CN109342631B - 中药组合物的hplc指纹图谱的构建方法及中药组合物的质量检测方法 - Google Patents

中药组合物的hplc指纹图谱的构建方法及中药组合物的质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药技术领域，具体涉及中药组合物的HPLC指纹图谱的构建方法及中药组合物的质量检测方法。包括供试品溶液的制备，对照品溶液的制备，色谱条件限定，经高效液相色谱法测定，得HPLC指纹图谱。在同一色谱条件下同时检测多味药材化学成分，从指纹图谱的相似度判断批量之间的质量一致性。还可追根溯源，寻找工艺操作中的问题。指纹图谱与对照图谱的相似度均大于0.9，能有效的反映成品批与批之间的质量，有利于全面监控产品的质量。避免了质量控制的单一性和片面性。并具有方便、快捷、稳定、精密、重现性好等特点。

Description

中药组合物的HPLC指纹图谱的构建方法及中药组合物的质量 检测方法
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及中药组合物的HPLC指纹图谱的构建方法及中药组合物的的质量检测方法。
背景技术
风寒感冒是风寒之邪外袭、肺气失宣所致。症状可见：恶寒重、发热轻、无汗、头痛身痛、鼻塞流清涕、咳嗽吐稀白痰、口不渴或渴喜热饮、苔薄白。治法应以辛温解表为主。常选用麻黄、荆芥、防风、苏叶等解表散寒药。代表方剂为《葱豉汤》、《荆防败毒散》。中成药可选用感冒清热冲剂、正柴胡饮冲剂、感冒软胶囊、川芎茶调散、通宣理肺丸等等。服药后可喝些热粥或热汤，微微出汗，以助药力驱散风寒。
败毒散主治发汗解表，散风祛湿。用于伤寒温病，憎寒壮热，项强头痛，四肢酸痛，噤口痢疾，无汗鼻塞，咳嗽有痰，是一剂扶正解表剂。主治气虚外感证。证见憎寒壮热，头项强痛，肢体酸痛，无汗，鼻塞声重，咳嗽有痰，胸膈痞满，舌淡苔白，脉浮而按之无力。扶正解表剂，适用于体质素虚又感外邪的表证。此时既要解表，又虑正虚，必须邪正兼顾。若单纯解表，则正虚而不堪发散，单纯补虚，则易于补而留邪。人体之虚，又有阴阳气血之不同侧重，故常以解表药分别配伍益气、助阳、滋阴、养血药物组成方剂，使表证得解，正气不伤。
目前，中国药典2015年版及相关文献报道中仅有枳壳、甘草、独活三味药材的薄层色谱的定性鉴别方法及枳壳的HPLC含量测定方法，不能够全面的控制产品的质量。
中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种中药组合物HPLC指纹图谱的构建方法及败毒颗粒的质量检测方法。该方法能有效的反映成品批与批之间的质量，有利于全面监控产品的质量。避免了质量控制的单一性和片面性。并具有方便、快捷、稳定、精密、重现性好等特点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了中药组合物的HPLC指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
制备供试品溶液；
制备对照品溶液；
分别取所述供试品溶液和所述对照品溶液经高效液相色谱法测定，获得中药组合物HPLC指纹图谱；
所述中药组合物的活性成分为柚皮苷、新橙皮苷和/或橙皮苷。
在本发明的一些具体实施方案中，所述中药组合物为治疗风寒感冒的中药组合物，包括党参10-30重量份、茯苓10-30重量份、甘草5-15重量份、枳壳10-30重量份、桔梗10-30重量份、羌活10-30重量份、独活10-30重量份、川芎10-30重量份、柴胡10-30重量份、前胡10-30重量份、生姜10-30 重量份、薄荷10-30重量份。所述中药组合物的具体制备方法为上述重量份生姜、薄荷水蒸汽蒸馏收集挥发油，并采用β-环糊精包合得挥发油包合物；除生姜、薄荷以外的药味，按照上述重量份高压差提取、浓缩、干燥，得水提取物。将上述水提取物及挥发油包合物，混合均匀，加入相应辅料制成颗粒剂、片剂、胶囊剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱法采用十八烷基键合硅胶为填充剂色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱，流速0.8～1mL/min，波长为210nm～290nm；柱温20℃～40℃。
在本发明的一些具体实施方案中，所述梯度洗脱程序如下：
Figure BDA0001912053080000021
Figure BDA0001912053080000031
在本发明的一些具体实施方案中，所述流速为1mL/min。
在本发明的一些具体实施方案中，所述波长为210nm～283nm。
在本发明的一些具体实施方案中，所述柱温为20℃～35℃。
在本发明的一些具体实施方案中，理论塔板数按柚皮苷计算应不低于 3000～6000。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备供试品溶液具体为：取中药组合物样品，研细后加甲醇，超声提取，过滤，收集滤液作为供试品溶液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述超声提取的功率为250W，频率为 40kHz，所述超声提取的时间为10～60min。作为优选，所述超声提取的时间为30min。
