CN113252837B - 一种荆防合剂的质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药制剂分析领域，具体涉及一种荆防合剂的质量检测方法，本发明在荆防合剂国家标准WS₃‑B‑1377‑93的基础上，结合产品处方及制法工艺特点，增加了处方中原料药材荆芥、川芎、羌活、防风、甘草、柴胡的薄层鉴别，同时增加了高效液相色谱法测定紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷3种有效成分的含量。本发明质量检测方法操作简单，可靠准确，重现性好，专属性强，能更全面地对荆防合剂质量进行评价控制，确保产品质量的稳定性和临床用药的安全性、有效性，从而更好地满足医疗和市场的需要。

Description

一种荆防合剂的质量检测方法

技术领域

本发明属于中药制剂分析领域，具体涉及一种荆防合剂的质量检测方法。

背景技术

荆防合剂的处方出自明朝张时初《摄生众妙方》中所载荆防败毒散，由荆芥、防风、柴胡、川芎、羌活、独活、前胡、茯苓、桔梗、枳壳、甘草共11味中药组成。荆防合剂能够发汗解表，散风祛湿，主要用于风寒感冒，症见恶寒无汗，头痛身痛，鼻塞清涕，咳嗽白痰，临床效果较为显著。通过查找古代文献，荆防合剂还能治疗乳蛾、牙痈、乳痈、皮肤荨麻疹等。

荆防合剂的现行标准为国家药品监督管理局标准WS₃-B-1377-93，载于中药成方制剂第七册，该标准仅涉及性状、密度检查项，缺乏对有效成分的定性定量检测。目前国内有5家荆防合剂上市，尚未有更科学、完善的质量检测方法来保证产品的安全性和有效性。因此，亟需提供一种科学、完善的荆防合剂的质量检测方法来确保产品的质量。

发明内容

针对现有技术对荆防合剂质量检测方法的不足，本发明的目的在于提供一种荆防合剂的质量检测方法。该方法在国家标准WS₃-B-1377-93的基础上，结合荆防合剂的处方及制法工艺特点，增加了处方中原料药材荆芥、川芎、羌活、防风、甘草、柴胡的薄层鉴别，同时增加了高效液相色谱法测定紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷3种有效成分的含量。本发明的测定方法科学合理、切实可行，处方中的重要原料组分都有了明确的质量指标，达到多组分联合控制的目的。

本发明的技术方案如下：

一种荆防合剂的质量检测方法，包括采用薄层色谱法鉴别荆芥、川芎、羌活、防风、柴胡和甘草，同时采用高效液相色谱法测定紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量。

优选地，一种荆防合剂的质量检测方法，采用薄层色谱法鉴别荆芥，以胡薄荷酮为对照品，以石油醚-乙酸乙酯溶液为展开剂进行测定；进一步优选以体积比为9:1的石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯为展开剂。

采用薄层色谱法鉴别川芎，以川芎为对照药材，以石油醚-乙酸乙酯溶液为展开剂进行测定；进一步优选以体积比为9:1的石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯为展开剂。

采用薄层色谱法鉴别羌活，以紫花前胡苷为对照品，以三氯甲烷-甲醇为展开剂进行测定；进一步优选以体积比为6:1的三氯甲烷-甲醇为展开剂。

采用薄层色谱法鉴别防风，以升麻素苷为对照品，以三氯甲烷-甲醇为展开剂进行测定；进一步优选以体积比为5:1的三氯甲烷-甲醇为展开剂。

采用薄层色谱法鉴别甘草，以甘草酸铵为对照品，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂进行测定；进一步优选以体积比为15:1:1:2的乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂。

采用薄层色谱法鉴别柴胡，以柴胡皂苷d为对照品，以三氯甲烷-甲醇-水为展开剂进行测定；进一步优选以体积比为13:7:2的三氯甲烷-甲醇-水为展开剂。

一种荆防合剂的质量检测方法，采用高效液相色谱法测定紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以乙腈-甲酸或磷酸水溶液为流动相进行洗脱，采用二极管阵列检测器进行检测。

优选地，所述色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18，Waters Symmetry C18；色谱柱规格为4.6×150mm，5μm；4.6×150mm，3.5μm或4.6×250mm，5μm。

