CN104914199B - 一种中药组合物制剂中十二种成分的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药组合物制剂中十二种成分含量的UPLC‑MS定量方法，测定了该中药组合物中毛蕊异黄酮‑7‑O‑葡萄糖苷（1）、异槲皮苷（2）、柚皮芸香苷（3）、橙皮苷（4）、人参皂苷Re（5）、人参皂苷Rg1（6）、杠柳毒苷（7）、人参皂苷Rf（8）、人参皂苷Rb1（9）、黄芪甲苷(10)、人参皂苷Rd（11）、杠柳苷H1（12）的含量，属于中药制剂的成分检测领域。采用本发明的测定方法周期短、重复性好、灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于中药分析领域，具体涉及中药制剂中各成分的含量测定方法。
背景技术
该中药组合物由黄芪、人参、香加皮、桂枝等11 味中药组成的复方中药，具有益气温阳、活血通络、利水消肿等功效， 临床用于冠心病、高血压所致轻、中度充血性心力衰竭等疾病。现代研究表明该中药组合物中活性成分多种多样，主要包括黄酮类，皂苷类，生物碱类等，目前对该中药组合物的研究主要集中在临床应用方面及其化学成分的定性研究方面，而对其活性成分的定量分析研究却鲜见报道。近年来，液质联用技术以其优越的灵敏度和分辨率成为现代药物定量分析的有效手段[叶茂, 谢国祥, 赵爱华, 等. 超高效液相色谱-飞行时间质谱法测定苦参素注射液中苦参碱和氧化苦参碱[J]. 中国中药杂志, 2008,33(12): 1398-1401.]。
由于该中药组合物中成分比较多，目前的方法检验周期长，成本高，因此为了能够有效的控制产品质量，保证公众的用药安全，对该中药组合物制剂进行质量控制，本研究采用UPLC-MS测定该中药组合物中毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷（1）、异槲皮苷（2）、柚皮芸香苷（3）、橙皮苷（4）、人参皂苷Re（5）、人参皂苷Rg1（6）、杠柳毒苷（7）、人参皂苷Rf（8）、人参皂苷Rb1（9）、黄芪甲苷(10)、人参皂苷Rd（11）、杠柳苷H1（12）的含量，为其质量控制提供参考。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测周期短、灵敏度高，同时检测多种成分含量的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
该中药组合物由下列重量份的原料药制成: 黄芪 150-450份、附子40-120份、人参75-225份、丹参75-225份、葶苈子50-150份、香加皮60-180份、泽泻75-225份、玉竹25-75份、桂枝30-90份、红花30-90份、陈皮25-75份，其含量测定方法由以下步骤组成：
A、供试品溶液的制备： 取该中药组合物制剂，研细，精密称定0.1-2g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20-100mL，称定重量，超声处理10-60分钟，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤即得；
B、标注曲线的制备：精密称取对照品黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、杠柳毒苷、杠柳苷H1、橙皮苷、柚皮芸香苷、异槲皮苷，加甲醇溶解，得对照品液，将对照品溶液逐级稀释成一系列浓度，分别精密吸取稀释后的溶液0.2-10ul，注入UPLC制备标准曲线；
C、UPLC液相色谱条件：色谱柱： C18；流动相A为乙腈，B为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱：0~4min（5%~30%A），4~9min（30%~33%A），9~11min（33%~95%A），11~11.5min（95%~5%A），11.5~14min（5%A），柱温：20-50℃；流速：0.2 -0.6mL/min；
D、UPLC液相质谱条件：电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，源喷雾电压（IS）-3500 V到-4000 V，辅助加热气温度400-700 ℃，雾化气40-65 psi，辅助气40-65 psi，气帘气15-45psi；解簇电压-60V；采集方法：TOF-MS/MS方法；
E、测定：吸入供试品溶液0.2-10µL注入UPLC液相中，以标准曲线法测定样品含量。
含量测定方法步骤优选为：
A供试品溶液的制备：取该中药组合物制剂，研细，精密称定0.15g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50mL，称定重量，超声处理30分钟放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.2μm滤膜即得；
步骤B、精密称取对照品黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、杠柳毒苷、杠柳苷H1、橙皮苷、柚皮芸香苷、异槲皮苷，加甲醇溶解，制备12种对照品溶液， 1~12的浓度分别为17.64 ug/mL、17.46 ug/mL、20.952 ug/mL、17.568 ug/mL、53.064 ug/mL、 39.024 ug/mL、8.376 ug/mL、18.18 ug/mL、143.352 ug/mL、22.176 ug/mL、40.12 ug/mL、77.748 ug/mL，得到对照品溶液，稀释，分别精密吸取稀释后的溶液0.2-10ul，注入UPLC制备标准曲线；
C、UPLC液相色谱条件：色谱柱：Phenomenex UPLC Kinetex C18，规格2.1×100mm，2.6μm，B为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱：0~4min（5%~30%A），4~9min（30%~33%A），9~11min（33%~95%A），11~11.5min（95%~5%A），11.5~14min（5%A），柱温：40℃，流速：0.4 mL/min；
