CN113063885B - 用于制备保元汤的组合物,保元汤制品,及其指纹图谱测定和质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了保元汤,其制品,及其指纹图谱测定方法和质量检测方法。所述指纹图谱测定方法包括如下步骤:1)供试品溶液的制备;2)混合对照品溶液的制备;3)色谱条件:流动相:乙腈(A)‑水(B),梯度洗脱,0‑20min 16‑17%A,20‑35min 17‑19.5%A,35‑55min 19.5‑26%A,55‑75min 26‑29%A,75‑110min 29‑42%A;流速1.0ml/min;柱温:35℃;色谱柱:Thermo BDS HYPERSIL C18 250×4.6mm,5μm;检测波长:203nm;4)测定;5)对供试样品溶液和混合对照品溶液的液相色谱进行数据匹配,得标准指纹图谱。
Description
技术领域
本发明属于中药领域,更具体而言,涉及一种保元汤提取物的HPLC指纹图谱测定方法。
背景技术
保元汤为经典名方。《简明医彀》(明·孙志宏)记载“治元气虚弱,精神倦怠,肌肉柔慢,饮食少进,面青白,睡卧宁静,……及有杂证,皆属虚弱,宜服”。其处方为:人参一钱,黄芪二钱,甘草五分,肉桂二分。制法及用法为:右加生姜一片,水煎服。剂型为:汤剂。
目前尚无对该方的物质基准研究。
中药指纹图谱技术因可全面标示中药主要化学成分的特性及其比例的特点,越来越多用于中药的质量控制。色谱法是分析化学领域中发展较快,应用较广泛的分析方法之一,也是中药指纹图谱最基本的技术。常用的色谱法有薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法,其中高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)具有应用范围广、分析速度快、灵敏度高等优点,是目前研究中药指纹图谱应用最广泛的方法。
目前还没有关于检测保元汤及其制品的指纹图谱的方法,建立标准指纹图谱的方法以及采用其进行质量控制的研究。
发明内容
本发明旨在提供一种用于制备保元汤的组合物,由其制备的保元汤,保元汤制品,其制备方法,以及其指纹图谱测定方法和质量检测方法。
根据一个方面,本发明提供了一种用于制备保元汤的组合物,其包括:人参3.73重量份,黄芪7.46重量份,甘草1.87重量份,肉桂0.75重量份,生姜3.00重量份。
另一方面,本发明提供了一种保元汤提取物的制备方法,该方法包括:将人参3.73重量份、黄芪7.46重量份、甘草1.87重量份、肉桂0.75重量份,加生姜3.00重量份,煎煮两次,一煎加水,浸泡30-60分钟后,煮沸,煎煮45-60分钟,趁热过滤,得一煎药液,二煎加水,煮沸,煎煮35-50分钟,趁热过滤,得二煎药液,合并两次药液,减压浓缩得到保元汤。
上述保元汤的制备方法中,优选地,第一煎加水的体积与人参的重量之比(mL/g)为600-800:3.73;优选地,第二煎加水的体积与人参的重量之比(mL/g)为450-650:3.73;优选地,减压浓缩至合并所得药液体积的四分之一至五分之一;优选地,减压浓缩中,温度≤60℃。
在上述保元汤的制备方法中,所用原料药可为中药饮片,标准采用《中国药典》2015版。
在一些实施方式中,本发明的保元汤提取物的制备方法进一步包括:在减压浓缩得到保元汤提取物之后,进行干燥的步骤。其中,干燥方式包括但不限于,常压干燥、减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥。优选地,干燥方式为冷冻干燥。优选地,冷冻干燥过程中,温度≤-40℃,压力≤20Pa;优选地,冷冻干燥时间为20-30小时,优选24小时。
本发明中,所述保元汤提取物包括上述制备方法中减压浓缩得到保元汤,以及在减压浓缩得到保元汤之后进一步进行干燥得到的各种浸膏粉,例如,冻干粉等。
另一方面,本发明提供了一种保元汤提取物,其由上述保元汤提取物的制备方法制备。
另一方面,本发明提供了一种保元汤提取物的HPLC指纹图谱的测定方法。
根据本发明的保元汤提取物的HPLC指纹图谱测定方法,包括如下步骤:
1)供试品溶液的制备:取不同批次的保元汤提取物称定,置具塞锥形瓶中,加入甲醇、50%甲醇或50%乙醇,称定重量,进行加热回流,超声处理或振摇提取处理,放冷,再称定重量,分别用甲醇、50%甲醇或50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液,回收溶剂至干,残渣加水使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取2-10次(优选3-5次),合并正丁醇提取液,用氨试液洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过;
2)混合对照品溶液的制备:将异甘草苷芹糖、异甘草苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、芒柄花素、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd加甲醇制成参照溶液,例如浓度分别为0.1mg/ml的溶液;
3)色谱条件:
流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱,0-20min 16-17%A,20-35min 17-19.5%A,35-55min 19.5-26%A,55-75min 26-29%A,75-110min 29-42%A;流速1.0ml/min;柱温:35℃;色谱柱:Thermo BDS HYPERSIL C18 250×4.6mm,5μm;检测波长:203nm;
4)测定:
吸取参照溶液与供试品溶液(例如,各10μl),注入液相色谱仪,测定,分别得到供试样品溶液和混合对照品溶液的液相色谱;
5)采用国家药典委员会制定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件,对供试样品溶液和混合对照品溶液的液相色谱进行数据匹配,得标准指纹图谱。
