CN103575820B - 血浆中5种黄酮苷的分析方法及其在药代动力学中的应用 - Google Patents
血浆中5种黄酮苷的分析方法及其在药代动力学中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种液相色谱串联质谱法定量检测血浆样本中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷的方法，包括步骤(1)样品的制备和步骤(2)检测。本发明的分析方法具有良好的专属性、精密度和准确度较高，线性范围较宽，可用于中药组合物的体内药代动力学测定。
Description
技术领域
本发明属于现代中药应用领域，特别涉及血浆中5种黄酮苷的液相色谱串联质谱检测方法，以及在药代动力学中的应用。
背景技术
质谱是以分子量测定为基础的分析方法，近年来，其与高效液相色谱法(HPLC)或毛细管电泳法(CE)等分离机制的联用不仅提高了其抗杂质干扰的能力和节省了分析时间，而且大大提高了测定的灵敏度。软电离技术，如电喷雾离子化技术(ESI)的发展，则扩大了分子量检测的范围。此外，电喷雾离子化技术可在大气压下进行，方便与液相色谱仪连结，使液相色谱质谱联用技术(LC/MS)成为了一种高灵敏度、高选择性且快速分析的技术，其能在短时间之内，同时实现分析物的分离与结构鉴定。通过液相色谱质谱联用技术(LC/MS/MS)能更清楚地了解药物在动物活体内的药物动力学规律，从而让研究人员能够更好地掌握药物的药理作用。另外还可以省去复杂、繁琐且耗时的样本前处理工作。
糖敏灵丸是在临床验证的有效方开郁清胃颗粒基础上加减变化与剂型改革而成。糖敏灵丸由黄连、大黄、黄芩、白芍、柴胡、枳实、山楂、乌梅、半夏、天花粉共十味常用中药组成，具有开郁清胃、滋阴降火、通腑泻浊之功效。临床观察证实其对Ⅱ型糖尿病的血糖有明显的改善作用，尤其是对体型偏胖的早中期Ⅱ型糖尿病患者效果更加显著。同时，药理实验揭示糖敏灵能显著增强高热量饲料诱导的胰岛素抵抗模型糖尿病大鼠和自发性Ⅱ型糖尿病大鼠的胰岛素敏感性。
柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷是糖敏灵中的5种有效成份，但是目前还没有可以同时检测血浆样本中这5种成份的方法。
发明内容
糖敏灵制剂作为药物，需要进行必要的药代动力学实验，由于上述药物活性成分在血中含量极低，需要精密仪器和精密方法进行操作，本发明经过研究，找到了适合测定这些物质的方法。
本发明提供一种液相色谱串联质谱法定量检测血浆样本中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷的方法，以及在药代动力学中的应用。
根据本发明，检测方法包括步骤(1)样品的制备和步骤(2)检测，其特征在于步骤(1)样品制备采用包括以下步骤的方法：
a.向待测样品中依次加入所述流动相、内标溶液，酸及水并混匀；
b.上C18固相萃取柱，先用水洗脱，再用低级醇洗脱；
c.收集醇洗脱液，并吹干；
d.步骤c的干燥物重新溶解，离心，取上清液测定。
试验表明，步骤(1)b中使用固相萃取法(SPE)，回收率高且操作简单。比较了液液萃取法和固相萃取法(SPE)，结果表明，SPE法处理的样品内源性物质少，操作步骤少，待测物提取回收率均高于77%。黄酮苷极性较大，试验结果确定其更适合用SPE法进行血浆样品预处理。
根据本发明实施方式之一，步骤a中所述内标为甘草苷。
对栀子苷、柴胡皂苷A、大豆苷和甘草苷进行了筛选，其中甘草苷与5个待测物结构相似，均属于黄酮苷类化合物，以甘草苷为内标，待测物与内标质谱响应强度相当，可以提高方法的重复性和准确性。
根据本发明实施方式之一，其中步骤a所述的酸性物质包括但不限于盐酸、硫酸、高氯酸，磷酸，甲酸，乙酸等。
优选的，步骤a中所述酸性物质为盐酸。
根据本发明实施方式之一，步骤b中所述醇为甲醇。
根据本发明实施方式之一，步骤d重新溶解所用溶剂为乙腈-水。
根据本发明实施方式之一，步骤(2)检测所用液相色谱条件如下：色谱柱为C18色谱柱，流动相为0.01%-0.5%甲酸水-乙腈。
优选的，步骤(2)检测所用流动相为0.1%甲酸水-乙腈，体积比为30:70，采用梯度洗脱，洗脱程序为：
0~3.0min，24%B；
3.0~3.1min，24%B-40%B；
3.1~10.0min，40%B-60%B。
根据本发明实施方式之一，步骤(2)检测所用质谱采用电喷雾离子化源，电离模式为正、负离子切换模式。
优选的，负离子模式下，参数喷雾电压为3500V，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷的碰撞诱导裂解电压分别为35eV，35eV，35eV，12eV；正离子模式下，参数喷雾电压为4000V，黄芩苷和汉黄芩苷的碰撞诱导裂解电压分别为28eV，21eV。
