
采用实施例1相同的薄层板和样品，二氯甲烷-无水乙醇-水(14：9：1.3)5～10℃以下放置12小时的下层溶液作为展开剂展开，喷以10％(v/v)硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，UV365nm下检视。
结果如图12所示，图中编号1-8样本分别为：2号口炎清颗粒样品，3号口炎清颗粒样品，麦冬对照药材，天冬对照药材，2号口炎清颗粒样品，3号口炎清颗粒样品，麦冬对照药材，天冬对照药材样本。结果显示特征斑点不明显，对应性不好，且斑点扩散。
3、展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5：4：0.5)
采用实施例1相同的薄层板和样品，甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5：4：0.5)作为展开剂展开，晾干，UV365nm下检视。结果如图13所示，图中编号1-5样本分别为：2号口炎清颗粒样品，麦冬对照药材，天冬对照药材，麦冬阴性样品，天冬阴性样品。结果显示阴性有干扰。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种口炎清质量检测方法，其特征在于，包括山银花和天冬鉴别、麦冬鉴别、甘草和玄参鉴别：
所述山银花和天冬鉴别包括以下步骤：
山银花和天冬供试品溶液制备：取口炎清供试品，加入甲醇提取，提取液蒸干后的残渣加水溶解，并以水饱和正丁醇萃取，得到正丁醇液，正丁醇液加入碱性溶液洗涤，弃去碱性溶液，再将正丁醇液蒸干，残渣以有机溶剂溶解，即得山银花和天冬供试品溶液；
山银花和天冬对照药材溶液制备：分别取山银花对照药材和天冬对照药材，分别加水煎煮提取，提取液加入无水乙醇静置，滤过，取滤液以水饱和正丁醇萃取，得到正丁醇液，正丁醇液加入碱性溶液洗涤，弃去碱性溶液，再将萃取液蒸干，残渣以有机溶剂溶解，分别得到山银花对照药材溶液和天冬对照药材溶液；
灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液制备：取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品，加入有机溶剂制成对照品溶液，即得灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液；
山银花和天冬薄层鉴别：分别吸取山银花和天冬供试品溶液、山银花对照药材溶液、天冬对照药材溶液和灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液，点于硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水的体积比为13︰9︰3的混合溶液在5～10℃放置分层的下层溶液为展开剂，展开，薄层板取出后晾干，喷以硫酸乙醇溶液，80±5℃加热显色，分别置日光和紫外光下检视天冬特征性斑点，再在105±5℃加热至斑点显色清晰，再分别置日光和紫外光下检视山银花特征性斑点；
所述麦冬鉴别包括以下步骤：
麦冬供试品溶液制备：以所述山银花和天冬供试品溶液作为麦冬供试品溶液；
麦冬对照药材溶液制备：取麦冬对照药材，加水煎煮提取，提取液加入无水乙醇静置，滤过，取滤液以水饱和正丁醇萃取，得到正丁醇液，正丁醇液加入碱性溶液洗涤，弃去碱性溶液，再将萃取液蒸干，残渣以有机溶剂溶解，得到麦冬对照药材溶液；
麦冬薄层鉴别：分别吸麦冬供试品溶液和麦冬对照药材溶液，点于硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水的体积比为12︰4︰1的混合溶液在5～10℃放置分层的下层溶液为展开剂，展开，薄层板取出后晾干，喷以硫酸乙醇溶液，在105±5℃加热至斑点显色清晰，置紫外光下检视麦冬特征性斑点；
所述甘草和玄参鉴别包括以下步骤：
甘草和玄参供试品溶液制备：取口炎清供试品，加入水提取，提取液用乙酸乙酯萃取，取水层，并以水饱和正丁醇萃取，得到正丁醇液，用水洗涤，弃去水洗涤液，再将正丁醇液蒸干，残渣以有机溶剂溶解，即得甘草和玄参供试品溶液；
甘草和玄参对照药材溶液制备：分别取甘草对照药材和玄参对照药材，分别加水煎煮提取，提取液加入无水乙醇静置，滤过，取滤液用乙酸乙酯萃取，取水层，以水饱和正丁醇萃取，得到正丁醇液，正丁醇液以水洗涤，弃去水洗涤液，再将正丁醇液蒸干，残渣以有机溶剂溶解，分别得到甘草对照药材溶液和玄参对照药材溶液；
哈巴俄苷对照品溶液制备：取哈巴俄苷对照品，加入有机溶剂制成对照品溶液，即得哈巴俄苷对照品溶液；
甘草和玄参薄层鉴别：分别吸取甘草和玄参供试品溶液、甘草对照药材溶液、玄参对照药材溶液和哈巴俄苷对照品溶液，点于硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水的体积比为12︰4︰1的混合溶液在5～10℃放置分层的下层溶液为展开剂，展开，薄层板取出后晾干，喷以硫酸乙醇溶液，105±5℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光下检视甘草特征性斑点；再喷以香草醛硫酸溶液，105±5℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视玄参特征性斑点。
2.根据权利要求1所述的口炎清质量检测方法，其特征在于，所述山银花和天冬鉴别步骤，山银花和天冬供试品制备步骤中，所述碱性溶液为体积百分浓度为40％的浓氨水；
麦冬鉴别步骤，麦冬供试品制备步骤中，所述碱性溶液为体积百分浓度为40％的浓氨水。
3.根据权利要求1所述的口炎清质量检测方法，其特征在于，所述山银花和天冬鉴别步骤，山银花和天冬供试品溶液制备步骤中，取口炎清样品1袋，加入40±10ml甲醇，超声提取30±10min，滤过，提取液蒸干，加水30±10ml使残渣溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2-3次，每次30±10ml，合并正丁醇液，用碱性溶液充分洗涤2±1次，每次30±10ml，弃去碱性溶液，正丁醇液蒸干，加甲醇1±0.5ml使残渣溶解，即得山银花和天冬供试品溶液；
