CN107515262B - 同时测定动物血浆中林可霉素和庆大霉素的液质联用方法 - Google Patents

同时测定动物血浆中林可霉素和庆大霉素的液质联用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时测定动物血浆中林可霉素和庆大霉素的液质联用方法。本发明同时测定动物血浆中林可霉素和庆大霉素的液质联用方法,包括以下步骤:(1)用提取溶剂同时提取待检测血浆中的林可霉素和庆大霉素,得到提取液;(2)将提取液采用高效液相色谱串联质谱进行定性定量测定。本发明利用一种提取试剂实现同时将血浆中的林可霉素和庆大霉素有效提取,避免了分步骤提取的繁琐;而且样品前处理过程中未使用离子对试剂,不影响仪器的正常使用。本发明血浆样品前处理的方法和液质联用方法,步骤简单,灵敏度高,结果准确可靠,能够用于动物血浆中林可霉素和庆大霉素的简单高效测定。

Description

同时测定动物血浆中林可霉素和庆大霉素的液质联用方法
技术领域
本发明涉及一种同时测定动物血浆中林可霉素和庆大霉素的方法,尤其涉及一种同时测定动物血浆中林可霉素和庆大霉素的液质联用方法,属于林可霉素和庆大霉素的痕量检测领域。
背景技术
林可霉素和庆大霉素在兽医临床上应用广泛,但应用不当易造成耳毒性、肾毒性以及伪膜性肠炎和过敏性休克等不良反应,给动物生产和人类健康带来了严重危害。目前,对于从动物血浆中同时提取测定林可霉素和庆大霉素的方法,尚未见报道。
因此,建立一种用一种提取试剂同时将血浆中的林可霉素和庆大霉素有效提取、并通过液质联用仪同时检测林可霉素和庆大霉素的新方法,避免分步骤提取的繁琐以及前处理过程中使用离子对试剂等对设备造成的危害,实现方便、快捷、高效的药物测定,将具有重要的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是建立一种同时测定动物血浆中林可霉素和庆大霉素的液质联用方法,该方法利用一种提取试剂同时将血浆中的林可霉素和庆大霉素有效提取,通过液质联用仪进行检测,灵敏度高,结果准确可靠。
为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案是:
本发明公开了一种同时测定动物血浆中林可霉素和庆大霉素的液质联用方法,包括以下步骤:(1)用提取溶剂同时提取待检测血浆中的林可霉素和庆大霉素,得到提取液;(2)将提取液采用高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行定性定量测定。
本发明所述的庆大霉素包含庆大霉素C1、C1a和C2三个组份。
其中,步骤(2)所述高效液相色谱串联质谱的液相色谱条件包括:色谱柱为SHISEIDO SILICA-SG80,规格为2.0mm×150mm,5μm;流动相A为0.1%甲酸水溶液(体积百分比),流动相B为乙腈;流速为0.35mL/min;进样体积为10μL;柱温为35-45℃;梯度洗脱。
所述梯度洗脱的程序包括:按体积百分比计,0.01min,流动相A:30%,流动相B:70%;1.5min,流动相A:85%,流动相B:15%;6.50min,流动相A:85%,流动相B:15%;6.60min,流动相A:30%,流动相B:70%;10.0min,停止洗脱。
步骤(2)所述高效液相色谱串联质谱的质谱条件包括:ESI离子源温度为550℃;正离子扫描方式;喷雾电压为5500V;MRM扫描模式;s-MRM设置条件为200s的时间监测窗口,即每个化合物的采集时间为其保留时间±200s,软件自动优化各化合物的MRM驻留时间。
