CN108982700A

CN108982700A - PQQ对AGEs的抑制作用的研究方法

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Publication number: CN108982700A
Application number: CN201810927948.XA
Authority: CN
Inventors: 顾晓波; 周杏琴; 蔡刚明; 张荣军; 俞惠新; 包建东
Original assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Current assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Priority date: 2018-08-15
Filing date: 2018-08-15
Publication date: 2018-12-11
Anticipated expiration: 2038-08-15
Also published as: CN108982700B

Abstract

PQQ对AGEs的抑制作用的研究方法，是继PQQ（吡咯并喹呤醌）与Lys及Arg反应行为研究的方法之后，是PQQ与晚期糖基化终产物AGEs抑制作用的研究成果，属于生物分析技术领域。Nε‑（羧甲基）赖氨酸（CML），Nε‑（羧乙基）赖氨酸（CEL）是AGEs最主要的单体之一，本发明在测定CML、CEL的方法上进行了优化和改进，采用正‑丁醇/HCl衍生反应、固相萃取、UPLC‑MS/MS检测血浆中CML和CEL的含量，具有高效、准确、灵敏的特点。用所建立的方法分析D‑gal（D‑半乳糖）诱导衰老型大鼠和给予一定剂量的多奈哌齐（Don）和PQQ干预后，CML、CEL、蛋白结合CML和蛋白结合CEL的变化，为退行性疾病的发病机制和药物作用靶点提供新的依据。

Description

PQQ对AGEs的抑制作用的研究方法

技术领域

PQQ对AGEs的抑制作用的研究方法，是继PQQ（吡咯并喹呤醌）与Lys（赖氨酸）及Arg（精氨酸）反应行为研究的方法之后，是研究PQQ对晚期糖基化终产物AGEs抑制作用的结果，属于生物分析技术领域。

背景技术

老年性痴呆（Alzheimer disease，AD）是老年人常见的疾病，是一种以原发性智能障碍为主要表现的脑部疾病，其发病机制尚不明确。根据之前的假设，AD起因于大脑中Aβ蛋白的堆积和淀粉样蛋白的形成。因此，抑制淀粉样蛋白形成的药物在不断的研究开发中，然而临床试验结果对AD的治疗无显著效果。为了有效地预防和治疗AD，需要发现新的药物靶点和作用机制。

晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs) 是蛋白慢性非酶糖基化产物。AGEs在正常人体内普遍存在，随着年龄的增高血浆AGEs 的水平也会随之升高，它是机体衰老的重要生物标志物。据报道，AGEs的形成可能发生于AD早期斑块的形成之前。因此，AGEs是一个值得研究的重要靶点，通过抑制AGEs在体内的累积来达到预防AD的发生是极为有希望的潜在措施。Nε-（羧甲基）赖氨酸（CML），Nε-（羧乙基）赖氨酸（CEL）是 AGEs最主要的单体之一，是生物体内的糖氧化、脂质氧化和氧化应激的一个重要的生物指标物，与糖尿病、衰老及退行性疾病的发病机制高度相关。

文献报道CML、CEL的检测方法主要有: (1) 酶联免疫吸附法(ELISA)，其缺点是非特异性高。(2) 高效液相色谱结合荧光检测法，采用邻苯二甲醛或FMOC-Cl柱前衍生，耗时长，干扰因素较大。(3) 气相色谱－质谱法(GC-MS)，操作过程比较复杂。(4) 液相色谱-串联质谱检测法，样品前处理和流动相中使用离子对试剂，容易在质谱仪中残留，造成灵敏度下降。

本发明在测定CML、CEL的方法上进行了优化和改进，采用正-丁醇/HCl衍生反应、固相萃取、UPLC-MS/MS检测血浆中CML和CEL的含量。采用以硅胶为填充剂键合了乙醛的CUALD11R3固相萃取小柱处理血浆样本，由于该键合材料能够与活性分子形成共价结合，提高了CML和CEL的提取回收率；同时还检测了蛋白结合 CML 和蛋白结合CEL。具有高效、准确、灵敏的特点。