在本发明的一些具体实施方案中，参照物溶液的制备：分别取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷对照品适量，精密称定，分别用甲醇制成每1ml含80μg、 80μg、50μg的对照品溶液。
在本发明的一些具体实施方案中，供试品溶液制备：取样品粉末约1～5g，精密称定，精密加入50～70％甲醇25～100ml，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)提取10～60min，取出，放冷，再称定重量，用50～70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
在本发明的另一些具体实施方案中，供试品溶液制备：取样品粉末约1g，精密称定，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz) 提取30min，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
所述中药组合物的HPLC指纹图谱中包括10个特征峰，其中1个峰应与相应的参照物峰保留时间相同，柚皮苷为参照物峰(S峰)，计算特征峰1～8 的相对保留时间应在规定值的±5％之内，为：0.13～0.15(峰1)、0.18～0.20 (峰2)、0.22～0.24(峰3)、0.76～0.78(峰4)、0.86～0.88(峰5)、0.89～0.90 (峰6)、0.95～1.05(峰s)、1.03～1.05(峰8)、1.15～1.17(峰9)、1.27～1.29 (峰10)。
用前述中药组合物图谱的构建方法建立10批次中药组合物HPLC指纹图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)”生成有10个共有峰构成的中药组合物HPLC标准指纹图谱。其中7号为柚皮苷、8号为橙皮苷、9号为新橙皮苷。
本发明还提供了中药组合物的质量检测方法，包括如下步骤：
制备待测样品溶液；按照所述的构建方法获得待测样品的指纹图谱；
制备供试品溶液；按照所述的构建方法获得中药组合物HPLC指纹图谱；
对所述待测样品的指纹图谱与所述中药组合物HPLC指纹图谱进行相似性评价，相似度大于0.90为合格产品。
在本发明的一些具体实施方案中，取所述中药组合物样品，按上述同法操作，得到中药组合物样品指纹图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)”软件对中药组合物标准指纹图谱和样品指纹图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品。
通过试验，对10个特征峰进行归属：1、2、3、4号峰归属为柴胡药材， 5、6号峰归属为羌活药材，7～9号特征峰归属为枳壳药材，10号峰归属为独活药材。
本发明涉及中药组合物的HPLC指纹图谱的构建方法，包括供试品溶液的制备，对照品溶液的制备，色谱条件限定，分别精密吸取供试品溶液，各 10μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得HPLC指纹图谱。本发明的积极效果是：在同一色谱条件下同时检测多味药材化学成分，从指纹图谱的相似度判断批量之间的质量一致性。还可追根溯源，寻找工艺操作中的问题。指纹图谱与对照图谱的相似度均大于0.9，能有效的反映成品批与批之间的质量，有利于全面监控产品的质量。避免了质量控制的单一性和片面性。并具有方便、快捷、稳定、精密、重现性好等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示中药组合物的HPLC指纹图谱；
图2示中药组合物的10批次样品叠加图；
图3示中药组合物的对照指纹图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种中药组合物的HPLC指纹图谱的构建方法及中药组合物的质量检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的中药组合物指纹图谱的构建方法包括如下步骤：
1.供试品溶液制备：取所述中药组合物样品，研细，取约1～5g，精密称定，精密加入50％～70％甲醇25～100ml，称定重量，超声(功率250W，频率 40kHz)提取10～60分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％～70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.对照品溶液的制备：分别取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷对照品适量，精密称定，分别用甲醇制成每1ml含80μg、80μg、50μg的对照品溶液。
3.色谱条件：采用十八烷基键合硅胶为填充剂色谱柱；以乙腈为流动相 A，0.1％甲酸溶液为流动相B；柱温为20～40℃；流速为1ml/min；检测波长为210～290nm。
4.测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到中药组合物的指纹图谱。
在本发明的另一些具体实施方案中，中药组合物的HPLC指纹图谱的构建方法，其特征是包括下述步骤：