本发明为了保证每种待测物在质谱中都有较强的信号,采用流动注射泵连续进样进行了质谱条件的优化,在正模式下进行了全扫描,选择适当的电离模式和分子离子峰。对于电喷雾质谱,目标化合物的结构特征和流动相的组成对目标化合物的离子化效果及灵敏度影响很大。在其软件,MS tune页面上,锁定母离子([M+H]+)并优化其样品锥孔电压、毛细管电压、脱溶剂气温度和气流量,使信号达到最强。此后在确定好母离子的条件后,打开碰撞气氩气,对母离子进行碎裂,在二级谱图中选择三种碎片离子([M+H]+)中丰度较高的两种子离子作为定量和定性特征离子;并分别对两个子离子进行优化,最后以正离子多反应监测模式优化各种质谱调谐参数,最大程度提高了检测灵敏度。本发明优化后的质谱参数包括:林可霉素,母离子为407.200(m/z),子离子为126.200、359.300(m/z),其中定量离子为126.200;庆大霉素C1,母离子为478.200(m/z),子离子为157.100、322.200(m/z),其中定量离子为157.100;庆大霉素C1a,母离子为450.200(m/z),子离子为322.100、160.00(m/z),其中定量离子为322.100;庆大霉素C2,母离子为464.200(m/z),子离子为160.200、322.100(m/z),其中定量离子为160.200;其它质谱多反应监测条件如表2所示。
步骤(2)所述的定性定量方法为:定性方法是根据待检测药物与药物标准品的保留时间一致时,结合质谱参数中的定性和定量离子对确定为目标药物;定量方法是根据药物标准品浓度与峰面积绘制标准曲线,将待检测血浆中目标药物的峰面积带入标准曲线回归方程,计算目标药物的相应浓度。
本发明同时测定动物血浆中林可霉素和庆大霉素的液质联用方法,步骤(1)按照g/ml计,所述提取溶剂为含有10mM磷酸盐缓冲液的浓度为1-8%的三氯乙酸溶液,优选为含有10mM磷酸盐缓冲液的浓度为2%的三氯乙酸溶液。其中,所述2%的三氯乙酸溶液(含10mM磷酸盐缓冲液)的配制包括:准确称取三氯乙酸10g,用490mL水溶解,加入0.68g磷酸二氢钾,溶解混匀并定容至500ml(4℃避光可保存1个月)。进一步优选的,按照体积比计,待检测血浆:提取溶剂=1:5。
步骤(1)所述提取的方法包括:(a)向待检测血浆中加入提取溶剂和正己烷,涡旋、离心,取下层液体(可以将残渣复提合并),蒸干或蒸至近干;(b)将蒸干后产物复溶,涡旋,然后加入正己烷除脂,离心,取下层液体,过滤,收集滤液,即得。
按照体积比计,步骤(a)待检测血浆:正己烷=1:5;按照体积比计,步骤(b)所述复溶为用乙腈:0.1%甲酸=7:3的溶液进行复溶,所述过滤为经0.22μm有机滤膜过滤。步骤(b)所述正己烷的用量为:每1ml待检测血浆样品,用5mL正己烷除脂。步骤(a)或步骤(b)所述离心为10000r/min离心5min。步骤(a)所述涡旋的时间优选为2min;步骤(b)所述涡旋的时间优选为1min。
本发明选择四种色谱柱对林可霉素和庆大霉素各个组份的分离效果和响应值进行考察,结果表明,庆大霉素各个组份在经过SHISEIDOSILICA SG 80(2.0×150mm,5μm)色谱柱分离后的响应值最高,而且峰型较好,对称,不拖尾;而色谱柱Waters Atlantis T3(2.1×150mm,3μm)、SHISEIDO CAPCELL PAK C18(2.0×75mm,3μm),或Phenomenex KinetexC18(2.0×50mm,3μm)下的庆大霉素各个组分的分离效果较差,峰型不好,并且药物的响应值低。林可霉素在四种色谱柱下的响应值差别不大,但是在经过后三种色谱柱后的出峰时间太靠前。综合各种因素,本发明选择色谱柱SHISEIDO SILICA SG 80(2.0×150mm,5μm)。