D、UPLC液相质谱条件：电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，源喷雾电压（IS）-4000 V，辅助加热气温度550 ℃，雾化气55 psi，辅助气55 psi，气帘气25 psi；解簇电压-60V；采集方法：TOF-MS/MS方法。
含量测定方法步骤还优选为：步骤A供试品溶液的制备：取该中药组合物制剂，研细，精密称定0.3g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇100mL，称定重量，超声处理60分钟放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜即得；步骤C UPLC液相色谱条件：色谱柱：Phenomenex UPLC Kinetex C18，规格2.1×100 mm，2.6μm，柱温：25℃，流速：0.6 mL/min。
含量测定方法步骤还优选为：步骤A供试品溶液的制备：取该中药组合物制剂，研细，精密称定0.1g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20mL，称定重量，超声处理10分钟放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.2μm滤膜即得；步骤C UPLC液相色谱条件：色谱柱：ACQUITY BEH C18 ，规格为2.1×100mm，1.7μm，柱温：50℃，流速：0.2 mL/min。
含量测定方法步骤还优选为：步骤A供试品溶液的制备：取该中药组合物制剂，研细，精密称定0.2g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇40mL，称定重量，超声处理40分钟放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜即得。
含量测定方法的中药组合物原料药的重量份比例优选为：黄芪450份、附子112.5份、人参225份、丹参225份、葶苈子150份、香加皮180份、泽泻225份、玉竹75份、桂枝90份、红花90份、陈皮75份。
含量测定方法的该中药组合物原料药的重量份比例还优选为：黄芪150份、附子40份、人参225份、丹参225份、葶苈子50份、香加皮180份、泽泻75份、玉竹75份、桂枝30份、红花90份、陈皮25份。
含量测定方法的该中药组合物原料药的重量份比例还优选为：黄芪250份、附子112.5份、人参200份、丹参120份、葶苈子135份、香加皮150份、泽泻200份、玉竹60份、桂枝75份、红花75份、陈皮60份。
含量测定方法的中药组合物制剂的剂型优选为胶囊剂、片剂、丸剂、口服液或颗粒剂。
中药组合物制剂胶囊剂是由以下步骤组成：
（1）将黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮按照比例量称取加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30 的清膏，备用；
（2）桂枝、陈皮按照比例蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加8倍量水煎煮1小时，滤过，合并水煎液，备用；
（3）附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水煎液合并，浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30的清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30的清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合，65-70℃烘干；
（4）将步骤（3）所得干膏粉碎成100目粉，加70%乙醇适量制粒，喷入桂枝、陈皮挥发油，混匀，装胶囊，即得。
为了验证本发明的方法的可行性和准确性，用实施例1中的胶囊剂作了如下的方法学验证试验：
1 仪器与试药
1.1 仪器 超高效液相色谱系统（Angilent 1290，美国）；质谱仪（Triple-TOFTM5600+，美国AB SCIEX公司），配有ESI源和APCI源；数据处理软件系统：MultiquantTMSoftware （美国AB SCIEX公司）；色谱柱（Phenomenex Kinetex C18 100×2.1mm，2.6μm）；超声波清洗器（KQ5200B，昆山市超声仪器有限公司）；分析天平（AG-135，瑞士METTLER公司）。
1.2 试药 对照品：黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、橙皮苷、异槲皮苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、杠柳毒苷，以上均购自中国食品药品检定研究院（批号分别为110781-201314、111920-201304、110721-201115、111809-201102、110704-201223、110754-201324、111818-201302、111719-201104、110703-200424、111793-200901）。柚皮芸香苷购自成都曼斯特生物科技有限公司（批号为MUST-11101011）。杠柳苷H1由石家庄以岭药业股份有限公司提供，纯度大于95%。
中药组合物胶囊剂（由石家庄以岭药业股份有限公司提供，批号130913，120805，120806，120807，120808，120901，120902，121101，121102，121103，121104）乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，美国Fisher公司），水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 液相条件 色谱柱：Phenomenex UPLC Kinetex C18 （2.1×100 mm，2.6μm）；流动相A-乙腈，B-0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱：0~4min（5%~30%A），4~9min（30%~33%A），9~11min（33%~95%A），11~11.5min（95%~5%A），11.5~14min（5%A），柱温：40℃；流速：0.4 mL/min；进样体积：5 µL。