(1)供试品溶液的制备：取中药组合物的样品，研细，取约0.5～1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25～100mL，称定重量，超声处理 (功率250W，频率40kHZ)10～60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：分别柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷3个对照品适量，用甲醇溶解，制成每1mL含柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷80μg、80μg、 50μg的溶液。作为对照品溶液；
(3)色谱条件：采用采用十八烷基键合硅胶为填充剂色谱柱；色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱，流速1mL/min，波长为210nm～283nm；柱温20℃～35℃；
梯度洗脱过程中，流动相A、B的比例变化为：0～15min，A相10％～20％， B相90％～80％；5～30min，A相20％，B相80％；30～50min，A相20％～34％， B相80％～66％；50～51min，A相34％～10％,B相66％～90％；51～56min，A相 10％,B相90％。
即梯度洗脱程序以如下体积比浓度配置进行；
(4)测定：精密吸取供试品溶液5～20μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到中药组合物的指纹图谱
本发明提供的所述中药组合物的指纹图谱的最佳建立方法如下：
1.供试品溶液的制备：取中药组合物样品，研细，取约1g，精密称定，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)提取 30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.对照品溶液的制备：分别取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷对照品适量，精密称定，分别用甲醇制成每1ml含80μg、80μg、50μg的对照品溶液。
3.色谱条件：采用十八烷基键合硅胶为填充剂色谱柱；以乙腈为流动相 A，0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为 1ml/min；检测波长为283nm。
梯度洗脱过程中，流动相A、B的比例变化为：0～15min，A相10％～20％， B相90％～80％；5～30min，A相20％，B相80％；30～50min，A相20％～34％， B相80％～66％；50～51min，A相34％～10％,B相66％～90％；51～56min，A相 10％,B相90％。
即梯度洗脱程序以如下体积比浓度配置进行：
梯度洗脱程序表
Figure BDA0001912053080000061
Figure BDA0001912053080000071
4.测定：精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到中药组合物的指纹图谱。
用前述中药组合物图谱的构建方法建立10批次中药组合物HPLC指纹图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)”生成有10个共有峰构成的中药组合物HPLC标准指纹图谱。其中7号为柚皮苷、8号为橙皮苷、9号为新橙皮苷。
在标准指纹图谱中，以柚皮苷峰为参照峰S峰，计算各共有峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在第一规定值的±5％之内，所述第一规定值为：0.13～0.15(峰1)、0.18～0.20(峰2)、0.22～0.24(峰3)、0.76～0.78 (峰4)、0.86～0.88(峰5)、0.89～0.90(峰6)、0.95～1.05(峰s)、1.03～1.05 (峰8)、1.15～1.17(峰9)、1.27～1.29(峰10)。
取中药组合物，按上述同法操作，得到中药组合物样品指纹图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)”软件对中药组合物标准指纹图谱和样品指纹图谱进行分析，相似度大于0.90。
通过试验，对10个特征峰进行归属：1、2、3、4号峰归属为柴胡药材，5、 6号峰归属为羌活药材，7～9号特征峰归属为枳壳药材，10号峰归属为独活药材。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)用本发明所提供的方法构建的中药组合物HPLC指纹图谱与对照图谱的相似度大于0.90，能有效的表征其质量，有利于全面监控产品质量。
(2)指纹图谱注重各特征峰的关联性及指纹图谱的整体的面貌特征，避免了中药组合物质量控制的单一性和片面性。减少了人为处理样品质量达标的可能性。
(3)本发明具有方便、快捷、精密度高、重现性好等优点，可准确可靠的控制中药组合物的质量。
仪器与试剂
仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪
METTLER TOLEDO MS205DU双程电子天平
试剂：甲醇、乙腈为色谱醇；甲醇、乙醇、磷酸等均为分析纯。
2.对照品来源：柚皮苷对照品(批号：110722-201613)；新橙皮苷对照品(批号：11857-201102)；橙皮苷对照品(批号：110721-201617)，均购自中国食品药品检定研究院。