所述山银花和天冬对照药材溶液制备步骤中，分别取1g山银花和天冬对照药材，加入50±10ml的水，煎煮提取60±20min，滤过，提取液加入1±0.5倍量的无水乙醇，摇匀，静置2±1小时，滤过，滤液置水浴中蒸至30±10ml，用水饱和正丁醇振摇提取2-3次，每次30±10ml，合并正丁醇液，用碱性溶液充分洗涤2±1次，每次30±10ml，弃去碱性溶液，正丁醇液蒸干，加甲醇1±0.5ml使残渣溶解，分别得到山银花对照药材溶液和天冬对照药材溶液；
麦冬鉴别步骤，麦冬对照药材溶液制备步骤中，取1g麦冬对照药材，加入50±10ml的水，煎煮提取60±20min，滤过，提取液加入1±0.5倍量的无水乙醇，摇匀，静置2±1小时，滤过，滤液置水浴中蒸至30±10ml，用水饱和正丁醇振摇提取2-3次，每次30±10ml，合并正丁醇液，用碱性溶液充分洗涤2±1次，每次30±10ml，弃去碱性溶液，正丁醇液蒸干，加甲醇1±0.5ml使残渣溶解，即得麦冬对照药材溶液。
4.根据权利要求1所述的口炎清质量检测方法，其特征在于，所述甘草和玄参鉴别，甘草和玄参供试品溶液制备步骤中，取口炎清样品1袋，加入40±10ml水，超声提取30±10min，离心，取上清液，用乙酸乙酯萃取2±1次，取水层，用水饱和正丁醇振摇提取2-3次，每次30±10ml，合并正丁醇液，用水洗涤2±1次，每次30±10ml，弃水洗涤液，正丁醇液蒸干，加甲醇1±0.5ml使残渣溶解，即得甘草和玄参供试品溶液；
所述甘草和玄参对照药材溶液制备步骤中，分别取1g甘草和玄参对照药材，加入50±10ml的水，煎煮提取60±20min，滤过，提取液加入1±0.5倍量的无水乙醇，摇匀，静置2±1小时，滤过，滤液置水浴中蒸至30±10ml，用乙酸乙酯萃取2±1次，每次30±10ml，取水层，用水饱和正丁醇振摇提取2-3次，每次30±10ml，合并正丁醇液，用水洗涤2±1次，每次30±10ml，弃水洗涤液，正丁醇液蒸干，加甲醇1±0.5ml使残渣溶解，分别得到甘草对照药材溶液和玄参对照药材溶液。
5.根据权利要求1所述的口炎清质量检测方法，其特征在于，所述山银花和天冬鉴别步骤，山银花和天冬薄层鉴别步骤中，所述展开在相对湿度≤50％的条件下展开；所述硫酸乙醇溶液中硫酸体积百分浓度为10±2％的硫酸乙醇溶液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的口炎清质量检测方法，其特征在于，还包括以下高效液相特征谱图检测步骤：
参照物制备：取3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品，制成参照物溶液，即得；
供试品溶液制备：取口炎清供试品，加入体积百分浓度为50±10％的甲醇水溶液，超声30±10min，过滤，滤液即为供试品溶液；
检测：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相：以乙腈为A相，体积百分浓度为0.05％的磷酸水溶液为B相，流速为1ml/min，按照以下梯度洗脱方式进行洗脱：
检测波长：210±2nm；
数据分析：以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰为参照S峰，计算得到各色谱峰的相对保留时间。
7.根据权利要求6所述的口炎清质量检测方法，其特征在于，数据分析步骤中，以相对保留时间在规定值±10％之内的色谱峰为特征峰，所述规定值为：0.82、0.99、1.08、1.28、1.38、1.43、1.58。
8.根据权利要求1-5任一项所述的口炎清质量检测方法，其特征在于，还包括以下含量测定步骤：
对照品制备：取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、甘草苷、异绿原酸B、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸C、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙和甘草酸铵对照品，制成对照品溶液，即得；
供试品溶液制备：取口炎清供试品，加入体积百分浓度为50±10％的甲醇水溶液，超声30±10min，过滤，滤液即为供试品溶液；
检测：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相：以乙腈为A相，体积百分浓度为0.05％的磷酸水溶液为B相，流速为1ml/min，按照以下梯度洗脱方式进行洗脱：
检测波长：210±2nm；
数据分析：根据对照品色谱峰面积，计算得到供试品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、甘草苷、异绿原酸B、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸C、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙和甘草酸铵的含量。
9.根据权利要求6所述的口炎清质量检测方法，其特征在于，以超高效液相色谱仪进行检测，得到超高效液相色谱特征图谱，所述检测步骤采用下述条件：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相：以乙腈为A相，体积百分浓度为0.05％的磷酸水溶液为B相，流速为0.3ml/min，按照以下梯度洗脱方式进行洗脱：
检测波长：210±2nm。
10.权利要求1-9任一项所述的口炎清质量检测方法在口炎清颗粒质量控制中的应用。
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