CN113567589B - 一种hplc-ms-ms法测定sd大鼠血浆中北五加皮苷n成分含量的方法 - Google Patents

一种hplc-ms-ms法测定sd大鼠血浆中北五加皮苷n成分含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种HPLC‑MS‑MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量的方法，包括以下步骤：分别向校正标示样品、质控样品、内标样品以及待测SD大鼠样品中加入10.0ng/mL甲苯磺丁脲内标工作液稀释20倍，分别离心取上清液，然后再分别将上清液用超纯水溶液稀释2倍即可进样分析。分别向空白基质和溶剂样中加入空白基质和超纯水，再分别用乙腈稀释20倍，分别离心取上清液，然后再分别将上清液用超纯水溶液稀释2倍即可进样分析。将上述处理后的各个样品分别注入液相色谱质谱联用仪中，对北五加皮苷N以及甲苯磺丁脲成分进行定量检测。本发明对样品分析简单便捷，检出限低、灵敏度高、重复性和回收率好。

Description

一种HPLC-MS-MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量 的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种HPLC-MS-MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量的方法。
背景技术
生物样品分析随着质谱技术的发展，其应用日益广泛。但由于生物样品中的基质复杂，且药物浓度低。因此，需要获得更准确且稳定的测定方法。HPLC-MS-MS技术中，高效液相色谱是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交换过程，它借助溶质在两相间的分配系数、亲和力、吸附能力、离子交换或分子大小不同引起的排阻作用差别使不同溶质进行分离。因此，亟待开发出一种采用HPLC-MS-MS技术，建立并验证SD大鼠血浆中北五加皮苷N浓度测定的液质联用方法，旨在获得更加准确且稳定性高的含量测定方法，从而便于科研以及工业化应用。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一种HPLC-MS-MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量的方法，其对样品分析简单便捷，检出限低、灵敏度高、重复性和回收率好。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
本发明提供一种HPLC-MS-MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量的方法，包括以下步骤：
步骤一、样品制备：
制备校正标示样品：以北五加皮苷N为溶质，以乙腈水溶液为溶剂，配制北五加皮苷N不同梯度浓度的校正标示工作液；分别取各浓度校正标示工作液，用空白基质稀释，得到校正标示样品；
制备质控样品：以北五加皮苷N为溶质，以乙腈水溶液为溶剂，配制北五加皮苷N不同梯度浓度的质控工作液；分别取各浓度质控工作液，用空白基质稀释，得到质控样品；
步骤二、样品处理：
分别向校正标示样品、质控样品、内标样品以及待测SD大鼠血浆中加入甲苯磺丁脲内标工作液稀释，分别离心取上清液，然后再分别将上清液用超纯水溶液稀释；
分别向空白基质和溶剂样中加入乙腈稀释，分别离心取上清液，然后再分别将上清液用超纯水溶液稀释；
步骤三、样品检测：
将上述步骤二中处理后的校正标示样品、质控样品、内标样品、待测SD大鼠血浆、空白基质和水样分别注入液相色谱质谱联用仪中，对北五加皮苷N以及甲苯磺丁脲成分进行定量检测，通过回归和数据处理获得SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量。
作为优选，所述步骤一中，制备校正标示样品和质控样品所采用的乙腈水溶液的体积浓度均为50％；采用空白基质稀释的倍数均为20倍。