3.供试品来源:
本发明提供的中药组合物为治疗风寒感冒的中药组合物，包括党参10-30 重量份、茯苓10-30重量份、甘草5-15重量份、枳壳10-30重量份、桔梗10-30 重量份、羌活10-30重量份、独活10-30重量份、川芎10-30重量份、柴胡10-30 重量份、前胡10-30重量份、生姜10-30重量份、薄荷10-30重量份。所述中药组合物的具体制备方法为上述重量份生姜、薄荷水蒸汽蒸馏收集挥发油，并采用β-环糊精包合得挥发油包合物；除生姜、薄荷以外的药味，按照上述重量份高压差提取、浓缩、干燥，得水提取物。将上述水提取物及挥发油包合物，混合均匀，加入相应辅料制成颗粒剂、片剂、胶囊剂。
本发明提供的中药组合物HPLC指纹图谱的构建方法及中药组合物的质量检测方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1色谱条件的确定
检测波长：
精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，采用DAD检测器，于 200nm～400nm波长下检视光谱图。其他条件保持一致，根据三维扫描图中所有色谱峰出现最大吸收的检测波长。结果在283nm波长处，色谱峰的数目较多，且所有色谱峰出现最大吸收，色谱峰之间的分离效果较好。
流动相：
经查中国药典2015年版及相关资料，其他条件保持一致，考察流动相体系：①甲醇-水；②乙腈-水；③乙腈-0.4％磷酸溶液；④乙腈-0.1％甲酸溶液。
表1
组别 对照组3 对照组4 对照组5 实验组6
流动相 甲醇-水 乙腈-水 乙腈-0.4％磷酸溶液 乙腈-0.1％甲酸溶液
分离度 1.67 1.82 1.98 2.54*
注：*示与实验组相比，具有显著差异(P＜0.05)；#示与实验组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
结果，以柚皮苷色谱峰为参照峰，兼顾各成分峰面积及色谱峰的分离效果，选择乙腈-0.1％甲酸溶液为流动相。
柱温：
取同一供试品溶液，其他条件保持一致，分别在不同温度(25℃、30℃、 35℃等)下进行特征图谱测定。
表2
组别 对照组6 实验组7 实验组8 实验组9 实验组10 对照组7
柱温 15 20 30 35 40 45
分离度 1.23 2.44<sup>*</sup> 2.56<sup>#</sup> 2.08<sup>*</sup> 1.62<sup>*</sup> 1.41
注：*示与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)；#示与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
结果表明柱温在25℃、30℃时，以柚皮苷色谱峰为参照峰，色谱图中各成分峰的分离效果良好，30℃时最佳。
色谱柱：
取同一供试品溶液，其他条件保持一致，分别采用下列色谱柱进行特征图谱测定：
实验组11：(1)Kromasil 100-5-C18(4.6mm*250mm，5μm)
对照组8：(2)ACE 5 C18-AR(4.6mm*250mm，5μm)
对照组9：(3)Agilent C18(4.6mm*250mm，5μm)
结果，采用不同厂家色谱柱进行测定的色谱图中，特征峰的数目及峰序均不发生变化，峰型及色谱峰之间的分离度均较好。
供试品溶液制备方法：
提取方法：
分别取中药组合物，研细，约1g，精密称定，共6份，精密加入甲醇50ml，称定重量，其他条件保持一致，第1份超声处理(功率250W，频率40kHz) 10分钟，第2份超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，第3份超声处理(功率250W，频率40kHz)60分钟，第4份超声处理(功率250W，频率40kHz)5分钟，第5份超声处理(功率250W，频率40kHz)70分钟，第 6份回流提取60分钟，取出，放冷，再称定重量，分别用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。
表3
Figure BDA0001912053080000101
注：*示与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)；#示与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
超声提取的供试品色谱图中，色谱峰个数较稳定且杂质峰较少，分离效果较好。
提取溶剂选择：
分别取中药组合物，研细，约1g，精密称定，共4份，其他条件保持一致，精密加入30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇溶液50ml，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，用上述溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。
表4
Figure BDA0001912053080000102
注：*示与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)；#示与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
