CN116818973A - 一种二冬汤物质基准或二冬汤制剂的质量标准控制方法 - Google Patents

一种二冬汤物质基准或二冬汤制剂的质量标准控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种二冬汤物质基准或二冬汤制剂的质量标准控制方法，提供了一种用于二冬汤物质基准或二冬汤制剂的质量标准控制中的色谱测定指纹图谱的方法，所述色谱的流动相A为乙腈、流动相B为醋酸铵‑冰醋酸溶液，所述醋酸铵‑冰醋酸溶液中醋酸铵的浓度为0.04‑0.06mol/L。本发明中提供的色谱测定指纹图谱的方法可以建立分离度好、重现性高的指纹图谱，可实现较好的二冬物质基准或二冬汤制剂的质量标准控制。

Description

一种二冬汤物质基准或二冬汤制剂的质量标准控制方法
技术领域
本发明涉及中药制剂生产技术领域，具体涉及一种二冬汤物质基准或二冬汤制剂的质量标准控制方法。
背景技术
二冬汤出自清代程国彭《医学心悟》，处方原文为：治上消者，宜润其肺，兼清其胃，二冬汤主之。主要由天冬、麦冬、天花粉、黄芩、知母、甘草、人参和荷叶组成组成。二冬汤是中医经典方剂，主治肺胃燥热之上消，烦渴不止，小便频数，短气神倦，口干舌燥，舌质红，苔薄黄，脉数乏力者。二冬汤现代临床应用广泛，主要用于治疗糖尿病、糖尿病合并甲状腺功能亢进症、慢性支气管炎合并念珠菌感染等，疗效显著，无明显不良反应。
目前二冬汤被列入首批公布的经典名方100首中，具有较高的开发应用价值，例如，《山东中医药大学学报》2009年第43卷第2期的一篇《基于标准汤剂参比的二冬汤颗粒提取工艺研究》论文中，以二冬汤标准汤剂为参考，以黄芩苷、甘草酸、总皂苷、总多糖、浸膏率、乙醇(70％)可溶物测定为指标，筛选二冬汤颗粒的提取工艺；确定最佳工艺为药材加水煎煮2次，第1次加10倍量，煎煮2h，第2次加8倍量，煎煮1h。
但目前对于二冬汤物质基准和二冬汤制剂的质量标准控制方法，尚无全程控制手段，亦无全面反映该经方各味药所含化学成分种类及物质传递的系统性研究报道。例如，CN201911009150A公开了一种二冬汤组方中荷叶饮片指纹图谱测定方法，采用指纹图谱检定技术，对二冬汤中荷叶饮片中黄酮类成分和生物碱同时进行轮廓分析，该专利仅针对单独的荷叶饮片进行指纹图谱测定，并对二冬汤复方制剂进行检测。基于此，在如何将遵古与创新结合，并采用准确的质量标准控制方法来监控二冬汤物质基准和二冬汤制剂的制备过程是一个亟需解决的问题。
因此，本领域亟待开发一种针对二冬汤物质基准或二冬汤制剂的质量标准控制方法。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种色谱测定指纹图的方法，该方法可以建立分离度好、重现性高的指纹图谱，可实现较好的二冬物质基准或二冬汤制剂的质量标准控制。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种色谱测定指纹图谱的方法，用于二冬汤物质基准或二冬汤制剂的质量标准控制，所述色谱的流动相A为乙腈、流动相B为醋酸铵-冰醋酸溶液，所述醋酸铵-冰醋酸溶液中醋酸铵的浓度为0.04-0.06mol/L。
本发明通过选择特定的色谱条件，包括将乙腈和醋酸铵浓度为0.04-0.06mol/L的醋酸铵-冰醋酸溶液分别作为流动相A和流动相B，使得到的指纹图谱具有更好的分离度以及重现性。
如上所述的色谱测定指纹图谱的方法，作为一种优选方式，所述流动相B中醋酸铵的浓度为0.05mol/L。
如上所述的色谱测定指纹图谱的方法，作为一种优选方式，所述流动相B中冰醋酸的体积占比为2.5％-3.5％。即每1L水加入25-35mL的冰醋酸。
如上所述的色谱测定指纹图谱的方法，作为一种优选方式，所述色谱的条件包括：检测波长为250～260nm，流速为0.8～1.0mL/min，进样量为5～20μL，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
如上所述的色谱测定指纹图谱的方法，作为一种优选方式，所述色谱的条件包括：检测波长为254nm，和/或，流速为0.8mL/min，和/或，进样量为10μL，和/或，色谱柱为Inertsil ODS-4色谱柱。
如上所述的色谱测定指纹图谱的方法，作为一种优选方式，所述色谱的洗脱程序如下：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～52 14→21 86→79
52～75 21→44 79→56
75～90 44→67 56→33。
如上所述的色谱测定指纹图谱的方法，作为一种优选方式，所述色谱为高效液相色谱。
如上所述的色谱测定指纹图谱的方法，作为一种优选方式，所述色谱的供试品溶液的制备方法包括：
取所述二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加入醇类溶媒，称定重量，超声处理15～45min，冷却，再称定重量，用相应的溶媒补足减失的重量，混合均匀，过滤，取续滤液，即得到供试品溶液。
如上所述的色谱测定指纹图谱的方法，作为一种优选方式，所述醇类溶媒包括浓度为70％的乙醇、稀乙醇或70％甲醇中的任意一种或至少两种组合。本领域公知，“稀乙醇”指的是浓度为50％的乙醇。
如上所述的色谱测定指纹图谱的方法，作为一种优选方式，所述色谱的供试品溶液的制备方法包括：
取所述二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加入浓度为70％的乙醇，称定重量，超声处理30min，冷却，再称定重量，用70％乙醇不足损失的重量，混合均匀，过滤，取续滤液，即得到供试品溶液。
如上所述的色谱测定指纹图谱的方法，作为一种优选方式，所述超声的功率为250～800W，优选500W，频率为40kHz。
如上所述的色谱测定指纹图谱的方法，作为一种优选方式，所述色谱的供试品溶液的制备方法如下：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
如上所述的色谱测定指纹图谱的方法，作为一种优选方式，所述指纹图谱的参照物溶液的制备方法为：取黄芩苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液，即得。
如上所述的色谱测定指纹图谱的方法，作为一种优选方式，所述方法还可以用于测定甘草酸的含量，测试条件如上文所述。
当所述方法用于测定甘草酸含量时，对照溶液的制备方法为：取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含25μg的溶液，即得。(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)。
通过本发明提供的方法测定得到指纹图谱后，确定二冬汤物质基准的指纹图谱是否包含表1和表2中的色谱峰，并进行相似度评价，判断待测二冬汤质量是否合格。
表1
编号 平均保留时间 保留时间RSD(％)
峰1 0.255 0.3
峰2 0.546 0.2
峰3 0.694 0.1
峰4(S) 1.000 0.0
峰5 1.272 0.1
峰6 1.449 0.1
峰7 1.605 0.2
峰8 1.950 0.3
峰9 2.006 0.3
以上色谱峰的具体归属情况如图1所示。
表2
以上色谱峰的具体归属情况图2所示，其中，a为物质基准，b为芒果苷，c为金丝桃苷，d为黄芩苷，e为千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，f为汉黄芩苷，g为甘草酸，h为黄芩素。
本发明的目的之二在于提供一种二冬汤物质基准或二冬汤制剂的质量标准控制方法，所述质量标准控制方法包括：
(1)色谱测定指纹图谱；
(2)色谱测定甘草酸、黄芩苷、知母皂苷BⅡ以及芒果苷的含量；
(3)薄层鉴别天冬、麦冬、黄芩、知母、甘草以及荷叶。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，所述指纹图谱或所述甘草酸的含量按照目的之一所述的方法进行测定。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，所述黄芩苷含量测定中，供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加入70％乙醇或稀乙醇，称定重量，超声15-45分钟(例如15分钟、30分钟或45分钟等)，冷却，再称定重量，用相应溶媒补足减失的重量，混合均匀，滤过，取续滤液，置于量瓶中，加相应溶媒稀释至刻度，混合均匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
和/或，所述知母皂苷BⅡ含量测定中，供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加入25％乙腈或30％丙酮，称定重量，超声处理15-45分钟(例如15分钟、30分钟或45分钟等)，冷却，再称定重量，用相应的溶媒补足减失的重量，混合均匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
和/或，所述芒果苷含量测定中，供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加入70％乙醇，稀乙醇或70％甲醇，称定重量，超声处理15分钟，30分钟或45分钟，冷却，再称定重量，用相应的溶媒补足减失的重量，混合均匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，所述知母皂苷BⅡ含量测定，流动相为乙腈-水(25︰75)。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，甘草酸含量测定方法如下：