文献报道D-gal（D-半乳糖）诱导氧化应激损伤可导致衰老，采用腹腔注射D-gal（150mg/kg/d）连续6周可以成功建立AD模型。PQQ是一种氧化还原酶辅基，主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳动物之中。PQQ具有较强的抗氧化能力，能够改善在衰老等神经退行性疾病中因氧化损伤和氧化应激引起的认知功能缺损；能抑制淀粉样蛋白的堆积，在治疗神经系统疾病方面具有较重要的研究前景。另外，最近有文献报道口服PQQ能够改善2型糖尿病小鼠糖耐量受损，能够减轻糖尿病小鼠不同器官氧化损伤。PQQ在神经退行性疾病方面的潜在疗效是否通过抑制AGEs的形成未见报道，能否作为新的治疗靶点对AD的发病机制和治疗是值得深入研究的。本发明所建立的UPLC –MS /MS 结合固相萃取方法研究PQQ对D-gal损伤所致AD模型鼠血浆AGEs含量的变化，未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种PQQ对AGEs的抑制作用的研究方法，在测定CML、CEL的方法上进行了优化和改进，采用正-丁醇/HCl衍生反应、固相萃取、UPLC-MS/MS检测血浆中CML和CEL的含量，具有高效、准确、灵敏的特点。

本发明的技术方案：PQQ对AGEs的抑制作用的研究方法，步骤为：

（1）标准溶液和内标溶液配制：分别准确称取适量CML和CEL标准品，用70%甲醇溶解配成浓度都为200μg /mL的CML和CEL标准溶液；

分别称取适量的[²H₂] -CML和[²H₄] –CEL标准品，用70% 甲醇溶液溶解配制成均为50μg /mL的内标溶液，置于4℃冰箱中保存；移取适量CML和CEL标准溶液，准确加入内标溶液，用水稀释定容，混匀；系列标准溶液浓度约为1～800 ng /mL，内标溶液浓度均为100 ng /mL；

（2）血浆样品前处理：取50µL血浆样品，加400 µL硼砂缓冲溶液(pH 9.2、 0.2M)，加100µL 100mM硼氢化钠溶液，涡旋混合，室温孵育3h，加 1000 µL (4℃)三氟乙酸，充分混匀，10000r/min 4℃离心10min，除去上清液；沉淀物加500µL 6 N HCl溶液，混合均匀，110℃孵育18h，进行蛋白水解；

（3）加CML、CEL内标物

取40μL步骤（2）所得蛋白水解溶液和20μL内标物（含5µg/mL[²H₂] -CML和 [²H₄] –CEL）的混合溶液进行充分混合；然后在70℃的氮气流下蒸发干燥；加100µL正-丁醇/HCl（3/1，V/V），70℃下衍生反应90min；然后在氮气下蒸发干燥，再溶解于200µL水中成溶液；取20µL上述溶液加20µL内标[¹³C₆] -L-赖氨酸（5μg/mL）溶解于500 µL 10 mmol/L 氨水中，为衍生后溶液；

（4）将步骤（3）所得衍生后溶液以1mL/min的速度过CUALD11R3固相萃取小柱，完全富集后用2 mL乙腈-0.1%三氟乙酸（V/V，60/40）水溶液淋洗，真空抽干，再用5 mL 5% 氨水甲醇溶液洗脱，真空抽干并收集流出液，于40℃氮气吹干，浓缩干燥后，用50% 乙腈溶液溶解残留物定容至1mL，涡旋混匀，过0. 22 μm 滤膜后UPLC-MS/MS分析；

（5）CML、CEL和Lys在下列色谱条件下同时达到分离：反相C18色谱柱（BEH C18 column(2.1×100mm,1.7μm)，20 mmol/L 95/5甲酸铵/乙腈5 min，25 min线性梯度至25/75甲酸铵/乙腈，柱温30℃，流速800 µL/min，进样体积2 µL；