上述保元汤提取物指纹图谱的测定方法中,优选地,供试品溶液的制备包括:取不同批次的保元汤提取物,如浸膏粉约1.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇、50%甲醇或50%乙醇50-200ml,称定重量,进行加热回流2-3h、超声处理(功率600W,频率40KHz)10-30分钟或振摇3-4h,放冷,再称定重量,分别用甲醇、50%甲醇或50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液40ml,回收溶剂至干,残渣加水15ml使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次25ml,合并正丁醇提取液,用氨试液15ml洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过。
另一方面,本发明提供了一种保元汤提取物的HPLC标准指纹图谱,其如图16所示。
所述指纹图谱有13个特征共有峰,峰1、2来自于甘草,峰3、9、10来自于黄芪和甘草,峰4、5、8、11来自于黄芪,峰6、7、12、13来自于人参。
所述指纹图谱中,1号峰为异甘草苷芹糖,2号峰为异甘草苷,3号峰为芒柄花苷,4号峰为毛蕊异黄酮,6号峰为人参皂苷Rg1,7号峰为人参皂苷Re,9号峰为芒柄花素,12号峰为人参皂苷Rb1,13号峰为人参皂苷Rd。
另一方面,本发明提供了一种保元汤提取物的质量控制方法,该方法包括以下步骤:
取待检的保元汤提取物,按照上述步骤1)至5)得到HPLC指纹图谱;
将待检的保元汤提取物的HPLC指纹图谱与标准指纹图谱进行对比,可以通过将保元汤提取物的图谱和保元汤提取物标准指纹图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行比较,计算样品图谱与标准图谱之间的相似度,符合即为合格产品,不符合即为不合格产品。
如实验结果所证实的,根据本发明的保元汤提取物指纹图谱的测定方法,所得到的色谱图中,峰数量较多,灵敏高,基线平稳、噪音小,响应敏锐,响应值大,分离度好。此外,空白溶剂对供试品溶液的测试不存在干扰,专属性良好。方法的精密度、稳定性和重现性良好。
附图说明
图1显示实施例1中色谱柱选择试验结果(A.:Kromasil 100-5C18;B:Venusil XBPC18;C:Thermo BDS Hypersil)。
图2显示实施例1中流动相系统考察结果(A:乙腈-0.05%醋酸;B:乙腈-0.05%磷酸;C:乙腈-水;1:人参皂苷Rg1;2:人参皂苷Re;3:人参皂苷Rb1)。
图3显示实施例1中色谱柱柱温考察结果(A:20℃;B:25℃;C:30℃;D:35℃;E:40℃)。
图4显示实施例1中流速考察结果(A:0.8ml/min;B:1.0ml/min;C:1.2ml/min;1:人参皂苷Rg1;2:人参皂苷Re;3:人参皂苷Rb1)。
图5显示实施例1中提取方法考察结果(A:方法1,B:方法2,C:方法3,D:方法4,E:方法5,F:人参水提取物,G:人参药材,H:对照品,1:人参皂苷Rg1,2:人参皂苷Re,3:人参皂苷Rb1)。
图6为人参对照图(A:保元汤,B:人参阴性,C:Rg1、Re、Rb1,D:Rc,E:Rf,F:Rd,G:Rb2)。
图7为人参中主要色谱峰的光谱图。
图8为黄芪对照图(A:保元汤,B:黄芪阴性,C:芒柄花素,D:毛蕊异黄酮葡萄糖苷,E:黄芪甲苷,F:毛蕊异黄酮,G:芒柄花苷)。
图9为黄芪中主要色谱峰的光谱图。
图10为保元汤各单味药图(A:保元汤,B:人参,C:黄芪,D:甘草,E:肉桂,F:生姜,a:芒柄花苷,b:芒柄花素)。
图11为甘草对照图(A:保元汤,B:甘草阴性,C:异甘草苷,D:新甘草苷,E:异甘草苷芹糖,F:异甘草素,G:甘草素,H:甘草苷)。
图12为甘草中主要色谱峰的光谱图。
图13为肉桂对照图(A:保元汤,B:肉桂阴性)。
图14为生姜对照图(A:保元汤,B:生姜阴性,C:6-姜辣素)。
图15为6-姜辣素光谱图(A:对照品,B:样品)。
图16为HPLC标准指纹图谱(13个特征共有峰:峰1、2来自于甘草,峰3、9、10来自于黄芪和甘草,峰4、5、8、11来自于黄芪,峰6、7、12、13来自于人参)。
图17为供试品及各阴性样品对比图(A:保元汤,B:人参阴性,C:黄芪阴性,D:甘草阴性,E:肉桂阴性,F:生姜阴性)。
图18显示实施例1中17批保元汤提取物的HPLC特征图谱。
具体实施方式
以下具体实施方式本质上仅是例示性,且并不欲限制本发明及其用途。此外,本文并不受前述现有技术或发明内容或以下具体实施方式或实施例中所描述的任何理论的限制。
制备实施例
原料:保元汤中人参、黄芪、甘草、肉桂、生姜均使用饮片投料。所用人参为符合《中国药典》2015年版一部第8页“人参”项下饮片的各项规定;所用黄芪符合《中国药典》2015年版一部第302页“黄芪”项下饮片的各项规定;所用肉桂符合《中国药典》2015年版一部第136页“肉桂”项下饮片的各项规定;所用甘草符合《中国药典》2015年版一部第86页“甘草”项下饮片的各项规定;生姜符合《中国药典》2015年版一部第101页“生姜”项下饮片的各项规定。
制备实施例1:保元汤的制备
保元汤原料配方见下表1。
[表1]
制备过程:将表1所列原料置于3L煎药壶中,加生姜三片(~9.00g),煎煮两次,一煎加水1800ml,浸泡30分钟,加热煮沸(约13分钟),煎煮45分钟,趁热过滤(200目),得一煎药液,二煎加水1350ml,加热煮沸(约9分钟),煎煮35分钟,趁热过滤(200目),得二煎药液,合并两次药液,减压浓缩(温度60℃)至300ml,得到保元汤。
制备实施例2:保元汤浸膏粉的制备
将制备实施例1中得到的保元汤经预冷冻后进行冷冻干燥(温度-40℃,压力20Pa)24h,得保元汤冻干粉,自封袋密封,置干燥柜保存。
性状:棕黄色至棕褐色的粉末;味甜,微苦。
制备实施例3:根据与制备实施例2相似的方法,制备17批的保元汤浸膏粉。
实施例
实施例1:保元汤提取物的指纹图谱的测定方法
1.仪器与材料
1.1主要仪器:岛津LC-20A型高效液相色谱仪,安捷伦1260型高效液相色谱仪。
1.2实验材料:制备实施例2制备的保元汤浸膏粉
2.液相条件考察
2.1色谱柱选择
液相条件:流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱:0-35min19%A,35-55min19%-29%A,55-70min29%A,70-100min29%-40%A;流速1.0ml/min;柱温:35℃。
分别采用不同色谱柱:Kromasil 100-5C18 250×4.6mm,5μm;Venusil XBP C184.6×250mm,5μm;Thermo BDS Hypersil C18 250×4.6mm,5μm,用《中国药典》2015版第一部人参项下含量测定方法考察不同色谱柱对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的适用性。结果见图1:A.:Kromasil 100-5C18;B:Venusil XBP C18;C:Thermo BDS Hypersil。
