CN114113403B - 荷丹片液质联用测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种荷丹片液质联用测定方法，所述方法包括将补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3‑O‑葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、番泻苷B、紫云英苷、番泻苷A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸C、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚作为对照品，配制成对照品溶液A、B与供试品溶液，注入液质联用仪中，其中A在正离子模式，B负离子模式在得到质谱图，根据质谱图计算供试品中有效成分的含量，色谱条件：Agilent C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速0.4mL·min‑1，进样体积2μL。柱温30℃，流动相0.2％磷酸水溶液(A)‑乙腈(B)作为流动相，进行梯度洗脱。

Description

荷丹片液质联用测定方法

技术领域

本发明涉及一种中成药的检测方法，特别涉及荷丹片液质联用测定方法。

背景技术

荷丹片是一种已经上市的中成药，由荷叶、丹参、山楂、番泻叶、补骨脂(盐炒)组成。具有化痰降浊，活血化瘀的功效。用于痰浊、瘀血所致的高脂血症。中国专利201910890137.1公开了一种荷丹片的质量检测方法，该方法没有公开有效成份的含量测定方法。中国专利2019108930497公开了一种高效液相色谱法测定荷丹片中多种有效成分的含量测定方法，但其中番泻苷B、番泻苷A、丹酚酸C三种成分无法检测到。番泻苷B、番泻苷A、丹酚酸C分别是荷丹片中番泻叶和丹参的主要活性成分，其含量是否稳定影响荷丹片的质量控制与药效。本研究建立的方法样品处理简单，用醇溶液提取稀释后即可直接测定，且三重四极杆质谱质谱MRM特异性强，定性定量的准确性大大优于紫外检测器，可检测出番泻苷B、番泻苷A、丹酚酸C的含量。

发明内容

本发明公开了一种新的荷丹片检测方法，本发明方法采用液质联用法，所述测定方法，包括以下步骤：

1)对照品溶液的配制：

将补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、番泻苷B、紫云英苷、番泻苷A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸C、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚作为对照品，配制成对照品溶液；

2)供试品溶液的配制：

将荷丹片粉碎后用溶剂将有效成份溶出；

3)测定：

将对照品溶液和供试品溶液注入注入液质联用仪中，得到色谱图；

4)，根据色谱图计算供试品溶液中补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、番泻苷B、紫云英苷、番泻苷A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸C、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚的含量。

其中，所述色谱条件如下：液相色谱条件Agilent C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速0.4mL·min-1，进样体积2μL。柱温30℃，流动相0.2％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)作为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱过程如下：

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正、负离子模式下分别扫描。正离子模式干燥气温度350℃，毛细管电压35V，喷雾电压3.4kV，干燥气流速：10L/min，干燥气压力：35psi；负离子模式干燥气温度400℃，毛细管电压-35V，喷雾电压-3.4kV，干燥气流速：10L/min，干燥气压力：35psi；检测方式：多反应监测(MRM)。

其中，步骤1)所述对照品溶液的配制包括以下步骤：

取补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、番泻苷B、紫云英苷、番泻苷A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸C、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚对照品适量，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成浓度分别为：227.6μg/mL、128.3μg/mL、169.5μg/mL、248.4μg/mL、135.7μg/mL、185.3μg/mL、119.2μg/mL、84.2μg/mL、193.8μg/mL、74.8μg/mL、236.1μg/mL、149.3μg/mL、106.2μg/mL、196.4μg/mL、125.8μg/mL、62.7μg/mL、174.8μg/mL、58.3μg/mL、44.2μg/mL、138.3μg/mL、96.4μg/mL的对照品储备液。

其中，步骤1)所述对照品溶液的配制，进一步包括以下步骤：

取补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、异槲皮苷、荷叶碱、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮的对照品储备液制得混合对照品溶液A。

其中，步骤1)所述对照品溶液的配制，进一步包括以下步骤：

取槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷、番泻苷B、紫云英苷、番泻苷A、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、大黄酸、补骨脂酚的对照品储备液制得混合对照品溶液B。

其中，步骤2)所述供试品溶液的配制，步骤如下：取荷丹片，粉碎，称取约0.5g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声处理15min，放冷，用甲醇定容至刻度线，密塞摇匀，取适量12000rpm离心10min，精密移取上清液5mL至10mL容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，混匀，即得供试品溶液。其中，步骤2)所述测定，方法如下：

吸取混合对照品溶液A、B与供试品溶液，注入液质联用仪中，其中A在正离子模式，B负离子模式在得到质谱图。

本发明方法是经过筛选得到的，筛选过程如下：

1材料与方法

1.1仪器

1.2试药

对照品：

荷丹片样品，批号分别为：20200901、20200902、20200903、20200905、20200906、20201009、20201010、20201101、20201102、20201103，由南昌济顺制药有限公司提供。