优化后的质谱条件：脱溶剂气温度400℃, 脱溶剂气流量600 L/h, 源温度110℃, 锥孔气流速50 L/h, 毛细管电压3000 V, 锥体电压30V；未标记的峰面积与对应的内标峰面积的比值计算出CML、CEL和Lys的浓度。计算蛋白结合CML和蛋白结合CEL浓度(以μmol/molLys表示)；

（6）线性范围与检出限

在1～800 ng /mL 浓度范围内，分别以CML和CEL标准工作溶液浓度(X，ng/mL)为横坐标，以CML和CEL离子峰面积除以内标峰面积的值再与内标浓度（ng/mL）的乘积(Y) 为纵坐标，绘制标准工作曲线，线性方程

CML为：Y = 0. 6278X-2.1037，R²=0.9999；CEL为：Y = 1. 6063X-0.5004，R²=0.9998。将CML和CEL标准溶液稀释，按峰高与噪音的3倍信噪比计算得到CML和CEL最低检出限均为0. 05ng /mL；

（7）精密度试验

在确定的色谱条件下分别于1d内和连续3d内进样测定，CML日内和日间的RSD分别为0.79%和1.13% (n=6)；CEL日内和日间的RSD分别为0.88%和0.97% (n=6)；

（8）色谱条件优化

考察了不同流动相组成：纯水-乙腈体系、甲酸-乙腈体系、三氟乙酸-乙腈体系、甲酸铵-乙腈体系作为流动相的分离效果，发现甲酸铵-乙腈体系时，待测物CML与CEL具有最佳的峰形，调整洗脱梯度为上述条件时，分离度和灵敏度较佳；

（9）硼氢化钠浓度和孵育时间的选择

由于在蛋白水解过程中赖氨酸与糖类反应可能转化为CML，导致测定值高于真实值，因此我们通过添加硼氢化钠抑制CML的形成，精密配置CML和CEL浓度为100ng/mL的标准溶液，按上述方法处理，添加不同浓度的硼氢化钠，实际测定值CML和CEL浓度对硼氢化钠浓度作图（图3）。当硼氢化钠浓度达到100mM，孵育时间3h时CML和CEL浓度不再下降（图4）；

（10）不同固相萃取小柱对CML 和CEL回收率的影响

在空白血浆中分别加入含CML、CEL高、中、低浓度的血浆样品。分别采用不同固相萃取小柱处理血浆样品，测定回收率。结果见表1。

表1 不同固相萃取小柱对CML、CEL回收率的影响

实验结果显示普通的ODS-C18固相萃取小柱回收率较低，Styre Screen® H2P由亲水的N-乙烯吡咯烷酮和亲脂性的二乙烯基苯聚合而成，对极性化合物具有较强的吸附能力。与ODS-C18固相萃取相比，回收率略有提高。Sepax CUALD型号的固相萃取小柱是以硅胶为填充剂，键合不同的共价基团，形成不同吸附能力的固定相。其中CUALD11R3以硅胶为填充剂键合了乙醛，其特点是能与活性分子形成共价结合而极大地提高了吸附能力，而且可以除去还原剂以及基质中的杂蛋白。结果显示采用CUALD11R3固相萃取小柱处理血浆样本后，CML和CEL回收率最高。因此，我们选择CUALD11R3固相萃取小柱，提高了测定样本的回收率，而且由于其能够与蛋白活性分子形成共价结合，我们还能同时测定蛋白结合 CML 和蛋白结合CEL；

（11）PQQ对血浆CML 、CEL、蛋白结合 CML 和蛋白结合CEL的影响

各组血浆样品按上述方法处理后测定，测定结果参见图5。D-gal诱导造模6周后血浆游离CML、CEL、蛋白结合CML和蛋白结合CEL较对照组不同程度的升高，经多奈哌齐及PQQ给药后血浆CML含量均有显著下降；同时PQQ还能降低血浆CEL和蛋白结合CML；而多奈哌齐对二者无影响；然而无论PQQ还是多奈哌齐对血浆蛋白结合CEL均无影响。为PQQ在衰老疾病作用机理研究方面提供了新的依据。