本发明对流动相洗脱比例的优化结果表明,流动相的洗脱比例对各个药物的回收率和响应值有显著影响。洗脱程序中有机相的初始比例较大,考虑到林可霉素和庆大霉素的极性较大,洗脱时若水相的比例先增大,药物的出峰时间会很靠前。综合各种因素,本发明确定洗脱比例为:0.01min,流动相B:70%;1.5min,流动相B:15%;6.50min,流动相B:15%;6.60min,流动相B:70%。而在其他洗脱条件下,或者不能把药物充分洗脱下来,各个药物的回收率过低,未达到80%;或者洗脱出的杂质较多,药物回收率超出120%,干扰药物的检测。
本发明在流动相水相(0.1%甲酸)中加入5mmol/L乙酸铵时,林可霉素和庆大霉素的响应值均有所降低,并且庆大霉素的分型较宽,有分叉。可见,流动相中加入乙酸铵不利于庆大霉素各个组份的检测。因此,本发明采用0.1%甲酸作为流动相的水相。
液质联用仪中常用的有机流动相为甲醇和乙腈,本发明流动相的有机相为甲醇时,庆大霉素各个组份均未出峰,对林可霉素响应值影响不大,但是出峰的时间提前至1.56min。考虑到复方药物的特殊性,本发明选用乙腈作为洗脱的有机相。
由于前处理过程中未加入离子对试剂,庆大霉素的响应值可能会降低很多,因此本发明对进样的体积进行筛选,以保证药物的响应值。结果表明,进样体积对药物的出峰时间几乎无影响,但是随之进样体积的增加同浓度下药物的响应值增加,但是考虑到进样体积过大会污染质谱,影响其使用寿命,并且影响其他药物的检测。因此,本发明选择进样体积为10μL。
本发明对流速和柱温的考察结果表明,流速对药物的响应值几乎无影响,但是对出峰的时间有明显的影响;随之流速增大,庆大霉素各组分药物以及林可霉素的出峰时间均提前。由于大流速下两种药物的出峰提前,分离效果不好,因此本发明选择适中的流速0.35mL/min。同时,柱温在35-45℃对药物的出峰时间和响应值均无显著的影响。
前处理过程中使用固相萃取柱进行净化、富集和浓缩能有效提高样品的纯度。本发明中庆大霉素的氨基有很强的亲水性,因此在使用固相萃取柱的时候多使用离子对试剂来增加其在柱子上的保留能力。但是离子对试剂易与溶液中的阳离子形成紧密的中性离子对,不能被检出,同时易在质谱中积累,污染质谱,影响灵敏度。因此,本申请考察了在不使用离子对试剂的情况下经过固相萃取的回收率。结果表明,使用C18或HLB固相萃取柱,庆大霉素和林可霉素的回收率均非常低,即使更换固相萃取步骤中洗脱液的比例,庆大霉素和林可霉素的回收率仍然远远低于实际需要(80%-115%)。本发明通过淋洗曲线考察药物回收率低的原因,结果林可霉素和庆大霉素在固相萃取的各个阶段均有流出,不适合上述两种药物的分离。因此,本发明样品的前处理中不经过固相萃取步骤。
本发明对三氯乙酸提取溶液浓度的筛选结果表明,在1%-8%范围内,随着三氯乙酸浓度的加大,庆大霉素和林可霉素的回收率先上升后下降。随着酸度的增加,离子浓度会增大,考虑到提取液的离子浓度过大会抑制质谱的电离,会使质谱的灵敏度下降,因此本发明采用2%的三氯乙酸溶液作为提取液。
方法学验证结果表明,血浆中林可霉素浓度的线性范围为50-800ppb,庆大霉素C1组分浓度的线性范围为54-864ppb,庆大霉素C1a组分浓度的线性范围为50-800ppb,庆大霉素C2组分浓度的线性范围为94-1500ppb。各药物浓度与仪器响应值之间在线性范围内呈良好的相关关系,林可霉素和庆大霉素各个组分的标准曲线相关系数(R2)均大于0.99。在本发明建立的色谱、质谱条件下,林可霉素和庆大霉素的加标回收率为72.39%-107.78%,对样品6次测定的RSD为3.78%-12.14%,精密度良好。
根据信噪比(S/N)的值,确定本发明方法林可霉素的检测限为0.1ppb,定量限为10ppb;庆大霉素C1、C1a、C2的检测限分别为0.108、0.05、0.094ppb,定量限分别为5.40、1.00、1.88ppb。说明本发明方法的灵敏度高,完全能满足林可霉素和庆大霉素的检测要求。
本发明技术方案与现有技术相比,具有以下有益效果:
