CN109324126B - 一种利用uplc-ms/ms同时测定酸枣仁中9种化学成分的方法 - Google Patents
一种利用uplc-ms/ms同时测定酸枣仁中9种化学成分的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种UPLC‑MS/MS同时测定酸枣仁中9种化学成分的方法，涉及中药活性成分含量测定技术领域。所述方法包括如下步骤：(1)酸枣仁样品脱脂后用70％乙醇回流，过0.22μm微孔滤膜得供试品溶液；(2)通过超高效液相串联质谱技术，采用三重四级杆的多重反应监测(MRM)定量模式进行含量测定；(3)用系列浓度标准品溶液分别建立9种成分的标准曲线，通过标准曲线和样品的峰面积计算酸枣仁中9种成分的含量。该测定方法分析时间短；检测限和定量限低，灵敏度高；能有效地消除中药复杂基质的对测定成分的干扰，准确度较高。可用于同时测定酸枣仁和理枣仁中9种成分，并应用于酸枣仁的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及中药质量控制领域，具体涉及一种利用UPLC-MS/MS同时测定酸枣仁中9种化学成分的方法。
背景技术
酸枣仁为鼠李科植物酸枣(Ziziphus jujuba Mill.var.spinose(Bunge)Hu exH.F.Chou)的干燥成熟种子。是临床上治疗失眠的首选药物。在治疗失眠的中药制剂中，使用频率高达67.3％，远超其他常用安神类中药。目前，酸枣仁的质量控制多采用高效液相色谱法对其中的一个或少数几个成分进行含量测定。2015年版《中国药典》一部以斯皮诺素和酸枣仁皂苷A作为酸枣仁药材和饮片的含量测定指标。大量研究表明，酸枣仁中黄酮类、皂苷类和生物碱类均为酸枣仁的主要的活性成分，所以仅控制一个或少数几个成分的含量不能反映酸枣仁质量全貌。
韩国学者Lijuan Liao建立了HPLC-DAD-ELSD法同时定量酸枣仁中9种成分的方法。该方法测定指标包括了黄酮、皂苷和生物碱类，然而该方法检测时长达55min，不利于大量样本的快速测定。此外，已有的测定方法检测灵敏度低、专属性低。因此需要建立一种全新的酸枣仁中化学成分含量测定方法，以能够更加可信、全面地对酸枣仁进行质量控制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时测定酸枣仁中9种化学成分的方法，且该方法也适用于酸枣仁伪品理枣仁中9种化学成分的测定，以更加全面地对酸枣仁进行质量控制。
本发明所提供的同时测定酸枣仁中9种化学成分的方法，包括：步骤(1)样品的制备和步骤(2)采用UPLC-MS/MS法进行检测；
步骤(1)样品的制备采用包括以下步骤的方法：
a)对照品溶液的配制：以乌药碱、木兰花碱、维采宁Ⅱ、斯皮诺素、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、6”'-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B标准品为对照品，加甲醇溶解，混匀，得到混合对照品母液；加甲醇稀释，得到一系列各标准品浓度已知的混合对照品溶液；
b)供试品溶液的制备：
首先对样品粉末进行脱脂处理，然后以乙醇为溶剂回流提取脱脂后的样品，滤过，收集滤液，并用乙醇洗涤滤渣，合并洗液与滤液，除去其中的溶剂得到残渣，用甲醇溶解残渣，过滤，取续滤液，得到供试品溶液；
上述方法a)中，所述混合对照品母液中，乌药碱、木兰花碱、维采宁Ⅱ、斯皮诺素、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、6”'-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B标准品的浓度依次可为：15.18μg/mL、60.48μg/mL、9.00μg/mL、36.94μg/mL、2.02μg/mL、3.06μg/mL、20.94μg/mL、25.70μg/mL、6.07μg/mL。
上述方法b)中，所述脱脂处理的操作为：以石油醚为溶剂加热回流提取样品粉末，滤过，收集药渣，待药渣挥去溶剂，得到脱脂后的样品。
其中，所述石油醚可为：沸程为60～90℃的石油醚。
所述样品粉末为酸枣仁粉末或理枣仁粉末
所述样品粉末与石油醚的配比可为：2g：70-100mL，具体可为2g：90mL。
所述加热回流提取的时间可为4-5h，具体可为4h。
所述乙醇可为体积浓度70％的乙醇。
乙醇与所述样品粉末的配比可为：30-50mL：2g，具体可为40mL：2g，
所述乙醇为溶剂加热回流提取的时间可为2-3h，具体可为2小时。
洗涤滤渣用乙醇可为(体积浓度)70％的乙醇。
步骤(2)检测所用超高效液相色谱条件如下：
色谱柱为：ACQUITY 
