CN110007023B - 鱼体内磺胺类药物的高分辨质谱筛查方法及其与蛋白大分子相互作用的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明鱼体内磺胺类药物的高分辨质谱筛查方法及其与蛋白大分子相互作用的分析方法，筛查方法通过孵育得到待测样液，采用超高效液相色谱‑四极杆飞行时间质谱，用优化后的色谱质谱条件对BSA标准溶液与待测样液进行检测，通过计算得到部分磺胺类药物与鱼体内蛋白大分子存在相互作用；分析方法通过优化提取溶液的成分、除水剂和吸附剂的种类、用量以最佳效率除去样品中的杂质，将磺胺类药物提取到有机相中，消除了蛋白大分子与磺胺类药物之间的相互作用，采用优化后的色谱质谱条件能对磺胺类药物A和BSA的含量进行定量检测，进而提高鱼类样品中磺胺类药物的回收率，达到准确定量的目的，为监管鱼类食品质量安全具有重要意义。

Description

鱼体内磺胺类药物的高分辨质谱筛查方法及其与蛋白大分子 相互作用的分析方法

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体为鱼体内磺胺类药物的高分辨质谱筛查方法及其与蛋白大分子相互作用的分析方法

背景技术

近年来鱼类食品药物残留超标问题频频发生。磺胺类药物进入鱼体后，较均匀地分布于各内脏组织及血液中，磺胺类药物在鱼血浆中一部分以游离状态存在，另一部分则与血浆白蛋白结合，在定量过程中，结合态磺胺类药物难以测定，从而导致磺胺类药物总量的测定出现误差。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供鱼体内磺胺类药物的高分辨质谱筛查方法及其与蛋白大分子相互作用的分析方法，分辨率高、定性与定量结果准确、灵敏度高、质量精度高，提高了鱼类样品中磺胺类药物的回收率，为监管鱼类食品质量安全具有重要意义。

本发明是通过以下技术方案来实现：

鱼体内磺胺类药物与蛋白大分子相互作用的分析方法，包括以下步骤，

步骤1，将BSA标准溶液和磺胺类药物标准溶液A加入乙酸铵缓冲液A中混合均匀得到混合体系A；

其中BSA标准溶液与磺胺类药物标准溶液A的浓度比为1:3；BSA标准溶液的溶剂为乙酸铵缓冲液B，磺胺类药物标准溶液A的溶剂为甲醇；

所述乙酸铵缓冲液A和乙酸铵缓冲液B的浓度均为0.01mol/L，并调节乙酸铵缓冲液A和乙酸铵缓冲液B的pH均至7.4；

步骤2，将混合体系A在37℃下孵育30～120min后得到待测样液；

步骤3，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱，在正离子模式下对BSA标准溶液与待测样液进行检测；

检测参数包括色谱参数和质谱参数，

所述色谱参数为：流动相为乙腈水溶液，其中水和乙腈的体积比为95:5；进样量为2～10μL；进样速度为0.05～0.2mL/min；

所述质谱参数为：毛细管电压4.0kV，喷嘴电压1.0kV，干燥气温度150.0℃，干燥气流量11.0L/min，雾化气压力20.0psi，鞘气温度180.0℃，鞘气流量9.0L/min，碎裂电压150v，雾化气、干燥气和鞘气为氮气；

步骤4，检测BSA与磺胺类药物结合前后的质量数位移，计算BSA与磺胺类药物结合前后同一带电数下复合物及BSA的质荷比差值，若质荷比差值和带电荷数的乘积S₁与磺胺类药物A的质荷比M₁满足如下关系时，则可断定BSA与磺胺类药物存在相互作用；

优选的，步骤1采用氨水调节乙酸铵缓冲液A和乙酸铵缓冲液B的pH均至7.4。

优选的，步骤1通过震荡与涡旋将加入乙酸铵缓冲液中的BSA标准溶液和磺胺类药物标准溶液A混合均匀。

优选的，步骤1中量取500μL浓度为100μmol/L的BSA标准溶液，加入75μL浓度为2mmol/L的磺胺类药物标准溶液A，用乙酸铵缓冲液定容至10mL，混合均匀得到混合体系A。

优选的，所述的磺胺类药物为磺胺甲噻二唑或磺胺多辛。

鱼体内磺胺类药物的高分辨质谱筛查方法，包括以下步骤，

步骤1，称取鱼样品1.0～5g，加入BSA和磺胺类药物A，用乙酸铵缓冲液C定容至1mL，混合均匀得到混合体系B；

其中，BSA的浓度为2～5μmol/L，BSA与磺胺类药物B的浓度比为1:3，乙酸铵缓冲液C的浓度为0.01mol/L，并调节乙酸铵缓冲液C的pH至7.4；；

步骤2，将混合体系B在37℃下孵育30～120min得到混合体系C，向混合体系C中加入甲醇2.0～3.0mL，用经乙酸酸化的乙腈水溶液定容至15mL，混合均匀得到混合体系D，其中乙酸酸化的乙腈水溶液中，乙腈与水的体积比为84:16，乙酸体积占溶液体积的1％；