分别比较了ESI源正、负离子两种扫描模式，结果表明柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和甘草苷(IS)在负离子模式下响应强度高于正离子模式，而黄芩苷和汉黄芩苷在正离子模式下质谱响应更好。因此优选正负离子切换模式，0~4.0min时，在负离子模式下扫描；4.1~10.0min时，在正离子模式下扫描。
本发明所述方法可成功用于糖敏灵制剂药代动力学的测定。
本发明所述糖敏灵丸由下列重量份的原料制成：
天花粉10~30份柴胡10~30份枳实3~15份大黄1~6份半夏1~12份黄芩3~15份黄连1~12份白芍3~15份乌梅5~20份山楂3~15份。
制备方法如下：所述的黄芩加水提取两次，每次1小时，提取液加浓盐酸调ph值至1.5～2.0，80℃保温1小时，抽滤，滤饼干燥，得黄芩提取物；所述的黄连加75%乙醇提取2次每次2小时，提取液减压回收乙醇，加入浓盐酸调ph值至1.0～2.0，抽滤，滤饼干燥，得黄连提取物；其余8味药用水回流提取2次，每次1小时，提取液减压浓缩至1∶1，加入95%乙醇至含醇量70%，滤过，滤液减压浓缩至稠膏加入黄连提取物与黄芩提取物，即得糖敏灵制剂的药物活性成分。药物活性成分与微晶纤维素按适当比例混合，按照常规方法制备成浓缩丸。
本发明所述糖敏灵制剂包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉针剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、滴剂、贴剂、滴丸。因为药物活性成分相同，所以本发明提供的方法可以用于多种不同制剂的糖敏灵药代动力学的检测。
本申请相对现有技术而言所具有的优点和效果：
1、可以一次性检测多种药物活性成分的数据。
2、可用于多种药物活性成分的药代动力学测定。
3、检测结果准确，灵敏度高。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1.空白血浆样品中甘草苷(IS)的SRM色谱图。
图2.空白血浆中加入甘草苷(IS)对照品溶液后的SRM色谱图。
图3.大鼠灌胃给予糖敏灵后0.67h，血浆样品中甘草苷(IS)的SRM色谱图。
图4.空白血浆样品中柚皮苷的SRM色谱图。
图5.空白血浆中加入柚皮苷对照品溶液后的SRM色谱图。
图6.大鼠灌胃给予糖敏灵后0.67h，血浆样品中柚皮苷的SRM色谱图。
图7.空白血浆样品中橙皮苷和新橙皮苷的SRM色谱图。
图8.空白血浆中加入橙皮苷和新橙皮苷对照品溶液后的SRM色谱图。
图9.大鼠灌胃给予糖敏灵后0.67h，血浆样品中橙皮苷和新橙皮苷的SRM色谱图。
图10.空白血浆样品中黄芩苷的SRM色谱图。
图11.空白血浆中加入黄芩苷对照品溶液后的SRM色谱图。
图12.大鼠灌胃给予糖敏灵后0.67h，血浆样品中黄芩苷的SRM色谱图。
图13.空白血浆样品中汉黄芩苷的SRM色谱图。
图14.空白血浆中加入汉黄芩苷对照品溶液后的SRM色谱图。
图15.大鼠灌胃给予糖敏灵后0.67h，血浆样品中汉黄芩苷的SRM色谱图。
图16.大鼠灌胃给予糖敏灵后，柚皮苷的药-时曲线。
图17.大鼠灌胃给予糖敏灵后，橙皮苷的药-时曲线。
图18.大鼠灌胃给予糖敏灵后，新橙皮苷的药-时曲线。
图19.大鼠灌胃给予糖敏灵后，黄芩苷的药-时曲线。
图20.大鼠灌胃给予糖敏灵后，汉黄芩苷的药-时曲线。
图21.甘草苷(IS)[M–H]-离子的产物离子质谱图。
图22.柚皮苷[M–H]-离子的产物离子质谱图。
图23.橙皮苷[M-H]-离子的产物离子质谱图。
图24.新橙皮苷[M-H]-离子的产物离子质谱图。
图25.黄芩苷[M+H]+离子的产物离子质谱图。
图26.汉黄芩苷(IS)[M+H]+离子的产物离子质谱图。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
本发明所述的取动物灌胃糖敏灵后抽取的血浆，是使用糖敏灵丸作为药物，给动物服用，当然也包括给人服用，服用后经过一段时间的药物吸收，通过动脉或静脉用注射器抽取血液，分离出血浆并用肝素等抗凝剂抗凝，然后经过血浆预处理，再用仪器测定血浆中的药物活性成分的含量。
本发明筛选方法如下：
试验例1血浆样品中5种黄酮苷分析方法的建立
LC-MS/MS条件
色谱柱：ZORBAX SB-C18(150×2.1mm,5μm,Agilent)
预柱：Security Guard-C18(4.0mm×3.0mm i.d,5μm,Phenomenex)
