CN114624362A

CN114624362A - 一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN114624362A
Application number: CN202210265067.2A
Authority: CN
Inventors: 黄宪章; 严君; 徐玉竹; 张乔轩; 韩丽乔; 展敏; 张鹏伟; 万泽民; 王建兵; 柯培锋; 庄俊华
Original assignee: Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2022-03-17
Filing date: 2022-03-17
Publication date: 2022-06-14

Abstract

本发明涉及晚期糖基化终末产物检测技术领域，尤其涉及一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用。本发明检测血清中游离晚期糖基化终末产物的试剂盒包括洗脱液、稀释液、蛋白沉淀剂、质控品；所述蛋白沉淀剂为磺基水杨酸；本发明同时提供了一种检测血清样本中游离晚期糖基化终末产物的方法。采用本发明的检测方法及试剂盒，样品前处理更加简单、方便，仅需要一步蛋白沉淀过程，就能有效提取样本中的24种游离AGEs，同时可实现“一针进样”同时检测24种游离AGEs，单个样本检测时长为6分钟，大大缩短样本时间，通过色谱条件优化，能将生物体内存在的AGEs同分异构体实现基线分离，提高了定量的特异性和准确性。

Description

一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及晚期糖基化终末产物检测技术领域，尤其涉及一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用。

背景技术

晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)是体内蛋白质、脂质或核酸类大分子暴露于还原糖中生成的一组复杂的异质性物质，是人体在非酶促条件下，体内葡萄糖或其他还原糖的醛基或酮基与蛋白质、核酸、脂质等一些大分子物质的自由氨基，在体内经过系列反应生成的不可逆终末产物。AGEs对酶稳定，不易被降解，主要通过肾脏清除，在体内随着糖尿病、衰老等发展过程不断生成和蓄积，直接或间接与细胞表面的受体结合而发挥细胞毒性作用。多种研究表明体内血清中游离AGEs的含量在某些代谢性疾病如糖尿病及其并发症，心脑血管疾病如动脉粥样硬化及阿尔茨海默症等疾病中呈现不同程度的升高，是这类疾病的预警、诊断及疗效监测标志物。因此对不同疾病状态下各种不同结构的AGEs进行精准定量，为开发疾病的早期诊断标志物及疗效检测指标具有重要意义。

血清内游离AGEs是一类氨基酸衍生型的小分子物质，根据其与氨基酸结合类型的不同可大致分为赖氨酸衍生型、精氨酸衍生型、赖氨酸-精氨酸交联衍生型、半胱氨酸衍生型及组氨酸衍生型等。游离型AGEs在血液中含量低(通常在pmol水平)、结构类似物众多，因此，对检测方法的灵敏度和特异性要求很高。目前AGEs的常用检测方法包括荧光光谱法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、免疫荧光法(FIA)、免疫组织化学法和放射免疫分析法(RIA)、液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)等。荧光光谱法在临床应用较多，但是存在只能检测到具有荧光发光基团的少数几种AGEs的缺点。ELISA法是基于抗原抗体特异性结合的检测方法。然而由于一些AGEs有相同的抗原决定簇，其抗原表位发生改变会导致检测结果假性降低，另一方面AGEs可能会与非AGEs修饰的结构发生交叉反应导致结果假性升高，同时不含该抗原表位的蛋白来源AGEs和脂类来源的AGEs不能检测。RIA存在放射性核素对人体损害较大并造成环境污染。以抗原-抗体免疫反应为基础的方法，不可避免的带来了非特异性反应的问题而使得测定结果有明显系统误差，同时各实验室使用不同生产厂家的试剂导致结果可比性差，直接影响了检测结果在疾病筛查中的可信度。HPLC法能对AGEs中特定的几种能发荧光或者紫外光的化合物进行检测，对结构及其相似的化合物不能做到全部分离，从而干扰方法的特异性。

随着质谱技术的快速发展，液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)由于结合了质谱的高分辨与液相的高分离特点，对于小分子化合物的定量有着独特的优势。然而由于AGEs这类物质具有种类繁多、结构复杂、商品化的纯度标准品难以获得、化合物极性大色谱分离困难且存在多种同分异构体，关于多种血清游离AGEs同步检测的LC-MS/MS方法还未见报道。同时目前缺乏相应的质谱检测试剂盒应用于临床检测，限制了其在临床上的应用。因此，开发稳定的基于LC-MS/MS技术的检测血清游离AGEs的方法，并研制相应的检测试剂盒能够为临床提供更加准确可靠的检测方法，对推广精准医疗，提高国内代谢性相关疾病的诊断治疗水平具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用。本发明采用同步检测血清中24种游离AGEs的LC-MS/MS方法检测血清中游离AGEs，具有简单、耗时显著缩短、精准定量的优点。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种检测血清中游离晚期糖基化终末产物的试剂盒，所述试剂盒包括洗脱液、稀释液、蛋白沉淀剂、质控品；