步骤3，向混合体系D中加入无水硫酸镁3.0～6.0g、乙酸钠1.9g和氯化钠1.5g，混合均匀后离心得到上清液A，向上清液A中加入C18 0.4g、PSA0.4g和无水硫酸镁0.1g～0.5g，混合均匀后离心得到上清液B；

步骤4，将上清液B经0.22μm滤膜过滤，将得到的样液分为两份，其中一份样液稀释100倍对磺胺类药物A进行定量检测，另一份样液直接检测BSA的含量；

其中，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱进行检测，

磺胺类药物A的检测包括色谱参数和质谱参数，

所述色谱参数为：采用正离子模式，色谱柱：Thermo Hypersil GOLD AQ柱，参数为100mm×4.6mm，5μm；柱温：35℃；流动相A为水、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸体积占混合溶液体积的0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L；流动相B为甲醇、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸体积占混合溶液体积的0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L；梯度洗脱程序为：0.0～1.0min内，流动相A的比例保持100％；1.0～7.0min内，流动相A的比例由100％线性减少至0％；7.0～15.0min内，流动相A的比例保持0％；15.0～17.0min内，流动相A的比例由0％线性增加至100％；17.0～25.0min内，流动相A的比例保持100％；流速：0.3mL/min；进样量：10.0μL；

所述质谱参数为：采用电喷雾离子源，在正离子模式下进行检测；毛细管电压4.0kV，喷嘴电压1.0kV；干燥气温度280.0℃；干燥气流量13.00L/min；雾化气压力20.0psi；鞘气温度350.0℃；鞘气流量12.0L/min；采用氮气作为雾化气、干燥气和鞘气；

BSA的检测包括色谱参数和质谱参数，

所述色谱参数为：流动相为乙腈水溶液，其中水和乙腈的体积比为95:5；进样量为2～10μL；进样速度为0.05～0.2mL/min；

所述质谱参数为：毛细管电压：4.0kV，喷嘴电压：1.0kV，干燥气温度150.0℃，干燥气流量11.0L/min，雾化气压力20.0psi，鞘气温度180.0℃，鞘气流量9.0L/min，碎裂电压：150v，雾化气、干燥气和鞘气为氮气。

进一步，步骤1、步骤2和步骤3均通过震荡和涡旋混合均匀。

进一步，步骤3的离心转速和离心时间均分别为6000～10000r/min和5～10min。

进一步，步骤1所述的鱼样品为均质后的样品。

进一步，所述的磺胺类药物为磺胺甲噻二唑或磺胺多辛。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明所提供了鱼体内磺胺类药物与蛋白大分子相互作用的分析方法，采用浓度为0.01mol/L、pH为7.4的乙酸铵缓冲液作为磺胺类药物与BSA混合体系的溶剂，以模拟鱼体内的生理条件，使BSA及其与磺胺类药物形成复合物的过程中保持其生物功能，模拟出磺胺类药物在鱼体内真实的结合状态；并于37℃下孵育30～120min，得到待测样液；采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱，利用优化后的色谱质谱条件，于正离子模式下对BSA标准溶液与待测样液进行检测，得到BSA与磺胺类药物结合前后的质量数位移，通过计算BSA与磺胺类药物结合前后同一带电数下复合物及BSA的质荷比差值，判断BSA与磺胺类药物是否存在相互作用；利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱可直观、高效地反映出BSA与磺胺类药物在浓度比为1:3的情况下以1:1的比例结合。BSA与鱼血清白蛋白的结构及氨基酸序列相似，故可推断出以下结论：部分磺胺类药物与鱼体内蛋白大分子存在相互作用，以结合态形式存在。

本发明鱼体内磺胺类药物的高分辨质谱筛查方法，通过优化提取溶液的成分、除水剂和固体吸附剂的种类、用量，以最佳效率除去样品中的水分、蛋白质、色谱等杂质，并将磺胺类药物提取到有机相中。该方法彻底除掉了蛋白大分子，从而消除了蛋白大分子与磺胺类药物之间的相互作用，采用优化后的色谱质谱条件能对磺胺类药物A和BSA的含量进行定量检测，进而提高鱼类样品中磺胺类药物的回收率，达到准确定量的目的，为监管鱼类食品质量安全具有重要意义。

进一步的，样品经均质后能真实反映鱼体内的药物含量，提高筛查的准确性。

附图说明

图1为本发明的BSA与磺胺甲噻二唑相互作用的质谱图。

图2为图1中质荷比为1100～1140段的放大图。

图3为本发明的BSA与磺胺甲噻二唑相互作用的去卷积图。

图4为本发明在pH为3.51时BSA与磺胺甲噻二唑解离后的质谱图。

图5为本发明d-SPE前处理法前BSA的质谱图。

图6为本发明d-SPE前处理法后BSA的质谱图。

图7为本发明采用溶剂标准曲线及基质匹配标准曲线的斜率比值评价磺胺多辛基质效应的曲线图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