2.2质谱条件 电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，源喷雾电压（IS）-4000 V，辅助加热气温度550 ℃，雾化气55 psi，辅助气55 psi，气帘气25 psi；解簇电压-60V；采集方法：TOF-MS/MS方法，准确质量数用自动校正系统（CDS）进行校正，12种被测定成分质谱参数见表1：
表1 各化合物的质谱参数
2.3供试品溶液的制备 称取胶囊剂内容物，研细，精密称定0.15g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50mL，称定重量，超声处理30分钟（功率250w，频率40kHz)，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.2μm滤膜即得。
2.4对照品溶液的制备 精密称取对照品黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、杠柳毒苷、杠柳苷H1、橙皮苷、柚皮芸香苷、异槲皮苷，加甲醇溶解，得到浓度分别约为1.0 mg/mL的对照品储备液。
3 结果
3.1标准曲线及线性关系考察 分别精密吸取12种对照品储备液适量置于同一10ml量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，得到对照品溶液， 1~12的浓度分别为17.64 ug/mL、17.46 ug/mL、20.952 ug/mL、17.568 ug/mL、53.064 ug/mL、 39.024 ug/mL、8.376 ug/mL、18.18 ug/mL、143.352 ug/mL、22.176 ug/mL、40.12 ug/mL、77.748 ug/mL。将此对照品溶液逐级稀释成一系列浓度，按照2.1项下条件进行测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归分析。结果表明，12种分析物在各自线性范围内均呈现良好的线性关系，得回归方程，结果见表2：
表 2 各化合物的线性范围、定量下限、线性方程及相关系数
3.2精密度试验 精密吸取同一浓度的对照品溶液5μL，按2.1项下色谱条件连续进样5次，记录峰面积。结果显示12种化合物峰面积的RSD值均小于1.93%，表明仪器精密度良好。
3.3稳定性试验 按2.3项下制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别在0、2、4、8、12、24h进样5μL，记录峰面积。结果显示12种化合物峰面积的RSD均小于4.3%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
3.4重复性试验 精密称取同一批号中药组合物制剂样品6份，按照2.3项下制备供试品溶液6份，分别在上述色谱条件下，分别进样5μL，记录峰面积，计算含量。结果显示化合物1~12含量的RSD值分别为1.87%，2.76%，2.4%，2.41%，2.61%，2.93%，2.02%，2.25%，2.64%，2.14%，2.72%，2.61%，表明方法的重复性良好。
3.5加样回收率试验 精密称取6份己知含量的同一批号中药组合物制剂药粉0.075g，分别加入一定量的对照品溶液，依照2.3项下制备供试品溶液，进样5μL，记录峰面积，计算各对照品的加样回收率，分别为：99.30%，100.48%，99.43%，98.625%，101.83%，98.42%，100.44%，98.97%，100.58%，100.20%，98.20%，100.05%；RSD值分别为：3.00%，3.42%，3.29%，2.65%，2.47%，2.19%，3.51%，2.90%，3.67%，3.88%，2.93%，3.69%,表明本方法的准确度高。
3.6 样品含量的测定 取中药组合物制剂10批，按2.3项下制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，分别对10批中药组合物制剂样品中的12种有效成分进行含量测定，结果见表3：
表 3 十批胶囊剂中主要成分含量测定结果（mg/g）
由以上结果可知，采用本方法测定的十二种成分含量，方法稳定可行。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：本发明采用UPLC同时测定该中药组合物中多种成分的含量，重复性好、精密度高、分析速度快，可以在比较短的周期内检测出各成分的含量，可以更方便的控制药物的质量，降低生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明
实施例1：本发明药物胶囊剂的制备
处方：
黄芪450g 附子112.5g 人参225g 丹参225g 葶苈子150g
香加皮180g 泽泻225g 红花90g 玉竹75g 陈皮75g
制备方法：
（1）将黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮按照上述处方加8倍量（重量比）70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30 的清膏，备用；
（2）桂枝、陈皮按照比例蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加8倍量水煎煮1小时，滤过，合并水溶液，备用；
（3）附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量（重量比）煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水溶液合并，浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合，65-70℃烘干；