70％甲醇为溶剂的供试品色谱图中，色谱峰数目较多，吸收值较大，分离效果较好。
提取时间选择：
取中药组合物，研细，约1g，精密称定，共3份，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，其他条件保持一致，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)5、 10、20、30、40、50、60、70分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，精密吸取供试品溶液 10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。
表5
Figure BDA0001912053080000111
注：*示与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)；#示与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
超声30分钟的供试品色谱图中，色谱峰数目较多且稳定，相对用时较短，吸收值较大，分离效果较好。
提取溶剂量：
取中药组合物，研细，约1g，精密称定，共3份，其他条件保持一致，分别精密加入70％甲醇20、25、50、100、110ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。
表6
Figure BDA0001912053080000112
注：*示与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)；#示与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
表中数据表明，相同称样量，溶剂量越大，色谱峰越小，峰个数越少。加入70％甲醇50ml的供试品色谱图中，色谱峰数目较多，吸收值较平均，分离效果较好。
经过上述试验确定供试品溶液的制备方法及色谱条件如下：
1.供试品溶液的制备：取中药组合物，研细，取约1g，精密称定，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)提取30 分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.对照品溶液的制备：分别取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷对照品适量，精密称定，分别用甲醇制成每1ml含80μg、80μg、50μg的对照品溶液。
3.色谱条件：采用十八烷基键合硅胶为填充剂色谱柱；以乙腈为流动相 A，0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为 1ml/min；检测波长为283nm。
梯度洗脱过程中，流动相A、B的比例变化为：0～15min，A相10％～20％， B相90％～80％；5～30min，A相20％，B相80％；30～50min，A相20％～34％， B相80％～66％；50～51min，A相34％～10％,B相66％～90％；51～56min，A相 10％，B相90％。
即梯度洗脱程序以如下体积比浓度配置进行：
表7梯度洗脱程序表
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～15 10→20 90→80
5～30 20 80
30～50 20→34 80→66
50～51 34→10 66→90
51-56 10 90
4.测定：精密吸取供试品溶液5～20μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到中药组合物的指纹图谱。
实施例2
色谱条件与系统适应性试验采用十八烷基键合硅胶为填充剂色谱柱；以乙腈为流动相A，0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1ml/min；检测波长为283nm。
表8流动相梯度表
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～15 10→20 90→80
5～30 20 80
30～50 20→34 80→66
50～51 34→10 66→90
51-56 10 90
参照物溶液的制备：分别取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷对照品适量，精密称定，分别用甲醇制成每1ml含80μg、80μg、50μg的对照品溶液。
供试品溶液制备：取样品粉末约1g，精密称定，精密加入70％甲醇 50ml，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)提取60分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10～20μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