鳕鱼为全世界年捕捞量最大的鱼类之一，具有重要的食用和经济价值，故本发明以鳕鱼为代表，由于BSA及其与磺胺类药物形成的复合物在离子化过程中可保持其生物功能，能模拟出磺胺类药物在鱼体内真实的结合状态，因此本发明以BSA为载体蛋白，以磺胺甲噻二唑、磺胺多辛为代表性药物，分析确定鱼体内蛋白大分子与磺胺类药物之间是否存在相互作用；并建立简单、高效的前处理技术解离磺胺类药物与蛋白大分子的相互作用，将结合态磺胺转化成游离状态，从而提高鱼肌肉中磺胺类药物的回收率，更加准确地进行定量分析，解决结合态磺胺类药物难以测定的问题。

电喷雾电离为近年来新发展的一种离子化技术，其离子化效率较高，尤其对蛋白质来说，接近100％。该技术可通过高灵敏度、高精确度的质谱图直观而高效地得到生物大分子与药物小分子是否存在相互作用，是分析磺胺类药物与鱼体内蛋白大分子相互作用的理想分析工具。d-SPE前处理方法为一种新型样品制备方法，具有可同时完成样品分离净化与浓缩、节省时间、提高检测效率、节省溶剂、重现性较好、可批量处理等优势。本发明采用d-SPE前处理法对加标鱼肉样品进行处理，通过优化前处理参数达到最佳净化效果，从而在保留磺胺类药物的同时，去除蛋白大分子，消除相互作用力进而提高鱼类样品中磺胺类药物的回收率，达到准确定量的目的，为监管鱼类食品质量安全具有重要意义。

本发明采用高分辨质谱法分析鱼体内蛋白大分子与磺胺类药物相互作用及消除方法，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法，依次包括以下内容：

1，以BSA为载体蛋白，以磺胺甲噻二唑及磺胺多辛为代表性药物，分别将两种磺胺药物与BSA孵育，利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法分别观察孵育后BSA的位移状况及磺胺药物的回收率，判断相互作用是否存在。

孵育条件具体为：量取两份500μL浓度为100μmol/L BSA溶液于两个10mL离心管中，各加入一定体积浓度为2mmol/L的磺胺甲噻二唑和一定体积浓度为2mmol/L磺胺多辛标准溶液，采用乙酸铵缓冲液定容至10mL，震荡，涡旋，混合后蛋白质与磺胺类药物的浓度比均为1:3，放置于37℃恒温水浴锅中孵育30～120min后进行检测。

判断蛋白大分子与磺胺类药物相互作用的途径包括以下两种：第一，卸除色谱柱，通过直接检测蛋白大分子与两种磺胺药物结合前后离子峰簇响应值的降幅、同一带电数下复合物及蛋白质的质荷比差值，来判断两者之间是否存在相互作用；第二，利用色谱柱的保留与分离作用，通过检测药物小分子在加入蛋白大分子前后量的浓度变化，来确认第一种方式下药物小分子与蛋白大分子之间有无相互作用的结论是否正确。

色谱质谱分析条件

利用HPLC-Q-TOF-MS法，采用电喷雾离子源，主要仪器：美国Angilent公司的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，配有电喷雾离子源。在正离子模式下对BSA标准溶液及其经孵育后的样液原液进行检测，待测样品不采用色谱柱分离，直接由流动相送至质谱。

采用以下色谱质谱参数对BSA标准溶液及其经孵育后的样液原液进行检测：流动相采用乙腈水溶液，水和乙腈的体积比为95:5，进样量为2～10μL；进样速度为0.05～0.2mL/min；质谱条件为：毛细管电压：4.0kV，喷嘴电压：1.0kV，干燥气温度150.0℃，干燥气流量11.0L/min，雾化气压力20.0psi，鞘气温度180.0℃，鞘气流量9.0L/min，碎裂电压：150v。采用氮气作为雾化气、干燥气及鞘气。

采用以下色谱质谱参数对磺胺甲噻二唑、磺胺多辛进行定量分析：

将孵育后的样液稀释100倍，根据以下条件进行检测：采用正离子模式，色谱柱：Thermo Hypersil GOLD AQ柱，参数为100mm×4.6mm，5μm；柱温：35℃；流动相A为水、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸体积占混合溶液体积的0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L，流动相B为甲醇、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸体积占混合溶液体积的0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L；梯度洗脱程序：0.0～1.0min，100％A，1.0～7.0min，100％～0％A，7.0～15.0min，0％A，15.0～17.0min，0％～100％A，17.0～25.0min，100％A；流速：0.3mL/min；进样量：10.0μL；质谱条件：采用电喷雾离子源，在正离子模式下进行检测；毛细管电压4.0kV，喷嘴电压1.0kV；干燥气温度280.0℃；干燥气流量13.00L/min；雾化气压力20.0psi；鞘气温度350.0℃；鞘气流量12.0L/min。采用氮气作为雾化气、干燥气及鞘气。

2，利用冰乙酸溶液将蛋白大分子与磺胺药物混合溶液的pH值调整至酸性，以初步解离蛋白大分子与磺胺药物的相互作用，为下一步消除该相互作用提供理论基础，其中，冰乙酸溶液中冰乙酸的体积与溶液总体积的比值为0.1％。