色谱条件与系统适用性试验：用Inertsil ODS-4(4.6×250mm，5μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.05mol/L的醋酸铵溶液-冰醋酸(取3.85g醋酸铵溶于1000mL水中，加入30mL冰醋酸)为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm；流速为每分钟0.8mL。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500，洗脱梯度如下表：
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含25μg的溶液，即得(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)。
供试品溶液的制备：取二冬汤物质基准约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，黄芩苷含量测定方法如下：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-磷酸(47︰53︰0.2)为流动相；检测波长为280nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取二冬汤物质基准约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液1mL，置25mL量瓶中，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，知母皂苷BⅡ含量测定方法如下：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(25︰75)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按知母皂苷BⅡ峰计算应不低于10000。
对照品溶液的制备：取知母皂苷BⅡ对照品适量，精密称定，加25％乙腈制成每1mL含0.5mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取二冬汤物质基准约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％乙腈25mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)15分钟，放冷，再称定重量，用25％乙腈补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液3μL、10μL，供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，芒果苷含量测定方法如下：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(8︰92)为流动相；检测波长为258nm。理论板数按芒果苷峰计算应不低于6000。
对照品溶液的制备：取芒果苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含30μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取二冬汤物质基准约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，所述天冬的薄层鉴别使用的展开剂为13:7:2:0.1的三氯甲烷-甲醇-水-甲酸混合溶液；
和/或，所述麦冬的薄层鉴别使用的展开剂为7:3:(0.2-0.25)的甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸混合溶液；
和/或，所述黄芩的薄层鉴别使用的展开剂为5:3:1:(0.5-1)的乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水混合溶液；
和/或，所述知母的薄层鉴别使用的展开剂为1:1的乙醇-水混合溶液或20︰20︰0.1的乙醇-水-甲酸混合溶液；
和/或，所述甘草的薄层鉴别使用的展开剂为(13-14):7:2的三氯甲烷-甲醇-水混合溶液；
和/或，所述荷叶的薄层鉴别使用的展开剂为3:4:2:(0.5-1)的二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水。
上述展开剂中的比例为体积比。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，所述天冬薄层鉴别的供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加水溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2次，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，正丁醇液蒸干，残渣加水溶解，通过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、20％乙醇、60％乙醇、95％乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，即得到供试品溶液；
和/或，所述麦冬薄层鉴别的供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加水、盐酸，煎煮20分钟，滤过，滤液放冷后用三氯甲烷振摇提取2次，合并三氯甲烷液，用氨水洗涤直至上层无色，取下层三氯甲烷液，蒸干，残渣加三氯甲烷使溶解，即得到供试品溶液；
和/或，所述黄芩或知母薄层鉴别的供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂置于容器中，加70％乙醇，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得到供试品溶液；
和/或，所述甘草薄层鉴别的供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加甲醇，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水使溶解，用乙醚振摇提取2次，弃去乙醚液，水层用水饱和正丁醇振摇提取2次，合并正丁醇液，用0.5％氢氧化钠溶液洗涤2次，合并氢氧化钠液，正丁醇液留用，氢氧化钠液用盐酸调节pH值至3～4，乙酸乙酯振摇提取2次，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，即得到供试品溶液；
和/或，所述荷叶薄层鉴别的供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加0.5％氢氧化钠溶液，超声使溶解，离心，取上清液用乙酸乙酯振摇提取2次，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇使溶解，即得到供试品溶液。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，所述天冬薄层鉴别的点样量为5μL。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，所述麦冬薄层鉴别的点样量为2μL。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，所述天冬薄层鉴别的步骤，具体为：取二冬汤物质基准2g，加水25mL溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次25mL，正丁醇液蒸干，残渣加水适量溶解，通过D101大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，柱高10cm)，依次用水、20％乙醇、60％乙醇、95％乙醇各50mL洗脱，收集95％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取原薯蓣皂苷对照品，加25％乙腈制成每1mL含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(13︰7︰2︰0.1)4℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开15cm，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，麦冬薄层鉴别的步骤，具体为：取二冬汤物质基准2g，加水60mL，盐酸3mL，煎煮20分钟，滤过，滤液放冷后用三氯甲烷振摇提取2次，每次30mL，合并三氯甲烷液，用氨水洗涤数次，直至上层无色，取下层三氯甲烷液，蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为供试品溶液；另取麦冬对照药材1g，同法制成麦冬对照药材溶液。吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(7:3:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与麦冬对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，黄芩薄层鉴别的步骤，具体为：取二冬汤物质基准1g，置具塞锥形瓶中，加70％乙醇50mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取黄芩对照药材0.5g，加水40mL，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加70％乙醇25mL使溶解，取上清液作为黄芩对照药材溶液。再取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液5μL、对照药材溶液2μL、对照品溶液10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5︰3︰1︰1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铁乙醇溶液，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，知母薄层鉴别的步骤，具体为：取二冬汤物质基准1g，置具塞锥形瓶中，加70％乙醇50mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取知母对照药材1g，加水50mL，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加70％乙醇50mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。再取芒果苷对照品，加70％乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液6μL、对照药材溶液和对照品溶液各1μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-水(1︰1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，甘草薄层鉴别的步骤，具体为：取二冬汤物质基准3g，加甲醇25mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水25mL使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次25mL，弃去乙醚液，水层用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次25mL，合并正丁醇液，用0.5％氢氧化钠溶液洗涤2次，每次25mL，合并氢氧化钠液，正丁醇液留用，氢氧化钠液用盐酸调节pH值至3～4，乙酸乙酯振摇提取2次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材1g，加水50mL，煎煮30分钟，滤过，自“用乙醚振摇提取2次”起，同法制成对照药材溶液。再取甘草苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13︰7︰2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或黄绿色荧光斑点。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，荷叶薄层鉴别的步骤，具体为：取二冬汤物质基准2g，加0.5％氢氧化钠溶液50mL，超声使溶解，离心，取上清液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30mL，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取荷叶对照药材1g，加水50mL，煎煮30分钟，滤过，蒸干，自“加0.5％氢氧化钠溶液50mL”起，同法制成对照药材溶液。再取荷叶碱对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液和对照药材溶液各10μL、对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3︰4︰2︰1)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
如上所述的质量标准控制方法，作为一种优选方式，所述二冬汤制剂的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂或丸剂。
相较于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用高效液相色谱法建立分离度、重现性较好的指纹图谱，从整体上评价二冬汤物质基准的内在化学物质的种类、传递规律及其含量；
(2)本发明构建了二冬汤物质基准或二冬汤制剂的质量控制方法，采用高效液相色谱建立指纹图谱，并通过高效液相色谱法对黄芩苷、知母皂苷BⅡ、芒果苷、甘草酸进行定量研究，精密度、稳定性及重复性均良好。此外，采用薄层色谱法对物质基准中天冬、麦冬、荷叶、知母、黄芩、甘草进行鉴别，为物质基准中的特征成分溯源到药材提供了依据。
(3)本发明可保证临床用药的安全、有效和稳定，也为二冬汤复方制剂后续的制备工艺研究、质量标准建立及稳定性考察提供了详实可靠的研究基础。
附图说明
图1是二冬汤物质基准中药味归属HPLC对比图谱；
图2是二冬汤物质基准中相关成分确认HPLC对比图谱；
图3是对比例1的指纹图谱；
图4是对比例2的指纹图谱；
图5是对比例3的指纹图谱；
图6是实施例1的指纹图谱；
图7是实施例2的指纹图谱；
图8是实施例3的指纹图谱；
图9实施例4的指纹图谱；
图10实施例5的指纹图谱-1；
图11是实施例5的指纹图谱-2；
图12是实施例6～8的指纹图谱；
图13是实施例19薄层色谱图；
图14是实施例20薄层色谱图；
图15是实施例21薄层色谱图；
图16是实施例22薄层色谱图；
图17是实施例23薄层色谱图；
图18是实施例24薄层色谱图；
图19是实施例25的薄层色谱图；
图20是实施例26的薄层色谱图；
图21是实施例27的薄层色谱图；
图22是实施例28的薄层色谱图；
图23是实施例29的薄层色谱图；
图24是实施例30的薄层色谱图；
图25是实施例31的薄层色谱图；
图26是实施例32的薄层色谱图；
图27是实施例33的薄层色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
以下实施例和对比例针对二冬汤物质基准进行测试，二冬汤物质基准通过如下方法制备得到：
取天冬7.46g、麦冬11.19g、天花粉3.73g、黄芩3.73g、知母3.73g、甘草1.87g、人参(捣碎)1.87g、荷叶3.73g，置砂锅(规格：容量约750mL，内径为13.5cm，外径为16.0cm；高度为6.0cm，厚度为1.0cm)中，明火(燃气灶)加盖煎煮二次，第一次加水10倍量，浸泡30分钟，武火煮沸后，文火煎煮40分钟，200目滤布趁热滤过；第二次加水8倍量，武火煮沸后，文火煎煮30分钟，200目滤布趁热滤过，合并提取液；提取液减压浓缩(温度：70℃，真空度：-0.09MPa～-0.1MPa)至饮片投料量与浓缩液重量比约为1:3(g:g)(约110g)，冷冻干燥(预冻：温度为-20℃～-45℃，时间至少30分钟；干燥：冷阱温度为-50℃～-70℃，真空度＜100Pa，干燥时间至少16小时)，粉碎，即得二冬汤物质基准。
对比例1
本对比例提供一种高效液相色谱仪测定二冬汤物质基准指纹图谱的方法：
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，检测波长为258nm，按下表进行梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml，柱温为30℃。
供试品溶液的制备：取二冬汤物质基准约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法精密吸取供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，结果如图3所示。
梯度洗脱表
对比例2
在对比例1基础上，将流动相调整为以乙腈为流动相A，以0.2％醋酸溶液为流动相B，并调整洗脱梯度见下表，其他测定条件不变，指纹图谱如图4所示。
梯度洗脱表
对比例3
在对比例2基础上，将流动相调整为以乙腈为流动相A，以0.2％醋酸溶液为流动相B，并调整洗脱梯度见下表，其他测定条件不变，指纹图谱如图5所示。
梯度洗脱表
实施例1
在对比例3基础上，将流动相调整为以乙腈为流动相A，以0.05mol/L乙酸铵-冰醋酸溶液为流动相B(取3.85g醋酸铵溶于1000mL水中，加入30mL冰醋酸)，并调整洗脱梯度见下表，指纹图谱如图6所示。
梯度洗脱表
观察对比例1-3、实施例1得到的指纹图谱，对比例1的色谱峰多集中至16～42分钟段，前后信息量较少。对比例2的色谱峰集中在前60分钟内，但15分钟～25分钟内色谱峰分离度不佳。对比例3的色谱峰主要分布在48～80分钟，前面时间段信息量较少。实施例1的色谱峰分离效果优于对比例3，因此，以乙腈为流动相A、乙酸铵-冰醋酸溶液为流动相B能够得到分离度更佳的指纹图谱。
此外，当流动相B中乙酸铵浓度为0.04mol/L或0.06mol/L时，同样可以获得信息量丰富、分离度高的指纹图谱。