作为优选，所述步骤一中，校正标示工作液中的北五加皮苷N的梯度浓度为20.0～20000ng/mL；质控工作液中的北五加皮苷N的梯度浓度为20.0～15000ng/mL。
作为优选，所述步骤二中，采用的甲苯磺丁脲内标工作液的浓度为10.0ng/mL；利用其对校正标示样品、质控样品、内标样品以及待测SD大鼠血浆进行稀释的倍数为20倍；采用超纯水溶液稀释的倍数为2倍。
作为优选，所述步骤二中，向空白基质和溶剂样中加入乙腈稀释的倍数为20倍；采用超纯水溶液稀释的倍数为2倍。
作为优选，所述步骤一中，以北五加皮苷N为溶质进行配制样品采用的是含有白五加皮苷的二甲基亚砜溶液；所述白五加皮苷N在二甲基亚砜溶液中的浓度为1.00mg/mL。
作为优选，所述步骤三中，按照下述液相色谱条件进行检测：
固定相：填料粒径为5μm，直径2.1mm，长度50mm的ACE 5C18色谱柱；
流动相：流动相为A和B的混合体系，A为甲酸乙酸铵水溶液，其中甲酸：乙酸铵(1M)：水的体积比为0.1:0.2:100；B为甲酸乙酸铵甲醇乙腈溶液，其中甲酸：乙酸铵(1M)：甲醇：乙腈的体积比为0.1:0.1:50:50；
洗脱梯度为：
0.01min，A的体积百分比为40％，B的体积百分比为60％；
0.90min，A的体积百分比为0％，B的体积百分比为100％；
1.60min，A的体积百分比为0％，B的体积百分比为100％；
1.61min，A的体积百分比为40％，B的体积百分比为60％；
2.50min，A的体积百分比为40％，B的体积百分比为60％。
作为优选，所述步骤三中，所述液相色谱的进样器清洗液为：弱洗采用50％甲醇水溶液，强洗采用甲醇、乙腈、异丙醇、水按照体积比1:1:1:1混合而成。
作为优选，所述步骤三中，按照下述液相色谱条件进行检测：
流速：0.40mL/min；
柱温：40℃；
自动进样器温度：4℃；
进样量：10μL。
作为优选，所述步骤三中，按照下述质谱条件进行检测：
离子源：电喷雾离子源；
离子化模式：正离子模式；
分辨力模式为Unit；
碰撞气、气帘气、雾化气、辅助气1和辅助气2均为高纯氮气；
喷雾电压5500V。
作为优选，所述步骤三中，按照下述回归和数据处理方法：
回归模型为y＝ax+b,线性回归，权重因子1/x2，y为分析物与内标的峰面积比，x为校正标示样中分析物的浓度；
计算软件为Analyst 1.6.3和Microsoft Office 2016(or other version)，所有浓度值保留3位有效数字，％Bias和％CV保留到小数点后1位；
分析物：北五加皮苷N；
基质：SD大鼠血浆(肝素钠为抗凝剂)；
校正曲线范围：1.00ng/mL～1000ng/mL；
定量下限：1.00ng/mL；
线性范围：1.00ng/mL～1000ng/mL。
本发明的有益效果：
本发明的HPLC-MS-MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量的方法对样品分析简单便捷，检出限低、灵敏度高、重复性和回收率好。
为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中溶剂样品中分析物为北五加皮苷N(上)/甲苯磺丁脲(下)的谱图；
图2是本发明实施例中双空白样品中分析物为北五加皮苷N(上)/甲苯磺丁脲(下)的谱图；
图3是本发明实施例中质控样品中分析物为北五加皮苷N(上)/甲苯磺丁脲(下)的谱图；
图4是本发明实施例中分析物为北五加皮苷N(上)/甲苯磺丁脲(下)的残留效应谱图；
图5是本发明实施例中校正标示样定量下限中分析物为北五加皮苷N(上)/甲苯磺丁脲(下)的谱图；
图6是本发明实施例中校正标示样定量上限中分析物为北五加皮苷N(上)/甲苯磺丁脲(下)的谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中的仪器与试药如下：
仪器：
高效液相色谱Shimadzu LC-30AD
质谱仪AB SCIEX-5000Q TRAP-LC/MS/MS system
数据采集及管理Analyst 1.6.3,AppliedBiosystem
日常计算/报告处理Office 2016or other version,Microsoft