解离过程具体为：量取500μL浓度为100μmol/L BSA溶液及10μL冰乙酸于10mL离心管中，分别加入一定体积浓度为2mmol/L的磺胺甲噻二唑和一定体积浓度为2mmol/L的磺胺多辛标准溶液，采用pH为7.4的乙酸铵缓冲溶液定容至10mL，震荡，涡旋，混合后测得溶液的pH为3.51，允许存在±0.1的误差，蛋白质与磺胺类药物的浓度比为1:3。放置于37℃恒温水浴锅中孵育30～120min后进行检测。该pH条件下，BSA与两种磺胺药物均不能发生结合。

3，建立一种d-SPE前处理法，通过优化提取溶液的成分、除水剂和固体吸附剂的种类、用量，去除体系中的蛋白质，将磺胺药物提取到有机相中，从而消除蛋白大分子与磺胺类药物之间的相互作用。

d-SPE前处理法具体为：称取经均质鱼肌肉样品1.0～5.0g，量取500μL浓度为100μmol/L的BSA溶液、一定体积浓度为2mmol/L的磺胺甲噻二唑标准溶液或一定体积浓度为2mmol/L的磺胺多辛标准溶液于50mL离心管中，并采用乙酸铵缓冲液定容至1mL，震荡，涡旋，混合后蛋白质与磺胺类药物的浓度比为1:3。放置于37℃恒温水浴锅中孵育30～120min，于孵育后的样品中加入2.0～3.0mL甲醇，采用经乙酸酸化的乙腈水溶液定容至15mL，震荡，涡旋，其中，乙酸酸化的乙腈水溶液中，乙腈的体积和水的体积比为84:16，乙酸体积占乙酸酸化的乙腈水溶液体积的1％；加入无水硫酸镁3.0～6.0g、乙酸钠1.9g及氯化钠1.5g，震荡，涡旋，于6000～10000r/min离心5～10min，取上清液至试管中，加入C180.4g、PSA 0.4g及0.1～0.5g无水硫酸镁，涡旋震荡，于6000～10000r/min离心5～10min，上清液经0.22μm滤膜过滤，将得到的样液分为两份，一份稀释100倍对磺胺甲噻二唑或磺胺多辛进行定量检测，另一份直接上机，检测BSA的含量；

其中，磺胺类药物B的检测条件为：采用正离子模式，色谱柱：Thermo HypersilGOLD AQ柱，参数为100mm×4.6mm，5μm；柱温：35℃；流动相A为水、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸的体积比与混合溶液的体积比为0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L，流动相B为甲醇、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸的体积占混合溶液体积的0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L；梯度洗脱程序：0.0～1.0min，100％A，1.0～7.0min，100％～0％A，7.0～15.0min，0％A，15.0～17.0min，0％～100％A，17.0～25.0min，100％A；流速：0.3mL/min；进样量：10.0μL；质谱条件：采用电喷雾离子源，在正离子模式下进行检测；毛细管电压4.0kV，喷嘴电压1.0kV；干燥气温度280.0℃；干燥气流量13.00L/min；雾化气压力20.0psi；鞘气温度350.0℃；鞘气流量12.0L/min。采用氮气作为雾化气、干燥气和鞘气；

BSA的检测参数为：流动相为乙腈水溶液，其中水和乙腈的体积比为95:5，进样量为2～10μL；进样速度为0.05～0.2mL/min；质谱条件为：毛细管电压：4.0kV，喷嘴电压：1.0kV，干燥气温度150.0℃，干燥气流量11.0L/min，雾化气压力20.0psi，鞘气温度180.0℃，鞘气流量9.0L/min，碎裂电压：150v，雾化气、干燥气和鞘气为氮气。

标准溶液的配制

配置0.01mol/L乙酸铵溶液，采用氨水调节pH至7.4，得到乙酸铵缓冲溶液待用。称取0.067g BSA标准品，采用乙酸铵缓冲液定容至10mL，配制成浓度为100μmol/L的BSA溶液，储存于4℃下备用。分别称取

0.054g磺胺甲噻二唑、0.054g磺胺多辛标准品，采用甲醇定容至100mL，配制成浓度为2mmol/L的溶液；同时分别称取0.01g磺胺甲噻二唑和0.01g磺胺多辛标准品，采用含甲酸铵、甲酸和甲醇的混合溶液定容至100mL，配制成浓度为100μg/mL的溶液，均储存于-20℃下待用，其中的混合溶液中，甲酸的体积为混合溶液体积的0.2％，甲酸铵在混合溶液中的浓度为4.0mmol/L。