实施例2：
与实施例1的区别在于，调整洗脱梯度见下表，指纹图谱如图7所示。
梯度洗脱表
实施例2与实施例1相比，得到的图谱信息量较大，色谱峰较多，且各色谱峰分离度更好，故优选洗脱梯度如上表所示。
实施例3
与实施例2的区别仅在于，将色谱条件中的流速由1.0mL/min调整为0.8mL/min，指纹图谱如图8所示。
通过对比实施例2和3的实验结果可知，降低流速为0.8mL/min后，分离效果更好。
实施例4
采用二极管阵列检测器，供试品溶液在190～400nm波长下进行扫描，通过等吸收图谱进行分析，结果显示色谱峰在250～300nm波长范围内，信息量较大。选取波长240nm、250nm、254nm、260nm、280nm、300nm、320nm进行分析，其余检测条件均与实施例3相同，结果如图9所示(其中，1为240nm，2为250nm，3为254nm，4为260nm，5为280nm，6为300nm，7为320nm)，在254nm波长下，且各色谱峰响应值也较为适中，峰信息量较大，基线较平稳。根据上述结果，优选检测波长为250-260nm，进一步优选检测波长为254nm。
实施例5
分别考察不同色谱柱该方法耐用性，其余检测条件均与对比例1相同，结果如图10所示(1的色谱柱为Inertsil ODS-4(4.6×250mm，5μm)，2的色谱柱为华普Tnature C18(4.6×250mm，5μm)，3的色谱柱为岛津Inertsil ODS-3(4.6×250mm，5μm))，在不同色谱柱中以Inertsil ODS-4分离效果最佳，其余色谱柱分离效果不佳且信息量减少，因此，采用Inertsil ODS-4(4.6×250mm，5μm)型色谱柱不同S/N号进行测定，结果如图11所示(1的色谱柱为Inertsil ODS-4(4.6×250mm，5μm)8EF37062，2的色谱柱为Inertsil ODS-4(4.6×250mm，5μm)7CF37036，3的色谱柱为Inertsil ODS-4(4.6×250mm，5μm)20E0114691，4为对照图谱)，结果各共有峰峰型尖锐，对称，分离度良好。确定色谱柱为Inertsil ODS-4(4.6×250mm，5μm)。
实施例6-8
取二冬汤物质基准约1g(共三份)，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入70％乙醇50mL(实施例6)、稀乙醇50mL(实施例7)、70％甲醇50mL(实施例8)，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用相应溶媒补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，色谱条件测定为：用Inertsil ODS-4(4.6×250mm，5μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.05mol/L的醋酸铵溶液-冰醋酸(取3.85g醋酸铵溶于1000mL水中，加入30mL冰醋酸)为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm；流速为每分钟0.8mL。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。
梯度洗脱表
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～52 14→21 86→79
52～75 21→44 79→56
75～90 44→67 56→33
记录不同溶剂提取的供试品溶液色谱图，如图12所示，其中，1为实施例8，2为实施例6，3为实施例7，4为黄芩苷对照。
由实施例6-8的结果可知，70％乙醇、稀乙醇、70％甲醇为提取溶媒时，色谱中峰信息量、响应值均相差不大，且基线平稳程度基本一致，结合黄芩苷含量测定方法，故优选70％乙醇为提取溶媒。
通过对比例1-2、实施例1-8的实验，获得最优的指纹图谱测定方法：
色谱条件与系统适用性试验用Inertsil ODS-4(4.6×250mm，5μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.05mol/L的醋酸铵溶液-冰醋酸(取3.85g醋酸铵溶于1000mL水中，加入30mL冰醋酸)为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm；流速为每分钟0.8mL。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。
梯度洗脱表
参照物溶液的制备取黄芩苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取二冬汤物质基准约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
实施例7-9分别提供黄芩苷含量测定方法，具体如下：
实施例7：考察提取溶媒
取二冬汤物质基准约1g(共3组)，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％乙醇、稀乙醇、甲醇各50mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，分别用70％乙醇、稀乙醇、甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1mL，置25mL量瓶中，加相应溶媒稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取续滤液10μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。结果见下表。
提取溶媒考察结果
提取溶媒 黄芩苷含量(mg/g)
甲醇 17.22
70％乙醇 24.57
稀乙醇 25.34
实施例7技术效果：由试验结果可知，以70％乙醇及稀乙醇为溶媒的供试品溶液中黄芩苷含量基本一致且高于以甲醇为溶媒的供试品溶液，同时参考《中国药典》2015年版一部“黄芩”【含量测定】项下提取溶媒及操作可行性考虑，故本方法优选70％乙醇为提取溶媒。
实施例8：考察提取方式的考察
取二冬汤物质基准约1g(共3组)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定重量，分别加热回流30分钟、超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟、振摇30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1mL，置25mL量瓶中，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取续滤液10μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。结果见下表。
提取方式考察结果
提取方式 黄芩苷含量(mg/g)
回流提取 25.25
超声处理 27.76
振摇 26.39
实施例8技术效果：由试验结果可知，超声处理的提取方式中黄芩苷含量高于其他两种方式，故优选提取方式为超声提取。
实施例9：考察提取时间
取二冬汤物质基准约1g(共3组)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定重量，分别超声处理(功率500W，频率40kHz)15分钟、30分钟、45分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1mL，置25mL量瓶中，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取续滤液10μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。结果见下表。
提取时间考察结果
提取时间(分钟) 黄芩苷含量(mg/g)
15 26.80
30 27.26
45 26.85
实施例9技术效果：由试验结果可知，提取30分钟黄芩苷含量高于提取15分钟和45分钟，故优选提取时间为30分钟。
实施例10-12分别提供知母皂苷BⅡ含量测定方法，具体如下：
实施例10：考察提取溶媒
取二冬汤物质基准约1g(共3组)，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入30％丙酮、稀乙醇、25％乙腈、50％甲醇各25mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用相应溶媒补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。精密吸取续滤液20μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。结果见下表。
提取溶媒考察结果
提取溶媒 知母皂苷BⅡ含量(mg/g)
30％丙酮 3.178
稀乙醇 2.846
25％乙腈 3.169
50％甲醇 2.172
实施例10技术效果：由试验结果可知，以30％丙酮和25％乙腈为溶媒的供试品中知母皂苷BⅡ含量无差异且均高于稀乙醇及50％甲醇为溶媒的供试品，由于本方法的流动相体系为乙腈-水(25︰75)，故优选25％乙腈为提取溶媒。
实施例11：考察提取方式