1.3试剂

1.4方法

1.4.1对照品溶液的制备

取补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、番泻苷B、紫云英苷、番泻苷A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸C、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚对照品适量，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成浓度分别为：227.6μg/mL、128.3μg/mL、169.5μg/mL、248.4μg/mL、135.7μg/mL、185.3μg/mL、119.2μg/mL、84.2μg/mL、193.8μg/mL、74.8μg/mL、236.1μg/mL、149.3μg/mL、106.2μg/mL、196.4μg/mL、125.8μg/mL、62.7μg/mL、174.8μg/mL、58.3μg/mL、44.2μg/mL、138.3μg/mL、96.4μg/mL的对照品储备液。

取补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、异槲皮苷、荷叶碱、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮的对照品储备液制得混合对照品溶液A，取槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷、番泻苷B、紫云英苷、番泻苷A、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、大黄酸、补骨脂酚的对照品储备液制得混合对照品溶液B，备用。

1.4.2供试品溶液的制备

取荷丹片，粉碎，称取约0.5g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声处理15min，放冷，用甲醇定容至刻度线，密塞摇匀，取适量12000rpm离心10min，精密移取上清液5mL至10mL容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，混匀，即得供试品溶液；

1.4.3测定方法：

吸取混合对照品溶液A、B与供试品溶液，注入液质联用仪中，其中A在正离子模式，B负离子模式在得到质谱图，根据质谱图计算供试品中有效成分的含量。

色谱条件：Agilent C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速0.4mL·min-1，进样体积2μL。柱温30℃，流动相0.2％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)作为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱过程如下：

质谱条件：

电喷雾离子源(ESI)，正、负离子模式下分别扫描。正离子模式干燥气温度350℃，毛细管电压35V，喷雾电压3.4kV，干燥气流速：10L/min，干燥气压力：35psi；负离子模式干燥气温度400℃，毛细管电压-35V，喷雾电压-3.4kV，干燥气流速：10L/min，干燥气压力：35psi；检测方式：多反应监测(MRM)。数据采集和分析采用Xcalibur 2.1和Mass Frontier6.0软件。

2.1方法学研究

2.1.1线性关系考察

将混合对照品溶液A、B用50％甲醇逐级稀释为一系列混合对照品溶液，分别精密吸取上述梯度稀释液各2μl，注入液质联用仪中，以标准品浓度为横坐标，以离子流峰面积为纵坐标，进行线性回归分析绘制校准曲线，并计算相关系数和线性范围。结果表明线性关系良好，见表1。

表1各指标成分的线性回归方程和线性范围、检测限和定量限

以上各组分和英文缩写对照表如下：

2.1.2精密度、重复性和稳定性试验

将混合对照品溶液A和B连续重复进样6次，测定各成分峰面积，计算RSD值，考察该方法的精密度。

取某批次供试品精密称定，平行6份，分别制备供试品溶液，进样检测分析，测定各成分峰面积，计算RSD值，考察该方法的重现性。

将混合对照品溶液A和B在室温下放置0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时和12小时进样检测，测定各成分的峰面积，计算RSD值，考察该方法的稳定性。

表2方法的精密度、重复性和稳定性结果

2.1.3加样回收率试验

精密吸取某批次荷丹供试品溶液，进样检测分析，测定各成分峰面积，根据标准曲线计算各成分含量。按照各成分含量的50％、100％、150％分别精密加入相对应的对照品溶液，制备加标供试品溶液，进样检测分析，测定各成分峰面积，计算加样回收率。

回收率(％)＝(测得量-供试品中含量)/加入对照品量

表3荷丹片中21个指标成分的加样回收率结果

/>

表4各指标成分定性数据

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荷丹片多批次含量测定

制备10批供试品溶液，进行检测，检测结果见表5。

表5 10批次荷丹片中各指标成分的含量测定结果(n＝3，mg/g)

/>

附图说明

图1、荷丹片样品溶液正离子模式图；

图2、混合对照品溶液A正离子模式图(其中，1、补骨脂苷；2、异补骨脂苷；3、金丝桃苷；4、异槲皮苷；5、荷叶碱；6、补骨脂素；7、异补骨脂素；8、新补骨脂异黄酮；9、补骨脂宁；10、隐丹参酮)；

图3、荷丹片样品溶液负离子模式图；

图4、混合对照品溶液B负离子模式图(其中，1、槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷；2、番泻苷B；3、紫云英苷；4、番泻苷A；5、紫草酸；6、迷迭香酸；7、丹酚酸B；8、丹酚酸A；9、丹酚酸C；10、大黄酸；11、补骨脂酚)。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

对照品溶液的制备

取补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、番泻苷B、紫云英苷、番泻苷A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸C、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚对照品适量，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成浓度分别为：227.6μg/mL、128.3μg/mL、169.5μg/mL、248.4μg/mL、135.7μg/mL、185.3μg/mL、119.2μg/mL、84.2μg/mL、193.8μg/mL、74.8μg/mL、236.1μg/mL、149.3μg/mL、106.2μg/mL、196.4μg/mL、125.8μg/mL、62.7μg/mL、174.8μg/mL、58.3μg/mL、44.2μg/mL、138.3μg/mL、96.4μg/mL的对照品储备液。