实施例1

待测样液a的制备

量取两份500μL浓度为100μmol/L BSA溶液于两个10mL离心管中，各加入75μL浓度为2mmol/L的磺胺甲噻二唑和75μL浓度为2mmol/L磺胺多辛标准溶液，采用乙酸铵缓冲液定容至10mL，震荡，涡旋，混合后蛋白质与磺胺类药物的浓度比均为1:3，放置于37℃恒温水浴锅中孵育30min后进行检测。

d-SPE前处理法制备待测样液b

称取经均质鱼肌肉样品1.0g，量取200μL浓度为100μmol/L的BSA溶液、30μL浓度为2mmol/L的磺胺甲噻二唑标准溶液于50mL离心管中，并采用乙酸铵缓冲液定容至1mL，震荡，涡旋，混合后蛋白质与磺胺类药物的浓度比为1:3。放置于37℃恒温水浴锅中孵育30min，于孵育后的样品中加入2.0mL甲醇，采用经乙酸酸化的乙腈水溶液定容至15mL，震荡，涡旋，其中，乙酸酸化的乙腈水溶液中，乙腈的体积和水的体积比为84:16，乙酸体积占乙酸酸化的乙腈水溶液体积的1％；加入无水硫酸镁3.0g、乙酸钠1.9g及氯化钠1.5g，震荡涡旋，于6000r/min离心10min，取上清液至试管中，加入C18 0.4g、PSA 0.4g及0.1g无水硫酸镁，涡旋，震荡，于6000r/min离心10min，上清液经0.22μm滤膜过滤，将得到的样液分为两份，一份稀释100倍对磺胺甲噻二唑进行定量检测，另一份直接上机，检测BSA的含量。

实施例2

待测样液c的制备

量取两份500μL浓度为100μmol/L BSA溶液于两个10mL离心管中，各加入75μL浓度为2mmol/L的磺胺甲噻二唑和75μL浓度为2mmol/L磺胺多辛标准溶液，采用乙酸铵缓冲液定容至10mL，震荡，涡旋，混合后蛋白质与磺胺类药物的浓度比均为1:3，放置于37℃恒温水浴锅中孵育75min后进行检测。

d-SPE前处理法制备待测样液d

称取经均质鱼肌肉样品3.0g，量取300μL浓度为100μmol/L的BSA溶液、45μL浓度为2mmol/L的磺胺多辛标准溶液于50mL离心管中，并采用乙酸铵缓冲液定容至1mL，震荡，涡旋，混合后蛋白质与磺胺类药物的浓度比为1:3。放置于37℃恒温水浴锅中孵育75min，于孵育后的样品中加入2.5mL甲醇，采用经乙酸酸化的乙腈水溶液定容至15mL，震荡，涡旋，其中，乙酸酸化的乙腈水溶液中，乙腈的体积和水的体积比为84:16，乙酸体积占乙酸酸化的乙腈水溶液体积的1％；加入无水硫酸镁4.0g、乙酸钠1.9g及氯化钠1.5g，震荡，涡旋，于10000r/min离心5min，取上清液至试管中，加入C18 0.4g、PSA 0.4g及0.3g无水硫酸镁，涡旋震荡，于10000r/min离心5min，上清液经0.22μm滤膜过滤，将得到的样液分为两份，一份稀释100倍对磺胺甲噻二唑、磺胺多辛进行定量检测，另一份直接上机，检测BSA的含量。

实施例3

待测样液e的制备

量取两份500μL浓度为100μmol/L BSA溶液于两个10mL离心管中，各加入75μL浓度为2mmol/L的磺胺甲噻二唑和75μL浓度为2mmol/L磺胺多辛标准溶液，采用乙酸铵缓冲液定容至10mL，震荡，涡旋，混合后蛋白质与磺胺类药物的浓度比均为1:3，放置于37℃恒温水浴锅中孵育120min后进行检测。

d-SPE前处理法制备待测样液f

称取经均质鱼肌肉样品5.0g，量取500μL浓度为100μmol/L的BSA溶液、75μL浓度为2mmol/L的磺胺甲噻二唑标准溶液于50mL离心管中，并采用乙酸铵缓冲液定容至1mL，震荡，涡旋，混合后蛋白质与磺胺类药物的浓度比为1:3。放置于37℃恒温水浴锅中孵育120min，于孵育后的样品中加入3.0mL甲醇，采用经乙酸酸化的乙腈水溶液定容至15mL，震荡，涡旋，其中，乙酸酸化的乙腈水溶液中，乙腈的体积和水的体积比为84:16，乙酸体积占乙酸酸化的乙腈水溶液体积的1％；加入无水硫酸镁6.0g、乙酸钠1.9g及氯化钠1.5g，震荡涡旋，于8000r/min离心7min，取上清液至试管中，加入C18 0.4g、PSA 0.4g及0.5g无水硫酸镁，涡旋震荡，于8000r/min离心7min，上清液经0.22μm滤膜过滤，将得到的样液分为两份，一份稀释100倍对磺胺甲噻二唑、磺胺多辛进行定量检测，另一份直接上机，检测BSA的含量。