所述蛋白沉淀剂为磺基水杨酸；

所述晚期糖基化终末产物包括：N-(羧甲基)-赖氨酸CML、N-(1-羧乙基)赖氨酸CEL、N⁶-甲酰基赖氨酸Formyl Lysine、N⁶-乙酰基赖氨酸Acetyl Lysine、N⁶-丙酰基赖氨酸lactoyl Lysine、N⁶-草酰基赖氨酸Oxalyl Lysine、N⁶-丙三醇基赖氨酸glycerinylLysine、N-(2-羟乙酰基)赖氨酸GALA、吡咯素Pyrraline、N-(羧甲基)-精氨酸CMA、N-(羧乙基)精氨酸CEA、N-(二甲基嘧啶)精氨酸Argpyrimidine、咪唑啉酮精氨酸G-H、甲基咪唑啉酮精氨酸MG-H、3-脱氧葡萄糖酮3DG-H、四氢嘧啶THP、乙二醛-赖氨酸二聚体GOLD、甲基乙二醛-赖氨酸二聚体MOLD、3-脱氧葡萄糖苷-赖氨酸二聚体DOLD、N⁶-乙二醛基赖氨酸二聚体GOLA、乙二醛赖氨酸-精氨酸二聚体GODIC、甲基乙二醛赖氨酸-精氨酸二聚体MODIC、戊糖苷素PEN、羧甲基半胱氨酸CMC中的一种或多种。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述蛋白沉淀剂与血清样本的体积比为(1:4)～(1:1)。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B；所述洗脱液A为九氟戊酸水溶液，所述洗脱液B为质谱纯乙腈。优选地，所述九氟戊酸水溶液中九氟戊酸的浓度为20mmol/L。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述稀释液为空白血清基质，所述质控品为以所述稀释液作溶剂的溶液。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述质控品包括4种，其中溶质分别是：浓度为1、50、100和500ng/mL的所述晚期糖基化终末产物。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括复溶液、标准品和内标液；

所述复溶液为甲酸：水溶液；所述复溶液中甲酸与水的体积比为甲酸：水＝1：99；

所述标准品为所述晚期糖基化终末产物与所述复溶液的混合溶液，混合标准品的浓度分别为1、5、10、50、125、250和500ng/mL；

所述内标液为晚期糖基化终末产物内标溶液与所述复溶液的混合溶液，所述晚期糖基化终末产物内标溶液为超纯水配制的CML-d4、GOLD-¹⁵N₂、G-H1-¹³C₂、MG-H1-d3、Pentosidine-d3的混合溶液。优选地，所述混合溶液浓度为50ng/mL。

本发明同时提供一种检测血清样本中游离晚期糖基化终末产物的方法，包括如下步骤：

(1)样本预处理：将血清样本用蛋白沉淀剂磺基水杨酸沉淀处理，离心取上清，氮气吹干，甲酸水溶液复溶；优选地，所述蛋白沉淀剂与血清样本的体积比为1：1；

优选地，所述步骤(1)具体操作如下：取200μL血清样本于2mL Eppendorf中，加入20μL，50ng/mL CML-d4、GOLD-¹⁵N₂、G-H1-¹³C₂、MG-H1-d3、Pentosidine-d3内标化合物，斡旋混匀后于室温平衡10min，加入200μL 6％的磺基水杨酸溶液，斡旋混匀3min后，12,000g离心10min，取上清，氮气吹干，以300μL 1％甲酸水溶液复溶。

(2)色谱分离：将步骤(1)预处理后的样本10～50μL上样至色谱柱，在流速为0.2～0.4mL/min，柱温35～45℃条件下，以梯度洗脱5～7min；

优选地，所述梯度洗脱中洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B；所述洗脱液A为20mmol/L的九氟戊酸水溶液，所述洗脱液B为质谱纯乙腈；

优选地，所述色谱分离的梯度条件如下：0～1.0min，30％B；1.0～2.0min B相从30％增加至50％；2.0～3.0min B相从50％增加至90％；3.0～5.0min，90％B；5.0～5.1minB相从90％降低至30％；5.1～6.0，30％B；

更优选地，所述步骤(2)取预处理的样本10μL上样，以流速0.2ml/min洗脱。

(3)质谱检测：取步骤(1)预处理后的样本，选择ESI正离子模式上样，采用多反应监测技术检测晚期糖基化终末产物；

优选地，所述质谱检测中质谱参数如下：毛细管电压为3kV、锥孔电压为30V、离子源温度为149℃、脱溶剂温度450℃，质谱扫描模式采用多反应检测；

(4)利用系列浓度的晚期糖基化终末产物标准品制备标准曲线，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清样本中各个游离晚期糖基化终末产物的含量。

需要说明的是，本发明液相条件可以实现“一针进样”在六分钟内对所有24种AGEs进行有效完全分离，同步检测大大缩短了分析时间。

需要说明的是，本发明检测方法利用ESI离子化模式，优化了质谱条件，大大提高了检测信号的灵敏度；方法学考察结果显示，该方法精密度、准确度、稳定性均满足定量分析要求。

作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(2)中所述色谱柱为Waters AtlantisPremier BEH C18 AX，1.7um，100×2.1mm色谱柱。