（4）干膏混合粉碎成100目粉，加70%乙醇适量制粒，喷入桂枝、陈皮挥发油，混匀，装胶囊，制成1000粒，即得。
用法用量：每次4粒，每日3次。
该胶囊剂的含量测定方法由以下步骤为：
A、供试品溶液的制备：取该中药组合物制剂，研细，精密称定0.15g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50mL，称定重量，超声处理30分钟放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.2μm滤膜即得；
B、标准曲线的制备：精密称取对照品黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、杠柳毒苷、杠柳苷H1、橙皮苷、柚皮芸香苷、异槲皮苷，加甲醇溶解，得1~12的浓度分别为17.64 ug/mL、17.46 ug/mL、20.952 ug/mL、17.568 ug/mL、53.064 ug/mL、 39.024 ug/mL、8.376 ug/mL、18.18 ug/mL、143.352 ug/mL、22.176 ug/mL、40.12 ug/mL、77.748 ug/mL；将此对照品溶液逐级稀释成一系列浓度，分别精密吸取稀释后的溶液0.2ul，注入UPLC制备标准曲线；做标准曲线；
C、UPLC液相色谱条件：色谱柱：Phenomenex UPLC Kinetex C18，规格2.1×100mm，2.6μm，流动相A为乙腈，B为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱：0~4min（5%~30%A），4~9min（30%~33%A），9~11min（33%~95%A），11~11.5min（95%~5%A），11.5~14min（5%A），柱温：40℃，流速：0.4 mL/min；
D、UPLC液相质谱条件：电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，源喷雾电压（IS）-4000 V，辅助加热气温度550 ℃，雾化气55 psi，辅助气55 psi，气帘气25 psi；解簇电压-60V；采集方法：TOF-MS/MS方法。
E、测定：吸入供试品溶液5 µL注入UPLC液相中，以标准曲线法测定样品含量。
实验结果：测得样品中1-12种成分的含量分别为：
1、精密度试验：精密吸取同一浓度的对照品溶液5μL，连续进样5次，记录峰面积。结果显示12种化合物峰面积的RSD值均小于1.93%，表明仪器精密度良好。
2、稳定性试验：按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别在0、2、4、8、12、24h进样5μL，记录峰面积。结果显示12种化合物峰面积的RSD均小于4.3%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
3、重复性试验：精密称取同一批号中药组合物制剂样品6份，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液6份，分别在上述色谱条件下，分别进样5μL，记录峰面积，计算含量。结果显示化合物1~12含量的RSD值分别为1.87%，2.76%，2.4%，2.41%，2.61%，2.93%，2.02%，2.25%，2.64%，2.14%，2.72%，2.61%，表明方法的重复性良好。
4、加样回收率试验 精密称取6份己知含量的同一批号中药组合物制剂药粉0.075g，分别加入一定量的对照品溶液，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，进样5μL，记录峰面积，计算各对照品的加样回收率，分别为：99.30%，100.48%，99.43%，98.625%，101.83%，98.42%，100.44%，98.97%，100.58%，100.20%，98.20%，100.05%；RSD值分别为：3.00%，3.42%，3.29%，2.65%，2.47%，2.19%，3.51%，2.90%，3.67%，3.88%，2.93%，3.69%,表明本方法的准确度高。
由以上结果可知，采用以上方法作为该中药组合物12种成分的含量测定方法，重复性好、精密度高、分析速度快，可以在比较短的周期内检测出各成分的含量，可以更方便的控制药物的质量，降低生产成本。
该胶囊剂的含量测定方法还可以由以下步骤组成：
A、供试品溶液的制备：取该中药组合物制剂，研细，精密称定0.2g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇40mL，称定重量，超声处理40分钟放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜即得；
B、标准曲线的制备：精密称取对照品黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、杠柳毒苷、杠柳苷H1、橙皮苷、柚皮芸香苷、异槲皮苷，加甲醇溶解，得1~12的浓度分别为17.64 ug/mL、17.46 ug/mL、20.952 ug/mL、17.568 ug/mL、53.064 ug/mL、 39.024 ug/mL、8.376 ug/mL、18.18 ug/mL、143.352 ug/mL、22.176 ug/mL、40.12 ug/mL、77.748 ug/mL；将此对照品溶液逐级稀释成一系列浓度，分别精密吸取稀释后的溶液0.2ul，注入UPLC制备标准曲线；做标准曲线；
C、UPLC液相色谱条件：色谱柱：Phenomenex UPLC Kinetex C18，规格2.1×100mm，2.6μm，流动相A为乙腈，B为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱：0~4min（5%~30%A），4~9min（30%~33%A），9~11min（33%~95%A），11~11.5min（95%~5%A），11.5~14min（5%A），柱温：40℃，流速：0.4 mL/min；