从图1中可以看出色谱柱为Thermo BDS Hypersil C18 250×4.6mm,5μm时Rg1、Re、Rb1均能有效分离,Rg1和Re的分离度为1.702,对比于其他两款色谱柱,较适宜人参皂苷的分析,因此选用Thermo BDS Hypersil C18 250×4.6mm,5μm作为分析柱。
2.2流动相系统考察
液相条件:考察乙腈(A)-0.05%磷酸(B)、乙腈(A)-水(B)、乙腈(A)-0.05%乙酸(B)这3种流动相对样品的分析情况,梯度洗脱:0-15min 18%A,15-35min 18-20%A,35-55min 20-28%A,55-70min 28-29%A,70-100min 29-40%A;流速1.0ml/min;柱温35℃;色谱柱Thermo BDS Hypersil C18 250×4.6mm,5μm;波长203nm。
供试品溶液的制备:取制备实施例2制备的保元汤浸膏粉2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50ml,称定重量,加热回流1小时,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25ml,回收溶剂至干,残渣加水使溶解,用水饱和正丁醇提取2次,每次25ml,合并正丁醇液,用氨试液50ml洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过。
测定法:精密吸取供试品溶液10μl,在流动相分别为乙腈(A)-0.05%磷酸(B)、乙腈(A)-水(B)、乙腈(A)-0.05%乙酸(B)时,注入液相色谱仪,测定,结果见图2:A:乙腈-0.05%醋酸;B:乙腈-0.05%磷酸;C:乙腈-水;1:人参皂苷Rg1;2:人参皂苷Re;3:人参皂苷Rb1。
从图2中可以看出当乙腈-0.05%乙酸作为流动相时,色谱图在40分钟以后基线会往下飘,因此不选用;而乙腈-0.05%磷酸作为流动相时,基线还是会稍微往下飘,没有乙腈-水作为流动相时得到的基线平,且加入磷酸后对3种人参皂苷的峰形没有改善;因此选择流动相系统为乙腈-水。
2.3柱温考察
液相条件:流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱:0-20min 16-17%A,20-35min 17-18%A,35-55min 18-26%A,55-75min 26-30%A,75-100min 30-40%A;流速1.0ml/min。
试验采用色谱柱Thermo BDS Hypersil C18 250×4.6mm,5μm;考察当色谱柱温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃时,对3种人参皂苷的色谱行为的影响。
供试品溶液的制备:取制备实施例2制备的保元汤浸膏粉2.0g,精密称定(2.0131g),置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50ml,称定重量,加热回流1小时,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25ml,回收溶剂至干,残渣加水使溶解,用水饱和正丁醇提取2次,每次25ml,合并正丁醇液,用氨试液50ml洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过。
测定法:精密吸取供试品溶液10μl,在柱温为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃时,注入液相色谱仪,测定,结果见图3:A:20℃;B:25℃;C:30℃;D:35℃;E:40℃。
结果表明,不同色谱柱温度对3种人参皂苷的保留时间及分离度影响很大,在这个梯度条件下,色谱柱温度为35℃时分离度良好。因此选用35℃作为色谱分析温度。
2.4流速考察
液相条件:流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱:0-20min 16-17%A,20-35min 17-18%A,35-55min 18-26%A,55-75min 26-30%A,75-100min 30-40%A;柱温35℃;色谱柱Thermo BDS Hypersil C18 250×4.6mm,5μm;波长203nm。
试验采用色谱柱Thermo BDS Hypersil C18 250×4.6mm,5μm;考察流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时样品中3种人参皂苷的色谱行为情况。供试品溶液的制备:同“2.3柱温考察”。
测定法:精密吸取供试品溶液10μl,在流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时,注入液相色谱仪,测定,结果见图4:A:0.8ml/min;B:1.0ml/min;C:1.2ml/min;1:人参皂苷Rg1;2:人参皂苷Re;3:人参皂苷Rb1。
从图4中可以看出,不同流速对3种人参皂苷的保留时间和分离度都有不同程度的影响,在流速为1.0ml/min时,分离度最佳。流速为1.2ml/min时,Rg1和Re无法分开,流速为0.8ml/min时Rg1和和Re的分离度及纯度均不好。因此,选择分析流速为1.0ml/min。
3.供试品溶液制备考察
3.1制备方法考察a
方法1:取保元汤浸膏粉约2.0g,精密称定,加入三氯甲烷100ml,置索氏提取器中,回流3小时,弃去三氯甲烷液,药渣挥干溶剂,连同滤纸筒移入100ml锥形瓶中,精密加入水饱和正丁醇50ml,密塞,放置过夜,超声处理(功率250W,频率40KHz)30分钟,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液25ml,置蒸发皿中,蒸干,残渣加甲醇溶解,并转移至5ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液即得。
方法2:取保元汤浸膏粉约2.0g,精密称定,加入乙醚100ml,加入回流2小时,滤过,滤渣及滤纸挥尽乙醚,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理(功率250W,频率40KHz)30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
