CN112730706A - 一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种高通量液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物样本中三甲胺、氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐、左旋肉碱和咪唑丙酸的方法。本发明方法能一次检测血清、血浆和尿样中的三甲胺、氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐、左旋肉碱、和咪唑丙酸7种物质，比以往技术增加了三甲胺和咪唑丙酸。生物样本前处理简单，分析时间短，易于临床推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法，属于临床生物样本检测技术领域。
背景技术
心血管病(cardiovascular disease，CVD)严重威胁人类健康，目前在中国的患病率和死亡率都持续上升，患病人数约3.0亿，其死亡率居各病因首位，占居民疾病死亡构成的40％以上。随着经济社会的发展，国民生活方式也发生了巨大改变，在居民不健康生活方式盛行的背景下，国民CVD危险因素普遍暴露，致使对CVD早预防、早发现、早治疗变的尤为重要。
已经发现体内氧化三甲胺及其相关代谢物的含量水平是识别和治疗CVD疾病进程的重要指标，准确测定其含量有助于完善CVD风险评估体系，为临床治疗疾病提供重要依据。
目前，申请号为202010024358.3的中国专利公开了“液相色谱串联质谱检测新型心血管疾病风险标志物的方法”，该发明公开了一种测定5种小分子(氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱)的液相串联质谱方法，但检测物质相对不全。申请号为201910274765.7的中国专利公开了“一种试剂盒”，该发明公开一种测定血浆的试剂盒，但仅测氧化三甲胺一种物质。申请号为201811068542.7的中国专利公开了“一种测定小分子生物标志物的方法”，该发明公开了“一种测定11种小分子物质的液相串联质谱方法”，但样本前处理复杂，不适合临床推广。申请号为201710502265.5的中国专利公开了“一种氧化三甲胺定量检测试剂盒及方法”，该发明公开了一种测定氧化三甲胺的液相串联质谱方法，但仅测氧化三甲胺一种物质。
综上所述可知，关于心血管疾病风险标志物的检测方法主要不足在于：
1、多数检测方法检测物质种类不全，无法满足临床需要。
2、生物样本前处理过程复杂，难以推广到临床应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种超高效液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物样本中的三甲胺、氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐、左旋肉碱和咪唑丙酸的方法。
本发明所要解决的技术问题采取以下技术方案来实现：
一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法，包括下列步骤：
步骤S1：标准溶液的配制
(a)标准内标液的配制
分别称取氧化三甲胺，胆碱、肌酐、甜菜碱和左旋肉碱内标适量，用50％乙腈水溶液溶解，配制各内标储备液，再用50％乙腈水溶液稀释配制1-10μM的混合内标工作溶液；
(b)标准曲线的配制
分别称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐、左旋肉碱、和咪唑丙酸适量，用50％乙腈水溶液溶解，配制单标标品储备溶液，其中三甲胺为已知浓度的储备溶液，再使用50％乙腈水溶液配制上述7种物质的混合标准品工作溶液；
使用50％乙腈水溶液稀释混合标准工作溶液，配制标准曲线，使其浓度范围分别为：TMA 0.098-25.0μg/mL，TMAO 0.019-12.5μM，Choline 0.019-12.5μM，Betaine 0.039-12.5μM，Creatinine 0.019-12.5μM，L-Carnitine 0.039-12.5μM，Imidazolepropionicacid 0.0195-1.5625μM；
(c)质控品的配制
分别称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐、左旋肉碱、和咪唑丙酸适量，用50％乙腈水溶液溶解，配制得到质控品储备溶液，其中三甲胺为已知浓度液体储备液，用50％乙腈水溶液稀释质控储备溶液，分别配制得到低浓度、中浓度和高浓度三个浓度水平的质控工作溶液；
取20-30份生物样本等量体积混合，制得混合QC，用移液枪移取20μLQC样本，加入不超过总体积10％的混合质控工作溶液，制得低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)和高浓度质控品(HQC)；每个浓度点平行制备3份，放-80℃冰箱保存备用；
步骤S2：质控样本的前处理
质控品从-80℃冰箱取出后在低温操作台上解冻，吸取5-10μL内标工作液加入其中，然后吸取一定量蛋白沉淀试剂加入，振荡离心取上清液进质谱分析；
步骤S3：生物样本的前处理
样本在低温环境解冻后，振荡离心，用移液枪吸取10-30μL样本于1.5mL离心管中，再吸取5-10μL的内标工作溶液加入其中，最后吸取50-100μL蛋白沉淀试剂加入其中，振荡离心取上清液进质谱分析；