取二冬汤物质基准约1g(共3组)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％乙腈25mL，称定重量，分别加热回流30分钟、超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟、振摇30分钟，取出，放冷，再称定重量，用25％乙腈补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。精密吸取续滤液20μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。结果见下表。
提取方式考察结果
提取方式 知母皂苷BⅡ含量(mg/g)
回流提取 3.231
超声处理 3.180
振摇 3.181
实施例11技术效果：由试验结果可知，三种提取方式所得知母皂苷BⅡ含量无明显差异，但超声操作简单，便捷，故优选提取方式为超声处理。
实施例12：考察提取时间
取二冬汤物质基准约1g(共3组)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％乙腈25mL，称定重量，分别超声处理(功率500W，频率40kHz)15分钟、30分钟、45分钟，取出，放冷，再称定重量，用25％乙腈补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。精密吸取续滤液20μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。结果见下表。
提取时间考察结果
提取时间(分钟) 知母皂苷BⅡ含量(mg/g)
15 3.111
30 3.030
45 3.032
实施例12技术效果：由试验结果可知，三种提取时间所得知母皂苷BⅡ含量无明显差异，故优选提取时间为15分钟。
实施例13-15分别提供芒果苷含量测定方法，具体如下：
实施例13：考察提取溶媒
取二冬汤物质基准约1g(共3组)，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％乙醇、稀乙醇、甲醇各50mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，分别用70％乙醇、稀乙醇、甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取续滤液10μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
表38 提取溶媒考察结果
提取溶媒 芒果苷含量(mg/g)
甲醇 1.323
70％乙醇 1.382
稀乙醇 1.386
实施例13技术效果：由试验结果可知，三种提取溶媒测定的供试品溶液中芒果苷含量基本一致，选择提取溶媒为70％乙醇。
实施例14：考察提取方式
取二冬汤物质基准约1g(共3组)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定重量，分别加热回流30分钟、超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟、振摇30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取续滤液10μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
表39 提取方式考察结果
提取方式 芒果苷含量(mg/g)
超声 1.383
振摇 1.170
回流 1.409
实施例14技术效果：由试验结果可知，振摇提取测定的供试品溶液中芒果苷含量偏低，提取不充分；超声提取与回流提取测定的供试品溶液中芒果苷含量基本一致，选择提取方式为超声提取。
实施例15：考察提取时间
取二冬汤物质基准约1g(共3组)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定重量，分别超声处理(功率500W，频率40kHz)15分钟、30分钟、45分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。精密吸取续滤液10μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
表40 提取时间考察结果
提取时间 芒果苷含量(mg/g)
15分钟 1.422
30分钟 1.403
45分钟 1.396
实施例15技术效果：由试验结果可知，提取时间为15分钟、30分钟、45分钟时，测定的供试品溶液中芒果苷含量基本一致，选择优选时间为15分钟。
实施例16-18分别提供甘草酸含量测定方法，具体如下：
实施例16：提取溶媒考察
取二冬汤物质基准约1g(共3组)，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％乙醇、稀乙醇、甲醇各50mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，分别用70％乙醇、稀乙醇、甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取续滤液10μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
表50 提取溶媒考察结果
提取溶媒 甘草酸含量(mg/g)
甲醇 0.5600
70％乙醇 1.058
稀乙醇 1.080
实施例16技术效果：由试验结果可知，甲醇做提取溶剂时，测定的供试品溶液中甘草酸含量偏低，表明提取不充分；70％乙醇、稀乙醇测定的供试品溶液中甘草酸含量基本一致，由于稀乙醇做溶剂时滤过困难，故优选提取溶媒为70％乙醇。
实施例17：提取方式考察
取二冬汤物质基准约1g(共3组)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定重量，分别加热回流30分钟、超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟、振摇30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取续滤液10μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
表51 提取方式考察结果
提取方式 甘草酸含量(mg/g)
超声 1.084
振摇 1.031
回流 1.108
实施例17技术效果：由试验结果可知，三种提取方式测定的供试品中甘草酸含量基本一致，考虑到操作简便，优选提取方式为超声提取。
实施例18：提取时间考察
取二冬汤物质基准约1g(共3组)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定重量，分别超声处理(功率500W，频率40kHz)15分钟、30分钟、45分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，即得。精密吸取续滤液10μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
表52 提取时间考察结果
实施例18技术效果：由试验结果可知，提取时间为15分钟、30分钟、45分钟时，测定的供试品中甘草酸含量基本一致，选择提取时间为15分钟。
实施例19-22分别提供天冬薄层鉴别方法
实施例19
取二冬汤物质基准3g，加水35mL使溶解，滤过，滤液用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次30mL，取正丁醇层，用水洗涤2次，每次30mL，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5mL使溶解，作为供试品溶液。另取缺天冬阴性粉末1.5g、缺麦冬阴性粉末1.5g，分别同法制成缺天冬阴性样品溶液和缺麦冬阴性样品溶液。再取天冬饮片和麦冬饮片各2g，分别加水50mL，煎煮30分钟，滤过，自“滤液用水饱和正丁醇振摇提取2次”起，同法制成相应的饮片溶液。吸取上述溶液1μL～2μL，分别点于同一硅胶G薄层板(烟台硅胶G板(T:26.4℃RH:67％))上，以三氯甲烷-甲醇-水(13︰7︰2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，如图13所示，其中，1为天冬饮片溶液(TD-20180313-DJC-YP02)1μl，2为缺天冬阴性样品溶液(D-190408-Y-TD-01)2μl，3为物质基准供试品溶液(D-190329-01)1μl，4为缺麦冬阴性样品溶液(D-190408-Y-MD-01)2μl，5为麦冬饮片溶液(MD-20171114-CSJ-YP03)1μl。
实施例20
取二冬汤物质基准2g，加水25mL溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次25mL，正丁醇液蒸干，残渣加水适量溶解，通过D101大孔树脂吸附色谱柱(内径1.5cm，柱高10cm)，依次用水、20％乙醇、60％乙醇、95％乙醇各50mL洗脱，收集95％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取缺天冬阴性样品2g，缺麦冬阴性样品2g，同法制成缺天冬、缺麦冬阴性样品溶液。再取天冬对照药材1g，麦冬对照药材1g，加水50mL，煎煮30分钟，滤过，滤液自“用水饱和正丁醇振摇提取2次”起，同法制成对照药材溶液。吸取上述溶液适量，分别点于同一硅胶G薄层板(烟台硅胶G板，T:26.1℃，RH:81％)上，以三氯甲烷-甲醇-水(13︰7︰2)4℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365nm)下检视，如图14所示，其中，1为天冬饮片溶液(TD-20180313-DJC-YP02)1μl，2为缺天冬阴性样品溶液(D-190408-Y-TD-01)2μl，3为物质基准供试品溶液(D-190329-01)1μl，4为缺麦冬阴性样品溶液(D-190408-Y-MD-01)2μl，5为麦冬饮片溶液(MD-20171114-CSJ-YP03)1μl。