方法3:取保元汤浸膏粉约2.0g,精密称定,加20ml水使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取5次(20ml、20ml、20ml、15ml、15ml)合并正丁醇提取液,蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,取续滤液,即得。
方法4:取保元汤浸膏粉约2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理(功率250W,频率40KHz)30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
方法5:取保元汤浸膏粉约2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加三氯甲烷50ml,超声处理(功率250W,频率40KHz)30分钟,滤过,弃去三氯甲烷液,药渣连同滤纸挥干溶剂,精密加入甲醇50ml,称定重量,加热回流1小时,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25ml,回收溶剂至干,残渣加水饱和正丁醇溶液20ml溶解,用氨试液50ml洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过。
取人参饮片按照制备实施例1制备人参水提物,之后按照制备实施例2制备浸膏粉,取浸膏粉约1g,同方法1制备人参药材溶液。其中,人参水提物的制备方法,与制备实施例1的不同之处在于,以人参饮片代替表1所列原料和生姜。
对照品溶液:取人参皂苷Rg1对照品(1270-090207,中国固体制剂制造技术国家工程中心)、人参皂苷Re对照品(110754-200822,中国药品生物制品检定所)、人参皂苷Rb1对照品(110704-201625,中国药品生物制品检定所)适量于10ml容量瓶中,用甲醇定容,混匀,滤过,即可。
测定法:分别测定,结果见图5:A:方法1,B:方法:2,C:方法:3,D:方法:4,E:方法:5,F:人参水提取物,G:人参药材,H:对照品,1:人参皂苷Rg1,2:人参皂苷Re,3:人参皂苷Rb1。
从图5中可以看出,前处理为方法1、方法2、方法3、方法4制得的图谱中,在人参皂苷Rg1对照品和人参皂苷Re对照品相应位置杂质峰较多,不利于目标峰的分离,且这四种处理方法得到的供试品色谱峰数量及大小均较为一致,表明样品经过三氯甲烷(方法1)或乙醚(方法2)的前处理并没有去除对主峰的干扰,提取时用非极性溶剂进行除杂是没有必要的。方法5处理得到的供试品杂峰少,较适宜本样品的处理。
3.2制备方法考察b
比较甲醇回流提取和水饱和正丁醇直接提取对三种人参皂苷的影响。
液相条件:流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱:0-15min 18%A,15-35min 18-20%A,35-55min 20-28%A,55-70min 28-29%A,70-100min 29-40%A;流速1.0ml/min;柱温35℃;色谱柱Thermo BDS Hypersil C18 250×4.6mm,5μm;波长203nm。
方法1:取保元汤浸膏粉约2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50ml,称定重量,加热回流1小时,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25ml,回收溶剂至干,残渣加水15ml使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取2次,每次25ml,合并正丁醇液,用氨试液50ml洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过。
方法2:取保元汤浸膏粉约2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加水饱和正丁醇50ml,称定重量,静置一夜后超声处理(250W,40KHz)40分钟,放冷,再称定重量,用水饱和正丁醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25ml,用氨试液50ml洗涤,弃去氨试液,正丁醇回收溶剂至干,残渣用甲醇适量使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,即可。
对照品溶液的制备:人参皂苷混合溶液,含人参皂苷Rg1 0.1874mg/ml,人参皂苷Re 0.2103mg/ml,人参皂苷Rb1 0.1803mg/ml。人参皂苷Rg1 110703-201832,人参皂苷Re111610-201607,人参皂苷Rb1 110704-201625,均购于中国食品药品检定研究院。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,结果见下表2。
表[2]提取方法试验b
结果表明,经甲醇回流提取方法较正丁醇直接提取方法所得样品中的3种人参皂苷含量较高。因此选择甲醇回流的提取方法进行前处理制备。
3.3提取方式考察
液相条件:流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱:0-20min 16-17%A,20-35min 17-19.5%A,35-55min 19.5-26%A,55-75min 26-29%A,75-110min 29-42%A;流速1.0ml/min;色谱柱Thermo BDS Hypersil C18 250×4.6mm,5μm;柱温35℃;波长203nm。
供试品溶液的制备:取制备实施例2制备的保元汤浸膏粉约1.5g,精密称定,置100ml具塞锥形瓶中,6份,精密加入50%乙醇50ml,称定重量,分别进行加热回流2h,超声处理(功率600W,频率40KHz)20分钟,振摇提取3小时处理,放冷,再称定重量,用50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液40ml,回收溶剂至干,残渣加水15ml使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次25ml,合并正丁醇提取液,用氨试液15ml洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过。