结果与讨论

1，BSA与磺胺药物的相互作用

蛋白质在电喷雾质谱中可通过持续去溶剂的方法从液滴表面发射，从而转变为气相，形成具有多个电荷的离子，带多个电荷的效果表现在质谱图上则为一系列的离子峰簇，且相邻离子峰带电数均差1，质荷比越高，则带电荷数越少。当BSA与磺胺药物在体外结合形成复合物，其质量数有所增加，质谱图中复合物离子峰出现在质荷比高于蛋白质离子峰的方向。故可通过检测蛋白与小分子药物结合前后的质量数位移判断是否存在相互作用。分析BSA及其复合物的存在有两种途径：一种是以BSA及其复合物多电荷离子峰簇中较具代表性的某一个离子峰作为分析对象，另一种则为将BSA及其复合物所有的多电荷离子簇峰进行去卷积拟合计算，处理为一个总离子峰，然后进行分析。结果表明BSA分别与磺胺甲噻二唑、磺胺多辛均存在相互作用。以BSA结合磺胺甲噻二唑后的多电荷峰簇为例，如图1和图2所示，BSA的电荷数分布在31～66范围内，相邻簇峰间相差一个电子。以[M+60H]⁶⁰⁺和[M+59H]⁵⁹⁺对应的两个离子峰，及其与磺胺甲噻二唑的复合物峰为例，即图2，离子峰B代表BSA蛋白，由图2可知，每个BSA蛋白的离子峰B后总会出现B`峰，由于BSA在制备、存储和处理的过程中易出现氧化或污染等问题，导致BSA被杂质修饰，质量数增大，引起离子峰向质荷比高的方向偏移，由此判断B`为被杂质修饰的BSA离子峰。每组电荷峰均包含BSA离子峰B、被杂质修饰的BSA离子峰B`、BSA与一分子磺胺甲噻二唑结合的复合物峰B+S及被杂质修饰的BSA与磺胺甲噻二唑结合的复合物峰B`+S。非共价键复合物的质荷比位移S可通过式1计算：

式中：M_B和M_S分别是BSA及磺胺药物的分子量；i为正离子模式下检测到的蛋白质电荷价态。

+60电荷峰中BSA的m/z为1108.1521Da，BSA与目标小分子复合物的m/z为1112.6601Da，位移差为4.5180，计算得该小分子的质量为270.48Da，与磺胺甲噻二唑的质量数270.33Da相比差值为0.15，在允许范围内，这与实验现象吻合，证明BSA与磺胺甲噻二唑在浓度比为1:3的情况下以1:1的比例结合。

任意两个离子峰均可有效测定BSA实际精确分子质量。已知BSA的系列离子峰中两个相邻离子峰的m/z分别为m_i和m_i-1，假设对应的电荷数分别为i和i-1，BSA的分子量表示为M，则可得方程1：

m_i×i＝m_i-1×(i-1) (1)

解以上方程即可求得离子峰的电荷数(i，i-1)。BSA的分子量M＝m_i×i，从而得到BSA的实际分子质量。实际工作中也可利用去卷积计算软件，迅速准确的计算出蛋白质的实际分子质量，及各离子峰所带的电荷数。将图2进行软件去卷积处理后得到图3所示谱图。由图可观察到四个响应值较高的离子峰，分别对应BSA离子峰B、被杂质修饰的BSA离子峰B`、BSA与一分子磺胺甲噻二唑结合的复合物峰B+S及被杂质修饰的BSA与磺胺甲噻二唑结合的复合物峰B`+S。由图3可知，BSA实际精确分子质量为66473.54Da，被杂质修饰的BSA实际精确分子质量为66590.45Da，BSA与一分子磺胺甲噻二唑结合的复合物实际精确分子质量为66744.07Da，被杂质修饰的BSA与磺胺甲噻二唑结合的复合物实际精确分子质量为66848.40Da。经过计算后得BSA与磺胺甲噻二唑复合物离子峰的质量比未结合的BSA高270.54Da，与磺胺甲噻二唑分子量值270.33Da相比差值为0.21，在允许范围内，证明BSA与磺胺甲噻二唑在浓度比为1:3的情况下以1:1的比例结合。

同理分析BSA与磺胺多辛的相互作用，以+60电荷数对应的离子峰来分析，可知质谱图中BSA离子峰与复合物离子峰的位移差为5.18，计算得该小分子的质量为310.65，与磺胺多辛的质量数310.33Da相比差值为0.32，在允许范围内；将质谱图去卷积后，经过计算得复合物离子峰的质量比BSA高310.57Da，与磺胺多辛分子量值310.33Da相比差值为0.24，在允许范围内，证明BSA与磺胺甲噻二唑在浓度比为1:3的情况下以1:1的比例结合。通过对比BSA与磺胺药物复合物离子峰的相应值可知，磺胺多辛与BSA的结合程度高于磺胺甲噻二唑与BSA的结合程度。

2，磺胺药物的HPLC-Q-TOF-MS法定量分析

采用HPLC-Q-TOF-MS法分别对磺胺甲噻二唑、磺胺多辛进行定量分析，探究与BSA结合后体系中游离磺胺药物含量变化。经孵育的样液中磺胺药物浓度8.0μg/mL，该浓度过高，会对色谱柱造成严重污染，故将孵育后的样液稀释100倍，按照所述色谱质谱条件进行定量分析。每个样品测定3次，结果表明，磺胺甲噻二唑的平均回收率为61.4％，相对标准偏差为1.37％，磺胺多辛的平均回收率为53.7％，相对标准偏差为1.09％。表明体系中游离磺胺药物含量低于理论添加量，剩余部分均以结合态存在于体系中，证明了BSA分别与磺胺甲噻二唑、磺胺多辛均存在相互作用，且磺胺多辛与BSA的结合程度高于磺胺甲噻二唑与BSA的结合程度。