HSS T3柱(150mm×2.1mm，1.8μm)；
流动相采用乙腈为A相，含0.1％甲酸的水为B相，其中，0.1％甲酸是甲酸相当于水的体积比；
洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序如下：
0～2min：A相占流动相总体积的17％；
2～4min：A相的体积分数由17％增加至19％；
4～10min：A相的体积分数由19％增加至33％；
10～15min：A相的体积分数由33％增加至100％；
流动相的流速可为0.15mL/min；柱温可为40℃；进样量可为3μL。
步骤(2)检测所用质谱条件如下：
离子源：ESI源；正、负离子切换的扫描模式；扫描模式：MRM；雾化器流量：2.0L/min；干燥气流量：10.0L/min；加热气流量：10.0L/min；接口电压：4.0KV；接口温度：300℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；CID气：270KPa；
各成分对应的检测离子对、裂解电压及碰撞能量如下：
乌药碱：检测离子对(m/z)286.0/194.1、裂解电压42V、碰撞能量46eV；
木兰花碱：检测离子对(m/z)342.1/222.3、裂解电压35V、碰撞能量30eV；
维采宁Ⅱ：检测离子对(m/z)595.3/325.3、裂解电压115V、碰撞能量48eV；
斯皮诺素：检测离子对(m/z)609.5/327.3、裂解电压98V、碰撞能量35eV；
当药黄素：检测离子对(m/z)447.2/267.2、裂解电压38V、碰撞能量35eV；
山奈酚-3-O-芸香糖苷：检测离子对(m/z)595.2/287.3、裂解电压35V、碰撞能量30eV；
6”'-阿魏酰斯皮诺素：检测离子对(m/z)785.4/327.3、裂解电压76V、碰撞能量46eV；
酸枣仁皂苷A：检测离子对(m/z)1205.3/1073.8、裂解电压32V、碰撞能量46eV；
酸枣仁皂苷B：检测离子对(m/z)1043.3/911.1、裂解电压50V、碰撞能量37eV。
本发明还包括一种同时检测酸枣仁中9种化学成分的含量的方法，包括下述步骤：
1)标准曲线的制备：将一系列各已知标准品浓度的混合对照品溶液进样，记录各标准品对应的峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，标准品浓度(X，μg/mL)为横坐标进行线性回归，得到各标准品的线性方程；
2)待测样品粉末中9种化学成分的含量测定：将待测样品粉末按照上述的样品制备方法进行制备，然后对得到的续滤液按照上述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录9种化学成分对应的峰面积；根据步骤1)中的线性方程得到所述待测样品粉末中9种化学成分的含量。
上述同时检测酸枣仁中9种化学成分的方法在酸枣仁质量控制/鉴别酸枣仁和理枣仁中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明建立了一种同时测定酸枣仁中9种重要活性成分的方法，可将其应用于酸枣仁的质量评价。
本发明所建立的酸枣仁中9种成分含量测定方法，所测成分涵盖了黄酮、皂苷和生物碱，可以更加全面深入的控制酸枣仁的质量，与现有方法相比具有如下优势：1.分析时间缩短了一半(缩短了25min)；2.该方法检测限和定量限低，可以对含量较低的当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷进行准确定量，如表1所示；3.MRM多重反应监测(multiple reactionmonitoring，MRM)定量模式，该技术采用三重四级杆质谱仪，检测靶标分子的母离子和子离子的质谱响应信号，从而获取较高灵敏度和高重现性的定性和定量信息。
表1 本研究与文献定量限比较
参见《Simultaneous analysis of bioactive metabolites from Ziziphusjujuba by HPLC–DAD–ELSD–MS/MS》Lijuan Liao·Tae Hyung Won·Sam Sik Kang·Jongheon Shin，Journal of Pharmaceutical Investigation，2012。
本发明采用UPLC-MS/MS同时测定酸枣仁中三种不同类型的活性成分，包括5个黄酮(斯皮诺素、6-阿魏酰斯皮诺素、维采宁Ⅱ、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷)，2个生物碱(乌药碱和木兰花碱)和2个皂苷(酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B)，检测时间仅需20min。此外，本发明采用了三重四级杆的多重反应监测(MRM)定量模式，该方法检测限和定量限低，灵敏度高；能有效消除中药复杂基质对测定成分的干扰，准确度较高。