对照品溶液的制备:精密称取人参皂苷Rg1对照品(批号110703-201731)9.25mg,人参皂苷Re对照品(批号110754-201827)9.09mg,人参皂苷Rb1对照品(批号110704-201726)8.94mg于20ml量瓶中,加甲醇溶解并定容,即得对照品混合溶液。对照品均购于中国食品药品检定研究院。
对照品混合溶液浓度分别是Rg1为0.4329mg/ml,Re为0.4245mg/ml,Rb1为0.4072mg/ml。
测定法:分别精密吸取对照溶液5μl与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,结果见下表3。
[表3]提取方式考察
数据显示三种提取方式得到3种人参皂苷含量没有明显差异,表明这三种提取方式的效果较一致,因超声处理操作叫简便,提取时间短,因此选择超声处理作为提取方式。
3.4提取溶剂考察
液相条件:流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱:0-20min 16-17%A,20-35min 17-19.5%A,35-55min 19.5-26%A,55-75min 26-29%A,75-110min 29-42%A;流速1.0ml/min;色谱柱Thermo BDS Hypersil C18 250×4.6mm,5μm;柱温35℃,波长203nm。
供试品溶液的制备:取制备实施例2制备的保元汤浸膏粉约1.0g,精密称定,置100ml具塞锥形瓶中,8份,分别精密加入甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇50ml,称定重量,超声(600W,40kHz)处理20分钟,放冷,再称定重量,用相应溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液40ml,回收溶剂至干,残渣加水15ml使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次25ml,合并正丁醇提取液,用氨试液15ml洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过。
对照品溶液的制备:取“3.3提取方式考察”项下对照品溶液。
测定法:分别精密吸取对照溶液5μl与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,结果见下表4。
[表4]提取溶剂考察
从表4中数据可以看出,提取溶剂为50%乙醇时,3种人参皂苷的含量较高,因此选择50%乙醇作为提取溶剂。
3.5提取时间考察
液相条件:流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱:0-20min 16-17%A,20-35min 17-19.5%A,35-55min 19.5-26%A,55-75min 26-29%A,75-110min 29-42%A;流速1.0ml/min;色谱柱Thermo BDS Hypersil C18 250×4.6mm,5μm;柱温35℃,波长203nm。
供试品溶液的制备:取制备实施例2制备的保元汤冻干粉约1.0g,精密称定,置100ml具塞锥形瓶中,6份,精密加入50%乙醇50ml,称定重量,分别进行超声(600W,40kHz)处理10分钟、20分钟、30分钟处理,,放冷,再称定重量,用50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液40ml,回收溶剂至干,残渣加水15ml使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次25ml,合并正丁醇提取液,用氨试液15ml洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过。
对照品溶液的制备:取“3.3提取方式考察”项下对照品溶液。
测定法:分别精密吸取对照溶液5μl与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,结果见下表5。
[表5]提取时间考察
从表5中可以看出超声处理10-30分钟所提取的3种人参皂苷含量相差很小,无显著性差异,表明超声处理10分钟已能全部将3种人参皂苷提取完全,因此选择最佳超声处理时间为10分钟。
3.6溶剂量考察
制备实施例2制备的保元汤浸膏粉分别精密加入50%乙醇50ml、100ml、200ml,称定重量,超声(600W,40kHz)处理10分钟,放冷,再称定重量,用50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,分别精密量取续滤液40ml、80ml、160ml,回收溶剂至干,残渣加水15ml使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次25ml,合并正丁醇提取液,用氨试液15ml洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过。对照品溶液的制备:取“3.3提取方式考察”项下对照品溶液。
测定法:分别精密吸取对照溶液5μl与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,结果见下表6。
[表6]溶剂量考察
溶剂加入量的考察结果为溶剂加入量在50-200ml范围内,测得人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量基本一致,表明溶剂的加入量对3种人参皂苷的提取量影响很小,没有显著性差异,从缩短提取操作时间及节约溶剂使用量方面考虑,选择最佳溶剂加入量为50ml。
3.4萃取次数考察
液相条件:流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱:0-20min 16-17%A,20-35min 17-19.5%A,35-55min 19.5-26%A,55-75min 26-29%A,75-110min 29-42%A;流速1.0ml/min;色谱柱Thermo BDS Hypersil C18 250×4.6mm,5μm;柱温35℃,波长203nm。