优选地，所述流动相中甲酸或磷酸的体积浓度为0.05～0.3％，进一步优选流动相中甲酸或磷酸的体积浓度为0.1％。

优选地，所述洗脱方式为等度洗脱或梯度洗脱，所述等度洗脱方式中乙腈体积含量为15～18％；所述梯度洗脱方式为0～44min，乙腈的体积含量为15～100％。

更进一步地，所述的梯度洗脱程序如下：

在一个优选的实施方式中，所述的梯度洗脱程序如下：

优选地，所述流动相流速为0.8～1.2ml/min，进一步优选流速为1.0ml/min。

优选地，所述的进样量为5～10μl。

下面将详述本发明的技术方案。

一种荆防合剂的质量检测方法，包括采用薄层色谱法鉴别荆芥和川芎，具体包括如下步骤：

A、供试品溶液的制备取荆防合剂加水和乙酸乙酯，通过挥发油测定器提取，取乙酸乙酯层即为供试品溶液；

B、对照品溶液制备称取胡薄荷酮对照品，加甲醇稀释定容作为荆芥鉴别的对照品溶液；取川芎对照药材，加甲醇稀释，超声处理，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇定容作为川芎鉴别的对照药材溶液；

C、点样、展开吸取上述3中溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(体积比为9:1)为展开剂，展开，取出晾干；

川芎对照药材置紫外灯下365nm检视，供试品色谱中，在与川芎对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点鉴别川芎；

胡薄荷酮对照品在日光下检视，供试品色谱中，在与对照品胡薄荷酮色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点鉴别荆芥。

采用薄层色谱法鉴别羌活，具体包括如下步骤：

A、供试品溶液制备取荆防合剂，加乙酸乙酯振摇提取，水液I备用，乙酸乙酯层蒸干，残渣加水溶解后上聚酰胺柱，分别经水和乙酸乙酯洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解即得供试品溶液；

B、对照品溶液制备称定紫花前胡苷对照品，加甲醇溶解即得羌活鉴别的对照品溶液；

C、点样、展开将供试品溶液和对照品溶液各5～15μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(体积比为6:1)为展开剂，展开，取出晾干，置紫外灯365nm下检视，供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显蓝色的荧光斑点鉴别羌活。5

采用薄层色谱法鉴别防风，具体包括如下步骤：

A、供试品溶液的制备取羌活鉴别项下水液I，加入正丁醇，摇匀，用氨试液洗涤，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇溶解即得供试品溶液；

B、对照品溶液的配制称取升麻素苷对照品，加甲醇溶解配制成鉴别防风的对照品溶液；

C、点样、展开取供试品和对照品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(体积比为5:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯254nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点鉴别防风。

采用薄层色谱法鉴别柴胡，具体包括如下步骤：

A、供试品溶液的制备取荆防合剂，加乙酸乙酯振摇提取，乙酸乙酯层用氨试液洗涤，弃去氨试液，将乙酸乙酯层蒸干，残渣加甲醇溶解，再滴加稀盐酸作为供试品溶液。

B、对照品溶液的制备称取柴胡皂苷d，加甲醇溶解后再滴加稀盐酸作为对照品溶液。

C、点样、展开取供试品和对照品溶液各1～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(体积比为13:7:2，10℃下放置)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％对二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液，在60℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点鉴别柴胡。

采用薄层色谱法鉴别甘草，具体步骤如下：

A、供试品溶液的制备取荆防合剂，加稀盐酸，超声后离心，弃去上清液，沉淀加碳酸氢氨溶液溶解，用水的水饱和的正丁醇溶液振摇提取，弃去正丁醇层，加入冰醋酸，水饱和的正丁醇溶液萃取，收集正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇溶解作为供试品溶液。

B、对照品溶液制备称取甘草酸铵对照品，加甲醇溶解作为甘草鉴别的对照品溶液。

C、点样、展开取供试品和对照品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯：甲酸：冰醋酸：水(体积比为15:1:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，置于254nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱上相应的位置上，显相同颜色的斑点鉴别甘草。

本发明同时提供了采用高效液相色谱法测定紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷，具体包括如下步骤：

A、供试品溶液的配制精密量取荆防合剂置于容量瓶中，加入稀释剂稀释并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液即得供试品溶液；

B、对照品溶液的配制分别精密称定紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷对照品，分别置于容量瓶中加入稀释剂稀释定容得各对照品溶液；

C、HPLC检测将对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照如下的色谱条件进行测定：

色谱柱：十八烷基硅烷键合色谱柱；流动相：乙腈-0.05～0.3％甲酸或磷酸水溶液；流速：0.8～1.2ml/min；检测器：二极管阵列检测器；波长：紫花前胡苷检测波长为330～340nm，柚皮苷和新橙皮苷的检测波长为280～285nm；进样量：5～20μl；

梯度洗脱程序如下：

D、记录色谱图，由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量。

优选地，所述流动相中甲酸或磷酸的体积浓度为0.1％。

优选地，稀释剂为甲醇或甲醇水溶液，进一步优选为30～50％甲醇水溶液，在一种实施方式中，稀释剂为50％甲醇水溶液；另一种实施方式中，稀释剂为80％甲醇水溶液；在一种优选的实施方式中，稀释剂为30％甲醇水溶液。