供试品特征图谱中应呈现10个特征峰，其中1个峰应与相应的参照物峰保留时间相同，柚皮苷为参照物峰(S峰)，计算特征峰1～8的相对保留时间应在规定值的±5％之内，为：0.13～0.15(峰1)、0.18～0.20(峰2)、0.22～0.24 (峰3)、0.76～0.78(峰4)、0.86～0.88(峰5)、0.89～0.90(峰6)、0.95～1.05 (峰s)、1.03～1.05(峰8)、1.15～1.17(峰9)、1.27～1.29(峰10)。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
实施例3色谱条件与系统适应性试验
采用十八烷基键合硅胶为填充剂色谱柱；以乙腈为流动相A，0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；柱温为25～35℃；流速为 0.8～1ml/min；检测波长为281～285nm。
表9流动相梯度表
Figure BDA0001912053080000141
参照物溶液的制备：分别取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷对照品适量，精密称定，分别用甲醇制成每1ml含80μg、80μg、50μg的对照品溶液。
供试品溶液制备：取样品粉末约0.4～1g，精密称定，精密加入70％甲醇 25～50ml，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)提取15～60分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10～20μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。供试品特征图谱中应呈现8个特征峰，其中1个峰应与相应的参照物峰保留时间相同，柚皮苷为参照物峰(S峰)，计算特征峰1～8的相对保留时间应在规定值的±5％之内，为：供试品特征图谱中应呈现10个特征峰，其中1个峰应与相应的参照物峰保留时间相同，柚皮苷为参照物峰(S峰)，计算特征峰1～8的相对保留时间应在规定值的±5％之内，为：0.13～0.15(峰1)、0.18～0.20(峰2)、0.22～0.24(峰3)、0.76～0.78 (峰4)、0.86～0.88(峰5)、0.89～0.90(峰6)、0.95～1.05(峰s)、1.03～1.05 (峰8)、1.15～1.17(峰9)、1.27～1.29(峰10)。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不低于 0.90。
实施例4精密度试验
取同一份供试品(本发明提供的中药组合物)，按实施例1特征图谱测定方法，连续进样6次，进行测定。记录色谱图，比较各主要共有峰(占总峰面积1％以上)的相对保留时间及相对峰面积，计算结果RSD值均小于3％，表明仪器测试精度符合要求。结果见表10、11。表面仪器精密度良好。
表10精密度试验相对保留时间
共有峰 1 2 3 4 5 6 均值 RSD(％)
1 0.139 0.139 0.139 0.139 0.139 0.139 0.139 0.021
2 0.187 0.187 0.187 0.187 0.187 0.187 0.187 0.066
3 0.232 0.232 0.232 0.232 0.232 0.232 0.232 0.056
4 0.801 0.800 0.801 0.800 0.800 0.801 0.801 0.031
5 0.837 0.837 0.838 0.837 0.837 0.838 0.837 0.021
6 0.942 0.941 0.941 0.941 0.941 0.941 0.941 0.019
7 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000
8 1.079 1.079 1.080 1.080 1.080 1.079 1.079 0.036
9 1.213 1.213 1.213 1.213 1.213 1.213 1.213 0.014
10 1.342 1.342 1.343 1.342 1.342 1.342 1.342 0.021
表11精密度试验相对峰面积
共有峰 1 2 3 4 5 6 均值 RSD(％)
1 0.100 0.100 0.100 0.100 0.100 0.099 0.100 0.331
2 0.048 0.048 0.048 0.048 0.048 0.048 0.048 0.405
3 0.051 0.052 0.051 0.052 0.052 0.052 0.052 1.550
4 0.100 0.100 0.100 0.100 0.100 0.100 0.100 0.081
5 0.057 0.057 0.056 0.056 0.056 0.056 0.056 0.243
6 0.036 0.035 0.035 0.035 0.035 0.035 0.035 0.874
7 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000
8 0.110 0.110 0.110 0.110 0.110 0.110 0.110 0.112
9 1.305 1.302 1.303 1.303 1.302 1.303 1.303 0.072
10 0.078 0.078 0.078 0.077 0.078 0.078 0.078 0.363
实施例5稳定性试验