本发明建立了一种同时测定动物血浆中林可霉素和庆大霉素的LC/MS-MS方法。本发明利用一种提取试剂实现同时将血浆中的林可霉素和庆大霉素有效提取,避免了分步骤提取的繁琐。本发明样品前处理过程中,未使用离子对试剂等对设备有害的试剂,不会影响仪器的正常使用,实现了绿色环保以及保护仪器的要求。本发明方法步骤简单,灵敏度高,结果准确可靠,能够用于动物血浆中林可霉素和庆大霉素的简单高效测定。
附图说明
图1为色谱柱A、B、C、D下各个药物的峰型;其中,A1为色谱柱A下庆大霉素-C1(Gen-C1)组分的峰型,B1为色谱柱B下庆大霉素-C1(Gen-C1)组分的峰型,C1为色谱柱C下庆大霉素-C1(Gen-C1)组分的峰型,D1为色谱柱D下庆大霉素-C1(Gen-C1)组分的峰型;A2为色谱柱A下庆大霉素-C1a(Gen-C1a)组分的峰型,B2为色谱柱B下庆大霉素-C1a(Gen-C1a)组分的峰型,C2为色谱柱C下庆大霉素-C1a(Gen-C1a)组分的峰型,D2为色谱柱D下庆大霉素-C1a(Gen-C1a)组分的峰型;A3为色谱柱A下庆大霉素-C2(Gen-C2)组分的峰型,B3为色谱柱B下庆大霉素-C2(Gen-C2)组分的峰型,C3为色谱柱C下庆大霉素-C2(Gen-C2)组分的峰型,D3为色谱柱D下庆大霉素-C2(Gen-C2)组分的峰型;A4为色谱柱A下林可霉素(Lin)的峰型,B4为色谱柱B下林可霉素(Lin)的峰型,C4为色谱柱C下林可霉素(Lin)的峰型,D4为色谱柱D下林可霉素(Lin)的峰型;
图2为流动相水相为0.1%甲酸(FA)和1%甲酸(5mmol/L乙酸铵)(AA)时各个药物的峰型;其中,A为1%甲酸(5mmol/L乙酸铵)(AA)时庆大霉素-C1(Gen-C1)的峰型,B为1%甲酸(5mmol/L乙酸铵)(AA)时庆大霉素-C1a(Gen-C1a)的峰型,C为1%甲酸(5mmol/L乙酸铵)(AA)时庆大霉素-C2(Gen-C2)的峰型,D为1%甲酸(5mmol/L乙酸铵)(AA)时林可霉素(Lin)的峰型,E为流动相水相为0.1%甲酸(FA)时庆大霉素-C1(Gen-C1)的峰型,F为流动相水相为0.1%甲酸(FA)时庆大霉素-C1a(Gen-C1a)的峰型,G为流动相水相为0.1%甲酸(FA)时庆大霉素-C2(Gen-C2)的峰型,H为流动相水相为0.1%甲酸(FA)时林可霉素(Lin)的峰型;
图3为流动相有机相为乙腈(ACE)和甲醇(MET)时各个药物的峰型;其中,A为流动相有机相为乙腈(ACE)庆大霉素-C1(Gen-C1)的峰型,B为流动相有机相为甲醇(MET)庆大霉素-C1(Gen-C1)的峰型,C为流动相有机相为乙腈(ACE)庆大霉素-C1a(Gen-C1a)的峰型,D为流动相有机相为甲醇(MET)庆大霉素-C1a(Gen-C1a)的峰型,E为流动相有机相为乙腈(ACE)庆大霉素-C2(Gen-C2)的峰型,F为流动相有机相为甲醇(MET)庆大霉素-C2(Gen-C2)的峰型,G为流动相有机相为乙腈(ACE)林可霉素(Lin)的峰型,H为流动相有机相为甲醇(MET)林可霉素(Lin)的峰型。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的,不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1同时测定动物血浆中林可霉素和庆大霉素的液质联用方法建立
1、材料与方法
1.1主要仪器
LC-20AD液相色谱仪,AB SCIEX Triple QuadTM6500三重四级杆质谱仪,电喷雾离子源(ESI),旋涡混合器,AllegraTM X-22R离心机,MS2型旋涡混匀器,TDZ5-WS离心机,IKA-RV10旋转蒸发仪。
1.2主要材料与试剂
林可霉素、庆大霉素标准品由中国食品药品检定研究院提供,乙腈为质谱纯,其余试剂均为色谱纯。
1.3试验条件
1.3.1液相色谱条件