流动相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序：0~3.0min，24%B；3.0~3.1min，24%B–40%B；3.1~10.0min，40%B–60%B。
柱温：25℃
流速：300μL·min-1
离子源：电喷雾离子化源(ESI)
电离模式：正、负离子切换模式
MS/MS：选择反应监测(SRM)。0~4.0min，采用负离子模式，用于定量分析的离子分别为m/z579→271(柚皮苷)，m/z609→301(橙皮苷和新橙皮苷)，m/z417→255(内标，甘草苷)；4.1~10.0min，采用正离子模式，用于定量分析的离子分别为m/z447→271(黄芩苷)，m/z461→285(汉黄芩苷)。
质谱参数：负离子模式下，参数喷雾电压为4000V，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为35eV，35eV，35eV，12eV；正离子模式下，参数喷雾电压为3500V，黄芩苷和汉黄芩苷的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为28eV，21eV；扫描时间：0.5s。正、负离子模式下，其它质谱参数相同：离子源电压为10eV，毛细管温度为350℃，鞘气为N2(45psi)，辅助气为N2(15psi)，碰撞气体压力为Ar1.0mTorr。
溶液的制备
(1)标准系列溶液的配制取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷各适量，精密称定，分别置于10mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为0.172mg·mL-1，0.105mg·mL-1，0.126mg·mL-1，0.681mg·mL-1，0.221mg·mL-1的对照品溶液。分别精密量取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷对照品溶液0.3，0.1，0.8，2.0，0.4mL，置于同一10mL量瓶中，甲醇-水(1∶1)稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为5.160μg·mL-1，1.050μg·mL-1，10.08μg·mL-1，136.2μg·mL-1，8.84μg·mL-1的混合对照品储备液。
分别精密量取适量混合对照品储备液，用去离子水稀释制成混合对照品溶液，其中柚皮苷浓度为2.580,7.740,25.80,64.50,129.0,258.0,516.0ng·mL-1，橙皮苷浓度为0.5250,1.575,5.250,13.12,26.25,52.50,105.0ng·mL-1，新橙皮苷浓度为5.040,15.12,50.40,126.0,252.0,504.0,1008ng·mL-1，黄芩苷浓度为68.10,204.3,681.0,1703,3405,6810,1.362×104ng·mL-1，汉黄芩苷浓度为4.420,13.26,44.20,110.5,221.0,442.0,884ng·mL-1。
(2)内标溶液的配制取甘草苷适量，精密称定，置10mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，获得浓度为0.206mg·mL-1的储备液。精密量取储备液0.2mL，置于100mL量瓶中，去离子水稀释至刻度，获得浓度为412.0ng·mL-1的内标溶液。
各储备液及标准系列溶液置4℃冰箱保存备用。
血浆样品预处理
取肝素抗凝血浆100μL，置2.0mL塑料EP管中，依次加入流动相100μL，内标溶液100μL(甘草苷溶液，412.0ng·mL-1)，0.6M盐酸溶液50μL，加去离子水600μL，涡旋30s混匀后，上处理好的SPE C18小柱(SPE小柱使用前先用1.0mL甲醇活化，再用1.0mL去离子水平衡)，先用1.0mL去离子水洗脱，然后用1.0mL甲醇洗脱。甲醇洗脱液于45℃氮气吹干，残渣用100μL乙腈-水(3:7)溶解，12000r·min-1离心5min，取上清液20μL进样，记录色谱图。
分析方法的确证
(1)方法的专属性大鼠空白血浆100μL，除用100μL流动相代替内标溶液外，其余按“血浆样品预处理”项下方法操作，得空白样品的色谱图(图1、4、7、10和13)；将一定浓度的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷混合对照品溶液和内标溶液加入空白血浆中，依法操作，得相应的色谱图(图2、5、8、11和14)，取大鼠灌胃糖敏灵后的血浆样品，同法操作，得色谱图(图3、6、9、12和15)。其中甘草苷(IS)、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷的保留时间分别为2.0，2.3，2.5，2.8，4.1，8.3min；结果表明，血浆中内源性物质不干扰测定。