供试品溶液的制备:取制备实施例2制备的保元汤浸膏粉约1.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,6份,精密加入50%乙醇50ml,称定重量,超声(600W,40kHz)处理10分钟,放冷,再称定重量,用50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液40ml,回收溶剂至干,残渣加水15ml使溶解,用水饱和正丁醇分别振摇提取2次、3次、4次,每次25ml,合并正丁醇提取液,用氨试液15ml洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过。
测定法:分别精密吸取对照溶液5μl与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,结果见下表7。
[表7]萃取次数考察
由上表可知,当萃取3次氨试液使用量为15ml时已能完全萃取出样品中3种人参皂苷,因此选择最佳萃取次数为3次。
4.色谱峰的指认
4.1色谱条件:
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm,内径为4.6mm,粒径为5μm,Thermo BDS Hypersil C18色谱柱),以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟1.0ml,柱温为35℃,检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷Rb1峰计算应不低于6000。
4.2溶液配制
4.2.1供试品溶液的配制:取制备实施例2制备的保元汤浸膏粉约1.0g,精密称定,置100ml具塞锥形瓶中,精密加入50%乙醇50ml,称定重量,超声处理(功率600W,频率40KHz)10分钟,放冷,再称定重量,用50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液40ml,回收溶剂至干,残渣加水15ml使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次25ml,合并正丁醇提取液,用氨试液15ml洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过。
4.2.2单味药溶液的配制:分别取人参水提物0.5g、甘草水提物0.2g、黄芪水提物0.8g、生姜0.02g、肉桂水提物0.01g(其中,各水提物的制备方法同制备实施例1和2,不同之处在于,以相应的药材代替表1所列原料和生姜),精密称定,置100ml具塞锥形瓶中,同“4.2.1供试品溶液的配制”制备人参样品溶液、生姜样品溶液、肉桂样品溶液、甘草样品溶液、黄芪样品溶液。
4.2.3阴性样品溶液的配制:
4.2.3.1人参阴性样品溶液的配制:除了不加入人参以外,按照制备实施例1和2制备浸膏粉,取1.0g,同“4.2.1供试品溶液的配制”制备人参阴性样品溶液。
4.2.3.2生姜阴性样品溶液的配制:除了不加入生姜以外,按照制备实施例1和2制备浸膏粉,取1.0g,精密称定,置100ml具塞锥形瓶中,同“4.2.1供试品溶液的配制”制备生姜阴性样品溶液。
4.2.3.3肉桂阴性样品溶液的配制:除了不加入肉桂以外,按照制备实施例1和2制备浸膏粉,取1.0g,精密称定,置100ml具塞锥形瓶中,同“4.2.1供试品溶液的配制”制备肉桂阴性样品溶液。
4.2.3.4甘草阴性样品溶液的配制:除了不加入甘草以外,按照制备实施例1和2制备浸膏粉,取1.0g,精密称定,置100ml具塞锥形瓶中,同“4.2.1供试品溶液的配制”制备甘草阴性样品溶液。
4.2.3.5黄芪阴性样品溶液的配制:除了不加入黄芪以外,按照制备实施例1和2制备浸膏粉,取1.0g,精密称定,置100ml具塞锥形瓶中,同“4.2.1供试品溶液的配制”制备黄芪阴性样品溶液。
4.2.4对照品溶液:人参皂苷Rg1(人参皂苷Rg1以92.4%计,批号110703-201832)、人参皂苷Re(人参皂苷Re以93.4%计,批号110754-201827)、人参皂苷Rb1(人参皂苷Rb1以91.1%计,批号110704-201827)、人参皂苷Rd(批号111818-201603)、6-姜辣素(批号111833-201705)、人参皂苷Rb2(批号111715-201203)、甘草苷(批号111610-201607)、人参皂苷Rf(批号111719-201806)、黄芪甲苷(批号110781-201717)、芒柄花素(批号111703-201504)上述10种对照品均购于中国食品药品检定研究院;人参皂苷Rc(BCY-000630)购于江西佰草生物科技有限公司;异甘草苷(250026-201811)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(130030-201811)、异甘草素(250234-201906)、异甘草苷芹糖(170109-201906)、新甘草苷(240065-201903)以上6种对照品购于上海鸿永生物科技有限公司。取上述对照品各适量,加甲醇制成单个对照品溶液。
4.3测定方法:分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液、各阴性样品溶液各1-10μl,注入液相色谱仪,测定。通过比较确定化合物位置及其归属,结果各对照图谱及光谱图如下:人参对照见图6(A:保元汤,B:人参阴性,C:Rg1、Re、Rb1,D:Rc,E:Rf,F:Rd,G:Rb2);黄芪对照见图8(A:保元汤,B:黄芪阴性,C:芒柄花素,D:毛蕊异黄酮葡萄糖苷,E:黄芪甲苷,F:毛蕊异黄酮,G:芒柄花苷);甘草对照见图11(A:保元汤,B:甘草阴性,C:异甘草苷,D:新甘草苷,E:异甘草苷芹糖,F:异甘草素,G:甘草素,H:甘草苷);肉桂对照见图13(A:保元汤,B:肉桂阴性);生姜对照见图14(A:保元汤,B:生姜阴性,C:6-姜辣素)。
由图6中可以看,供试品图中,在与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd对照品相应位置显示色谱峰,同时样品的光谱图与对照品一致(见图7),且阴性无干扰。人参皂苷Rc、人参皂苷Rf供试品图中有其他成分干扰,人参皂苷Rb2在供试品图中显示峰特别小。