取同一份供试品(本发明提供的中药组合物)溶液，按分别在0、2、4、 8、10、12、18、24小时按实施例1特征图谱测定方法进行测定，结果，特征图谱中各共有峰(占总峰面积1％以上)的相对保留时间及相对峰面积，RSD 值均小于3.0％，表明供试品溶液在24小时内稳定。结果见表12、13。表面样品在24小时内稳定性良好。
表12稳定性试验相对保留时间
Figure BDA0001912053080000161
表13稳定性试验相对峰面积
Figure BDA0001912053080000162
Figure BDA0001912053080000171
实施例6重复性试验
取同一批供试品(本发明提供的中药组合物)，按实施例1特征图谱测定方法制备6份供试品溶液，进行测定，结果，6次测定特征图谱中各共有峰 (占总峰面积1％以上)的相对保留时间及相对峰面积RSD值均小于3.0％。表明方法的重复性较好。结果见表14、15。
表14重复性相对保留时间
共有峰 1 2 3 4 5 6 均值 RSD(％)
1 0.139 0.139 0.139 0.138 0.138 0.138 0.138 0.181
2 0.187 0.187 0.187 0.187 0.187 0.187 0.187 0.108
3 0.233 0.232 0.232 0.232 0.232 0.232 0.232 0.106
4 0.802 0.801 0.801 0.801 0.801 0.800 0.801 0.063
5 0.838 0.837 0.837 0.837 0.837 0.836 0.837 0.062
6 0.943 0.943 0.943 0.943 0.943 0.943 0.943 0.014
7 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000
8 1.079 1.079 1.079 1.079 1.079 1.079 1.079 0.010
9 1.212 1.212 1.212 1.213 1.212 1.213 1.212 0.034
10 1.341 1.341 1.341 1.340 1.340 1.340 1.341 0.047
表15重复性相对峰面积
Figure BDA0001912053080000172
Figure BDA0001912053080000181
实施例7共有模式的建立
取10个批号的中药组合物，分别按实施例1特征图谱测定方法进行测定，得到10批供试品的高效液相色谱图。将10批供试品的测试数据导入国家药典委员会中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)软件进行处理，根据相似度的结果，经校正，将谱峰自动匹配，生成共有模式。确定了10个共有峰，其中峰面积较大，保留时间适中的7号峰(柚皮苷)作为参照峰S，分别将10批样品的特征图谱导入国家药典委员会中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)软件进行处理，生成对照特征图谱。10批供试品特征图谱相似度，如结果表 16～18。
表16 10批次中药组合物的相对保留时间
Figure BDA0001912053080000182
Figure BDA0001912053080000191
表17 10批次中药组合物的相对峰面积
Figure BDA0001912053080000192
表18 10批样品相似度评价结果
供试品编号 1 2 3 4 5
相似度 0.999 0.998 0.993 0.992 0.999
供试品编号 6 7 8 9 10
相似度 0.998 0.998 0.999 0.999 0.997
试验结果表明，10批样品的特征图谱的相似度均在0.9以上，中药组合物指纹图谱方法可以作为控制产品质量的有效方法。
对比例
1.现有技术即指中国药典2015版中列入的成方制剂败毒散的质量标准，并不是我们现在做的中药组合物，两者属于通处方药，但本发明提供的中药组合物是新药，并未列入药典或其他国标或部标。
2.薄层鉴别项是定性研究，针对的是样品中该药材或成分的有无进行定性判断，而指纹图谱则是定量研究，针对该成品中成分的有无和多少都可以进行判断，这种方法能有效并快速的反映成品批与批之间的质量，有利于全面的监控产品的质量。
3.对于中国药典2015版中败毒散的质量标准中的薄层鉴别项包括：独活，甘草，枳壳。其方法如下：
枳壳：取本品5g,加乙醇50ml，超声处理15分钟，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加70％乙醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取枳壳对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。再取柚皮苷对照品，加甲醇制成每lml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-氨试液(3:3:1) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液，在紫外光(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