(2)标准曲线和线性范围取大鼠空白血浆100μL，加入系列混合标准溶液100μL，配制成相当于柚皮苷血浆质量浓度为2.580，7.740，25.80，64.50，129.0，258.0，516.0ng·mL-1的模拟血浆样品，橙皮苷血浆质量浓度为0.5250，1.575，5.250，13.12，26.25，52.50，105.0ng·mL-1的模拟血浆样品，新橙皮苷5.040，15.12，50.40，126.0，252.0，504.0，1008ng·mL-1的模拟血浆样品，黄芩苷血浆质量浓度为为68.10，204.3，681.0，1703，3405，6810，1.362×104ng·mL-1的模拟血浆样品，汉黄芩苷血浆质量浓度为4.420，13.26，44.20，110.5，221.0，442.0，884ng·mL-1的模拟血浆样品，除不加100μL流动相外，其余按“血浆样品预处理”项下操作，每一浓度进行双样本分析，记录色谱图。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归分析。典型大鼠血浆样品标准曲线为柚皮苷：y=5.542×10-4x–4.717×10-4，r=0.9956；橙皮苷：y=1.440×10-3x–4.465×10-4,r=0.9952；新橙皮苷：y=1.909×10-3x–6.645×10-3，r=0.9951；黄芩苷：y=1.283x–1.684×10-2，r=0.9961；汉黄芩苷：y=2.159×10-3x–3.142×10-3，r=0.9959。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷定量下限(LLOQ)分别为0.5160ng·mL-1，0.5250ng·mL-1，0.5040ng·mL-1，0.3400ng·mL-1，0.3680ng·mL-1。
(3)精密度和准确度取大鼠空白血浆100μL，按照“标准曲线的绘制”项下方法，分别配制低、中、高三个浓度的质量控制(QC)样品。每一浓度进行6样本分析，连续测定3天，并与标准曲线同时进行。根据当日标准曲线计算QC样品的浓度，结果进行方差分析，求得方法的精密度RSD和准确度RE，各被测组分的日间RSD≤11%，日内RSD≤9.9%RE在-5.1%~6.7%之间，结果见表1。分析方法的准确度和精密度均符合药代动力学研究技术指导原则对生物样品分析方法技术要求，该法可用于大鼠血浆中5种黄酮苷成分准确测定。
(4)提取回收率取空白血浆100μL，按上述“精密度和准确度”项下方法分别制备低、中、高三个浓度的QC样品，各6样本，照“血浆样品的预处理”方法操作，峰面积为A；同时另取大鼠空白血浆100μL，按“血浆样品预处理”项下方法操作，向获得的上清液中加入相应浓度的标准溶液100μL和内标100μL，涡流混合，45℃下氮气吹干，加入100μL流动相复溶，进样分析，色谱峰面积为B(6次测定的平均值)。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值(A/B)计算提取回收率，采用同样的方法考察了内标的提取回收率。测得各待测组分的提取回收率均大于77%，结果见表2。
(5)基质效应采用不同来源的空白血浆进行6样本分析，取大鼠空白血浆100μL，按“血浆样品预处理”项下操作，向获得的上清液中加入标准溶液(含柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷分别为64.50，13.12，126.0，1703，110.5ng·mL-1)和内标溶液(412.0ng·mL-1)各100μL，45℃下氮气吹干，残渣加入100μL流动相复溶，12000r·min-1离心5min，取上清液20μL进样分析，峰面积为B；同时取相应浓度的标准溶液20μL进样分析，峰面积为C。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值(B/C)计算基质效应，结果见表3。
(6)样品稳定性考察了未处理的血浆样品室温放置4h的稳定性，血浆样品经历3次冷冻–解冻循环的稳定性，处理后的血浆样品室温放置24h内的稳定性。每一项稳定性考察时，按“标准曲线和线性范围”项下配制低、中、高三个浓度的QC样品，每一浓度进行3样本分析，照“血浆样品的预处理”项下操作，测得样品浓度，计算相对误差(RE%)，结果见表4。结果表明处理后的血浆样品室温放置24h内稳定(RE在±6.2%，RSD≤14%)，未处理的血浆样品室温放置4h稳定(RE在±11%，RSD≤14%)，血浆样品经历3次冻-融循环后稳定(RE在±6.1%，RSD≤13%)。