附图说明
图1为混合对照品溶液中9种成分的MRM质谱图，其中A：乌药碱；B：木兰花碱；C：维采宁Ⅱ；D：斯皮诺素；E：当药黄素；F：山奈酚-3-O-云香糖苷；G：6”'-阿魏酰斯皮诺素；H：酸枣仁皂苷A；I：酸枣仁皂苷B；
图2为9种待测成分的化学结构式图，其中A：乌药碱；B：木兰花碱；C：维采宁Ⅱ；D：斯皮诺素；E：当药黄素；F：山奈酚-3-O-云香糖苷；G：6”'-阿魏酰斯皮诺素；H：酸枣仁皂苷A；I：酸枣仁皂苷B。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、仪器
岛津LC-MS/MS系统，包括LC-30AD二元泵、CTO-30A柱温箱、SIL-20ACHT自动进样器、DGU-20As在线脱气机，MS-8050质谱仪，LabSolutions工作站，日本岛津公司；Mili-Q去离子水发生器，美国Millipore公司；CPA225D型十万分之一分析天平，德国sartorius北京仪器系统有限公司；Neofuge 13R高速冷冻离心机，上海力申科学仪器有限公司。
2、药品与试剂
对照品木兰花碱(批号20160710)、维采宁Ⅱ(批号HV187847198)、斯皮诺素(批号20160314)、6”'-阿魏酰斯皮诺素(批号20160303)、山奈酚-3-O-芸香糖苷(批号20170417)、酸枣仁皂苷A(批号20160315)均购于宝鸡市辰光生物科技有限公司，乌药碱(批号HC225036198)和当药黄素(批号140516)购于四川省维克奇生物科技有限公司，酸枣仁皂苷B(Jujuboside B批号C52H84021)购于南京春秋生物工程有限公司，经HPLC测定对照品的质量分数均大于98％。甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，均购于Fisher公司，超纯水(Milli-Q制备)。
实施例1、溶液制备及色谱质谱条件
供试品溶液的制备
取酸枣仁样品粉末(过四号筛)约2g，精密称定，置索氏提取中，加石油醚(60～90℃)90mL，加热回流4小时，药渣挥去溶剂，转移至圆底烧瓶，加入70％乙醇40mL，加热回流2小时，滤过，药渣用70％乙醇5mL洗涤，合并洗液与滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10mL容量瓶中，过0.22μm滤膜，取续滤液即得。
2、对照品溶液的制备
分别精密称取乌药碱、木兰花碱、维采宁Ⅱ、斯皮诺素、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、6”'-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂、酸枣仁皂苷B对照品适量，加入甲醇溶解，摇匀，得到浓度分别为15.18μg/mL、60.48μg/mL、9.00μg/mL、36.94μg/mL、2.02μg/mL、3.06μg/mL、20.94μg/mL、25.70μg/mL、6.07μg/mL的混合对照品溶液，加甲醇逐级稀释制成6个质量浓度梯度的混合对照品溶液。
3、色谱条件
ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(150mm×2.1mm，1.8μm)，ACQUITY UPLC○R HSS T3预柱(1.8μm)；流动相为乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)，梯度洗脱程序为0～2min，17％A；2～4min，17→19％A；4～10min，19→33％A；10～15min，33→100％A，流速为0.15mL/min；柱温为40℃；进样量为3μL。
4、质谱条件
离子源：ESI源；正负离子切换的扫描模式；雾化器流量：2.0L/min；干燥器流量：10.0L/min；加热气流量：10.0L/min；接口电压：4.0KV；接口温度：300℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；CID气：270KPa。9种待测成分的质谱参数及MRM质谱图见表2。
表2 9种化学成分的质谱参数
实施例2、方法学考察
1、线性范围考察
精密量取混合对照品溶液适量，加甲醇逐级稀释2、4、8、16、32、64倍，摇匀，制成6个浓度梯度的混合对照品溶液，进样3μL，记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X，μg/mL)为横坐标进行线性回归，按“实施例步骤”项下的方法制备供试品溶液，得信噪比3和10时9种成分的检测限和定量限，结果见表3。