D、UPLC液相质谱条件：电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，源喷雾电压（IS）-3500 V，辅助加热气温度400 ℃，雾化气65 psi，辅助气45 psi，气帘气15 psi；解簇电压-60V；采集方法：TOF-MS/MS方法；
E、测定：吸入供试品溶液5 µL注入UPLC液相中，以标准曲线法测定样品含量。
实验结果：测得样品中1-12种成分的含量分别为：
1、精密度试验：精密吸取同一浓度的对照品溶液5μL，连续进样5次，记录峰面积。结果显示12种化合物峰面积的RSD值均小于2.28%，表明仪器精密度良好。
2、稳定性试验：按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别在0、2、4、8、12、24h进样5μL，记录峰面积。结果显示12种化合物峰面积的RSD均小于3.8%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
3、重复性试验：精密称取同一批号中药组合物制剂样品6份，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液6份，分别在上述色谱条件下，分别进样5μL，记录峰面积，计算含量。结果显示化合物1~12含量的RSD值分别为2.36%，2.18%，1.58%，2.76%，2.81%，2.83%，2.00%，2.17%，2.68%，2.04%，2.42%，2.63%，表明方法的重复性良好。
4、加样回收率试验：精密称取6份己知含量的同一批号中药组合物制剂药粉0.1g，分别加入一定量的对照品溶液，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，进样5μL，记录峰面积，计算各对照品的加样回收率，分别为：97.30%，98.78%，99.52%，98.35%，99.53%，97.89%，98.14%，97.84%，99.18%，98.20%，98.870%，99.32%；RSD值分别为：2.15%，2.67%，3.08%，2.19%，2.63%，2.55%，2.80%，2.71%，2.27%，3.12%，2.22%，2.36%,表明本方法的准确度高。
由以上结果可知，采用以上方法作为该中药组合物12种成分的含量测定方法，重复性好、精密度高、分析速度快，可以在比较短的周期内检测出各成分的含量，可以更方便的控制药物的质量，降低生产成本。
实施例2：本发明药物片剂的制备
处方：
黄芪150g 附子40g 人参225g 丹参225g 葶苈子50g 香加皮180g 泽泻75g玉竹75g 桂枝30g 红花90g 陈皮25g
制备方法：
（1）将黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮按照上述处方加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30 的清膏，备用；
（2）桂枝、陈皮按照处方量蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加8倍量水煎煮1小时，滤过，合并水煎液，备用；
（3）附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水煎液合并，浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合，65-70℃烘干；
（4）按常规制剂方法制成片剂。
该片剂的含量测定方法由以下步骤为：
A、供试品溶液的制备：取该中药组合物制剂，研细，精密称定2g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇100mL，称定重量，超声处理60分钟放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜即得；
B、标准曲线的制备：精密称取对照品黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、杠柳毒苷、杠柳苷H1、橙皮苷、柚皮芸香苷、异槲皮苷，加甲醇溶解，得1~12的浓度分别为17.64 ug/mL、17.46 ug/mL、20.952 ug/mL、17.568 ug/mL、53.064 ug/mL、 39.024 ug/mL、8.376 ug/mL、18.18 ug/mL、143.352 ug/mL、22.176 ug/mL、40.12 ug/mL、77.748 ug/mL；将此对照品溶液逐级稀释成一系列浓度，分别精密吸取稀释后的溶液10uL，注入UPLC制备标准曲线；做标准曲线；
C、UPLC液相色谱条件：色谱柱：Phenomenex UPLC Kinetex C18，规格2.1×100 mm，2.6μm，流动相A为乙腈，B为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱：0~4min（5%~30%A），4~9min（30%~33%A），9~11min（33%~95%A），11~11.5min（95%~5%A），11.5~14min（5%A），柱温：25℃，流速：0.6 mL/min；
D、UPLC液相质谱条件：电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，源喷雾电压（IS）-4500 V，辅助加热气温度650 ℃，雾化气45 psi，辅助气40 psi，气帘气45 psi；解簇电压-60V；采集方法：TOF-MS/MS方法；
E、测定：吸入供试品溶液10 µL注入UPLC液相中，以标准曲线法测定样品含量。
实验结果：测得样品中1-12种成分的含量分别为：
1、精密度试验：精密吸取同一浓度的对照品溶液5μL，连续进样5次，记录峰面积。结果显示12种化合物峰面积的RSD值均小于1.62%，表明仪器精密度良好。
2、稳定性试验：按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别在0、2、4、8、12、24h进样10μL，记录峰面积。结果显示12种化合物峰面积的RSD均小于3.6%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