实施例21
取二冬汤物质基准2g，加水25mL溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次25mL，正丁醇液蒸干，残渣加水适量溶解，通过D101大孔树脂吸附色谱柱(内径1.5cm，柱高10cm)，依次用水、20％乙醇、60％乙醇、95％乙醇各50mL洗脱，收集95％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取缺天冬阴性样品2g，缺麦冬阴性样品2g，同法制成缺天冬、缺麦冬阴性样品溶液。再取天冬对照药材1g，麦冬对照药材1g，加水50mL，煎煮30分钟，滤过，滤液自“用水饱和正丁醇振摇提取2次起，同法制成对照药材溶液。吸取上述溶液适量，分别点于同一硅胶G薄层板(青岛硅胶G板，T:25.0℃，RH:54％)上，以三氯甲烷-甲醇-水(13︰7︰2)4℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365nm)下检视，如图15所示，其中，1为物质基准供试品溶液(D-190708-01)4μl，2为缺天冬阴性样品溶液(D-190715-Y-TD-01)，3为天冬对照药材溶液(批号：121139-201605，中国食品药品检定研究院)2μl，4为物质基准供试品溶液(D-190708-01)为4μl，5为缺麦冬阴性样品溶液(D-190715-Y-MD-01)4μl，6为麦冬对照药材溶液(批号：121013-201711，中国食品药品检定研究院)2μl。
实施例22
取二冬汤物质基准2g，加水25mL溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次25mL，正丁醇液蒸干，残渣加水适量溶解，通过D101大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，柱高10cm)，依次用水、20％乙醇、60％乙醇、95％乙醇各50mL洗脱，收集95％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取缺天冬阴性样品2g，同法制成缺天冬阴性样品溶液。再取原薯蓣皂苷对照品适量，加25％乙腈制成每毫升含0.1mg的对照品溶液。吸取上述溶液适量，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(13︰7︰2︰0.1)4℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开15cm，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视，点样量为5μL的薄层鉴别结果如图16所示，图中为烟台高效硅胶G板(10×20cm)(T:25.3℃RH:44％)，其中1为5μL原薯蓣皂苷对照品溶液(批号：111937-201201，中国食品药品检定研究院)，2～4为5μL物质基准供试品溶液(D-210324-02)，5为5μL缺天冬阴性样品溶液(D-211022-Y-TD-01)。
图13显示，供试品色谱中，在与天冬饮片及麦冬饮片相应位置上显相同颜色的荧光斑点，但天冬、麦冬专属性斑点分离度较差。
图14显示，在与天冬饮片相应位置上显相同颜色的斑点，但背景干扰较重且麦冬饮片色谱中无清晰可见的斑点，方法不可行。
图15显示，天冬斑点比移值偏小，天冬麦冬相应位置上有轻微干扰，主斑点描述不够清晰，故将天冬、麦冬分开单独进行鉴别。
图16显示，在与原薯蓣皂苷相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰，同时点样量为5μL时斑点大小及颜色深浅较为合适，因此优选点样量为5μL。
实施例23-24分别提供麦冬薄层鉴别方法
实施例23：采用酸水解制样试验。
取二冬汤物质基准2g，加水60mL，盐酸3mL，煎煮20分钟，滤过，滤液放冷后用三氯甲烷振摇提取2次，每次30mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为供试品溶液；另取缺麦冬阴性样品2g，同法制成缺麦冬阴性样品溶液；再取麦冬饮片1g，剪碎，同法制成麦冬饮片溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取上述溶液1μL～2μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(7:3:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，结果如图17所示，图中，烟台高效硅胶GF254板，T:25.5℃RH:75％，1～2为麦冬饮片溶液(MD-20180313-CST-YP02)1μl～2μl，3～4为物质基准供试品溶液(D-200709-01)1μl～2μl，5～6为缺麦冬阴性样品溶液(D-200709-Y-MD-01)1μl～2μl。
实施例23的结果中阴性有干扰，杂质干扰较多。
实施例24：在实施例23制样的基础上，采用氨水洗涤进行除杂。
取二冬汤物质基准2g，加水60mL，盐酸3mL，煎煮20分钟，滤过，滤液放冷后用三氯甲烷振摇提取2次，每次30mL，合并三氯甲烷液，用氨水洗涤数次，直至上层无色，取下层三氯甲烷液，蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为供试品溶液；另取缺麦冬阴性样品2g，同法制成缺麦冬阴性样品溶液；再取麦冬对照药材1g，同法制成麦冬对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取上述溶液1μL～2μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(7:3:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。结果如图18所示，图中为青岛硅胶GF254板(T:24.7℃RH:52％)，其中，1～2为麦冬对照药材溶液(批号：121013-201711，中国食品药品检定研究院)1μL、2μL，3～4为物质基准供试品溶液(D-200709-01)1μL、2μL，5～6为缺麦冬阴性样品溶液(D-200709-Y-MD-01)1μL、2μL。
实施例24的结果中，在与麦冬对照药材相应位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。由此可知，采用氨水洗涤制样(实施例24)相较于采用酸水解制样(实施例23)效果更好，且点样量为2μL时斑点清晰，阴性无干扰，方法可行。
实施例25-27分别提供黄芩薄层鉴别方法
实施例25
取本品5g，加乙酸乙酯-甲醇(3:1)混合液40ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺黄芩阴性样品5g，同法制成阴性样品溶液。再取黄芩对照药材0.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，同法制成黄芩对照药材溶液。继取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液适量，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5︰3︰1︰1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铁乙醇溶液，置日光下检视，结果见图19，图中为青岛硅胶G板，T:26.0℃，RH:57％，1为黄芩苷对照品溶液(批号：110715-201720，中国食品药品检定研究院)2μl，2为黄芩对照药材溶液(批号：120955-201810，中国食品药品检定研究院)2μl，3为物质基准供试品溶液(D-190329-01)2μl，4为缺黄芩阴性样品溶液(D-190408-Y-HQ-01)2μl。
实施例25结果中：在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。
实施例26：
采用定量毛细管对点样量进行考察，确定最佳点样量。结果如图20所示，图中为烟台硅胶G板，T:25.8℃，RH:59％，1～3为缺黄芩阴性样品溶液(D-190715-Y-HQ-01)2μl、5μl、10μl，4～6为供试品溶液(D-190708-01)2μl、5μl、10μl，7～9为黄芩对照药材溶液(批号：120955-201810)1μl、2μl、5μl，10～12为黄芩苷对照品溶液(批号：110715-201821)2μl、5μl、10μl。
实施例26结果中：确定黄芩苷对照品的点样量为10μl，黄芩对照药材溶液的点样量为2μl，供试品溶液的点样量为5μl。
实施例27：