试药：
乙腈HPLC级
甲醇HPLC级
异丙醇HPLC级
甲酸AR级
本实施例提供一种HPLC-MS-MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量的方法，包括以下步骤：
一、样品和溶液制备：
1.制备校正标示样品：
称量一定量的北五加皮苷N，溶解于二甲基亚砜溶液中，得到1.00mg/mL北五加皮苷N储备液。
取1.00mg/mL北五加皮苷N储备液，以50％乙腈水溶液稀释至北五加皮苷N系列浓度20、40、200、1600、4000、16000、20000ng/mL的校正标示工作液。
分别取10μL各个浓度的校正标示工作液与190μL空白基质混合，分别得到北五加皮苷N系列浓度为1、2、10、80、200、800、1000ng/mL的校正标示样。
2.制备质控样品：
称量一定量的北五加皮苷N，溶解于二甲基亚砜溶液中，得到1.00mg/mL北五加皮苷N储备液。取1.00mg/mL北五加皮苷N储备液，以50％乙腈水溶液稀释至北五加皮苷N系列浓度为20、60、600、15000ng/mL的质控工作液。
分别取10μL各个浓度的质控工作液与190μL空白基质混合，分别得到北五加皮苷N系列浓度为1、3、30、750ng/mL的质控样品。
3.制备双空白样品：空白基质，本实施例中空白基质均为从安领生物医药(苏州)有限公司采集的SD大鼠血浆，以肝素钠为抗凝剂。
4.制备溶剂样品：溶剂样。本实施例中所用的水均超纯水。
5.制备待测样品：即待测SD大鼠血浆样本。
6.制备纯液体样品：乙腈。
7.制备回收率和基质效应纯溶液，即neat溶液：
以甲苯磺丁脲溶液和50％乙腈水溶液混合，使甲苯磺丁脲终浓度为22.5ng/mL。
以北五加皮苷N溶液和50％乙腈水溶液混合，使北五加皮苷N终浓度为0.75、188ng/mL。
二、样品处理：
以下处理步骤中用到的内标工作液为10.0ng/mL甲苯磺丁脲内标工作液。乙腈代表100％浓度乙腈。
将20μL校正标示样、180μL内标工作液混合均匀，离心取上清液100μL，加入100μL水溶液低速涡旋混匀，进样分析。
将20μL质控样品、180μL内标工作液混合均匀，离心取上清液50μL，加入50μL水溶液低速涡旋混匀，进样分析。
将20μL内标样品即空白基质、180μL内标工作液混合均匀，离心取上清液50μL，加入50μL水溶液低速涡旋混匀，进样分析。
将20μL待测样品(待测SD大鼠血浆)、180μL内标工作液混合均匀，离心取上清液50μL，加入50μL水溶液低速涡旋混匀，进样分析。
将20μL溶剂样品即水、180μL乙腈混合均匀，离心取上清液50μL，加入50μL水溶液低速涡旋混匀，进样分析。
将20μL双空白样品、180μL乙腈混合均匀，离心取上清液50μL，加入50μL水溶液低速涡旋混匀，进样分析。双空白样品指不添加分析物和内标的空白基质，用于考察残留。
将20μL基质效应样品、180μL乙腈混合均匀；离心取上清液50μL，与20μLneat溶液，30μL水溶液低速涡旋混匀，进样分析。基质效应样品为至少6个批次的空白基质。
将20μL回收率样品即空白基质、180μL乙腈混合均匀，离心取上清液50μL，与20μLneat溶液，30μL水溶液低速涡旋混匀，进样分析。
将20μL纯液体样品即水、180μL乙腈混合均匀，离心取上清液50μL，与20μL neat溶液，30μL水溶液低速涡旋混匀，进样分析。
三、样品检测：
将上述步骤二中处理后的校正标示样品、质控样品、内标样品、待测样品、双空白样品、溶剂样品、纯液体样品、基质效应样品以及回收率样品，分别注入液相色谱质谱联用仪中，对北五加皮苷N以及甲苯磺丁脲成分进行定量检测，其得到的相应谱图见附图1～6。
图1为溶剂样品经样品前处理后进样LC-MS/MS质谱图(上：0ng/mL北五加皮苷N/下：0ng/mL甲苯磺丁脲)；图2为空白基质样品经样品前处理后进样LC-MS/MS质谱图(上：0ng/mL北五加皮苷N/下：0ng/mL甲苯磺丁脲)；图3为内标样品经样品前处理后进样LC-MS/MS质谱图(上：0ng/mL北五加皮苷N/下：10ng/mL甲苯磺丁脲)；图4为空白基质样品(考察ULOQ样品后进样空白基质以考察残留)经样品前处理后进样LC-MS/MS质谱图(上：0ng/mL北五加皮苷N/下：0ng/mL甲苯磺丁脲)；图5为定量下限样品经样品前处理后进样LC-MS/MS质谱图(上：1ng/mL北五加皮苷N/下：10ng/mL甲苯磺丁脲)；图6为定量上限样品经样品前处理后进样LC-MS/MS质谱图(上：1000ng/mL北五加皮苷N/下：10ng/mL甲苯磺丁脲)。