步骤S4：质控品及待测样本的检测
使用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪对步骤S2与步骤S3中处理得到的质控品和待测样本进行检测，用内标法计算样本浓度，以标准溶液中各物质的浓度为横坐标，以标准溶液中各物质的峰面积与对应内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，拟合得到标准曲线方程，将待测物样本中峰面积比值代入方程，计算得到样本中各待测物浓度。
作为优选实例，所述生物样本包括人的血清、血浆和尿液。
作为优选实例，所述内标为同位素内标，分别是氧化三甲胺-d9，胆碱-d9、肌酐-d3、甜菜碱-d11和左旋肉碱-d3。
作为优选实例，使用蛋白质沉淀剂作为内标工作液溶剂，蛋白沉淀剂使用纯乙腈。
作为优选实例，所述步骤S1的(c)质控品配制中，生物样本加标浓度如下表。
| 分析物 | LQCμM | MQCμM | HQCμM |
| 氧化三甲胺 | 0.5 | 1 | 3 |
| 胆碱 | 0.5 | 1 | 3 |
| 甜菜碱 | 0.5 | 1 | 3 |
| 肌酐 | 0.5 | 1 | 3 |
| 左旋肉碱 | 0.5 | 1 | 3 |
| 咪唑丙酸 | 0.02 | 0.1 | 0.5 |
| 三甲胺 | 0.5μg/mL | 1μg/mL | 3μg/mL |
作为优选实例，所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱以所使用的分析色谱柱为ACQUITY UPLCBEH HILIC 2.1*100mm，柱温为45℃，进样体积2-10μL。
作为优选实例，所述分析色谱柱的流动相为含10mM甲酸铵0.1％甲酸水溶液和含10mM甲酸铵0.1％甲酸95％乙腈溶液，流速为0.4mL/min，液相采用梯度洗脱方式，流动相A和流动相B比列变化如下表。
| Time(min) | A％ | B％ |
| 0 | 0 | 100 |
| 0.5 | 0 | 100 |
| 1.5 | 15 | 85 |
| 4 | 30 | 70 |
| 5 | 50 | 50 |
| 5.7 | 60 | 40 |
| 6 | 0 | 100 |
| 8 | 0 | 100 |
作为优选实例，所述质谱采集条件如下：离子源：电喷雾离子源；毛细管电压：1.5-3.0KV；去溶剂温度400-550℃；去溶剂气800-1000L/Hr；检测方式：正离子检测。
作为优选实例，所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪检测采用电喷雾离子源(ESI)和多重反应监测(MRM)扫描模式，具体的离子对如下表。
| 分析物 | 离子对 | 碰撞能量(v) |
| TMA | 60.1/44.3 | 36 |
| TMAO | 76.1/58.7 | 24 |
| Choline | 104.2/60.1 | 30 |
| L-Carnitine | 162.1/102.9 | 10 |
| Betaine | 118.1/58.9 | 33 |
| Creatinine | 114.0/44.1 | 5 |
| Imidazolepropionicacid | 141.10/81.06 | 18 |
| TMAO-d9 | 85.1/66.1 | 20 |
| Choline-d9 | 113.1/69.1 | 16 |
| Creatinine-d3 | 117.0/47.1 | 14 |
| Betaine-d11 | 129.168.1 | 18 |
| L-Carnitine-d3 | 165.1.103.0 | 18 |
本发明的有益效果是：
1、本发明方法能一次检测血清、血浆和尿样中的三甲胺、氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐、左旋肉碱、和咪唑丙酸7种物质，比以往技术增加了三甲胺和咪唑丙酸。
2、生物样本前处理简单，分析时间短，易于临床推广使用。
附图说明
图1为本发明具体实施方式的总色谱图；
图2为本发明具体实施方式中三甲胺的色谱图；
图3为本发明具体实施方式中氧化三甲胺的色谱图；
图4为本发明具体实施方式中胆碱的色谱图；
图5为本发明具体实施方式中甜菜碱的色谱图；
图6为本发明具体实施方式中肌酐的色谱图；
图7为本发明具体实施方式中左旋肉碱的色谱图；
图8为本发明具体实施方式中咪唑丙酸的色谱图。
具体实施方式
一、为了进一步使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施案列，对本发明进行进一步详细说明，但本发明并不限于此。
(一)、标准溶液的配制
(a)、标准内标溶液的配制
使用十万分子一天平分别精确称取氧化三甲胺-d9，胆碱-d9、肌酐-d3、甜菜碱-d11和左旋肉碱-d3适量于1.8mL进样小瓶中，用50％乙腈水溶液溶解，配制得浓度为20mM的内标储备液，再用50％乙腈水溶液稀释配制得到5μM和0.5μM浓度内标混合工作溶液。
(b)、标准曲线的配制
使用十万分之一的分析天平精密称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐、左旋肉碱、和咪唑丙酸适量于1.8mL进样小瓶中，用移液枪移取1mL50％乙腈水溶液溶解各单标，配制得20mM的单标储备液，三甲胺为100μg/mL的储备溶液。再用50％乙腈水溶液稀释单标储备液配制得到25μM的混标工作溶液。