3，BSA与磺胺类药物相互作用的解离

磺胺类药物在鳕鱼体内与蛋白大分子在pH为6.5～9.0范围内发生结合，蛋白大分子与磺胺类药物常常在弱酸性或弱碱性条件下可发生结合，本发明采用pH＝7.4的乙酸铵缓冲溶液，将体系pH控制在7.4左右，成功观察到BSA与两种磺胺药物发生结合。为了解离该结合作用，本发明以磺胺甲噻二唑为代表，通过改变体系pH值的途径来进行解离。量取500μL浓度为100μmol/L BSA溶液于10mL离心管中，加入75μL浓度为2mmol/L的磺胺甲噻二唑标准溶液，加入10μL冰醋酸，采用乙酸铵缓冲液定容至10mL，震荡，涡旋，混合后溶液的pH值为3.51，BSA与磺胺甲噻二唑的浓度比为1:3。结果如图4所示，展示了[M+60H]⁶⁰⁺与[M+59H]⁵⁹⁺两个离子峰在加入冰乙酸前后的变化。由图4可知，BSA与磺胺甲噻二唑的复合物峰已消失。说明该pH条件下，BSA与磺胺甲噻二唑不能发生结合。

4，BSA与磺胺药物相互作用的消除

将d-SPE前处理法得到的样液采用HPLC-Q-TOF-MS法对BSA及其与磺胺药物的复合物进行检测分析。实验显示，与图5 d-SPE前处理法前BSA的质谱图相比，质谱图中无BSA及其复合物的离子峰，如图6所示，BSA在乙腈水溶液及C18、PSA的作用下被完全去除，相互作用力得以消除。同时，将d-SPE前处理过程得到的样液稀释100倍，分别对磺胺甲噻二唑、磺胺多辛进行定量检测，并做三组平行。结果如表1所示，2种磺胺类药物的平均回收率分别为90.2％和96.9％，相对标准偏差为1.40％和1.37％，n＝3，表明所建前处理回收率及精密度良好，成功消除了两种磺胺药物与BSA的相互作用。

表1经d-SPE前处理法后磺胺甲噻二唑与磺胺多辛的回收率统计，其中重复试验次数n＝3

R：回收率/％；RSD：相对标准偏差/％。

5，对所建立的HPLC-Q-TOF-MS结合d-SPE前处理法，针对基质效应、线性范围、检出限、定量限、回收率及精密度进行多方面方法学参数验证。

a.基质效应

本发明进一步考察鳕鱼样品经d-SPE法处理后的基质效应情况。通过绘制溶剂标准曲线C_S及基质匹配标准曲线C_m，并计算其斜率比值，对每种目标物质的基质效应进行评价。采用鳕鱼空白基质样液将混合标准溶液稀释至150μg/kg、300μg/kg、450μg/kg、600μg/kg和750μg/kg，与同浓度溶剂稀释的标准溶液一同上机测定。采用以下公式2计算检测方法的基质效应X％：

式中：

X％——基质效应；

C_S——采用含4.0mmol/L甲酸铵的甲酸酸化的甲醇溶液稀释磺胺标准品所得的标准曲线斜率，其中甲醇溶液中甲酸的体积与溶液的总体积比为0.2％；

C_m——采用鳕鱼空白基质样液稀释磺胺药物所得的标准曲线斜率。

当磺胺药物基质效应的结果在±20％以内为较弱基质效应，其绝对值在20％～50％为中等基质效应，50％～100％则为强基质效应。由于d-SPE前处理法萃取效率及净化效果良好，与基质匹配标准校正法结合，将鳕鱼样品基质效应尽可能的降低，最大限度地消除了基质效应对定量过程准确性的影响。结果如表2所示，空白样品基质中，磺胺甲噻二唑及磺胺多辛的基质效应值分别为8.39与-9.15，为较弱基质效应，以磺胺多辛为例，如图7所示。