优选地，所述的流动相流速为1.0ml/min；

优选地，进样量为5～10μl；

优选地，紫花前胡苷检测波长为336nm，柚皮苷和新橙皮苷的检测波长为283nm。

优选地，梯度洗脱程序为：

在一个优选的实施方案中，一种荆防合剂的质量检测方法：包括采用薄层色谱鉴别荆芥、川芎、羌活、防风、柴胡和甘草，并进一步采用高效液相色谱法测定紫花柴胡苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量。

所述荆芥、川芎的鉴别具体步骤如下：

A、供试品溶液配制取荆防合剂30ml，置250ml圆底烧瓶中，加水70ml，混匀，连接挥发油测定器，自测定器上端加水至刻度并溢流入烧瓶中为止，再加乙酸乙酯1ml，连接回流冷凝管，加热至沸，并保持微沸30min，放冷，取乙酸乙酯层作为供试品溶液；

B、对照品溶液配制取胡薄荷酮对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。取川芎对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇定容至1ml，作为对照药材溶液；

C、点样、展开照薄层色谱法(中国药典2020版通则0502)试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(9：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

供试品色谱中，在与川芎对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点鉴别川芎；再喷以含5％香草醛硫酸溶液，在105℃下加热至斑点显色清晰；

在日光下，供试品色谱中，在与对照品胡薄荷酮色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点即鉴别荆芥。

所述羌活的鉴别包括下列步骤：

A、供试品溶液配制取荆防合剂10ml，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯，水液I备用，将乙酸乙酯层蒸干，残渣加5ml水溶解，上聚酰胺柱(30-60目，3g，干法上柱，内径10mm)，先用50ml水洗脱，弃去水洗脱液，再用乙酸乙酯40ml洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml溶解，作为供试品溶液；

B、对照品溶液配制另取紫花前胡苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；

C、点样、展开照薄层色谱法，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(6:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显蓝色的荧光斑点即鉴别羌活。

所述防风的鉴别包括下列步骤：

A、供试品溶液配制取羌活鉴别项下水液I，加入80ml正丁醇，摇匀，用氨试液洗涤3次，每次30ml，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；

B、对照品溶液配制另取升麻素苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；

C、点样、展开照薄层色谱法，吸取上述两种溶液，供试品溶液20μl，对照品溶液10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(5:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点即鉴别防风。

所述柴胡的鉴别包括下列步骤：

A、供试品溶液配制取荆防合剂10ml，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯，用氨试液洗涤2次，每次30ml，弃去氨试液，乙酸乙酯层蒸干，残渣加甲醇0.5ml溶解，加2滴稀盐酸，作为供试品溶液；

B、对照品溶液配制另取柴胡皂苷d，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，加2滴稀盐酸，作为对照品溶液；

C、展开层色谱法，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水＝13:7:2(10℃)下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％对二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液，在60℃加热至斑点显色淸晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点即鉴别柴胡。

所述甘草的鉴别包括下列步骤：

A、溶液配制取荆防合剂10ml，加稀盐酸5ml，超声10分钟，离心，弃去上清液，沉淀加0.5％碳酸氢铵溶液10ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，弃去正丁醇层，下层0.5％碳酸氢铵溶液，加入3ml冰醋酸，用水饱和的正丁醇萃取两次，每次20ml，正丁醇提取液，蒸干，残渣用甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；

B、对照品溶液配制再取甘草酸铵对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；

C、点样、展开照薄层色谱法，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以乙酸乙酯∶甲酸∶冰醋酸∶水(15∶1∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点即鉴定甘草。

所述高效液相色谱法测定紫花柴胡苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量具体步骤如下：

A、供试品溶液的制备取装量差异项下的荆防合剂，精密量取2ml，置50ml容量瓶中，加30％甲醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

B、对照品溶液的制备 精密称取紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷对照品适量，加30％甲醇制成各对照品溶液；

C、HPLC检测将对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照如下的色谱条件进行测定：

色谱柱：十八烷基硅烷键合色谱柱；流动相：乙腈-0.1％甲酸或磷酸水溶液；流速：1.0ml/min；检测器：二极管阵列检测器；波长：紫花前胡苷检测波长为336nm，柚皮苷和新橙皮苷的检测波长为283nm；进样量：5μl；

梯度洗脱程序如下：

D、记录色谱图，由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量。

与现有技术相比，本发明一种荆防合剂的质量检测方法取得了如下的有益效果：

(1)本发明在现有荆防合剂质量标准的基础上加了处方中原料药材荆芥、川芎、羌活、防风、甘草、柴胡的薄层鉴别，从而在结合现有技术的条件下可实现对制剂中6味原料药材定性鉴别，完善了荆防合剂的薄层鉴别体系，达到多组分联合控制的目的。