色谱柱为SHISEIDO SILICA-SG80(5μm,2.0mm×150mm),流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为乙腈,流速为0.35mL/min,流动相梯度见表1。
表1液相色谱梯度洗脱程序
注:A%,表示水相的体积百分比;B%,表示有机相的体积百分比。
1.3.2质谱条件
ESI离子源温度550℃;正离子扫描方式;喷雾电压5500V;MRM扫描模式;去簇电压(DP)和碰撞能(CE)等质谱参数见表2。s-MRM设置条件为200s的时间监测窗口,即每个化合物的采集时间为其保留时间±200s,软件自动优化各化合物的MRM驻留时间。
表2质谱多反应监测试验条件
注:*表示,该离子为定量离子。
1.4试验步骤
1.4.1溶液的配制
(1)标准品储备液的配制:精密称取干燥至恒重的林可霉素,庆大霉素(含C1,27.1%,C1a,25.3%,C2,47.5%)标准品10.00mg,置于100mL容量瓶中,用色谱级乙腈稀释至刻度,制成浓度为100μg/mL的标准储备液,置于-20℃保存,4-6个月。
(2)标准中间工作液的配制:用流动相(乙腈:0.1%甲酸)稀释标准储备液,配制浓度适当的标准中间工作液10μg/mL,3个月。
(3)混合标准工作液配制:精密量取适量标准中间工作液,配制成适合的标准工作液,现配现用。
(4)提取液的配制:三氯乙酸提取液(含10mM磷酸盐缓冲液):准确称取三氯乙酸10g,用490mL水溶解,加入0.68g磷酸二氢钾,溶解混匀并定容至500mL(4℃避光可保存1个月)。
1.4.2样品处理
取1mL的血浆,置于15mL干净的塑料离心管中,加入5mL三氯乙酸(磷酸盐)提取液和5mL的正己烷,涡旋,2min,10000r/min离心5min,吸取下层液体(水相)置另一干净的塑料离心管中,残渣复提合并,用旋转蒸发蒸至近干,用定容溶液(乙腈:0.1%甲酸=7:3,V:V)复溶,涡旋混合1min,加入5mL正己烷除脂,10000r/min离心5min,取下层,经0.22μm有机滤膜过滤后,进样,进行LC-MS/MS分析。以保留时间和质谱二级特征离子作为定性依据。
2、结果
2.1色谱条件优化
2.1.1色谱柱筛选
选择本领域常用的四种色谱柱对林可霉素和庆大霉素各个组份的分离效果和响应值进行考察,筛选效果较好的进行试验,洗脱条件同表1。色谱柱分别为①A:SHISEIDOSILICA SG 80(2.0×150mm,5μm);②B:Waters Atlantis T3(2.1×150mm,3μm);③C:SHISEIDO CAPCELL PAKC18(2.0×75mm,3μm);④D:Phenomenex Kinetex C18(2.0×50mm,3μm)。结果如表4所示。
表3标准品浓度
注:表中,STD-1为标准储备液;STD-10:标储稀释10倍;STD-5:标储稀释5倍;STD-2:标储稀释2倍,药物的实际浓度如上表所示,其他试验中的STD-10,STD-5同该表中所列。
表4四种色谱柱下各个药物的响应信息
注:表中,Area为峰面积;RT为保留时间;W为半峰宽,显示的数值为标准品浓度STD-5;表中3.64e+05,表示峰面积为3.64×105,为科学计数法的一种表示方法。
由结果可知,庆大霉素各个组份在经过四种色谱柱分离后,在A色谱柱的响应值最高。从图1可知在A色谱柱下的峰型较好,对称,不拖尾;色谱柱B、C、D下的庆大霉素各个组分的分离效果较差,峰型不好并且药物的响应值低。林可霉素的响应值差别不大,但是在经过B、C、D色谱柱后的出峰时间太靠前。综合各种因素,本发明选择色谱柱A(SHISEIDO SILICASG 80(2.0×150mm,5μm))。
2.1.2洗脱条件筛选
2.1.2.1流动相的洗脱比例
本发明考察流动相(Mobile Phase,MP)的洗脱比例,以得到最优的洗脱效果。各洗脱比例及具体比较结果数据见表5-表7。