其中，检测步骤中，按照下述液相色谱条件进行检测：
固定相：填料粒径为5μm，直径2.1mm，长度50mm的ACE 5C18色谱柱；
流动相：流动相为A和B的混合体系，A为甲酸乙酸铵水溶液，其中甲酸：乙酸铵(1M)：水的体积比为0.1:0.2:100；B为甲酸乙酸铵甲醇乙腈溶液，其中甲酸：乙酸铵(1M)：甲醇：乙腈的体积比为0.1:0.1:50:50；
洗脱梯度为：
0.01min，A的体积百分比为40％，B的体积百分比为60％；
0.90min，A的体积百分比为0％，B的体积百分比为100％；
1.60min，A的体积百分比为0％，B的体积百分比为100％；
1.61min，A的体积百分比为40％，B的体积百分比为60％；
2.50min，A的体积百分比为40％，B的体积百分比为60％。
进样器清洗液为：弱洗为进样器清洗液1，进样器清洗液1为50％甲醇水溶液，50％甲醇水溶液配制方法为在1L玻璃瓶中加入500mL甲醇和500mL水，混匀。
强洗为进样器清洗液2，进样器清洗液2为甲醇、乙腈、异丙醇、水按照体积比1:1:1:1混合而成。进样器清洗液2的配制方法为在1L玻璃瓶中加入250mL甲醇，250mL乙腈，250mL异丙醇，250mL水，混匀。
流速：0.40mL/min；
柱温：40℃；
自动进样器温度：4℃；
进样量：10μL。
在进样时，北五加皮苷N的保留时间大约为0.98min，甲苯磺丁脲的保留时间大约为0.75min。
其中，检测步骤中，按照下述质谱条件进行检测：
离子源：电喷雾离子源；
离子化模式：正离子模式；
分辨力模式为Unit；
碰撞气、气帘气、雾化气、辅助气1和辅助气2均为高纯氮气；
喷雾电压5500V。
四、回归和数据处理
回归模型为y＝ax+b,线性回归，权重因子1/x2，y为分析物与内标的峰面积比，x为校正标示样中分析物的浓度。
计算软件为Analyst 1.6.3和Microsoft Office 2016(or other version)，所有浓度值保留3位有效数字，％Bias和％CV保留到小数点后1位。
分析物：北五加皮苷N；
基质：SD大鼠血浆(肝素钠为抗凝剂)；
校正曲线范围：1.00ng/mL～1000ng/mL；
定量下限：1.00ng/mL；
线性范围：1.00ng/mL～1000ng/mL。
本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种HPLC-MS-MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量的方法，其特征在于，包
括以下步骤：
步骤一、样品制备：
制备校正标示样品：称量一定量的北五加皮苷N，溶解于二甲基亚砜溶液中，得到1.00mg/mL北五加皮苷N储备液；取1.00mg/mL北五加皮苷N储备液，以50%乙腈水溶液为溶剂，配制北五加皮苷N20.0~20000ng/mL梯度浓度的校正标示工作液；分别取各浓度校正标示工作液，用空白基质稀释，得到校正标示样品；
制备质控样品：称量一定量的北五加皮苷N，溶解于二甲基亚砜溶液中，得到1.00mg/mL北五加皮苷N储备液；取1.00mg/mL北五加皮苷N储备液，以50%乙腈水溶液为溶剂，配制北五加皮苷N20.0~15000ng/mL梯度浓度的质控工作液；分别取各浓度质控工作液，用空白基质稀释，得到质控样品；
步骤二、样品处理：
分别向校正标示样品、质控样品、内标样品以及待测SD大鼠血浆中加入甲苯磺丁脲内标工作液稀释，分别离心取上清液，然后再分别将上清液用超纯水溶液稀释；
分别向空白基质和溶剂样中加入乙腈稀释，分别离心取上清液，然后再分别将上清液用超纯水溶液稀释；
步骤三、样品检测：