(2)为简化分析操作步骤，本发明通过对处方药材的化学成分极性及理化性质进行对比分析，并经反复摸索验证，优选出针对荆芥、川芎同种制备方法，同种展开剂，仅显色前后就能鉴别两种药材；羌活、防风、两者TLC鉴别中“步进式”供试品制备方法；具体为羌活TLC鉴别中备用水液I作为防风TLC鉴别的起始物料。

(3)本发明的薄层鉴别荆防合剂中的六味药材，操作简单、不存在阴性干扰，显色清晰可辨。

(4)本发明高效液相双波长色谱法测定荆防合剂制剂中的紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷含量，各组分分离度好，不存在阴性干扰，提供了一种更加全面、合理的荆防合剂定量检测方法，可靠准确，重现性好，专属性强，能更加科学地对荆防合剂质量进行评价控制。

(5)本发明对现有质量标准进行优化升级，制定了科学合理、切实可行的成分鉴别和含量测定方法，让几种药材有了明确的质量指标，达到多组分联合控制的目的。可有效地检测荆防合剂的剂量配料情况，保证了荆防合剂的临床疗效。

附图说明

图1为紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷对照品在波长336nm下的HPLC图谱；

附图标记：峰A为紫花前胡苷；

图2为缺羌活阴性对照样品在波长336nm下的HPLC图谱；

图3为荆防合剂供试品溶液在波长336nm下的HPLC图谱；

附图标记：峰A为紫花前胡苷；

图4为紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷对照品在波长283nm下的HPLC图谱；

附图标记：峰B为柚皮苷、峰C为新橙皮苷；

图5为缺炽壳阴性对照样品在波长283nm下的HPLC图谱；

图6为荆防合剂供试品溶液在波长283nm下的HPLC图谱；

附图标记：峰B为柚皮苷、峰C为新橙皮苷；

图7为荆防合剂中川芎在365nm紫外光灯下的TLC图谱；

附图中标记分述如下：1-胡薄荷酮对照品，2-缺荆芥阴性样品，3-荆防合剂，4-缺川芎阴性样品，5-川芎对照药材；

图8为荆防合剂中荆芥在日光灯下的TLC图谱；

附图中标记分述如下：1-胡薄荷酮对照品，2-缺荆芥阴性样品，3-荆防合剂，4-缺川芎阴性样品，5-川芎对照药材；

图9为实施例6荆防合剂中羌活在365nm紫外光灯下的TLC图谱；

附图中标记分述如下：1-荆防合剂，2-缺羌活阴性样品，3-紫花前胡苷对照品；

图10为实施例7荆防合剂中羌活在365nm紫外光灯下的TLC图谱；

附图中标记分述如下：1-羌活对照药材，2-缺羌活阴性样品，3-紫花前胡苷对照品，4-荆防合剂；

图11为荆防合剂中防风在254nm紫外光灯下的TLC图谱；

附图中标记分述如下：1-缺防风阴性样品，2-升麻素苷对照品，3-荆防合剂；

图12为荆防合剂中柴胡在日光灯下的TLC图谱；

附图中标记分述如下：1-荆防合剂，2-柴胡皂苷d对照品，3-缺柴胡阴性样品；

图13为荆防合剂中甘草在254nm紫外光下的TLC图谱；

附图中标记分述如下：1-荆防合剂，2-甘草酸铵对照品，3-缺甘草阴性样品。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，应当理解的是，以下实施例仅用于例证的目的，并不用来限制本发明的保护范围，本领域技术人员在本发明技术方案的基础上做的显而易见的修饰均在本发明的保护范围之内。

以下实施例中所用到的仪器、试剂、材料如无特殊说明均可通过商业途径获得，荆防合剂产品由鲁南厚普制药有限公司提供，规格：10ml/支。紫花前胡苷对照品(批号111821-201604，纯度以99.6％计)、柚皮苷(批号110722-201815，纯度以91.7％计)和新橙皮苷对照品(批号111857-201804，纯度以99.4％计)均购自中国食品药品检定研究院。

实施例中所述的试液可按照本领域常规的方法来配制。

氨试液：取浓氨溶液400ml，加水使成1000ml，即得。

稀盐酸：取盐酸234ml加水稀释至1000ml，即得。

水饱和的正丁醇溶液：在150ml的分液漏斗中加入21ml水和100ml正丁醇，振摇3min后，静置分层，除去下层，上层则为水饱和的正丁醇溶液。

实施例1荆防合剂中紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷3种有效成分的测定

A、供试品溶液的配制精密量取荆防合剂2ml，置50ml容量瓶中，加30％甲醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