表3 9种化学成分的线性关系、检测限、定量限
2、稳定性试验
按“实施例步骤1”项下方法精密称取2.0g样品，制备供试品溶液，在室温下放置，在上述色谱、质谱条件下，分别于0、2、4、6、8、10、12、24h进样测定，计算乌药碱、木兰花碱、维采宁Ⅱ、斯皮诺素、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、6”'-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B色谱峰面积的RSD分别为1.60％，1.90％，2.00％，2.40％，2.70％，2.30％，2.50％，2.80％，1.20％。结果表明，供试品在24h内稳定。
2、重复性试验
取同一批酸枣仁粉末约2.0g，共6份，精密称定，按“实施例1步骤1”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱、质谱条件下进样测定，计算9种分析物的平均含量分别为乌药碱0.237mg/g，木兰花碱2.098mg/g，维采宁Ⅱ0.040mg/g，斯皮诺素0.730mg/g，当药黄素0.004mg/g，山奈酚-3-O-芸香糖苷0.052mg/g，6”'-阿魏酰斯皮诺素0.364mg/g，酸枣仁皂苷A 1.116mg/g和酸枣仁皂苷B 0.055mg/g，其RSD范围均0.94％～1.83％，表明方法重复性良好。
4、加样回收率试验
取“实施例1步骤3”项下已知含量的酸枣仁粉末6份，每份约1.0g精密称定，分别加入对照品混合溶液(含乌药碱、木兰花碱、维采宁Ⅱ、斯皮诺素、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、6”'-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B分别为0.622mg、2.900mg、0.036mg、0.943mg、0.002mg、0.050mg、0.403mg、1.680mg、0.247mg)，按“实施例1步骤1”项下方法制备供试品溶液，按“实施例1步骤3、4”项下色谱、质谱条件进样测定，并依据如下公式计算绿原酸回收率及RSD，9种成分平均回收率范围在95.49％～106.51％，其RSD范围均在0.61％～3.75％，表明方法回收率良好，具体结果见表4。
表4 回收率测定结果(n＝6)
实施例3、不同产地酸枣仁和理枣仁样品9种成分的测定
利用上述建立的同时测定样本中9种成分的条件对30批不同产地酸枣仁(SZR)和理枣仁(LZR)进行测定，样品信息见表5，含量测定结果见表6。
采用标准曲线法分别计算不同批次样品中9种成分的含量，如表6所示，酸枣仁中生物碱和皂苷的含量高于理枣仁，且理枣仁中不含酸枣仁皂苷A。黄酮类成分当药黄素和山奈酚-3-O-云香糖苷在酸枣仁中的含量较高，而维采宁Ⅱ、斯皮诺素和6”'-阿魏酰斯皮诺素在理枣仁中的含量较高，且同一成分在不同产地酸枣仁和理枣仁的含量中亦存在较大的差异，即使同一产地的不同批次，各成分的含量也存在不同程度的差异，不能从单一成分或者两个成分来评价酸枣仁和理枣仁的质量，而应该同时关注样品中的多个成分的含量，综合评价样品的质量。
从表7可以看出，9种成分的含量在酸枣仁和理枣仁中差异较明显，其中最明显的为理枣仁中不含酸枣仁皂苷A，所以为酸枣仁与其伪品理枣仁不能混用提供了理论依据。
表5 不同产地样品信息
表6 样品中9种成分的含量范围mg/g(n＝4)
续表6
注：序号1-9分别表示化学成分维采宁Ⅱ、斯皮诺素、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、6”'-阿魏酰斯皮诺素、乌药碱、木兰花碱、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B，ND为未检测到
表7 不同批次酸枣仁和理枣仁中9种成分的含量范围
Claims (6)
1.一种同时测定酸枣仁中9种化学成分的方法，包括：步骤(1)样品的制备和步骤(2)采用UPLC-MS/MS法进行检测；
步骤(1)样品的制备采用包括如下步骤的方法：
a)对照品溶液的配制：以乌药碱、木兰花碱、维采宁Ⅱ、斯皮诺素、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、6”'-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B标准品为对照品，加甲醇溶解，混匀，得到混合对照品母液；加甲醇稀释，得到一系列各标准品浓度已知的混合对照品溶液；
b)供试品溶液的制备：