需要说明的是，本发明的检测方法利用Waters Atlantis Premier BEH C18AX，1.7um，100×2.1mm色谱柱，以及条件优化实现了24种AGEs和其结构类似物的有效分离，方法特异性好。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤(1)还包括在进行血清样本前处理前加入内标化合物，所述内标化合物选自CML-d4、GOLD-¹⁵N₂、G-H1-¹³C₂、MG-H1-d3和Pentosidine-d3中的一种或多种。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤(3)中多反应监测技术检测所述游离晚期糖基化终末产物及内标的参数如下：

MG-H离子对，m/z:229-70，去簇电压为40V、碰撞电压为30V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为12V；

G-H离子对，m/z:215-70，去簇电压为30V、碰撞电压为20V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为10V；

CEL离子对，m/z:219-84，去簇电压为40V、碰撞电压为20V、碰撞池入口电压为9V、碰撞池出口电压为12V；

CML离子对，m/z:205-84，去簇电压为40V、碰撞电压为15V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为11V；

CEA离子对，m/z:247-70，去簇电压为20V、碰撞电压为30V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为12V；

CMA离子对，m/z:233-70，去簇电压为20V、碰撞电压为20V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为7V；

GALA离子对，m/z:205-84，去簇电压为40V、碰撞电压为25V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为12V；

Pyrraline离子对，m/z:255-175，去簇电压为20V、碰撞电压为12V、碰撞池入口电压为3V、碰撞池出口电压为16V；

Argpyrimidine离子对，m/z:255-70，去簇电压为40V、碰撞电压为20V、碰撞池入口电压为4V、碰撞池出口电压为15V；

GOLD离子对，m/z:327-84，去簇电压为40V、碰撞电压为30V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为12V；

MOLD离子对，m/z:341-84，去簇电压为60V、碰撞电压为30V、碰撞池入口电压为11V、碰撞池出口电压为14V；

GODIC离子对，m/z:343-183，去簇电压为40V、碰撞电压为30V、碰撞池入口电压为7V、碰撞池出口电压为13V；

Pentosidine离子对，m/z:379-135，去簇电压为40V、碰撞电压为40V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为16V；

CMC离子对，m/z:180-163，去簇电压为20V、碰撞电压为10V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为14V；

Formyl-L离子对，m/z:175-112，去簇电压为40V、碰撞电压为12V、碰撞池入口电压为9V、碰撞池出口电压为11V；

Acetyl-Lysine离子对，m/z:189-84，去簇电压为30V、碰撞电压为20V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为12V；

Lactoyl-Lysine离子对，m/z:219-156，去簇电压为32V、碰撞电压为20V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为8V；

Oxalyl-Lysine离子对，m/z:219-112，去簇电压为50V、碰撞电压为20V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为7V；

Glycerinyl-Lysine离子对，m/z:235-84，去簇电压为48V、碰撞电压为37V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为6V；

3DG-H离子对，m/z:319-115，去簇电压为30V、碰撞电压为20V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为12V；

THP离子对，m/z:319-70，去簇电压为52V、碰撞电压为32V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为11V；

DOLD离子对，m/z:431-302，去簇电压为50V、碰撞电压为26V、碰撞池入口电压为12V、碰撞池出口电压为14V；

GOLA离子对，m/z:333-84，去簇电压为45V、碰撞电压为54V、碰撞池入口电压为11V、碰撞池出口电压为13V；

MODIC离子对，m/z:357-70，去簇电压为50V、碰撞电压为44V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为12V；

CML-d4离子对，m/z:209-134，去簇电压为30V、碰撞电压为12V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为11V；

MG-H1-d3离子对，m/z:232-70，去簇电压为40V、碰撞电压为25V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为12V；

G-H1-¹³C₂离子对，m/z:217-70，去簇电压为30V、碰撞电压为25V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为10V；

GOLD-¹⁵N₂离子对，m/z:329-85，去簇电压为30V、碰撞电压为35V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为12V；

Pentosidine-d3离子对，m/z:382-138，去簇电压为30V、碰撞电压为45V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为16V。

本发明还提供了所述试剂盒在同位素稀释液相色谱串联质谱法检测血清晚期糖基化终末产物方法中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明的ID-LC-MS/MS(高效液相色谱-串联质谱)检测血清晚期糖基化终末产物(AGEs)的方法及试剂盒，样品前处理更加简单、方便，仅仅需要一步蛋白沉淀过程，就能有效提取样本中的AGEs，时间大大缩短，不需要衍生化和/或固相提取步骤，通过色谱条件优化，能将生物体内存在的AGEs同分异构体实现基线分离，“一针进样”可实现样本中24种AGEs的同步检测，提高了定量的特异性和准确性；发明人通过开发本发明的ID-LC-MS/MS检测方法的相应的检测试剂盒，能够为临床提供更加准确可靠的检测方法，为临床疾病的早期诊断标志物的开发提供可靠参考；