表5流动相的洗脱比例
表6不同流动相下各个药物的响应值和回收率
表7不同流动相下各个药物的响应值和回收率
本发明中,洗脱程序中有机相的初始比例较大,考虑到林可霉素和庆大霉素的极性较大,洗脱时若水相的比例先增大,药物的出峰时间会很靠前。如结果所示,洗脱条件MP-1中林可霉素和庆大霉素C1的出峰时间分别为1.88min和1.29min,出峰时间较洗脱条件MP-0中的2.59min和3.23min提前很多。
同时由结果可知,在不同的洗脱条件下,各个药物的回收率和响应值有所不同。回收率过低,未达到80%(庆大霉素各个组份,MP-1、2、4、5;林可霉素,MP-4),说明该洗脱条件不能把药物充分洗脱下来,不能满足检测要求;回收率过高,超出120%(庆大霉素各个组份,MP-6、7;林可霉素,MP-3、5),说明该洗脱条件洗脱出的杂质较多,干扰药物的检测。综合各种因素,MP-0是最优的洗脱条件。
2.1.2.2流动相水相(0.1%甲酸,Formic acid,FA)中加入乙酸铵(Ammoniumacetate,AA)
配制0.1%甲酸(5mmol/L乙酸铵)流动相,本发明采用色谱柱A(SHISEIDO SILICASG 80(2.0×150mm,5μm)),洗脱条件采用MP-0。结果表明,流动相中加入乙酸铵时,林可霉素和庆大霉素的响应值均有所降低(表8),并且庆大霉素的分型较宽,有分叉(图2)。
表8流动相中加入乙酸铵时林可霉素和庆大霉素的响应值(峰面积)
由以上结果可知,流动相中加入乙酸铵不利于庆大霉素各个组份的检测。因此,本发明只采用0.1%甲酸作为流动相的水相。
2.1.2.3流动相有机相换成甲醇(Methyl alcohol,Met)
液质联用仪中常用的有机流动相为甲醇和乙腈(Acetonitrile,ACE)。从本发明结果可知,流动相的有机相更换为甲醇后,庆大霉素各个组份均未出峰,结果见图3。有机相为甲醇对林可霉素响应值影响不大,但是出峰的时间提前至1.56min。考虑到复方药物的特殊性,本发明选用乙腈作为该方法中洗脱的有机相。
2.1.3进样体积(Injection,IJ)考察
由于未加入离子对试剂,庆大霉素的响应值可能会降低很多,因此筛选进样的体积,以保证药物的响应值,结果见表9。由结果可知,进样体积对药物的出峰时间几乎无影响,但是随之进样体积的增加同浓度下药物的响应值增加,但是考虑到进样体积过大会污染质谱,影响其使用寿命,并且影响其他药物的检测,因此本发明选择的进样体积为10μL。
表9进样量对药物响应值的影响
注:表中,IJ0-10:进样体积为10μL;IJ1-5:进样体积为5μL;IJ2-3:进样体积为3μL。
2.1.4流速(Total Flow,TF)和柱温(Oven Temperature,OT)考察
本发明分别考察了流速和柱温(表10)对庆大霉素各组分药物以及林可霉素检测的无影响。
由结果可知(表11),流速对药物的响应值几乎无影响,但是对出峰的时间有明显的影响,随之流速增大,庆大霉素各组分药物以及林可霉素的出峰时间均提前。由于大流速下两种药物的出峰提前,分离效果不好,因此应该选择适中的流速,故本发明选择流速为0.35mL/min。同时,柱温对药物的出峰时间和响应值均无显著的影响。
表10流速和柱温条件分组
表11柱温和流速对药物出峰的影响
注:表中,STD-L-100:柱温(OT)为40℃,流速(TF)为0.35mL/min。
2.2质谱条件的优化
为了保证每种待测物在质谱中都有较强的信号,本发明采用流动注射泵连续进样进行了质谱条件的优化,在正模式下进行了全扫描,选择适当的电离模式和分子离子峰。对于电喷雾质谱,目标化合物的结构特征和流动相的组成对目标化合物的离子化效果及灵敏度影响很大。在其软件,MS tune页面上,锁定母离子([M+H]+)并优化其样品锥孔电压、毛细管电压、脱溶剂气温度和气流量,使信号达到最强。此后在确定好母离子的条件后,打开碰撞气氩气,对母离子进行碎裂,在二级谱图中选择三种碎片离子([M+H]+)中丰度较高的两种子离子作为定量和定性特征离子。并分别对两个子离子进行优化,最后以正离子多反应监测模式优化各种质谱调谐参数,最大程度提高了检测灵敏度。优化后的质谱参数如表2所示。