3、重复性试验：精密称取同一批号中药组合物制剂样品6份，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液6份，分别在上述色谱条件下，分别进样10μL，记录峰面积，计算含量。结果显示化合物1~12含量的RSD值分别为1.52%，2.35%，2.14%，2.40%，2.73%，2.52%，2.17%，2.62%，2.65%，2.00%，2.32%，2.65%，表明方法的重复性良好。
4、加样回收率试验：精密称取6份己知含量的同一批号中药组合物制剂药粉0.15g，分别加入一定量的对照品溶液，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，进样10μL，记录峰面积，计算各对照品的加样回收率，分别为：98.80%，99.2%，99.25%，98.75%，100. 53%，99.56%，99.14%，97.92%，99.7%，100.00%，99.20%，98.05%；RSD值分别为：2.35%，3.54%，2.21%，2.33%，2.52%，2.31%，3.08%，2.62%，2.67%，2.58%，2.03%，3.41%,表明本方法的准确度高。
由以上结果可知，采用以上方法作为该中药组合物12种成分的含量测定方法，重复性好、精密度高、分析速度快，可以在比较短的周期内检测出各成分的含量，可以更方便的控制药物的质量，降低生产成本。
实施例3：本发明药物颗粒剂的制备
处方：
黄芪250g 附子112.5g 人参200g 丹参120g 葶苈子135g
香加皮150g 泽泻200g 玉竹60g 桂枝75g 红花75g 陈皮60g
制备方法：按常规制剂方法制成颗粒剂。
该颗粒剂的含量测定方法由以下步骤为：
A、供试品溶液的制备：取该中药组合物制剂，研细，精密称定0.1g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20mL，称定重量，超声处理10分钟放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.2μm滤膜即得；
B、标准曲线的制备：精密称取对照品黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、杠柳毒苷、杠柳苷H1、橙皮苷、柚皮芸香苷、异槲皮苷，加甲醇溶解，得1~12的浓度分别为17.64 ug/mL、17.46 ug/mL、20.952 ug/mL、17.568 ug/mL、53.064 ug/mL、 39.024 ug/mL、8.376 ug/mL、18.18 ug/mL、143.352 ug/mL、22.176 ug/mL、40.12 ug/mL、77.748 ug/mL；将此对照品溶液逐级稀释成一系列浓度，分别精密吸取稀释后的溶液5ul，注入UPLC制备标准曲线；做标准曲线；
C、UPLC液相色谱条件：色谱柱：ACQUITY BEH C18 ，规格为2.1×100mm，1.7μm，流动相A为乙腈，B为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱：0~4min（5%~30%A），4~9min（30%~33%A），9~11min（33%~95%A），11~11.5min（95%~5%A），11.5~14min（5%A），柱温：50℃，流速：0.2 mL/min；
D、UPLC液相质谱条件：电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，源喷雾电压（IS）-4200 V，辅助加热气温度700 ℃，雾化气50 psi，辅助气50 psi，气帘气20 psi；解簇电压-60V；采集方法：TOF-MS/MS方法。
E、测定：吸入供试品溶液2 µL注入UPLC液相中，以标准曲线法测定样品含量。
实验结果：测得样品中1-12种成分的含量分别为：
1、精密度试验：精密吸取同一浓度的对照品溶液2μL，连续进样5次，记录峰面积。结果显示12种化合物峰面积的RSD值均小于1.82%，表明仪器精密度良好。
2、稳定性试验：按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别在0、2、4、8、12、24h进样2μL，记录峰面积。结果显示12种化合物峰面积的RSD均小于2.8%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
3、重复性试验：精密称取同一批号中药组合物制剂样品6份，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液6份，分别在上述色谱条件下，分别进样2μL，记录峰面积，计算含量。结果显示化合物1~12含量的RSD值分别为1.84%，1.35%，2.39%，2.52%，2.53%，2.91%，2.67%，2.02%，2.62%，2.11%，2.32%，2.75%，表明方法的重复性良好。
4、加样回收率试验：精密称取6份己知含量的同一批号中药组合物制剂药粉0.05g，分别加入一定量的对照品溶液，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，进样2μL，记录峰面积，计算各对照品的加样回收率，分别为：99.61%，99.5%，98.25%，98.65%，99.13%，98.58%，97.84%，98.72%，97.7%，99.31%，100.20%，97.85%；RSD值分别为：2.14%，2.38%，2.57%，2.63%，2.72%，2.41%，2.28%，2.75%，2.94%，2.39%，2.54%，2.67%,表明本方法的准确度高。
由以上结果可知，采用以上方法作为该中药组合物12种成分的含量测定方法，重复性好、精密度高、分析速度快，可以在比较短的周期内检测出各成分的含量，可以更方便的控制药物的质量，降低生产成本。
实施例4
黄芪250g 附子112.5g 人参200g 丹参120g 葶苈子135g