(2)本发明的检测方法具有准确度高、重现性好，稳定、可靠的特点，可用于血清中晚期糖基化终末产物(AGEs)的同步定量检测；

(3)与GC-MS/MS方法相比，本发明的检测方法提高了灵敏度，操作简单，节约分析成本，所需分析时间较短，利于开展大批量样本检测，适于进行人群中相关疾病的筛查；为我国血清晚期糖基化终末产物(AGEs)的检测提供了切实可行的方法和检测试剂盒。

附图说明

图1为血清中24种游离晚期糖基化终末产物(AGEs)的化学结构，其中CML表示N-(羧甲基)-赖氨酸、CEL表示N-(1-羧乙基)赖氨酸、Formyl Lysine表示N⁶-甲酰基赖氨酸、acetyl Lysine表示N⁶-乙酰基赖氨酸、lactoyl Lysine表示N⁶-丙酰基赖氨酸、OxalylLysine表示N⁶-草酰基赖氨酸、glycerinyl Lysine表示N⁶-丙三醇基赖氨酸、GALA表示N-(2-羟乙酰基)赖氨酸、Pyrraline表示吡咯素、CMA表示N-(羧甲基)-精氨酸、CEA表示N-(羧乙基)精氨酸、Argpyrimidine表示N-(二甲基嘧啶)精氨酸、G-H表示咪唑啉酮精氨酸、MG-H表示甲基咪唑啉酮精氨酸、3DG-H表示3-脱氧葡萄糖酮、THP表示四氢嘧啶、GOLD表示乙二醛-赖氨酸二聚体、MOLD表示甲基乙二醛-赖氨酸二聚体、DOLD表示3-脱氧葡萄糖苷-赖氨酸二聚体、GOLA表示N⁶-乙二醛基赖氨酸二聚体、GODIC表示乙二醛赖氨酸-精氨酸二聚体、MODIC表示甲基乙二醛赖氨酸-精氨酸二聚体、PEN表示戊糖苷素、CMC表示羧甲基半胱氨酸。

图2为血清中24种游离晚期糖基化终末产物(AGEs)的LC-MS/MS图谱，其中，intensity表示强度，time表示时间，CML表示N-(羧甲基)-赖氨酸、CEL表示N-(1-羧乙基)赖氨酸、Formyl Lysine表示N⁶-甲酰基赖氨酸、Acetyl Lysine表示N⁶-乙酰基赖氨酸、LactoylLysine表示N⁶-丙酰基赖氨酸、Oxalyl Lysine表示N⁶-草酰基赖氨酸、glycerinyl Lysine表示N⁶-丙三醇基赖氨酸、GALA表示N-(2-羟乙酰基)赖氨酸、Pyrraline表示吡咯素、CMA表示N-(羧甲基)-精氨酸、CEA表示N-(羧乙基)精氨酸、Argpyrimidine表示N-(二甲基嘧啶)精氨酸、G-H表示咪唑啉酮精氨酸、MG-H表示甲基咪唑啉酮精氨酸、3DG-H表示3-脱氧葡萄糖酮、THP表示四氢嘧啶、GOLD表示乙二醛-赖氨酸二聚体、MOLD表示甲基乙二醛-赖氨酸二聚体、DOLD表示3-脱氧葡萄糖苷-赖氨酸二聚体、GOLA表示N⁶-乙二醛基赖氨酸二聚体、GODIC表示乙二醛赖氨酸-精氨酸二聚体、MODIC表示甲基乙二醛赖氨酸-精氨酸二聚体、PEN表示戊糖苷素、CMC表示羧甲基半胱氨酸。

具体实施方式

本发明涉及生物标记物体外检测领域，具体涉及一种血清中24种晚期糖基化终末产物(AGEs)的同位素稀释液相色谱-串联质谱技术检测方法及试剂盒。

本发明提供了一种高效液相色谱-串联质谱检测血清晚期糖基化终末产物(AGEs)的方法及试剂盒，通过前处理、色谱柱、色谱条件、质谱类型、质谱参数的优化选择，实现了血清AGEs的检测，特别是实现了血清中24种游离AGEs的同步定量检测，对其干扰物实现了基线分离；本发明用于检测血清中AGEs时，简单快捷，具有良好的特异性、精密度、准确度、稳定性，能够为临床提供更加准确可靠的检测方法。

在一些实施例中，本发明提供了一种同位素稀释液相色谱串联质谱技术检测血清晚期糖基化终末产物(AGEs)的方法，包括如下步骤：

采用同位素稀释液相色谱串联质谱技术同步检测经过预处理的血清样本中24种晚期糖基化终末产物(AGEs)，利用同位素稀释液相色谱将目标AGEs与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，分别计算24种AGEs的含量。