由图8中可以看,供试品图中,在与毛蕊异黄酮对照品相应位置显示色谱峰,同时样品的光谱图与对照品一致(见图9),且阴性无干扰。毛蕊异黄酮葡萄糖苷在供试品图中有其他色谱峰干扰。黄芪甲苷在供试品图中显示峰特别小,这与成分中含量低及其化合物结构紫外吸收弱有关。文献研究(张亚洲,徐风,梁静,唐静姝,尚明英,王璇,蔡少青.蒙古黄芪中异黄酮类化学成分研究[J].中国中药杂志,2012,37(21):3243-3248;罗舟,苏明智,颜鸣,史国兵,赵庆春.蒙古黄芪的化学成分研究[J].中草药,2012,43(03):458-462;刘育辰,陈有根,王丹,高雪岩,郭洪祝,傅欣彤,王文全.甘草化学成分研究[J].药物分析杂志,2011,31(07):1251-1255;陶晡,刘晓清,屈振刚.甘草化学成分研究进展[J].河北农业科学,2009,13(03):77-79.)表明芒柄花苷、芒柄花素同时存在甘草和黄芪中,从单味药的进样分析也表明芒柄花苷及芒柄花素同时来源于甘草及黄芪(见图10),样品的光谱与对照品一致(见图9)。
由图11中可以看,供试品图中,在与新甘草苷、甘草苷、异甘草苷芹糖、异甘草苷、甘草素对照品相应位置显色谱峰,同样品的光谱图与对照品一致(图12),且阴性无干扰。供试品图中异甘草素色谱峰小。
由图13中可以看出供试品图中阴性色谱图与供试品色谱图色谱峰数量一致,表明供试品谱图中未显示特征峰来自于肉桂。
由图14-15中可以看出供试品图中,在与6-姜辣素对照品相应位置上显相同色谱峰,阴性无干扰,样品中该峰的光谱图与对照品一致,表明供试品色谱中,保留时间为92.6分钟的色谱峰为6-姜辣素,其来自生姜。
4.4特征峰指认
保元汤中每味药均采购来自4个不同产地的15批次,经药味批次的随机组合共制备17批保元汤冻干粉,对照指纹图谱见图16。
通过对色谱峰指认、归属,共确定保元汤供试品中的13个特征峰,见图16,其中峰1、2来自于甘草,峰3、9、10来自于黄芪和甘草,峰4、5、8、11来自于黄芪,峰6、7、12、13来自于人参,见图16。通过色谱峰指认,表明其中1号峰为异甘草苷芹糖,2号峰为异甘草苷,3号峰为芒柄花苷,4号峰为毛蕊异黄酮,6号峰为人参皂苷Rg1,7号峰为人参皂苷Re,9号峰为芒柄花素,12号峰为人参皂苷Rb1,13号峰为人参皂苷Rd。
其中,以人参皂苷Rb1参照物峰相应的峰为S峰(峰12),计算各特征峰与S峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±5%之内,规定值为:0.34(峰1),0.36(峰2),0.40(峰3),0.50(峰4)、0.52(峰5)、0.57(峰6)、0.58(峰7)、0.59(峰9)、0.85(峰10)、0.90(峰10)、0.97(峰11)、1.00(峰12)、1.14(峰13)。
5.方法学研究
5.1液相条件:同“4.色谱峰的指认”项下的条件。
5.2供试品溶液的制备:同“4.色谱峰的指认”项下的条件。
5.3精密度试验
取制备实施例2制备的保元汤浸膏粉约1.0g,1份,精密称定,置100ml具塞锥形瓶中,同“4.2.1供试品溶液的配制”方法制备供试品溶液,精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪,重复进样6次,测定。以12号峰人参皂苷Rb1为参照峰,计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值。结果见下表8和下表9。
[表8]精密度试验相对保留时间
[表9]精密度试验相对峰面积
结果各特征峰相对保留时间的RSD均<0.434%,相对峰面积的RSD均<3.895%,符合指纹图谱要求,表明仪器精密度良好。
5.4重复性试验
取保元汤浸膏粉约1.0g,精密称定,置100ml具塞锥形瓶中,6份,同“4.2.1供试品溶液的配制”方法制备供试品溶液,精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪,测定。以12号峰人参皂苷Rb1为参照峰,计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值。结果见下表10和下表11。
[表10]重复性试验相对保留时间
[表11]重复性试验相对峰面积
结果各特征峰相对保留时间的RSD均<0.251%,相对峰面积的RSD均<4.933%,符合指纹图谱要求,表明本方法重复性良好。
5.3稳定性试验
取供试品溶液分别于0h、7h、19h、28h、37h、49h、73h各精密吸取10μl注入液相色谱仪测定,以10号峰人参皂苷Rb1为参照峰,计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值。结果见表12和表13。
[表12]稳定性试验相对保留时间
[表13]重复性试验相对峰面积
结果各特征峰相对保留时间的RSD均<0.201%,相对峰面积的RSD均<4.882%,符合指纹图谱要求,表明本供试品溶液在73小时内稳定。
6.指纹图谱的建立
对制备实施例3中的17个批次保元汤浸膏粉按上述的供试品溶液制备方法分别制备供试品溶液。应用上述色谱条件进行测定。
将17批保元汤浸膏粉色谱图数据(AIA数据)导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件,以S1(BYT15)为参照图谱,时间窗宽度设为0.1min,经多点校正,峰面积占总峰面积0%以上的峰进行全谱峰匹配,共计算出21个共有峰,采用平均值法生成对照图谱,17批保元汤浸膏粉与对照图谱的相似度结果见下表14,17批保元汤浸膏粉的色谱图见图18,对照指纹图谱见图16。选择图谱中含量较大、分离度好且具有特征的13个共有峰作为特征图谱的峰,在特征图谱中人参皂苷Rb1在13个特征峰中较稳定、含量相对较高、分离度好、且为人参的特征活性成分,故确定以人参皂苷Rb1(12号峰)为参照峰,计算13个特征峰的相对保留时间和相对峰面积,见下表15、16。
[表14]17批保元汤浸膏粉的相似度结果
[表15]17批保元汤浸膏粉的相对保留时间结果
[表16]17批保元汤浸膏粉的相对峰面积结果
从表14可以看出17批保元汤浸膏粉的相似度均大于0.9,表明化学成分稳定。从表15可以看出各峰的保留时间为0.34(峰1),0.36(峰2),0.40(峰3),0.50(峰4)、0.52(峰5)、0.57(峰6)、0.58(峰7)、0.59(峰9)、0.85(峰10)、0.90(峰10)、0.97(峰11)、1.00(峰12)、1.14(峰13)。表16表明17批次的13个特征峰RSD值在9.30%-68.72%,表明每批次的化合物含量大小有差异。
6.主要色谱峰的鉴定及归属
采用阴性样品对照、单味药材及对照品的比对,对保元汤浸膏粉指纹图谱中主要色谱峰进行归属及鉴定,结果见图16、17。
图17中(A保元汤,B人参阴性,C黄芪阴性,D甘草阴性,E肉桂阴性,F生姜阴性)