香加皮150g 泽泻200g 玉竹60g 桂枝75g 红花75g 陈皮60g
按比例称取上述药物，直接打成粉，按常规方法制成冲剂或散剂。
含量测定方法由以下步骤为：
A、供试品溶液的制备：取该中药组合物制剂，研细，精密称定2g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇100mL，称定重量，超声处理60分钟放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.2μm滤膜即得；
B、标准曲线的制备：精密称取对照品黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、杠柳毒苷、杠柳苷H1、橙皮苷、柚皮芸香苷、异槲皮苷，加甲醇溶解，得1~12的浓度分别为17.64 ug/mL、17.46 ug/mL、20.952 ug/mL、17.568 ug/mL、53.064 ug/mL、 39.024 ug/mL、8.376 ug/mL、18.18 ug/mL、143.352 ug/mL、22.176 ug/mL、40.12 ug/mL、77.748 ug/mL；将此对照品溶液逐级稀释成一系列浓度，分别精密吸取稀释后的溶液5ul，注入UPLC制备标准曲线；做标准曲线；
C、UPLC液相色谱条件：色谱柱：ACQUITY BEH C18 ，规格为2.1×100mm，1.7μm，流动相A为乙腈，B为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱：0~4min（5%~30%A），4~9min（30%~33%A），9~11min（33%~95%A），11~11.5min（95%~5%A），11.5~14min（5%A），柱温：50℃，流速：0.2 mL/min；
D、UPLC液相质谱条件：电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，源喷雾电压（IS）-4200 V，辅助加热气温度700 ℃，雾化气50 psi，辅助气50 psi，气帘气20 psi；解簇电压-60V；采集方法：TOF-MS/MS方法；
E、测定：吸入供试品溶液5 µL注入UPLC液相中，以标准曲线法测定样品含量。
实验结果：测得样品中1-12种成分的含量分别为：
1、精密度试验：精密吸取同一浓度的对照品溶液2μL，连续进样5次，记录峰面积。结果显示12种化合物峰面积的RSD值均小于1.81%，表明仪器精密度良好。
2、稳定性试验：按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别在0、2、4、8、12、24h进样2μL，记录峰面积。结果显示12种化合物峰面积的RSD均小于2.7%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
3、重复性试验：精密称取同一批号中药组合物制剂样品6份，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液6份，分别在上述色谱条件下，分别进样2μL，记录峰面积，计算含量。结果显示化合物1~12含量的RSD值分别为1.83%，1.35%，2.39%，2.51%，2.53%，2.91%，2.67%，2.02%，2.64%，2.11%，2.32%，2.74%，表明方法的重复性良好。
4、加样回收率试验：精密称取6份己知含量的同一批号中药组合物制剂药粉0.05g，分别加入一定量的对照品溶液，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，进样2μL，记录峰面积，计算各对照品的加样回收率，分别为：99.61%，99.5%，98.25%，98.65%，99.13%，98.48%，97.74%，98.72%，97.7%，99.31%，100.20%，97.85%；RSD值分别为：2.14%，2.38%，2.57%，2.63%，2.72%，2.41%，2.38%，2.75%，2.94%，2.39%，2.55%，2.66%,表明本方法的准确度高。
Claims (10)
1.一种中药组合物制剂中十二种成分的含量测定方法，该中药组合物由下列重量份的原料药制成: 黄芪 150-450份、附子40-120份、人参75-225份、丹参75-225份、葶苈子50-150份、香加皮60-180份、泽泻75-225份、玉竹25-75份、桂枝30-90份、红花30-90份、陈皮25-75份，其特征在于该含量测定方法由以下步骤组成：
A、供试品溶液的制备：取该中药组合物制剂，研细，精密称定0.1-2g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20-100mL，称定重量，超声处理10-60分钟，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤即得；
B、标准曲线的制备：精密称取对照品黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、杠柳毒苷、杠柳苷H1、橙皮苷、柚皮芸香苷、异槲皮苷，加甲醇溶解，得对照品溶液，将对照品溶液逐级稀释成一系列浓度，分别精密吸取稀释后的溶液0.2-10μl，注入UPLC制备标准曲线；
C、UPLC液相色谱条件：色谱柱： C18；流动相A为乙腈，B为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱：0~4min/5%~30%A，4~9min/30%~33%A，9~11min/33%~95%A，11~11.5min/95%~5%A，11.5~14min/5%A，柱温：20-50℃；流速：0.2 -0.6mL/min；
D、质谱条件：电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，源喷雾电压（IS）-3500 V到-4000V，辅助加热气温度400-700 ℃，雾化气40-65 psi，辅助气40-65 psi，气帘气15-45psi；解簇电压-60V；采集方法：TOF-MS/MS方法；