B、对照品溶液的制备分别精密称取对照品紫花前胡苷3.015mg、柚皮苷3.521mg、新橙皮苷2.503mg，分别置于50ml容量瓶中，加30％甲醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得各对照品溶液；再分别称取对照品紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷对照品于同一50ml容量瓶中，加30％甲醇溶液稀释定容至刻度，配制成每1ml含紫花前胡苷60μg、柚皮苷70μg、新橙皮苷50μg的混合对照品溶液，过滤，取续滤液得混合对照品溶液。

C、HPLC检测将各对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，按照如下的色谱条件进行测定：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB C₁₈色谱柱，4.6mm×150mm，3.5μm；流动相：乙腈-0.1％甲酸水溶液；流速：1.0ml/min；检测器：二极管阵列检测器；波长：紫花前胡苷检测波长为336nm，柚皮苷和新橙皮苷的检测波长为283nm；进样量：5μl；

梯度洗脱程序如下：

D、记录色谱图，由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量。荆防合剂中紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量如表1所示。

表1实施例1荆防合剂中紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量测定

实施例2荆防合剂中紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷3种有效成分的测定

A、供试品溶液的配制精密量取荆防合剂2ml，置50ml容量瓶中，加50％甲醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

B、对照品溶液的制备分别精密称取对照品紫花前胡苷3.106mg、柚皮苷3.519mg、新橙皮苷2.514mg，分别置于50ml容量瓶中，加50％甲醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得各对照品溶液；再分别称取对照品紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷对照品于同一50ml容量瓶中，加50％甲醇溶液稀释定容至刻度，配制成每1ml含紫花前胡苷60μg、柚皮苷70μg、新橙皮苷50μg的混合对照品溶液，过滤，取续滤液得混合对照品溶液。

C、HPLC检测将对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，按照如下的色谱条件进行测定。

色谱柱：Waters Symmetry C₁₈色谱柱，4.6mm×150mm，5μm；流动相：乙腈-0.3％磷酸水溶液；流速：1.2ml/min；检测器：二极管阵列检测器；波长：紫花前胡苷检测波长为330nm，柚皮苷和新橙皮苷的检测波长为280nm；进样量：10μl；

梯度洗脱程序如下：

D、记录色谱图，由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量。荆防合剂中紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量如表2所示。

表2实施例2荆防合剂中紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量测定

实施例3荆防合剂中紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷3种有效成分的测定

A、供试品溶液的配制精密量取荆防合剂2ml，置50ml容量瓶中，加30％甲醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

B、对照品溶液的制备分别精密称取对照品紫花前胡苷3.004mg、柚皮苷3.507mg、新橙皮苷2.510mg，分别置于50ml容量瓶中，加30％甲醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得各对照品溶液；再分别称取对照品紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷对照品于同一50ml容量瓶中，加30％甲醇溶液稀释定容至刻度，配制成每1ml含紫花前胡苷60μg、柚皮苷70μg、新橙皮苷50μg的混合对照品溶液，过滤，取续滤液得混合对照品溶液。

C、HPLC检测将对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，按照如下的色谱条件进行测定：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB C₁₈色谱柱，4.6mm×150mm，5μm；流动相：乙腈-0.05％甲酸水溶液；流速：0.8ml/min；检测器：二极管阵列检测器；波长：紫花前胡苷检测波长为340nm，柚皮苷和新橙皮苷的检测波长为285nm；进样量：5μl；

梯度洗脱程序如下：

D、记录色谱图，由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量。荆防合剂中紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量如表3所示。

表3实施例3荆防合剂中紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量测定

实施例4荆防合剂中紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷3种成分HPLC测定方法学研究1仪器与试药

1.1仪器Waters 2695高效液相色谱系统(包括四元梯度泵、PDA检测器和Empower工作站，美国沃特斯公司)；XSR105DM电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KS-5200DE超声波清洗器(昆山洁力美超声仪器有限公司)；Thermo Scientific Medifμge台式离心机(德国Thermo公司)；Milli-Q超纯水仪(法国Merck公司)。

1.2试药紫花前胡苷对照品(批号111821-201604，纯度以99.6％计)、柚皮苷(批号110722-201815，纯度以91.7％计)和新橙皮苷对照品(批号111857-201804，纯度以99.4％计)均购自中国食品药品检定研究院；荆防合剂由鲁南厚普制药有限公司提供(规格：10ml/支)；甲醇、乙腈为色谱纯(美国Tedia公司)，其余试剂为分析纯，超纯水自制。

2、色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB C₁₈色谱柱(4.6mm×150mm，3.5μm)；流动相：乙腈-0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱，洗脱程序见下表；流速：1ml/min；检测波长：紫花前胡苷为336nm、柚皮苷和新橙皮苷为283nm；柱温：25℃；进样量：5μl。

梯度梯度：

3、样品溶液制备

3.1供试品溶液的制备

取装量差异项下的本品，精密吸取2ml，置50ml容量瓶中，加入30％甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