取本品1g，置具塞锥形瓶中，加70％乙醇50ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取缺黄芩阴性粉末1g，同法制得阴性样品溶液。再取黄芩饮片0.5g，加水40ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加70％乙醇25ml使溶解，取上清液，作为黄芩饮片溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液适量，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5︰3︰1︰1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铁乙醇溶液，置日光下检视，结果见图21，图中为烟台硅胶G板，T:25.3℃，RH:64％，1为黄芩苷对照品溶液(批号:110715-201821，中国食品药品检定研究院)10μl，2为黄芩对照药材溶液(批号:120955-201810，中国食品药品检定研究院)2μl，3～5为物质基准供试品溶液(D-190708-01)5μl，6为缺黄芩阴性样品溶液(D-190715-Y-HQ-01)5μl。
实施例27结果中：在与黄芩饮片色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰，方法可行。
实施例28-29分别提供知母薄层鉴别方法
实施例28：
取本品1g，置具塞锥形瓶中，加70％乙醇50ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取缺知母阴性粉末1g，同法制得阴性样品溶液。再取知母对照药材1g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加70％乙醇50ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为知母对照药材溶液。继取芒果苷对照品，加70％乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取上述溶液适量，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-水(1︰1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。结果见图22，图中为台州聚酰胺薄膜，T:24.5℃，RH:72％，1～2为芒果苷对照品(批号：111607-201704，中国食品药品检定研究院)1μl、2μl，3～4为知母对照药材(批号：121070-201806，中国食品药品检定研究院)2μl、1μl，5～6为物质基准供试品溶液(D-200805-01)4μl、6μl，7～8为缺知母阴性样品溶液(D-200907-Y-ZM-01)4μl、6μl。
实施例28结果中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点且阴性无干扰，方法可行。并确定芒果苷对照品及对照药材的点样量为1μl，缺知母阴性样品溶液与物质基准供试品溶液的点样量为6μl。
实施例29：
取本品1g，研细，置具塞锥形瓶中，加70％乙醇50ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取缺知母阴性样品1g，同法制成缺知母阴性样品溶液；再取物质基准对应实物1g，同法制成物质基准溶液；继取知母对照药材1g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加70％乙醇50ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。继取芒果苷对照品，加70％乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液、缺知母阴性样品溶液和物质基准溶液各5μl、对照药材溶液和对照品溶液各1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-水-甲酸(20︰20︰0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。结果见图23，图中为路桥四甲聚酰胺薄膜，规格为10×10cm，温度29.2℃湿度70％，1为芒果苷溶液1μl(批号：111607-201704，中国食品药品检定研究院)，2为知母对照药材溶液1μl(批号：121070-201806，中国食品药品检定研究院)，3～5为供试品溶液5μl(ED-210323-CP-02)，6为物质基准溶液5μl(D-210324-01)，7为缺知母阴性样品溶液5μl(D-210423-Y-ZM-01)。
实施例29中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点，且阴性无干扰，方法可行。
实施例28及实施例29的方法均可鉴别知母。
实施例30-31分别提供甘草薄层鉴别方法
实施例30：
取本品3g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次25ml，弃去乙醚液，水层用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次25ml，合并正丁醇液，用0.5％氢氧化钠溶液洗涤2次，每次25ml，合并氢氧化钠液，用盐酸调节pH值至3～4，乙酸乙酯振摇提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺甘草阴性样品样品3g，同法制成阴性样品溶液。再取甘草对照药材1g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，自“用乙醚振摇提取2次”起，同法制成对照药材溶液。继取甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13︰7︰2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365nm)下检视。结果见图24，图中为青岛硅胶HSG板，T:23.0℃，RH:70％，1为甘草苷对照品溶液(批号：111610-201607，中国食品药品检定研究院)1μl，2为甘草对照药材溶液(批号：120904-201620，中国食品药品检定研究院)1μl，3为物质基准供试品溶液(D-190708-03)1μl，4为缺甘草阴性样品溶液(D-190715-Y-GC-01)1μl。
实施例30结果中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或黄绿色荧光斑点，阴性无干扰，方法可行。并确定点样量为1μl。
实施例31：
取本品3g，研细，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次25ml，弃去乙醚液，水层用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次25ml，合并正丁醇液，用0.5％氢氧化钠溶液洗涤2次，每次25ml，合并氢氧化钠液，氢氧化钠液用盐酸调节pH值至3～4，乙酸乙酯振摇提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺甘草阴性样品3g，同法制成缺甘草阴性样品溶液。再取物质基准对应实物3g，同法制成物质基准溶液。继取甘草对照药材1g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，自“用乙醚振摇提取2次”起，同法制成对照药材溶液。继取甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各1μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13︰7︰2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开10～13cm，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365nm)下检视。结果见图25，图中为烟台硅胶G薄层板，规格：10×20cm，展距：13cm，温度：28.5℃，湿度：70％，1为甘草苷溶液1μl(批号：111610-201908，中国食品药品检定研究院)，2为甘草对照药材溶液1μl(批号：120904-202021，中国食品药品检定研究院)，3～5为供试品溶液1μl(ED-210323-CP-02)，6为物质基准溶液1μl(D-210324-01)，7为缺甘草阴性样品溶液1μl(D-210423-Y-GC-01)。
实施例30结果中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，且阴性无干扰，制剂与物质基准信息基本一致，故确定方法可行。并确定点样量为：供试品溶液、阴性样品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各1μl。
实施例30及实施例31的方法均可鉴别甘草。
实施例32-33分别提供荷叶薄层鉴别方法
实施例32：