表2鳕鱼中磺胺甲噻二唑及磺胺甲噻二唑的相关技术指标，其中重复试验次数n＝3

b.线性范围与检出限

在空白基质样液中分别添加150μg/kg、300μg/kg、450μg/kg、600μg/kg和750μg/kg系列浓度的混合标准溶液，按所述前处理方法进行处理，统计各个物质在不同浓度下的回收率。以峰面积作为纵坐标，浓度为横坐标，绘制曲线，得到该方法在150μg/kg～750μg/kg线性范围内的回归曲线方程及相关系数，结果如表2所示。结果表明，2种化合物在该范围内线性关系良好，相关系数R²均大于0.99。分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算鳕鱼中2种磺胺药物的检出限及定量限，磺胺甲噻二唑的检出限和定量限分别为4.86μg/kg及16.20μg/kg，磺胺多辛的检出限和定量限分别为3.89μg/kg及12.97μg/kg。

c.回收率与精密度

称取1g鳕鱼基质样品，加标浓度为300μg/kg，按照前处理步骤进行处理，考察该方法的日内精密度及日间精密度，于同一天不同时间点测定3次，每次进行3组平行实验，来确定日内精密度；将同样的步骤于同样条件下连续测定3天，来确定日间精密度，结果见表3。由表可知，2种磺胺药物的平均回收率均大于80％，磺胺甲噻二唑的日内RSD和日间RSD范围分别为3.47％及2.60％，磺胺多辛的日内RSD和日间RSD范围分别为2.91％及1.19％，表明所建方法具有良好的精密度。

表3磺胺甲噻二唑及磺胺甲噻二唑的日内和日间精密度，其中重复试验次数n＝9

R：回收率/％；RSD：相对标准偏差/％

本发明还可以应用于其他鱼肉中蛋白大分子与磺胺类药物相互作用及其消除方法的研究，以上仅为本发明的较佳实施例，凡是对上述实施例做等效变化的情况，都为本发明实施例涉及的技术范畴。

Claims (5)

1.鱼体内磺胺类药物的高分辨质谱筛查方法，其特征在于，包括以下步骤，

步骤1，称取鱼样品1.0～5g，加入BSA和磺胺类药物A，用乙酸铵缓冲液C定容至1mL，混合均匀得到混合体系B；

其中，BSA的浓度为2～5μmol/L，BSA与磺胺类药物B的浓度比为1:3，乙酸铵缓冲液C的浓度为0.01mol/L，并调节乙酸铵缓冲液C的pH至7.4；

步骤2，将混合体系B在37℃下孵育30～120min得到混合体系C，向混合体系C中加入甲醇2.0～3.0mL，用经乙酸酸化的乙腈水溶液定容至15mL，混合均匀得到混合体系D，其中乙酸酸化的乙腈水溶液中，乙腈与水的体积比为84:16，乙酸体积占溶液体积的1％；

步骤3，向混合体系D中加入无水硫酸镁3.0～6.0g、乙酸钠1.9g和氯化钠1.5g，混合均匀后离心得到上清液A，向上清液A中加入C18 0.4g、PSA 0.4g和无水硫酸镁0.1g～0.5g，混合均匀后离心得到上清液B；

步骤4，将上清液B经0.22μm滤膜过滤，将得到的样液分为两份，其中一份样液稀释100倍对磺胺类药物A进行定量检测，另一份样液直接检测BSA的含量；

其中，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱进行检测，

磺胺类药物A的检测包括色谱参数和质谱参数，

所述色谱参数为：采用正离子模式，色谱柱：Thermo Hypersil GOLD AQ柱，参数为100mm×4.6mm，5μm；柱温：35℃；流动相A为水、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸体积占混合溶液体积的0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L；流动相B为甲醇、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸体积占混合溶液体积的0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L；梯度洗脱程序为：0.0～1.0min内，流动相A的比例保持100％；1.0～7.0min内，流动相A的比例由100％线性减少至0％；7.0～15.0min内，流动相A的比例保持0％；15.0～17.0min内，流动相A的比例由0％线性增加至100％；17.0～25.0min内，流动相A的比例保持100％；流速：0.3mL/min；进样量：10.0μL；

所述质谱参数为：采用电喷雾离子源，在正离子模式下进行检测；毛细管电压4.0kV，喷嘴电压1.0kV；干燥气温度280.0℃；干燥气流量13.00L/min；雾化气压力20.0psi；鞘气温度350.0℃；鞘气流量12.0L/min；采用氮气作为雾化气、干燥气和鞘气；

BSA的检测包括色谱参数和质谱参数，

所述色谱参数为：流动相为乙腈水溶液，其中水和乙腈的体积比为95:5；进样量为2～10μL；进样速度为0.05～0.2mL/min；

所述质谱参数为：毛细管电压：4.0kV，喷嘴电压：1.0kV，干燥气温度150.0℃，干燥气流量11.0L/min，雾化气压力20.0psi，鞘气温度180.0℃，鞘气流量9.0L/min，碎裂电压：150v，雾化气、干燥气和鞘气为氮气。

2.根据权利要求1所述的鱼体内磺胺类药物的高分辨质谱筛查方法，其特征在于，步骤1、步骤2和步骤3均通过震荡和涡旋混合均匀。

3.根据权利要求1所述的鱼体内磺胺类药物的高分辨质谱筛查方法，其特征在于，步骤3的离心转速和离心时间均分别为6000～10000r/min和5～10min。

4.根据权利要求1所述的鱼体内磺胺类药物的高分辨质谱筛查方法，其特征在于，步骤1所述的鱼样品为均质后的样品。

5.根据权利要求1所述的鱼体内磺胺类药物的高分辨质谱筛查方法，其特征在于，其特征在于，所述的磺胺类药物为磺胺甲噻二唑或磺胺多辛。

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