3.2对照品溶液的制备

依次精密称取紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷对照品16.97、20.59、21.84mg，分别置于50ml量瓶中，各以30％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得相应单一成分对照品储备液。精密吸取上述3种单一成分对照品储备液各4ml、3ml、3ml，置于同一25ml量瓶中，用30％甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得每1ml分别含紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷54.08μg、62.92μg、52.10μg的混合对照品溶液。

3.3缺羌活、枳壳阴性溶液的制备

取缺羌活、枳壳药材的荆防合剂阴性样品，按“3.1”项下方法制备缺羌活阴性对照溶液与缺枳壳阴性对照溶液。

4、专属性实验

将对照品溶液和缺羌活、炽壳阴性溶液和供试品溶液分别注入色谱系统，采用上述色谱条件进行测定，记录色谱图。

对照品溶液在336nm下的色谱图如图1所示，紫花前胡苷的保留时间为12.303min，缺羌活阴性对照溶液在336nm下的色谱图如图2所示，供试品溶液在336nm下的色谱图如图3所示；混合对照品溶液在283nm下的色谱图如图4所示，柚皮苷的保留时间为18.584min，新橙皮苷的保留时间为28.112min，缺炽壳阴性对照溶液在283nm下的色谱图如图5所示，供试品溶液在283nm下的色谱图如图6所示。从图1-6可以看出，供试品溶液和对照品溶液色谱图中，在紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷各自相同保留时间的位置处均出现吸收峰，而阴性对照溶液色谱图在相同位置未出现吸收峰，表明该方法专属性强，阴性对照无干扰。

5、线性关系考察

精密吸取“3.2”项下各单一成分对照品储备液适量，依次置于相应的同一量瓶中，分别加30％甲醇配制成下列浓度的混合对照品溶液，在上述色谱条件下分别进样5μl，测定峰面积，结果见表4。

表4紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷的线性关系考察结果

A、紫花前胡苷的测定：以紫花前胡苷浓度(μg/ml)为横坐标X，以紫花前胡苷峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得回归方程Y＝13191X-17731(r＝0.9998)，表明紫花前胡苷在10.14-135.2μg/ml浓度范围内线性良好。

B、柚皮苷的测定：以柚皮苷浓度(μg/ml)为横坐标X，以柚皮苷峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得回归方程Y＝9078.3X-13649(r＝0.9994)，表明柚皮苷在10.486-59.25μg/ml浓度范围内线性良好。

C、新橙皮苷的测定：以新橙皮苷浓度(μg/ml)为横坐标X，以新橙皮苷峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得回归方程Y＝9718.9X+8804.1(r＝0.9995)，表明新橙皮苷在8.684-86.84μg/ml浓度范围内线性良好。

6、精密度试验

精密吸取上述对照品溶液，连续进样6次，每次5μl，计算紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷三者峰面积的RSD均<2％，表明仪器精密度良好，结果见表5。

表5精密度试验结果

7、稳定性试验

取同一份供试样品溶液，分别于制备后0，2，4，6，8，10，12，16，20，24h进样测定，计算紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷三者峰面积的RSD均<2％，表明供试品在24h内稳定，结果见表6。

表6稳定性试验结果

8、重复性试验

取荆防合剂(批号：200908)，按“3.1”项下方法平行制备供试品溶液6份，按上述色谱条件进样测定，计算紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷3种成分含量，结果见表7-9。

表7紫花前胡苷重复性试验结果(n＝6)

表8柚皮苷重复性试验结果(n＝6)

表9新橙皮苷重复性试验结果(n＝6)

9、加样回收率试验

依次精密称取紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷对照品14.87、18.87、12.13mg，置同一50ml量瓶中，以30％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品储备液。备用(编号：20101101，其中紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷浓度依次为296.2104μg/ml、346.0758μg/ml、241.1444μg/ml)。取已知含量的荆防合剂(批号：200908)，精密吸取1ml，置50ml容量瓶中，加入30％甲醇40ml摇匀，再精密加入上述编号为20101101的混合对照品溶液5ml，再用30％的甲醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，按“3.1”项下方法制备供试样品溶液，进样测定，结果见表10-12。

表10紫花前胡苷加样回收率试验结果

表11柚皮苷加样回收率试验结果

表12新橙皮苷加样回收率试验结果

实施例5荆防合剂中荆芥、川芎的鉴别

1)供试品溶液制备取荆防合剂30ml，置250ml圆底烧瓶中，加水70ml，混匀，连接挥发油测定器，自测定器上端加水至刻度并溢流入烧瓶中为止，再加乙酸乙酯1ml，连接回流冷凝管，加热至沸，并保持微沸30min，放冷，分取乙酸乙酯层作为供试品溶液。