在一些实施例中，本发明提供了检测血清样本中晚期糖基化终末产物(AGEs)的方法，采用同位素稀释液相色谱串联质谱检测血清样本中AGEs，AGEs包括N-(羧甲基)-赖氨酸(CML)、N-(1-羧乙基)赖氨酸(CEL)、N⁶-甲酰基赖氨酸(Formyl Lysine)、N⁶-乙酰基赖氨酸(acetyl Lysine)、N⁶-丙酰基赖氨酸(lactoyl Lysine)、N⁶-草酰基赖氨酸(OxalylLysine)、N⁶-丙三醇基赖氨酸(glycerinyl Lysine)、N-(2-羟乙酰基)赖氨酸(GALA)、吡咯素(Pyrraline)、N-(羧甲基)-精氨酸(CMA)、N-(羧乙基)精氨酸(CEA)、N-(二甲基嘧啶)精氨酸(Argpyrimidine)、咪唑啉酮精氨酸(G-H1、G-H2、G-H)、甲基咪唑啉酮精氨酸(MG-H)、3-脱氧葡萄糖酮(3DG-H)、四氢嘧啶(THP)、乙二醛-赖氨酸二聚体(GOLD)、甲基乙二醛-赖氨酸二聚体(MOLD)、3-脱氧葡萄糖苷-赖氨酸二聚体(DOLD)、N⁶-乙二醛基赖氨酸二聚体(GOLA)、乙二醛赖氨酸-精氨酸二聚体(GODIC)、甲基乙二醛赖氨酸-精氨酸二聚体(MODIC)、戊糖苷素(PEN)、羧甲基半胱氨酸(CMC)。包括如下步骤：

(1)样本预处理：将血清样本用磺基水杨酸沉淀，12,000g离心10分钟，取上清，氮气吹干，甲酸水溶液复溶；磺基水杨酸与血清样本的体积比优选为1:1；

(2)色谱分离：将步骤(1)预处理后的样本10～50μL上样至Waters AtlantisPremier BEH C18 AX，1.7um，100×2.1mm色谱柱，在流速为0.2～0.4mL/min，柱温40℃条件下，以梯度洗脱6分钟；

其中洗脱液A为20mmol/L的九氟戊酸水溶液，洗脱液B为乙腈；

梯度条件如下：0～1.0min，30％B；1.0～2.0min B相从30％增加至50％；2.0～3.0min B相从50％增加至90％；3.0～5.0min，90％B；5.0～5.1min B相从90％降低至30％；5.1～6.0，30％B；

需要说明的是，该液相条件可以实现“一针进样”在六分钟内对所有24种AGEs进行有效完全分离，同步检测大大缩短了分析时间。

(3)质谱检测：取步骤(1)预处理后的样本，选择ESI正离子模式上样，采用多反应监测技术检测24种AGEs，其中，质谱参数如下：毛细管电压为3kV、锥孔电压为30V、离子源温度为150℃、脱溶剂温度450℃，质谱扫描模式采用多反应检测的；

(4)利用系列浓度的各种AGEs标准品混合液制备标准曲线的步骤，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清样本中AGEs的含量。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明的实施例中涉及的仪器、材料与试剂说明如下：

串联质谱仪(Waters Xevo TQ-S)，高效液相(Waters ACQUITY UPLC system)。N-(羧甲基)-赖氨酸(CML)、N-(1-羧乙基)赖氨酸(CEL)、N⁶-丙酰基赖氨酸(lactoyl Lysine)、N⁶-草酰基赖氨酸(Oxalyl Lysine)、N⁶-丙三醇基赖氨酸(glycerinyl Lysine)、N-(2-羟乙酰基)赖氨酸(GALA)、N-(羧甲基)-精氨酸(CMA)、N-(羧乙基)精氨酸(CEA)、咪唑啉酮精氨酸(G-H)、甲基咪唑啉酮精氨酸(MG-H)、3-脱氧葡萄糖酮(3DG-H)、四氢嘧啶(THP)、乙二醛-赖氨酸二聚体(GOLD)、甲基乙二醛-赖氨酸二聚体(MOLD)、3-脱氧葡萄糖苷-赖氨酸二聚体(DOLD)、N⁶-乙二醛基赖氨酸二聚体(GOLA)、乙二醛赖氨酸-精氨酸二聚体(GODIC)、甲基乙二醛赖氨酸-精氨酸二聚体(MODIC)、羧甲基半胱氨酸(CMC)均是从Iris Biotech公司购买。吡咯素(Pyrraline)、N-(二甲基嘧啶)精氨酸(Argpyrimidine)、N⁶-甲酰基赖氨酸(FormylLysine)、N⁶-乙酰基赖氨酸(acetyl Lysine)、N-(羧甲基)-赖氨酸(CML)从TRC公司购买。戊糖苷素(PEN)购自ZZ STANDERD公司。咪唑啉酮精氨酸(G-H)购自默克公司。活性炭吸附血清从Equitech-Bio,Inc.(美国)购买。磺基水杨酸及九氟戊酸购自Sigma公司。质谱级甲醇及乙腈购自Merck公司，2mL Eppendorf管购自Eppendorf公司，容量瓶购自BRAND GMBH+CO KG(德国)。纯水是通过Millipore Simplicity UA纯水仪纯化得到。

本发明中的标准品和内标液的配制方法，采用如下步骤：

(1)标准品母液制备

分别精确称取2mg上述24中AGEs标准品并混合，用20mL 50％甲醇水溶解，用20mL容量瓶定容，得0.1mg/mL的储备液。用50％甲醇水将储备液稀释成1μg/mL的标准品母液。