取本品2g，加0.5％氢氧化钠溶液50ml，超声使溶解，离心，取上清液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30ml，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺荷叶阴性样品2g，同法制成阴性样品溶液。再取荷叶对照药材1g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，蒸干，自“加0.5％氢氧化钠溶液50ml”起，同法制成对照药材溶液。继取荷叶碱对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述溶液适量，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3︰4︰2︰1)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液，置日光下检视。结果见图26，图中为青岛硅胶G板，T:23.8℃，RH:67％，1为荷叶碱对照品(批号：11156-201706，中国食品药品检定研究院)5μl，2为荷叶对照药材溶液(121322-201504，中国食品药品检定研究院)10μl，3～5为物质基准供试品溶液10μl，6为缺荷叶阴性样品溶液10μl。
实施例32结果中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰，方法可行。
实施例33：
采用定量毛细管对点样量进行考察，确定最佳点样量，结果见图27，图中为青岛硅胶G板，T:24.2℃，RH:64％，1～2为荷叶碱对照品(批号：111566-201706，中国食品药品检定研究院)5、10μl，3～4为荷叶对照药材溶液(121322-201504，中国食品药品检定研究院)5、10μl，5～6为物质基准供试品溶液5、10μl，7～8为缺荷叶阴性样品溶液5、10μl。
实施例33结果中，确定荷叶碱对照品的点样量为5μl，荷叶对照药材溶液、物质基准供试品溶液及缺荷叶阴性样品溶液的点样量为10μl。
综上所述，本发明通过提取时间考察、浓缩工艺考察及干燥工艺考察，确定物质基准制备工艺，使所制备物质基准与提取液标准保持一致，即在工艺过程中主要成分损失较小，关键质量参数传递良好。采用薄层色谱法对物质基准中天冬、麦冬等物质的薄层鉴别方法进行优化，建立具有专属性，且耐用性较好的薄层鉴别方法。采用高效液相色谱法，优化摸索指纹图谱测定方法，建立分离度、重现性较好的指纹图谱；采用高效液相色谱法，优化供试品处理方法，建立黄芩苷、知母皂苷BⅡ、芒果苷、甘草酸含量测定方法，方法准确度及耐用性良好。

Claims (10)

1.一种色谱测定指纹图谱的方法，其特征在于，用于二冬汤物质基准或二冬汤制剂的质量标准控制，所述色谱的流动相A为乙腈、流动相B为醋酸铵-冰醋酸溶液，所述醋酸铵-冰醋酸溶液中醋酸铵的浓度为0.04-0.06mol/L。
2.根据权利要求1所述的色谱测定指纹图谱的方法，其特征在于，所述色谱的条件包括：检测波长为250-260nm，和/或，流速为0.8-1.0mL/min，和/或，进样量为5-20μL，和/或，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
优选地，所述色谱的条件包括：检测波长为254nm，和/或，流速为0.8mL/min，和/或，进样量为10μL，和/或，色谱柱为Inertsil ODS-4色谱柱；
优选地，所述色谱的洗脱程序如下：
3.根据权利要求1所述的色谱测定指纹图谱的方法，其特征在于，所述色谱的供试品溶液的制备方法包括：
取所述二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加入醇类溶媒，称定重量，超声处理15～45min，冷却，再称定重量，用所述醇类溶媒补足损失的重量，混合均匀，过滤，取续滤液，即得到供试品溶液。
4.根据权利要求1所述的色谱测定指纹图谱的方法，其特征在于，所述超声的功率为250-800W，频率为40kHz。
5.一种二冬汤物质基准或二冬汤制剂的质量标准控制方法，其特征在于，所述质量标准控制方法包括：
(1)色谱测定指纹图谱；
(2)色谱测定甘草酸、黄芩苷、知母皂苷BⅡ以及芒果苷的含量；
(3)薄层鉴别天冬、麦冬、黄芩、知母、甘草以及荷叶。
6.根据权利要求5所述的质量标准控制方法，其特征在于，所述指纹图谱或所述甘草酸的含量按照权利要求1-4中任一项所述的方法进行测定。
7.根据权利要求5或6所述的质量标准控制方法，其特征在于，所述黄芩苷含量测定中，供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加入70％乙醇或稀乙醇，称定重量，超声15-45分钟，冷却，再称定重量，用相应溶媒补足减失的重量，混合均匀，滤过，取续滤液，置于量瓶中，加相应溶媒稀释至刻度，混合均匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
和/或，所述知母皂苷BⅡ含量测定中，供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加入25％乙腈或30％丙酮，称定重量，超声处理15-45分钟，冷却，再称定重量，用相应溶媒补足减失的重量，混合均匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
和/或，所述芒果苷含量测定中，供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加入70％乙醇、稀乙醇或70％甲醇，称定重量，超声处理15-45分钟，冷却，再称定重量，用相应溶媒补足减失的重量，混合均匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
8.根据权利要求5或6所述的质量标准控制方法，其特征在于，所述天冬的薄层鉴别使用的展开剂为13:7:2:0.1的三氯甲烷-甲醇-水-甲酸混合溶液；
和/或，所述麦冬的薄层鉴别使用的展开剂为7:3:(0.2-0.25)的甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸混合溶液；
和/或，所述黄芩的薄层鉴别使用的展开剂为5:3:1:(0.5-1)的乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水混合溶液；
和/或，所述知母的薄层鉴别使用的展开剂为1:1的乙醇-水混合溶液或20︰20︰0.1的乙醇-水-甲酸混合溶液；
和/或，所述甘草的薄层鉴别使用的展开剂为(13-14):7:2的三氯甲烷-甲醇-水混合溶液；
和/或，所述荷叶的薄层鉴别使用的展开剂为3:4:2:(0.5-1)的二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水。
9.根据权利要求5或6所述的质量标准控制方法，其特征在于，所述天冬薄层鉴别的供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加水溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2次，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，正丁醇液蒸干，残渣加水溶解，通过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、20％乙醇、60％乙醇、95％乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，即得到供试品溶液；
和/或，所述麦冬薄层鉴别的供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加水、盐酸，煎煮20分钟，滤过，滤液放冷后用三氯甲烷振摇提取2次，合并三氯甲烷液，用氨水洗涤直至上层无色，取下层三氯甲烷液，蒸干，残渣加三氯甲烷使溶解，即得到供试品溶液；
和/或，所述黄芩或知母薄层鉴别的供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂置于容器中，加70％乙醇，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得到供试品溶液；
和/或，所述甘草薄层鉴别的供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加甲醇，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水使溶解，用乙醚振摇提取2次，弃去乙醚液，水层用水饱和正丁醇振摇提取2次，合并正丁醇液，用0.5％氢氧化钠溶液洗涤2次，合并氢氧化钠液，正丁醇液留用，氢氧化钠液用盐酸调节pH值至3～4，乙酸乙酯振摇提取2次，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，即得到供试品溶液；
和/或，所述荷叶薄层鉴别的供试品溶液制备方法包括：
取二冬汤物质基准或二冬汤制剂，加0.5％氢氧化钠溶液，超声使溶解，离心，取上清液用乙酸乙酯振摇提取2次，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇使溶解，即得到供试品溶液。
10.根据权利要求5或6所述的质量标准控制方法，其特征在于，所述二冬汤制剂的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂或丸剂。
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