2)对照药材溶液的制备取川芎对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇定容至1ml，作为对照药材溶液。

3)对照品溶液的制备取胡薄荷酮对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

4)点样、展开照薄层色谱法，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60℃-90℃)-乙酸乙酯＝9∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；再喷以5％香草醛硫酸溶液，120℃加热至斑点显色清晰，于日光下检视。

荆防合剂中荆芥和川芎在紫外光灯(365nm)下的TLC图7所示，荆防合剂中荆芥和川芎在日光下的TLC图如图8所示，从图7-8可以看出，365nm下，含有川芎的样品色谱在与川芎对照药材色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱分离良好，川芎特征斑点突出，所建立的TLC鉴别方法可用于荆防合剂中川芎的定性鉴别。日光下，含有荆芥的样品色谱在与对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱分离良好，荆芥胡薄荷酮特征斑点突出，所建立的TLC鉴别方法可用于荆防合剂中荆芥的定性鉴别。

实施例6荆防合剂中羌活的鉴别

1)供试品溶液的制备取荆防合剂10ml，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯，水液I备用，将乙酸乙酯蒸干，残渣加5ml水溶解，上聚酰胺柱(30-60目，3g，干法上柱，内径10mm)，先用50ml水洗脱，弃去洗脱液，再用乙酸乙酯40ml洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml溶解，作为供试品溶液。

2)对照品溶液的制备取紫花前胡苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

3)点样、展开照薄层色谱法，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇＝6:1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

荆防合剂中羌活在紫外光灯(365nm)下的TLC图如图9所示，结果表明，含有羌活的样品色谱在与紫花前胡苷对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。色谱分离良好，羌活特征斑点突出，所建立的TLC鉴别方法可用于荆防合剂中羌活的定性鉴别。

实施例7荆防合剂中羌活的鉴别

1)供试品溶液的制备取荆防合剂10ml，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯，水液I备用，将乙酸乙酯蒸干，残渣加5ml水溶解，上聚酰胺柱(30-60目，3g，干法上柱，内径10mm)，先用50ml水洗脱，弃去洗脱液，再用乙酸乙酯40ml洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml溶解，作为供试品溶液。

2)对照品溶液的制备取紫花前胡苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

3)点样、展开照薄层色谱法，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇＝5:1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

荆防合剂中羌活在紫外光灯(365nm)下的TLC图如图10所示，结果表明，含有羌活的样品色谱在与紫花前胡苷对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，色谱分离良好，羌活特征斑点突出；但是缺羌活阴性样品溶液也在此显示荧光斑点，存在一定的阴性干扰。

实施例8荆防合剂中防风的鉴别

1)供试品溶液的制备取上述实施例6中步骤(1)项下备用水液I，加入80ml正丁醇，摇匀，用氨试液洗涤3次，每次30ml，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。

2)对照品溶液的制备取升麻素苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

3)点样、展开照薄层色谱法，吸取上述两种溶液，供试品溶液20μl，对照品溶液10μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上，使用三氯甲烷-甲醇＝5:1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。

荆防合剂中防风在紫外光灯(254nm)TLC图如图11所示，从图11可以看出，紫外光灯(254nm)下，含有防风的样品色谱在与升麻素苷对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；色谱分离良好，防风特征斑点突出，所建立的TLC鉴别方法可用于荆防合剂中防风的定性鉴别。

实施例9荆防合剂中柴胡的鉴别

A、供试品溶液的制备取荆防合剂10ml，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯，用氨试液洗涤2次，每次30ml，弃去氨试液，将乙酸乙酯层蒸干，残渣加甲醇0.5ml溶解，加2滴稀盐酸，作为供试品溶液；

2)对照品溶液的制备另取柴胡皂苷d，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，加2滴稀盐酸，作为对照品溶液。

3)点样、展开照薄层色谱法，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水＝13:7:2(10℃)以下放置的下层溶液(最好过夜)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％对二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液，60℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。

荆防合剂中柴胡在日光下的TLC图如图12所示，从图12可以看出，含有柴胡的样品色谱在与柴胡皂苷d色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱分离良好，柴胡皂苷d特征斑点突出，所建立的TLC鉴别方法可用于荆防合剂中柴胡的定性鉴别。

实施例10荆防合剂中甘草的鉴别

1)供试品溶液的制备取荆防合剂10ml，加稀盐酸5ml，超声10分钟，离心，弃去上清液，沉淀加0.5％碳酸氢铵溶液10ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，弃去正丁醇层，下层0.5％碳酸氢铵溶液，加入3ml冰醋酸，用水饱和的正丁醇萃取两次，每次20ml，正丁醇提取液，蒸干，残渣用甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。

2)对照品溶液的制备取甘草酸铵对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

3)点样、展开照薄层色谱法，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯：甲酸：冰醋酸：水＝15∶1∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视。