取100μL混标工作溶液用50％乙腈水溶液按照以下方式稀释：1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64,1/320,1/640，共得到9点浓度点。
将9个浓度点各取30μL分别与30μL的0.5μM的内标溶液1:1混合，最终得到含内标的9个点标准曲线，具体值如下：
(c)、质控品的配制
使用十万分之一的分析天平精密称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐、左旋肉碱、和咪唑丙酸适量，用50％乙腈水溶液溶解，配制得到质控品储备溶液，三甲胺为已知浓度液体储备液。用50％乙腈水溶液稀释质控储备溶液，分别配制得到低浓度、中浓度和高浓度三个浓度水平的质控工作溶液。
取20-30份生物样本等量一定体积混合，制得混合QC，用移液枪移取20μLQC样本，加入不超过总体积10％的混合质控工作溶液，制得低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)和高浓度质控品(HQC)，每个质控水平平行制备3份。具体浓度如下表：
(二)、质控样本的前处理
质控品从-80℃冰箱取出后在低温操作台上解冻，吸取5μL的5μM内标工作液加入其中，最后吸取一定量蛋白沉淀试剂加入，振荡离心取上清液进质谱分析
(三)、生物样本的前处理
样本在低温环境解冻后，振荡离心，用移液枪吸取20μL样本于1.5mL离心管中，再吸取5μL的5μM内标工作溶液加入其中，最后吸取75μL乙腈加入其中，振荡离心取上清液进质谱分析。
(四)、质控样品\待检测样品的计算
使用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪对上述处理得到的质控品和待测样本进行检测，用内标法计算样本浓度，以标准溶液中各物质的浓度为横坐标，以标准溶液中各物质的峰面积与对应内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，拟合得到标准曲线方程y＝a*x+b，将待测物样本中峰面积比值代入方程，计算得到样本中各待测物浓度。
所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱检测参数如下：
所述质谱检测的多重反应监测参数如下：
| Compound | Q1 | Q3 | Cone(v) | CE(v) |
| TMA | 60.1 | 44.3 | 16 | 36 |
| TMAO | 76.1 | 58.7 | 18 | 24 |
| Choline | 104.2 | 60.1 | 30 | 30 |
| L-Carnitine | 162.1 | 102.9 | 98 | 10 |
| Betaine | 118.1 | 58.9 | 2 | 33 |
| Creatinine | 114.0 | 44.1 | 32 | 5 |
| Imidazolepropionicacid | 141.10 | 81.06 | 30 | 18 |
| TMAO-d9 | 85.1 | 66.1 | 12 | 20 |
| Choline-d9 | 113.1 | 69.1 | 70 | 16 |
| Creatinine-d3 | 117.0 | 47.1 | 32 | 14 |
| Betaine-d11 | 129.1 | 68.1 | 2 | 18 |
| L-Carnitine-d3 | 165.1 | 103.0 | 2 | 18 |
所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪的流动相梯度洗脱程序参数如下表：
| Time(min) | A％ | B％ |
| 0 | 0 | 100 |
| 0.5 | 0 | 100 |
| 1.5 | 15 | 85 |
| 4 | 30 | 70 |
| 5 | 50 | 50 |
| 5.7 | 60 | 40 |
| 6 | 0 | 100 |
| 8 | 0 | 100 |
二、方法学验证结果
(一)、该方法的线性范围和检出限定量限：
将上述配制的标准曲线浓度，按本实施例测定条件进行测定，得到三甲胺、氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐、左旋肉碱和咪唑丙酸的线性范围和检出定量限如下：
(二)、该方法的精密度
按质控品的配制方法配制低、中、高3种浓度质控样本进行精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3次，精密度如下：
(三)、该方法的精回收率
按质控品的配制方法配制低、中、高3种浓度质控样本进行回收率实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3次，回收率如下：
综上实验验证，本实施例的检测限，定量限，线性，精密度和回收率都符合实要求，使用本发明方法检测生物样本能够得到准确的结果。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法，其特征在于，包括下列步骤：
步骤S1：标准溶液的配制
(a)标准内标液的配制
分别称取氧化三甲胺，胆碱、肌酐、甜菜碱和左旋肉碱内标适量，用50％乙腈水溶液溶解，配制各内标储备液，再用50％乙腈水溶液稀释配制1-10μM的混合内标工作溶液；
(b)标准曲线的配制
分别称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐、左旋肉碱、和咪唑丙酸适量，用50％乙腈水溶液溶解，配制单标标品储备溶液，其中三甲胺为已知浓度的储备溶液，再使用50％乙腈水溶液配制上述7种物质的混合标准品工作溶液；