2.3前处理条件的筛选
2.3.1前处理中使用固相萃取柱净化
参考以往的材料,前处理过程中使用固相萃取柱进行净化、富集和浓缩能有效提高样品的纯度。但本发明中庆大霉素的氨基有很强的亲水性,因此在使用固相萃取柱的时候多使用离子对试剂来增加其在柱子上的保留能力。同时应该注意的是,离子对试剂对质谱的污染不可忽视,大多数的离子对试剂均不易挥发,易在质谱积累,污染质谱。七氟丁酸是常用的易挥发的离子对试剂,但是易与溶液中的阳离子形成紧密的中性离子对,不能被检出,同时易在质谱中积累,污染质谱,影响灵敏度。因此本发明考察了在不使用离子对试剂的情况下经过固相萃取的回收率。
2.3.1.1考察不同固相萃取柱的回收率
采用不同固相萃取柱,庆大霉素、林可霉素的回收率见表12。可见,采用C18或HLB固相萃取柱,两种药物的回收率均非常低。
表12 C18和HLB固相萃取柱的回收率
2.3.1.2不同洗脱试剂的回收率
更换固相萃取步骤中洗脱液的比例,庆大霉素、林可霉素的回收率见表13-14。
表13不同洗脱比例下庆大霉素的回收率
表14不同洗脱比例下林可霉素的回收率
由表13-14可知,即使更换了固相萃取步骤中洗脱液的比例,两种药物的回收率仍然远远低于实际需要(80%-115%),回收率仍旧达不到要求。
2.3.1.3通过淋洗曲线考察药物回收率低的原因
通过淋洗曲线考察药物回收率低的原因,结果见表15。
表15淋洗曲线
由结果可知,林可霉素和庆大霉素在固相萃取的各个阶段均有流出,可能是因为该固相萃取柱不适合林可霉素和庆大霉素的分离。
2.3.2不经过固相萃取步骤前处理的提取回收率
血浆样品经过三氯乙酸提取后,加入10mL无水乙醇和5mL正丙醇(形成共沸物,有利于旋蒸),在55℃,110r/min下旋转蒸至近干,用稀释液(乙腈:0.1%甲酸=7:3)定容至2mL。三氯乙酸的浓度分别为:0-TCA1%、A-2%、B-3%、C-5%、D-8%。试验结果见表16。
表16不同含量三氯乙酸的提取回收率
由结果可知,在1%-8%含量范围内,随着三氯乙酸浓度的加大,庆大霉素和林可霉素的回收率先上升后下降。随着酸度的增加,离子浓度会增大,考虑到提取液的离子浓度过大会抑制质谱的电离,会使质谱的灵敏度下降,因此本发明采用2%的三氯乙酸溶液作为提取液,并未选择回收率差异不大的1%的三氯乙酸溶液作为提取液。
2.4方法学验证
2.4.1线性和范围
通过向空白基质中加入梯度标准品的方式得到血浆药物浓度与仪器响应值之间的相关关系,如表17所示,在线性范围内呈良好的相关关系,标准曲线相关系数(R2)大于0.99。
表17血浆中林可霉素和庆大霉素(C1,C1a,C2)各个组分的标准曲线
2.4.2精密度和回收率
以空白血浆作为基质,加入林可霉素和庆大霉素(含C1,27.1%,C1a,25.3%,C2,47.5%)标准品,按照实验1.3-1.4的条件和步骤测定其精密度及回收率,血浆样品的分析方法符合有关规范要求,测定结果见表18。
表18方法的回收率和精密度(n=6)
2.4.3灵敏度
根据信噪比(S/N)的值确定该方法的林可霉素的检测限为0.1ppb,定量限为10ppb,庆大霉素C1,C1a,C2的检测限分别为0.108,0.05,0.094ppb,定量限分别为5.40,1.00,1.88ppb。说明该方法的灵敏度高,完全能满足林可霉素和庆大霉素的检测要求。