将上述步骤二中处理后的校正标示样品、质控样品、内标样品、待测SD大鼠血浆、空白基质和溶剂样分别注入液相色谱质谱联用仪中，对北五加皮苷N以及甲苯磺丁脲成分进行定量检测，通过回归和数据处理获得SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量；
其中，按照下述液相色谱条件进行检测：
色谱柱：填料粒径为5μm，直径2.1mm，长度50mm的ACE 5C18色谱柱；
流动相：流动相为A和B的混合体系，A为甲酸乙酸铵水溶液，其中甲酸：1M乙酸铵：水 的体积比为0.1:0.2:100；B为甲酸乙酸铵甲醇乙腈溶液，其中甲酸：1M乙酸铵：甲醇：乙腈 的体积比为0.1:0.1:50:50；
洗脱梯度为：
0.01min，A的体积百分比为40％，B的体积百分比为60％；
0.90min，A的体积百分比为0％，B的体积百分比为100％；
1.60min，A的体积百分比为0％，B的体积百分比为100％；
1.61min，A的体积百分比为40％，B的体积百分比为60％；
2.50min，A的体积百分比为40％，B的体积百分比为60％。
2.根据权利要求1所述的HPLC-MS-MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量的方法，其特征在于，所述步骤一中，制备校正标示样品和质控样品所采用空白基质稀释的倍数均为20倍。
3.根据权利要求1所述的HPLC-MS-MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量的方法，其特征在于，所述步骤二中，采用的甲苯磺丁脲内标工作液的浓度为10.0ng/mL；利用其对校正标示样品、质控样品、内标样品以及待测SD大鼠血浆进行稀释的倍数为20倍；采用超纯水溶液稀释的倍数为2倍；
向空白基质和溶剂样中加入乙腈稀释的倍数为20倍；采用超纯水溶液稀释的倍数为2倍。
4.根据权利要求1所述的HPLC-MS-MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量的方法，其特征在于，所述步骤一中，以北五加皮苷N为溶质进行配制样品采用的是含有白五加皮苷N的二甲基亚砜溶液；所述白五加皮苷N在二甲基亚砜溶液中的浓度为1.00mg/mL。
5.根据权利要求1所述的HPLC-MS-MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量的方法，其特征在于，所述步骤三中，所述液相色谱的进样器清洗液为：弱洗采用50％甲醇水溶液，强洗采用甲醇、乙腈、异丙醇、水按照体积比1:1:1:1混合而成。
6.根据权利要求1所述的HPLC-MS-MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量的方法，其特征在于，所述步骤三中，按照下述液相色谱条件进行检测：
流速：0.40mL/min；
柱温：40℃；
自动进样器温度：4℃；
进样量：10μL。
7.根据权利要求1所述的HPLC-MS-MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量的方法，其特征在于，所述步骤三中，按照下述质谱条件进行检测：
离子源：电喷雾离子源；
离子化模式：正离子模式；
分辨力模式为Unit；
碰撞气、气帘气、雾化气、辅助气1和辅助气2均为高纯氮气；
喷雾电压5500V。
8.根据权利要求1所述的HPLC-MS-MS法测定SD大鼠血浆中北五加皮苷N成分含量的方法，其特征在于，所述步骤三中，按照下述回归和数据处理方法：
回归模型为y＝ax+b,线性回归，权重因子1/x2，y为分析物与内标的峰面积比，x为校正标示样中分析物的浓度；
计算软件为Analyst 1 .6.3和Microsoft Office 2016，所有浓度 值保留3位有效数字，％Bias和％CV保留到小数点后1位；
分析物：北五加皮苷N；
基质：SD大鼠血浆，以肝素钠为抗凝剂；
校正曲线范围：1.00ng/mL~1000ng/mL；
定量下限：1.00ng/mL；
线性范围：1.00ng/mL~1000ng/mL。
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