使用50％乙腈水溶液稀释混合标准工作溶液，配制标准曲线，使其浓度范围分别为：TMA 0.098-25.0μg/mL，TMAO 0.019-12.5μM，Choline 0.019-12.5μM，Betaine 0.039-12.5μM，Creatinine 0.019-12.5μM，L-Carnitine 0.039-12.5μM，Imidazolepropionic acid0.0195-1.5625μM；
(c)质控品的配制
分别称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐、左旋肉碱、和咪唑丙酸适量，用50％乙腈水溶液溶解，配制得到质控品储备溶液，其中三甲胺为已知浓度液体储备液，用50％乙腈水溶液稀释质控储备溶液，分别配制得到低浓度、中浓度和高浓度三个浓度水平的质控工作溶液；
取20-30份生物样本等量体积混合，制得混合QC，用移液枪移取20μLQC样本，加入不超过总体积10％的混合质控工作溶液，制得低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)和高浓度质控品(HQC)；每个浓度点平行制备3份，放-80℃冰箱保存备用；
步骤S2：质控样本的前处理
质控品从-80℃冰箱取出后在低温操作台上解冻，吸取5-10μL内标工作液加入其中，然后吸取一定量蛋白沉淀试剂加入，振荡离心取上清液进质谱分析；
步骤S3：生物样本的前处理
样本在低温环境解冻后，振荡离心，用移液枪吸取10-30μL样本于1.5mL离心管中，再吸取5-10μL的内标工作溶液加入其中，最后吸取50-100μL蛋白沉淀试剂加入其中，振荡离心取上清液进质谱分析；
步骤S4：质控品及待测样本的检测
使用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪对步骤S2与步骤S3中处理得到的质控品和待测样本进行检测，用内标法计算样本浓度，以标准溶液中各物质的浓度为横坐标，以标准溶液中各物质的峰面积与对应内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，拟合得到标准曲线方程，将待测物样本中峰面积比值代入方程，计算得到样本中各待测物浓度。
2.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法，其特征在于，所述生物样本包括人的血清、血浆和尿液。
3.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法，其特征在于，所述内标为同位素内标，分别是氧化三甲胺-d9，胆碱-d9、肌酐-d3、甜菜碱-d11和左旋肉碱-d3。
4.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法，其特征在于，使用蛋白质沉淀剂作为内标工作液溶剂，蛋白沉淀剂使用纯乙腈。
5.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法，其特征在于，所述步骤S1的(c)质控品配制中，生物样本加标浓度如下表。
6.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱以所使用的分析色谱柱为ACQUITYUPLCBEH HILIC 2.1*100mm，柱温为45℃，进样体积2-10μL。
7.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法，其特征在于，所述分析色谱柱的流动相为含10mM甲酸铵0.1％甲酸水溶液和含10mM甲酸铵0.1％甲酸95％乙腈溶液，流速为0.4mL/min，液相采用梯度洗脱方式，流动相A和流动相B比列变化如下表。
8.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法，其特征在于，所述质谱采集条件如下：离子源：电喷雾离子源；毛细管电压：1.5-3.0KV；去溶剂温度400-550℃；去溶剂气800-1000L/Hr；检测方式：正离子检测。
9.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪检测采用电喷雾离子源(ESI)和多重反应监测(MRM)扫描模式，具体的离子对如下表。
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|---|---|---|---|---|
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| CN114942276A (zh) * | 2021-06-18 | 2022-08-26 | 上海阿趣生物科技有限公司 | 一种生物样本中氧化三甲胺及相关代谢物的分析方法及其应用 |
| CN115047087A (zh) * | 2022-03-30 | 2022-09-13 | 武汉迈特维尔生物科技有限公司 | 一种同时检测血清样本中氧化三甲胺类物质的方法 |
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- 2021-02-04 CN CN202110156680.6A patent/CN112730706A/zh active Pending
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