荆防合剂中甘草在紫外光灯(254nm)的TLC图如图13所示，从图13可以看出，紫外光灯(254nm)下，含有甘草的样品色谱在与甘草酸铵对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；色谱分离良好，甘草酸铵特征斑点突出，所建立的TLC鉴别方法可用于荆防合剂中甘草的定性鉴别。

Claims (1)

1.一种荆防合剂的质量检测方法，包括采用薄层色谱法鉴别荆芥和川芎，具体包括如下步骤：

A、供试品溶液的制备 取荆防合剂加水和乙酸乙酯，通过挥发油测定器提取，取乙酸乙酯层即为供试品溶液；

B、对照品溶液制备 称取胡薄荷酮对照品，加甲醇稀释定容作为荆芥鉴别的对照品溶液；取川芎对照药材，加甲醇稀释，超声处理，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇定容作为川芎鉴别的对照药材溶液；

C、点样、展开 吸取上述3种 溶液各5~15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60~90℃石油醚-乙酸乙酯，体积比为9:1为展开剂，展开，取出晾干；

川芎对照药材置紫外灯下365nm检视，供试品色谱中，在与川芎对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点鉴别川芎；

胡薄荷酮对照品在日光下检视，供试品色谱中，在与对照品胡薄荷酮色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点鉴别荆芥；

采用薄层色谱法鉴别羌活，具体包括如下步骤：

A、供试品溶液制备 取荆防合剂，加乙酸乙酯振摇提取，水液I备用，乙酸乙酯层蒸干，残渣加水溶解后上聚酰胺柱，分别经水和乙酸乙酯洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解即得供试品溶液；

B、对照品溶液制备 称定紫花前胡苷对照品，加甲醇溶解即得羌活鉴别的对照品溶液；

C、点样、展开 将供试品溶液和对照品溶液各5~15μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6:1三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出晾干，置紫外灯365nm下检视，供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显蓝色的荧光斑点鉴别羌活；

采用薄层色谱法鉴别防风，具体包括如下步骤：

A、供试品溶液的制备 取羌活鉴别项下水液I，加入正丁醇，摇匀，用氨试液洗涤，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇溶解即得供试品溶液；

B、对照品溶液的配制 称取升麻素苷对照品，加甲醇溶解配制成鉴别防风的对照品溶液；

C、点样、展开 取供试品和对照品溶液各5~15μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为5:1三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯254nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点鉴别防风；

采用薄层色谱法鉴别柴胡，具体包括如下步骤：

A、供试品溶液的制备 取荆防合剂，加乙酸乙酯振摇提取，乙酸乙酯层用氨试液洗涤，弃去氨试液，将乙酸乙酯层蒸干，残渣加甲醇溶解，再滴加稀盐酸作为供试品溶液；

B、对照品溶液的制备 称取柴胡皂苷d，加甲醇溶解后再滴加稀盐酸作为对照品溶液；

C、点样、展开 取供试品和对照品溶液各1~10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以10℃下放置体积比为13:7:2三氯甲烷-甲醇-水溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%对二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，在60℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点鉴别柴胡；

采用薄层色谱法鉴别甘草，具体步骤如下：

A、供试品溶液的制备 取荆防合剂，加稀盐酸，超声后离心，弃去上清液，沉淀加碳酸氢氨溶液溶解，用水的水饱和的正丁醇溶液振摇提取，弃去正丁醇层，加入冰醋酸，水饱和的正丁醇溶液萃取，收集正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇溶解作为供试品溶液；

B、对照品溶液制备 称取甘草酸铵对照品，加甲醇溶解作为甘草鉴别的对照品溶液；

C、点样、展开 取供试品和对照品溶液各5~15μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为15:1:1:2乙酸乙酯：甲酸：冰醋酸：水为展开剂，展开，取出，晾干，置于254nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱上相应的位置上，显相同颜色的斑点鉴别甘草；

同时提供了采用高效液相色谱法测定紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷，具体包括如下步骤：

A、供试品溶液的配制 精密量取荆防合剂置于容量瓶中，加入稀释剂稀释并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液即得供试品溶液；

B、对照品溶液的配制 分别精密称定紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷对照品，分别置于容量瓶中加入稀释剂稀释定容得各对照品溶液；

C、HPLC检测 将对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照如下的色谱条件进行测定：

色谱柱：十八烷基硅烷键合色谱柱；流动相：乙腈-0.05~0.3%甲酸或磷酸水溶液；流速：0.8~1.2ml/min；检测器：二极管阵列检测器；波长：紫花前胡苷检测波长为330~340nm，柚皮苷和新橙皮苷的检测波长为280~285nm；进样量：5~20μl；

梯度洗脱程序如下：

D、记录色谱图，由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量。

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