(2)标准品配制

将标准品母液用50％甲醇水稀释成7个不同浓度的校准品：1,5,10,50,125,250和500ng/mL，不同浓度的校准品各1mL，保存于-20℃条件下。

(3)内标液CML-d4、GOLD-¹⁵N₂、G-H-¹³C2、MG-H-d3、Pentosidine-d3混合溶液制备

分别称取CML-d4、GOLD-¹⁵N₂、G-H-¹³C2、MG-H-d3、Pentosidine-d3并混合，用超纯水溶解后配制成0.1mg/mL的储备液。将储备液用超纯水稀释至1μg/mL即得实验用内标母液，继续稀释至50ng/mL即得实验用内标溶液。

实施例1检测条件的优化

(1)色谱条件的优化：色谱柱选择

预实验中使用Waters ACQUITY UPLC HSS T3，1.8um，50×2.1mm柱；WatersACQUITY UPLC BEH C18，1.7um，50×2.1mm柱；Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC，1.7um，50×2.1mm柱；Waters ACQUITY UPLC HSS T3，1.8um，50×2.1mm柱；Thermo Acclaim Mixed-Mode WAX-1，3um，150×2.1mm柱；Thermo scientific Accucore PFP,2.6um，100×2.1mm柱；Thermo scientific Hypercarb，3um，100×2.1mm柱；Waters Atlantis Premier BEHC18 AX，1.7um，100×2.1mm柱等8款不同色谱柱进行样本分析。

结果表明Waters Atlantis Premier BEH C18 AX，1.7um，100×2.1mm柱对AGEs及其结构类似物分离效果最佳。其他7种LC柱对其分离效果欠佳。Waters Atlantis PremierBEH C18 AX，1.7um，100×2.1mm对目标化合物有较好的保留和较高的柱效，有助于提高检测的特异性和灵敏度，故选其作为该方法的色谱柱。

(2)进样量选择：

对比10、20、30、40和50μL进样量，结果表明，高进样量会导致样品峰出现溶剂效应，使得峰形变差，甚至出现开叉峰。进样量太低会导致检测灵敏度降低。20μL进样时，峰形好，灵敏度也能满足检测需求。因此，选择进样量为20μL进行实验。

(3)缓冲盐、离子对试剂的种类和浓度：

通过比较甲酸铵(10mmol/L)、乙酸铵(10mmol/L)、氟化铵(0.1mmol/L)、九氟戊酸(20mmol/L)、甲酸(0.1％V/V)、三氟乙酸(0.1％V/V)。比较峰宽、峰形、保留时间与响应强度。

结果表明，适当浓度的九氟戊酸可增加此类极性化合物的保留时间，所得峰形较好，故选择九氟戊酸作为分析的离子对试剂。

分别配制不同浓度的九氟戊酸溶液：1、5、10和20mmol/L，以50ng/mL浓度标准品进样，比较在不同九氟戊酸浓度下，出峰的响应值和S/N。

结果表明，当九氟戊酸的浓度为20mmol/L时，其响应值和S/N均最大。因此，选择此浓度进行为离子对试剂的浓度。

(4)流动相梯度：

流动相梯度的确定是在满足适当的样本保留，良好的色谱峰峰形和良好的色谱分离能力的情况下得到，在流速为0.2mL/min条件下，采用表2梯度洗脱的方式，洗脱6min，目标物峰型良好，分离效果良好，且出峰时间较快，因此选择该条件进行洗脱。

(5)质谱条件的优化：

质谱条件的确定是按照以下步骤得到：比较相同浓度分析物在大气压化学电离(APCI)和电喷雾电离(ESI)两种电离模式下的离子响应，发现ESI模式下响应高，选择ESI模式。然后对比ESI模式下的正负离子强度，发现正离子模式响应高，选择正离子模式。

离子模式确定后，再优化多反应监测器(MRM)条件，具体包括以下步骤：根据分析物分子量，确定分析物母离子，通过在ESI正离子模式下，采用7μL/min的针泵注射标准溶液，进行母离子扫描，扫描范围：10-400Da，扫描速度：200Da/s。在图谱中寻找分析物母离子，然后选择特点的母离子进行子离子的选择。

所述子离子的选择按照以下步骤得到：选择特定的母离子后进行子离子扫描，扫描范围：50-400Da，扫描速度：200Da/s。调节DP，来寻找响应最高的子离子。确定好母离子和子离子后，进行质谱参数和MRM条件的优化。

(6)质谱参数的优化需要优化以下参数：毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂温度。

MRM条件的优化需要优化以下参数：锥孔电压Cone(V)、碰撞电压Collision(V)，驻留时间(Dwell time)。

质谱条件为在电喷雾电离(ESI)正离子检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；毛细管电压为3kV、锥孔电压为30V、离子源温度为150℃、脱溶剂温度450℃，锥孔气体流速为147L/h，碰撞气体流速为0.2ml/min；目标分析物和内标的分子量、母离子质荷比(m/z)、子离子质荷比(m/z)、锥孔电压Cone(V)、碰撞电压Collision(V)参数见表1。