通过对色谱峰指认、归属,共确定保元汤供试品中的13个特征峰,见图16,13个特征峰中,峰1、2来自于甘草,峰3、9、10来自于黄芪和甘草,峰4、5、8、11来自于黄芪,峰6、7、12、13来自于人参,1号峰为异甘草苷芹糖,2号峰为异甘草苷,3号峰为芒柄花苷,4号峰为毛蕊异黄酮,6号峰为人参皂苷Rg1,7号峰为人参皂苷Re,9号峰为芒柄花素,12号峰为人参皂苷Rb1,13号峰为人参皂苷Rd。
实施例2:保元汤经典名方颗粒的质量控制方法
一种保元汤经典名方颗粒的质量控制方法,包括以下步骤:
(1)取待检的保元汤经典名方颗粒,按照实施例1中的测定方法得到指纹图谱;
(2)将步骤(1)得到的指纹图谱与实施例1中的标准指纹图谱(图16)进行对比,符合即为合格产品,不符合即为不合格产品。
保元汤经典名方颗粒供试样品溶液的制备:取装量差异下的保元汤经典名方颗粒,混匀,研细,精密称定,置100ml具塞锥形瓶中,精密加入50%乙醇50ml,称定重量,超声处理(600W,40KHz)10分钟,放冷,再称定重量,用50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液40ml,回收溶剂至干,残渣加水15ml使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次25ml,合并正丁醇提取液,用氨试液15ml洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过。
Claims (13)
1.一种保元汤提取物的HPLC指纹图谱的测定方法,包括如下步骤:
1)供试品溶液的制备:取不同批次的保元汤提取物称定,置具塞锥形瓶中,加入甲醇、50%甲醇或50%乙醇,称定重量,进行加热回流,超声处理或振摇提取处理,再称定重量,分别用甲醇、50%甲醇或50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液,回收溶剂至干,残渣加水使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取2-10次,合并正丁醇提取液,用氨试液洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过;
2)混合对照品溶液的制备:将异甘草苷芹糖、异甘草苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、芒柄花素、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd加甲醇制成参照溶液;
3)色谱条件:
流动相:乙腈A-水B,梯度洗脱,0-20min 16-17%A,20-35min 17-19.5%A,35-55min19.5-26%A,55-75min 26-29%A,75-110min 29-42%A;流速1.0ml/min;柱温:35℃;色谱柱:Thermo BDS HYPERSIL C18 250×4.6mm,5μm;检测波长:203nm;
4)测定:
吸取参照溶液与供试品溶液,注入液相色谱仪,测定,分别得到供试样品溶液和混合对照品溶液的液相色谱;
5)采用国家药典委员会制定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件,对供试样品溶液和混合对照品溶液的液相色谱进行数据匹配,得标准指纹图谱,
其中,所述保元汤提取物通过包括以下步骤的制备方法得到:将人参3.73重量份、黄芪7.46重量份、甘草1.87重量份、肉桂0.75重量份,加生姜3.00重量份,煎煮两次,一煎加水,浸泡30-60分钟后,煮沸,煎煮45-60分钟,趁热过滤,得一煎药液,二煎加水,煮沸,煎煮35-50分钟,趁热过滤,得二煎药液,合并两次药液,减压浓缩得到保元汤提取物。
2.根据权利要求1所述的测定方法,其中,所述供试品溶液的制备包括:取不同批次的保元汤提取物,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇、50%甲醇或50%乙醇50-200ml,称定重量,进行加热回流2-3h、超声处理10-30分钟或振摇3-4h,再称定重量,分别用甲醇、50%甲醇或50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液40ml,回收溶剂至干,残渣加水15ml使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取3-5次,每次25ml,合并正丁醇提取液,用氨试液15ml洗涤,弃去氨试液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过。
3.根据权利要求1所述的测定方法,其中,所述指纹图谱有13个特征共有峰,峰1、2来自于甘草,峰3、9、10来自于黄芪和甘草,峰4、5、8、11来自于黄芪,峰6、7、12、13来自于人参。
4.根据权利要求1至3任一项所述的测定方法,其中,所述指纹图谱中1号峰为异甘草苷芹糖,2号峰为异甘草苷,3号峰为芒柄花苷,4号峰为毛蕊异黄酮,6号峰为人参皂苷Rg1,7号峰为人参皂苷Re,9号峰为芒柄花素,12号峰为人参皂苷Rb1,13号峰为人参皂苷Rd。
5.根据权利要求1所述的测定方法,其中,所述制备方法中,一煎加水的体积与人参的重量之比mL/g为600-800:3.73。
6.根据权利要求1所述的测定方法,其中,所述制备方法中,二煎加水的体积与人参的重量之比mL/g为450-650:3.73。
7.根据权利要求1所述的测定方法,其中,所述制备方法中,减压浓缩至合并所得药液体积的四分之一至五分之一。
8.根据权利要求1所述的测定方法,其中,所述制备方法中,减压浓缩中,温度≤60℃。
9.根据权利要求1所述的测定方法,其中,所述制备方法进一步包括:在减压浓缩得到保元汤之后,进行干燥的步骤。
10.根据权利要求9所述的测定方法,其中,所述干燥选自常压干燥、减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥。
11.根据权利要求9所述的测定方法,其中,所述干燥方式为冷冻干燥,冷冻干燥过程中,温度≤-40℃,压力≤20Pa。
12.根据权利要求11所述的测定方法,其中,冷冻干燥时间为20-30小时。
13.根据权利要求11所述的测定方法,其中,冷冻干燥时间为24小时。
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