本发明的有益效果：本发明在测定CML、CEL的方法上进行了优化和改进，采用正-丁醇/HCl衍生反应、固相萃取、UPLC-MS/MS检测血浆中CML和CEL的含量，具有高效、准确、灵敏的特点。用所建立的方法分析D-gal（D-半乳糖）诱导衰老型大鼠和给予一定剂量的多奈哌齐（Don）和PQQ干预后，CML、CEL、蛋白结合 CML 和蛋白结合CEL的变化，为退行性疾病的发病机制和药物作用靶点提供新的依据。

附图说明

图1 CML 标准曲线。

图2 CEL标准曲线。

图3 硼氢化钠浓度对实际测定值CML和CEL浓度的关系图。

图4 当硼氢化钠浓度达到100mM，孵育时间对CML和CEL浓度的关系图。

图5 PQQ对血浆CML 、CEL、蛋白结合 CML 和蛋白结合CEL的影响。A：PQQ对CML的影响；B：PQQ对CEL的影响；C：PQQ对蛋白结合CML的影响；D：PQQ对蛋白结合CEL的影响。

具体实施方式

实施例1 PQQ对AGEs的抑制作用的研究方法，步骤为：

(1) 标准溶液和内标溶液配制: 分别准确称取适量CML和CEL标准品，用70%甲醇溶解配成浓度为200μg /mL的CML和CEL标准储备溶液，分别称取适量的[²H₂] -CML和[²H₄] –CEL标准品，用70% 甲醇溶液溶解配制成50μg /mL的内标标准储备溶液，置于4℃冰箱中保存;移取适量CML和CEL标准溶液，准确加入内标溶液，用水稀释定容，混匀; 系列标准溶液浓度约为1～800 ng /mL，内标溶液浓度均为100 ng /mL。

（2）血浆样品前处理：取50µl血浆样品，加400 µL硼砂缓冲溶液(pH 9.2, 0.2M)，加100µL 100mM硼氢化钠溶液，涡旋混合，室温孵育3h。加 1000 µL (4℃)三氟乙酸，充分混匀，10000r /min 4℃离心10min，除去上清液。沉淀物加500µL 6 N HCl，混合均匀，110℃孵育18h，进行蛋白水解。

（3）加CML CEL内标物

取40μL水解产物和20μL内标物（含5µg/mL[²H₂] -CML和 [²H₄] –CEL）的内标混合溶液进行充分混合。然后在70℃的氮气流下蒸发干燥。加100µL正-丁醇/HCl（3/1，V/V）衍生70℃下反应90min。然后在氮气下蒸发干燥，再溶解于200µL水中。取20µL上述溶液加20µL内标[¹³C₆] -L-赖氨酸（5μg/mL）溶解于500 µL 10 mmol/L 氨水中，为衍生后溶液。

（4）将该衍生后溶液以1mL/min的速度过CUALD11R3固相萃取小柱，完全富集后用2mL乙腈-0.1%三氟乙酸水（V/V，60/40）溶液淋洗，真空抽干，再用5 mL 5% 氨水甲醇溶液洗脱，真空抽干并收集流出液，于40℃氮气吹干，浓缩干燥后，用50% 乙腈溶液溶解残留物定容至1mL，涡旋混匀，过0. 22 μm 滤膜后UPLC-MS/MS分析。

（5）CML、CEL和Lys在下列色谱条件下同时达到分离。反相C18色谱柱（BEH C18column (2.1×100mm,1.7μm)，20 mmol/L 95/5甲酸铵/乙腈5 min，25 min线性梯度至25/75甲酸铵/乙腈，柱温30℃，流速800 µl/min，进样体积2 µl。优化后的质谱条件：脱溶剂气温度400℃, 脱溶剂气流量600 L/h, 源温度110℃, 锥孔气流速50 L/h, 毛细管电压3000V, 锥体电压30V。未标记的峰面积与对应的内标峰面积的比值计算出CML、CEL和Lys的浓度。计算蛋白结合CML和蛋白结合CEL浓度(以μmol/mol Lys表示)。