表1 AGEs及内标的质谱参数

实施例2

为本发明检测血清样本中24种游离晚期糖基化终末产物(AGEs)的方法的一种实施例。

采用同位素稀释液相色谱串联质谱检测血清样本中24种AGEs，24种AGEs包括N-(羧甲基)-赖氨酸(CML)、N-(1-羧乙基)赖氨酸(CEL)、N⁶-甲酰基赖氨酸(Formyl Lysine)、N⁶-乙酰基赖氨酸(acetyl Lysine)、N⁶-丙酰基赖氨酸(lactoyl Lysine)、N⁶-草酰基赖氨酸(Oxalyl Lysine)、N⁶-丙三醇基赖氨酸(glycerinyl Lysine)、N-(2-羟乙酰基)赖氨酸(GALA)、吡咯素(Pyrraline)、N-(羧甲基)-精氨酸(CMA)、N-(羧乙基)精氨酸(CEA)、N-(二甲基嘧啶)精氨酸(Argpyrimidine)、咪唑啉酮精氨酸(G-H)、甲基咪唑啉酮精氨酸(MG-H)、3-脱氧葡萄糖酮(3DG-H)、四氢嘧啶(THP)、乙二醛-赖氨酸二聚体(GOLD)、甲基乙二醛-赖氨酸二聚体(MOLD)、3-脱氧葡萄糖苷-赖氨酸二聚体(DOLD)、N⁶-乙二醛基赖氨酸二聚体(GOLA)、乙二醛赖氨酸-精氨酸二聚体(GODIC)、甲基乙二醛赖氨酸-精氨酸二聚体(MODIC)、戊糖苷素(PEN)、羧甲基半胱氨酸(CMC)。包括如下步骤：

其中洗脱液A为20mmol/L的九氟戊酸水溶液，洗脱液B为乙腈；

(3)质谱检测：取步骤(1)预处理后的样本，选择ESI正离子模式上样，采用多反应监测技术检测24种AGEs，其中，

质谱参数如下：毛细管电压为3kV、锥孔电压为30V、离子源温度为150℃、脱溶剂温度450℃，质谱扫描模式采用多反应检测；

其中，步骤(1)在进行血清样本前处理前还包括加入CML-d4、GOLD-¹⁵N₂、G-H-¹³C2、MG-H-d3、Pentosidine-d3等内标化合物的操作。

步骤(1)具体操作如下：取200μL血清样本于2mL Eppendorf中，加入20μL，50ng/mLCML-d4、GOLD-¹⁵N₂、G-H-¹³C2、MG-H-d3、Pentosidine-d3内标化合物，斡旋混匀后于室温平衡10min，加入200μL 6％的磺基水杨酸溶液，斡旋混匀3min后，12,000g离心10min，取上清，氮气吹干，以300μL 1％甲酸水溶液复溶。

步骤(2)中色谱条件为：

流动相A：20mmol/L九氟戊酸水溶液；

流动相B：乙腈，纯度为质谱纯；

色谱柱型号：Waters Atlantis Premier BEH C18 AX，1.7um，100×2.1mm色谱柱；

采用梯度洗脱的方式，洗脱6min，梯度条件见表2。

表2 AGEs检测的梯度条件

Time/min	Pump B ACN(％)
		0.0	30
1.0	30
		2.0	50
3.0	90
		5.0	90
5.1	30
		6.0	30

步骤(3)中在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；毛细管电压为3kV、锥孔电压为30V、离子源温度为150℃、脱溶剂温度450℃，锥孔气体流速为147L/h，碰撞气体流速为0.2ml/min；目标分析物和内标的分子量、母离子质荷比(m/z)、子离子质荷比(m/z)、锥孔电压Cone(V)、碰撞电压Collision(V)参数见表1。

实施例3

本发明的检测血清样本中24种AGEs的试剂盒的一种实施例。

如表3所示，采用液相色谱串联质谱技术检测血清样本中AGEs，包括如下试剂：

(1)洗脱液：

洗脱液A：20mmol/L九氟戊酸水溶液；

洗脱液B：乙腈，纯度为质谱纯；

(2)标准品：

标准品的配制主要包括标准品母液的配制：

标准品母液：AGEs的50％甲醇水溶液；

配制：分别精确称取2mg上述24种AGEs标准品并混合，用20mL 50％甲醇水溶解，用20mL容量瓶定容，得0.1mg/mL的储备液。用50％甲醇水将储备液稀释成1μg/mL的标准品母液。