综上,本发明建立了一种简便的测定动物血浆中林可霉素和庆大霉素的LC/MS-MS方法。该法检测目标化合物,步骤简单,灵敏度高,结果准确可靠,平均回收率较好,可满足筛选和定量的需要。目前的材料中检测氨基糖苷类抗生素多使用离子对试剂来增加其在反相色谱柱上的保留能力。但是,离子对试剂都易于溶液中的阳离子形成紧密的中性离子对,不能被检出,同时易在质谱中积累,污染质谱,影响灵敏度。本发明方法中未使用离子对试剂,不会影响仪器的正常使用,实现了绿色环保以及保护仪器的要求。

Claims (9)

1.一种同时测定动物血浆中林可霉素和庆大霉素的液质联用方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)用提取溶剂同时提取待检测血浆中的林可霉素和庆大霉素,得到提取液;(2)将提取液采用高效液相色谱串联质谱进行定性定量测定;所述高效液相色谱串联质谱的液相色谱条件包括:色谱柱为SHISEIDO SILICA-SG80,规格为2.0mm×150mm,5μm;流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为乙腈;流速为0.35mL/min;进样体积为10μL;梯度洗脱;所述梯度洗脱的程序包括:按体积百分比计,0.01min,流动相A:30%,流动相B:70%;1.5min,流动相A:85%,流动相B:15%;6.50min,流动相A:85%,流动相B:15%;6.60min,流动相A:30%,流动相B:70%。
2.按照权利要求1所述的液质联用方法,其特征在于:步骤(1)所述庆大霉素包含C1、C1a和C2三个组份。
3.按照权利要求1所述的液质联用方法,其特征在于,步骤(2)所述高效液相色谱串联质谱的质谱条件包括:ESI离子源温度为550℃;正离子扫描方式;喷雾电压为5500V;MRM扫描模式。
4.按照权利要求1或3所述的液质联用方法,其特征在于,步骤(2)所述高效液相色谱串联质谱的质谱多反应监测条件包括:
林可霉素,母离子为407.200;子离子为126.200、359.300;其中定量离子为126.200;
庆大霉素C1,母离子为478.200;子离子为157.100、322.200;其中定量离子为157.100;
庆大霉素C1a,母离子为450.200,子离子为322.100、160.00;其中定量离子为322.100;
庆大霉素C2,母离子为464.200,子离子为160.200、322.100;其中定量离子为160.200。
5.按照权利要求1所述的液质联用方法,其特征在于:按照g/mL计,步骤(1)所述提取溶剂为含有10mM磷酸盐缓冲液的浓度为1-8%的三氯乙酸溶液
按照体积比计,待检测血浆:提取溶剂=1:5。
6.按照权利要求1所述的液质联用方法,其特征在于:步骤(1)所述提取溶剂为含有10mM磷酸盐缓冲液的浓度为2%的三氯乙酸溶液。
7.按照权利要求1所述的液质联用方法,其特征在于:步骤(1)所述提取的方法包括:(a)向待检测血浆中加入提取溶剂和正己烷,涡旋、离心,取下层液体,蒸干;(b)将蒸干后产物复溶,涡旋,然后加入正己烷除脂,离心,取下层液体,过滤,收集滤液,即得。
8.按照权利要求7所述的液质联用方法,其特征在于:按照体积比计,步骤(a)待检测血浆:正己烷=1:5;
按照体积比计,步骤(b)所述复溶为用乙腈:0.1%甲酸=7:3的溶液进行复溶;所述过滤为经0.22μm有机滤膜过滤;
步骤(a)或步骤(b)所述离心为10000r/min离心5min。
9.按照权利要求1所述的液质联用方法,其特征在于:步骤(2)所述的定性定量测定包括:
定性方法是根据待检测药物与药物标准品的保留时间一致,结合质谱参数中的定性和定量离子对确定为目标药物;
定量方法是根据药物标准品浓度与峰面积绘制标准曲线,将待检测血浆中目标药物的峰面积带入标准曲线回归方程,计算目标药物的相应浓度。
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