甘草：取本品5g，加乙醚80ml，加热回流1小时，滤过，药渣挥干，加甲醇80ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30ml，合并正丁醇液，用水30ml洗涤1 次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材0.5g，加乙醚20ml，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-乙酸乙酯-甲醇(5:1:2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光(365nm) 下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
独活：取本品10g，加乙醚100ml，超声处理15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取独活对照药材lg，同法制成对照药材溶液。再取二氢欧山芹醇当归酸酯对照品、蛇床子素对照品，分别加甲醇制成每lml含0.4mg 的溶液，作为对照品溶液。薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液各知8μl对照品溶液知4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(7:3)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
含量测定：
色谱条件与系统适用性以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈 -0.4％磷酸溶液(20:80)为流动相；检测波长为283nm。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备取柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lm l含0.16mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取装量差异项下的本品，混匀，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流1.5小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
中药组合物HPLC指纹图谱的建立可以同时定性定量检测多种药味，利用指纹图谱的相似度量反映成品批与批之间的质量一致性。还可追根溯源，寻找工艺操作中的问题。能有效的反映成品批与批之间的质量，有利于全面监控产品的质量。避免了质量控制的单一性和片面性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.中药组合物的HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备供试品溶液；
制备对照品溶液；
分别取所述供试品溶液和所述对照品溶液经高效液相色谱法测定，获得中药组合物HPLC指纹图谱；所述高效液相色谱法采用十八烷基键合硅胶为填充剂色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱，流速0.8～1mL/min，波长为210nm～290nm；柱温20℃～40℃；
所述梯度洗脱程序如下：
Figure FDA0002635804210000011
所述制备供试品溶液具体为：取中药组合物的样品，粉碎后与甲醇混合，超声提取，过滤，收集滤液作为供试品溶液；所述超声提取的功率为250W，频率为40kHz，所述超声提取的时间为10～60min；
所述中药组合物的活性成分为柚皮苷、新橙皮苷和/或橙皮苷；
所述中药组合物为治疗风寒感冒的中药组合物，包括党参10-30重量份、茯苓10-30重量份、甘草5-15重量份、枳壳10-30重量份、桔梗10-30重量份、羌活10-30重量份、独活10-30重量份、川芎10-30重量份、柴胡10-30重量份、前胡10-30重量份、生姜10-30重量份、薄荷10-30重量份；所述中药组合物的具体制备方法为上述重量份生姜、薄荷水蒸汽蒸馏收集挥发油，并采用β-环糊精包合得挥发油包合物；除生姜、薄荷以外的药味，按照上述重量份高压差提取、浓缩、干燥，得水提取物；将上述水提取物及挥发油包合物，混合均匀，加入相应辅料制成颗粒剂、片剂、胶囊剂。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述流速为1mL/min。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述波长为210nm～283nm。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述柱温为20℃～35℃。
5.中药组合物的质量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备待测样品溶液；按照如权利要求1至4任一项所述的构建方法获得待测样品的指纹图谱；
制备供试品溶液；按照如权利要求1至4任一项所述的构建方法获得中药组合物的HPLC指纹图谱；
对所述待测样品的指纹图谱与所述中药组合物的HPLC指纹图谱进行相似性评价，相似度大于0.90为合格产品。
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