将标准品母液用50％甲醇水稀释成7个不同浓度的校准品：1，5，10，50，125，250和500ng/mL。

不同浓度的校准品各1mL，保存于-20℃条件下。

(3)内标液：CML-d4、GOLD-¹⁵N₂、G-H-¹³C2、MG-H-d3、Pentosidine-d3混合溶液；

(4)蛋白沉淀剂：5-磺基水杨酸。

(5)质控品：AGEs血清基质溶液。用稀释液分别配制低中高浓度的QC1、QC2、QC3、QC4，浓度分别为：1、50、100和500ng/mL。

(6)稀释液：所述稀释液为空白血清基质溶液，该空白血清基质溶液为活性炭吸附人血清。

表3检测血清24种游离AGEs的试剂盒组分

实施例4实施例3的试剂盒的效果验证

实施例2采用AGEs的同位素稀释液相色谱串联质谱技术和实施例3的试剂盒，所得MRM监测色谱图如图1所示：24种AGEs及内标标准品及血清样品中的峰形对称，基本没有杂质干扰。表明该条件能够用于血清游离AGEs的定量分析。

AGEs含量的确定：校准曲线采用同位素内标定量法，利用Analyst软件以标准品与内标的浓度比为X轴，标准品与内标峰面积比为Y轴，建立曲线，计算血清中24种AGEs的浓度；24种AGEs在1～500ng/mL范围内线性较好，相关系数在0.99以上，满足定量要求。

检测灵敏度：实施例3的试剂盒检测24种AGEs的定量限(LOQ)均为1ng/mL，检测限(LOD)则小于1ng/mL，重复5次检测CVs均小于20％。所述LOD满足信噪比(S/N)>3，LOQ满足信噪比(S/N)>10，且重复5次检测CVs<20％。具体参数见表4。

表4检测血清24种游离AGEs的灵敏度

精密度试验：取200μL低、中、高四个浓度的AGEs质控品，其中24种AGEs的浓度分别为：1、5、10、50ng/mL。批内精密度是每个样本重复测定10次。批间精密度每批测定5次，每批均作标准曲线，连续测定3天，共15次测量。结果批内精密度(n＝10)：CV：1.63-3.88％；批间精密度(n＝15)，CV：3.54％-8.27％。

回收率试验：取200μL的碳吸附空白血清，分别加入10、50和500ng/mL的标准品溶液，每个浓度平行做3个样本，重复操作3次。24种AGEs的加标回收率均在95％～105％范围内，结果参见表5。

表5检测血清24种游离AGEs的加标回收率

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种检测血清中游离晚期糖基化终末产物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括洗脱液、稀释液、蛋白沉淀剂、质控品；

所述蛋白沉淀剂为磺基水杨酸；

所述晚期糖基化终末产物包括：N-(羧甲基)-赖氨酸CML、N-(1-羧乙基)赖氨酸CEL、N⁶-甲酰基赖氨酸Formyl Lysine、N⁶-乙酰基赖氨酸Acetyl Lysine、N⁶-丙酰基赖氨酸lactoylLysine、N⁶-草酰基赖氨酸Oxalyl Lysine、N⁶-丙三醇基赖氨酸glycerinyl Lysine、N-(2-羟乙酰基)赖氨酸GALA、吡咯素Pyrraline、N-(羧甲基)-精氨酸CMA、N-(羧乙基)精氨酸CEA、N-(二甲基嘧啶)精氨酸Argpyrimidine、咪唑啉酮精氨酸G-H、甲基咪唑啉酮精氨酸MG-H、3-脱氧葡萄糖酮3DG-H、四氢嘧啶THP、乙二醛-赖氨酸二聚体GOLD、甲基乙二醛-赖氨酸二聚体MOLD、3-脱氧葡萄糖苷-赖氨酸二聚体DOLD、N⁶-乙二醛基赖氨酸二聚体GOLA、乙二醛赖氨酸-精氨酸二聚体GODIC、甲基乙二醛赖氨酸-精氨酸二聚体MODIC、戊糖苷素PEN、羧甲基半胱氨酸CMC中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白沉淀剂与血清样本的体积比为(1:4)～(1:1)。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B；所述洗脱液A为九氟戊酸水溶液，所述洗脱液B为质谱纯乙腈。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液为空白血清基质，所述质控品为以所述稀释液作为溶剂的溶液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品包括4种，其中溶质分别是：浓度为1、50、100和500ng/mL的所述晚期糖基化终末产物。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括复溶液、标准品和内标液；

所述内标液为晚期糖基化终末产物内标溶液与所述复溶液的混合溶液，所述晚期糖基化终末产物内标溶液为超纯水配制的CML-d4、GOLD-¹⁵N₂、G-H1-¹³C₂、MG-H1-d3和Pentosidine-d3的混合溶液。

7.一种检测血清样本中游离晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样本预处理：将血清样本用蛋白沉淀剂磺基水杨酸沉淀处理，离心取上清，氮气吹干，甲酸水溶液复溶；

(4)利用系列浓度的晚期糖基化终末产物标准品制备标准曲线，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清样本中所述游离晚期糖基化终末产物的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述色谱柱为Waters AtlantisPremier BEH C18 AX，1.7um，100×2.1mm色谱柱。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)还包括在进行血清样本前处理前加入内标化合物，所述内标化合物选自CML-d4、GOLD-¹⁵N₂、G-H1-¹³C₂、MG-H1-d3和Pentosidine-d3中的一种或多种。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中多反应监测技术检测所述游离晚期糖基化终末产物及内标的参数如下：