取补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、异槲皮苷、荷叶碱、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮的对照品储备液制得混合对照品溶液A，取槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷、番泻苷B、紫云英苷、番泻苷A、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、大黄酸、补骨脂酚的对照品储备液制得混合对照品溶液B，备用。

供试品溶液的制备

取荷丹片，粉碎，称取约0.5g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声处理15min，放冷，用甲醇定容至刻度线，密塞摇匀，取适量12000rpm离心10min，精密移取上清液5mL至10mL容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，混匀，即得供试品溶液；

测定方法：

吸取混合对照品溶液A、B与供试品溶液，注入液质联用仪中，其中A在正离子模式，B负离子模式在得到质谱图，根据质谱图计算供试品中有效成分的含量。

色谱条件：Agilent C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速0.4mL·min-1，进样体积2μL。柱温30℃，流动相0.2％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)作为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱过程如下：

质谱条件：

电喷雾离子源(ESI)，正、负离子模式下分别扫描。正离子模式干燥气温度350℃，毛细管电压35V，喷雾电压3.4kV，干燥气流速：10L/min，干燥气压力：35psi；负离子模式干燥气温度400℃，毛细管电压-35V，喷雾电压-3.4kV，干燥气流速：10L/min，干燥气压力：35psi；检测方式：多反应监测(MRM)。数据采集和分析采用Xcalibur 2.1和Mass Frontier6.0软件。

结果：

补骨脂苷	mg/g
		异补骨脂苷	2.631
金丝桃苷	1.825
		槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷	3.057
异槲皮苷	3.944
		番泻苷B	2.259
紫云英苷	0.113
		番泻苷A	0.871
迷迭香酸	0.352
		紫草酸	0.294
丹酚酸B	0.385
		荷叶碱	4.319
丹酚酸A	1.872
		补骨脂素	0.26
异补骨脂素	0.727
		丹酚酸C	0.394
大黄酸	0.03
		新补骨脂异黄酮	0.164
补骨脂宁	0.095
		隐丹参酮	0.202
补骨脂酚	0.463

。

Claims (6)

1.一种荷丹片液质联用测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)对照品溶液的配制：

将补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、番泻苷B、紫云英苷、番泻苷A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸C、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚作为对照品，配制成对照品溶液；

2)供试品溶液的配制：

将荷丹片粉碎后用溶剂将有效成份溶出；

3)测定：

将对照品溶液和供试品溶液注入液质联用仪中，得到色谱图；

4)根据色谱图计算供试品溶液中补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、番泻苷B、紫云英苷、番泻苷A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸C、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚的含量；

其中，液相色谱条件Agilent C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速0.4mL·min-1，进样体积2μL；柱温30℃，流动相0.2％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)作为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱过程如下：

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正、负离子模式下分别扫描；正离子模式干燥气温度350℃，毛细管电压35V，喷雾电压3.4kV，干燥气流速：10L/min，干燥气压力：35psi；负离子模式干燥气温度400℃，毛细管电压-35V，喷雾电压-3.4kV，干燥气流速：10L/min，干燥气压力：35psi；检测方式：多反应监测(MRM)。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，其中，步骤1)所述对照品溶液的配制包括以下步骤：

取补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、番泻苷B、紫云英苷、番泻苷A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸C、大黄酸、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚对照品适量，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成浓度分别为：227.6μg/mL、128.3μg/mL、169.5μg/mL、248.4μg/mL、135.7μg/mL、185.3μg/mL、119.2μg/mL、84.2μg/mL、193.8μg/mL、74.8μg/mL、236.1μg/mL、149.3μg/mL、106.2μg/mL、196.4μg/mL、125.8μg/mL、62.7μg/mL、174.8μg/mL、58.3μg/mL、44.2μg/mL、138.3μg/mL、96.4μg/mL的对照品储备液。

3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，其中，步骤1)所述对照品溶液的配制，进一步包括以下步骤：

取补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、异槲皮苷、荷叶碱、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮的对照品储备液制得混合对照品溶液A。

4.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，其中，步骤1)所述对照品溶液的配制，进一步包括以下步骤：

取槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷、番泻苷B、紫云英苷、番泻苷A、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、大黄酸、补骨脂酚的对照品储备液制得混合对照品溶液B。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，其中，步骤2)所述供试品溶液的配制，步骤如下：取荷丹片，粉碎，称取约0.5g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声处理15min，放冷，用甲醇定容至刻度线，密塞摇匀，取适量12000rpm离心10min，精密移取上清液5mL至10mL容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，混匀，即得供试品溶液。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，其中，步骤2)所述测定，方法如下：

吸取混合对照品溶液A、B与供试品溶液，注入液质联用仪中，其中A在正离子模式，B负离子模式在得到质谱图。