首先对样品粉末进行脱脂处理，然后以乙醇为溶剂回流提取脱脂后的样品，滤过，收集滤液，并用乙醇洗涤滤渣，合并洗液与滤液，除去其中的溶剂得到残渣，用甲醇溶解残渣，过滤，取续滤液，得到供试品溶液；
步骤(2)检测所用超高效液相色谱条件如下：
色谱柱为：ACQUITY
HSS T3柱；
流动相采用乙腈为A相，含0.1％甲酸的水为B相，其中，0.1％甲酸是甲酸相当于水的体积比；
洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序如下：
0～2min：A相占流动相总体积的17％；
2～4min：A相的体积分数由17％增加至19％；
4～10min：A相的体积分数由19％增加至33％；
10～15min：A相的体积分数由33％增加至100％；
所述步骤(2)检测所用质谱条件如下：
离子源：ESI源；正、负离子切换的扫描模式；扫描模式：MRM；雾化器流量：2.0L/min；干燥气流量：10.0L/min；加热气流量：10.0L/min；接口电压：4.0KV；接口温度：300℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；CID气：270KPa；
各成分对应的检测离子对、裂解电压及碰撞能量如下：
乌药碱：检测离子对(m/z)286.0/194.1、裂解电压42V、碰撞能量46eV；
木兰花碱：检测离子对(m/z)342.1/222.3、裂解电压35V、碰撞能量30eV；
维采宁Ⅱ：检测离子对(m/z)595.3/325.3、裂解电压115V、碰撞能量48eV；
斯皮诺素：检测离子对(m/z)609.5/327.3、裂解电压98V、碰撞能量35eV；
当药黄素：检测离子对(m/z)447.2/267.2、裂解电压38V、碰撞能量35eV；
山奈酚-3-O-芸香糖苷：检测离子对(m/z)595.2/287.3、裂解电压35V、碰撞能量30eV；
6”'-阿魏酰斯皮诺素：检测离子对(m/z)785.4/327.3、裂解电压76V、碰撞能量46eV；
酸枣仁皂苷A：检测离子对(m/z)1205.3/1073.8、裂解电压32V、碰撞能量46eV；
酸枣仁皂苷B：检测离子对(m/z)1043.3/911.1、裂解电压50V、碰撞能量37eV。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：a)中，所述混合对照品母液中，乌药碱、木兰花碱、维采宁Ⅱ、斯皮诺素、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、6”'-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B标准品的浓度依次为：15.18μg/mL、60.48μg/mL、9.00μg/mL、36.94μg/mL、2.02μg/mL、3.06μg/mL、20.94μg/mL、25.70μg/mL、6.07μg/mL；
b)中，所述脱脂处理的操作为：以石油醚为溶剂加热回流提取样品粉末，滤过，收集药渣，待药渣挥去溶剂，得到脱脂后的样品；
其中，所述石油醚为：沸程为60～90℃的石油醚；
所述样品粉末为酸枣仁粉末；
所述样品粉末与石油醚的配比为：2g：70-100mL；
所述加热回流提取的时间为4-5；
所述乙醇可为体积浓度70％的乙醇；
乙醇与所述样品粉末的配比为：30-50mL：2g；
所述乙醇为溶剂加热回流提取的时间为2-3h；
洗涤滤渣用乙醇为体积浓度70％的乙醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述超高效液相色谱条件中，色谱柱为：ACQUITY
HSS T3柱，150mm×2.1mm，1.8μm；
流动相的流速为0.15mL/min；柱温为40℃；进样量为3μL。
4.一种同时检测酸枣仁中9种化学成分的含量的方法，包括如下步骤：
1)标准曲线的制备：将一系列各标准品浓度已知的混合对照品溶液进样，记录各标准品对应的峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，标准品浓度(X)为横坐标进行线性回归，得到各标准品的线性方程；
2)待测样品粉末中9种化学成分的含量测定：将待测样品粉末按照权利要求1的样品制备方法进行制备，然后对得到的续滤液按照权利要求1-3中任一项所述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录9种化学成分对应的峰面积；根据步骤1)中的线性方程得到所述待测样品粉末中9种化学成分的含量。
5.权利要求1或4所述的方法在酸枣仁质量控制中的应用。
6.权利要求1或4所述的方法在鉴别酸枣仁和理枣仁中的应用。
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