（6）线性范围与检出限

在1～800 ng /mL 浓度范围内，分别以CML 和CEL标准工作溶液浓度(X，ng/mL)为横坐标，以CML 和CEL离子峰面积除以内标峰面积的值再与内标浓度（ng/mL）的乘积(Y) 为纵坐标，绘制标准工作曲线，线性方程

CML为Y = 0. 6278X-2.1037，R²=0.9999；CEL为Y = 1. 6063X-0.5004，R²=0.9998。将CML和CEL标准溶液稀释，按峰高与噪音的3倍信噪比计算得到CML 和CEL最低检出限均为0.05ng /mL。

（7）精密度试验

在确定的色谱条件下分别于1d内和连续3d内进样测定，CML日内和日间的RSD分别为0.79%和1.13% (n=6)；CEL日内和日间的RSD分别为0.88%和0.97% (n=6)。

（8）色谱条件优化

（9）硼氢化钠浓度和孵育时间的选择

由于在蛋白水解过程中赖氨酸与糖类反应可能转化为CML，导致测定值高于真实值。因此我们通过添加硼氢化钠抑制CML的形成。精密配置CML和CEL浓度为100ng/mL的标准溶液，按上述方法处理，添加不同浓度的硼氢化钠，实际测定值CML和CEL浓度对硼氢化钠浓度作图。当硼氢化钠浓度达到100mM，孵育时间3h时CML和CEL浓度不再下降。

实施例2 不同固相萃取小柱对CML 和CEL回收率的影响

表1 不同固相萃取小柱对CML、CEL回收率的影响

实验结果显示普通的ODS-C18固相萃取小柱回收率较低，Styre Screen® H2P由亲水的N-乙烯吡咯烷酮和亲脂性的二乙烯基苯聚合而成，对极性化合物具有较强的吸附能力。与ODS-C18固相萃取相比，回收率略有提高。Sepax CUALD型号的固相萃取小柱是以硅胶为填充剂，键合不同的共价基团，形成不同吸附能力的固定相。其中CUALD11R3以硅胶为填充剂键合了乙醛，其特点是能与活性分子形成共价结合而极大地提高了吸附能力，而且可以除去还原剂以及基质中的杂蛋白。结果显示采用CUALD11R3固相萃取小柱处理血浆样本后，CML和CEL回收率最高。因此，我们选择CUALD11R3固相萃取小柱，提高了测定样本的回收率，而且由于其能够与蛋白活性分子形成共价结合，我们还能同时测定蛋白结合 CML 和蛋白结合CEL。

实施例3 PQQ对血浆CML 、CEL、蛋白结合 CML 和蛋白结合CEL的影响

Claims

1.PQQ对AGEs的抑制作用的研究方法，其特征在于步骤为：

分别称取适量的[²H₂] -CML和[²H₄] –CEL标准品，用70% 甲醇溶液溶解配制成均为50μg/mL的内标溶液，置于4℃冰箱中保存；移取适量CML和CEL标准溶液，准确加入内标溶液，用水稀释定容，混匀；系列标准溶液浓度为1～800 ng /mL，内标溶液浓度均为100 ng /mL；

（2）血浆样品前处理：取50µL血浆样品，加pH 9.2、0.2M的 400 µL硼砂缓冲溶液，加100µL 100mM硼氢化钠溶液，涡旋混合，室温孵育3h，加 1000 µL、4℃的三氟乙酸，充分混匀，10000r/min 4℃离心10min，除去上清液；沉淀物加500µL 6 N HCl溶液，混合均匀，110℃孵育18h，进行蛋白水解；