E、测定：吸入供试品溶液0.2-10µL注入UPLC液相中，以标准曲线法测定样品含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
步骤A、供试品溶液的制备：取该中药组合物制剂，研细，精密称定0.15g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50mL，称定重量，超声处理30分钟放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.2μm滤膜即得；
步骤B、精密称取对照品黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、杠柳毒苷、杠柳苷H1、橙皮苷、柚皮芸香苷、异槲皮苷，加甲醇溶解，制备12种对照品溶液，其浓度依次分别为17.64 µg/mL、17.46 µg/mL、20.952µg/mL、17.568µg/mL 、53.064 µg/mL、 39.024µg/mL、8.376 µg/mL、18.18µg/mL、143.352 µg/mL、22.176 µg/mL、40.12 µg/mL、77.748 µg/mL，得到对照品溶液，稀释，分别精密吸取稀释后的溶液0.2-10µl，注入UPLC制备标准曲线；
步骤C、UPLC液相色谱条件：色谱柱：Phenomenex UPLC Kinetex C18，规格2.1×100mm，2.6μm，柱温：40℃，流速：0.4 mL/min；
步骤D、质谱条件：电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，源喷雾电压（IS）-4000 V，辅助加热气温度550 ℃，雾化气55 psi，辅助气55 psi，气帘气25 psi；解簇电压-60V；采集方法：TOF-MS/MS方法。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
步骤A、供试品溶液的制备：取该中药组合物制剂，研细，精密称定0.3g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇100mL，称定重量，超声处理60分钟放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜即得；
步骤C 、UPLC液相色谱条件：色谱柱：Phenomenex UPLC Kinetex C18，规格2.1×100mm，2.6μm，柱温：25℃，流速：0.6 mL/min。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
步骤A、供试品溶液的制备：取该中药组合物制剂，研细，精密称定0.1g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20mL，称定重量，超声处理10分钟放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.2μm滤膜即得；
步骤C 、UPLC液相色谱条件：色谱柱：ACQUITY BEH C18 ，规格为2.1×100mm，1.7μm，柱温：50℃，流速：0.2 mL/min。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
步骤A供试品溶液的制备：取该中药组合物制剂，研细，精密称定0.2g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇40mL，称定重量，超声处理40分钟放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜即得。
6.根据权利要求1-5任一项所述的测定方法，其特征在于该中药组合物原料药的重量份比例为：黄芪450份、附子112.5份、人参225份、丹参225份、葶苈子150份、香加皮180份、泽泻225份、玉竹75份、桂枝90份、红花90份、陈皮75份。
7.根据权利要求1-5任一项所述的测定方法，其特征在于该中药组合物原料药的重量份比例为：黄芪150份、附子40份、人参225份、丹参225份、葶苈子50份、香加皮180份、泽泻75份、玉竹75份、桂枝30份、红花90份、陈皮25份。
8.根据权利要求1-5任一项所述的测定方法，其特征在于该中药组合物原料药的重量份比例为：黄芪250份、附子112.5份、人参200份、丹参120份、葶苈子135份、香加皮150份、泽泻200份、玉竹60份、桂枝75份、红花75份、陈皮60份。
9.根据权利要求1-5任一项所述的测定方法，其特征在于所述中药组合物制剂剂型为胶囊剂、片剂或颗粒剂。
10.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于所述胶囊剂通过以下步骤制备得到：
（1）将黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮按照比例量称取加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30 的清膏，备用；
（2）桂枝、陈皮按照比例蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加8倍量水煎煮1小时，滤过，合并水煎液，备用；
（3）附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水煎液合并，浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30的清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30的清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合，65-70℃烘干；
（4）将步骤（3）所得干膏粉碎成100目粉，加70%乙醇适量制粒，喷入桂枝、陈皮挥发油，混匀，装胶囊，即得。
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