（3）加CML、CEL内标物

取40μL步骤（2）所得蛋白水解溶液和含5µg/mL[²H₂] -CML和 [²H₄] –CEL的20μL内标物混合溶液进行充分混合；然后在70℃的氮气流下蒸发干燥；加V/V＝3/1的100µL正-丁醇/HCl，70℃下衍生反应90min；然后在氮气下蒸发干燥，再溶解于200µL水中成溶液；取20µL上述溶液加20µL、5μg/mL的内标[¹³C₆] -L-赖氨酸溶解于500 µL 10 mmol/L 氨水中，为衍生后溶液；

（4）将步骤（3）所得衍生后溶液以1mL/min的速度过CUALD11R3固相萃取小柱，完全富集后用2 mL、V/V＝60/40的乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液淋洗，真空抽干，再用5 mL 5% 氨水甲醇溶液洗脱，真空抽干并收集流出液，于40℃氮气吹干，浓缩干燥后，用50%乙腈溶液溶解残留物定容至1mL，涡旋混匀，过0. 22μm 滤膜后UPLC-MS/MS分析；

（5）CML、CEL和Lys在下列色谱条件下同时达到分离：反相C18色谱柱BEH C18 column(2.1×100mm,1.7μm)，20 mmol/L 95/5甲酸铵/乙腈5 min，25 min线性梯度至25/75甲酸铵/乙腈，柱温30℃，流速800 µL/min，进样体积2 µL；

优化后的质谱条件：脱溶剂气温度400℃, 脱溶剂气流量600 L/h, 源温度110℃, 锥孔气流速50 L/h, 毛细管电压3000 V, 锥体电压30V；未标记的峰面积与对应的内标峰面积的比值计算出CML、CEL和Lys的浓度；计算蛋白结合CML和蛋白结合CEL浓度，以μmol/molLys表示；

（6）线性范围与检出限

在1～800 ng /mL 浓度范围内，分别以CML和CEL标准工作溶液浓度为横坐标X，ng/mL；以CML和CEL离子峰面积除以内标峰面积的值再与内标浓度（ng/mL）的乘积为纵坐标Y，绘制标准工作曲线，线性方程

CML为：Y = 0. 6278X-2.1037，R²=0.9999；CEL为：Y = 1. 6063X-0.5004，R²=0.9998；将CML和CEL标准溶液稀释，按峰高与噪音的3倍信噪比计算得到CML和CEL最低检出限均为0.05ng /mL；

（7）精密度试验

（8）色谱条件优化

（9）硼氢化钠浓度和孵育时间的选择

由于在蛋白水解过程中赖氨酸与糖类反应可能转化为CML，导致测定值高于真实值，因此我们通过添加硼氢化钠抑制CML的形成，精密配置CML和CEL浓度为100ng/mL的标准溶液，按上述方法处理，添加不同浓度的硼氢化钠，实际测定值CML和CEL浓度对硼氢化钠浓度作图，当硼氢化钠浓度达到100mM，孵育时间3h时CML和CEL浓度不再下降；

（10）不同固相萃取小柱对CML、CEL回收率的影响

在空白血浆中分别加入含CML、CEL高、中、低浓度的血浆样品，分别采用ODS-C18固相萃取小柱、Styre Screen® H2P固相萃取小柱、Sepax CUALD11R3固相萃取小柱处理，测定回收率，结果显示采用CUALD11R3固相萃取小柱处理，CML和CEL回收率最高，由于选择CUALD11R3固相萃取小柱能够与蛋白活性分子形成共价结合，还能同时测定蛋白结合CML和蛋白结合CEL；

（11）PQQ对血浆CML 、CEL、蛋白结合 CML 和蛋白结合CEL的影响

D-gal诱导造模6周后血浆游离CML、CEL、蛋白结合CML和蛋白结合CEL较对照组不同程度的升高，经多奈哌齐及PQQ给药后血浆CML含量均有显著下降；同时PQQ还能降低血浆CEL和蛋白结合CML；而多奈哌齐对二者无影响；然而无论PQQ还是多奈哌齐对血浆蛋白结合CEL均无影响。