讨论
采用正、负离子切换扫描模式，建立了同时测定大鼠血浆中5种黄酮苷的LC-MS/MS方法，该方法专属性好、灵敏度高，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷的LLOQ分别为0.5160ng·mL-1，0.5250ng·mL-1，0.5040ng·mL-1，0.3400ng·mL-1，0.3680ng·mL-1。
内标的选择
对栀子苷、柴胡皂苷A、大豆苷和甘草苷进行了筛选，其中甘草苷与5个待测物结构相似，均属于黄酮苷类化合物，以甘草苷为内标，待测物与内标质谱响应强度相当，可以提高方法的重复性和准确性。
血浆样品预处理方法的建立
为了获得杂质少、提取回收率高且操作简单的血浆样品预处理方法，对液液萃取法和固相萃取法(SPE)进行比较，结果表明，SPE法处理的样品内源性物质少，操作步骤少，待测物提取回收率均高于77%。黄酮苷极性较大，试验结果确定其更适合用SPE法进行血浆样品预处理。
质谱条件的优化
分别比较了ESI源正、负离子两种扫描模式，结果表明柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和甘草苷(IS)在负离子模式下响应强度高于正离子模式，而黄芩苷和汉黄芩苷在正离子模式下质谱响应更好。因此选择扫描切换模式，0~4.0min时，在负离子模式下扫描；4.1~10.0min时，在正离子模式下扫描。取一定浓度的待测成分对照品溶液进行一级全扫描分析，结果发现负离子模式下柚皮苷的准分子离子为m/z579[M–H]-，橙皮苷的准分子离子为m/z609[M–H]-，新橙皮苷的准分子离子为m/z609[M–H]-，甘草苷(IS)的准分子离子为m/z417[M–H]-；正离子模式下黄芩苷的准分子离子为m/z447[M+H]+，汉黄芩苷的准分子离子为m/z461[M+H]+。
待测成分均为黄酮苷类化合物，裂解方式相似，即离子化过程中易丢失其配糖基形成产物离子。在负离子模式下对柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷(IS)的准分子离子m/z579，m/z609，m/z609，m/z417进行产物离子扫描(如图21-图24所示)。其中，柚皮苷的主要碎片离子m/z271是其准分子离子m/z579丢失一分子新橙皮糖而形成，橙皮苷的主要碎片离子m/z301是其准分子离子m/z609丢失一分子芸香糖而形成，新橙皮苷的主要碎片离子m/z301是其准分子离子m/z609丢失一分子新橙皮糖而形成，甘草苷的主要碎片离子m/z255是其准分子离子m/z417丢失一分子葡萄糖而形成的。在正离子模式下对黄芩苷和汉黄芩苷的准分子离子m/z447和m/z461进行产物离子扫描(如图25和26所示)。黄芩苷和汉黄芩苷的主要碎片离子m/z271和m/z285，分别是其准分子离子m/z447和m/z461丢失一分子葡萄糖醛酸苷而形成的。图21-图26表明，m/z271(柚皮苷)，m/z301(橙皮苷)，m/z301(新橙皮苷)，m/z255(IS)，m/z271(黄芩苷)，m/z285(汉黄芩苷)响应强且稳定，因此作为SRM的定量碎片离子。
对碰撞诱导裂解(CID)电压和碰撞气体能量等质谱参数进行了优化，确定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为35eV，35eV，35eV，12eV，28eV，21eV。
试验例2灌胃给药大鼠糖敏灵后5种黄酮苷的药动学
血浆样品的采集
取雄性Wistar大鼠8只，实验前禁食12h，自由饮水。按8mL·kg-1(相当于柚皮苷175mg·kg-1，橙皮苷23.2mg·kg-1，新橙皮苷185mg·kg-1，黄芩苷87.0mg·kg-1，汉黄芩苷6.96mg·kg-1)剂量灌胃给予糖敏灵丸生理盐水混悬液后，于0min和给药后0.1，0.2，0.3，0.7，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，24.0，32.0h眼眶采血0.3mL，置预先肝素化试管中，离心(4000rpm)10min，分取血浆，置20℃冰箱中保存待测。
药动学测定结果
Wistar大鼠灌胃给予糖敏灵(5.85g·kg-1)后，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷的平均药物浓度-时间曲线见表5和图16-20。采用TOPFIT软件，选用非隔室模型对血药浓度-时间数据进行处理，主要药动学参数见表6。
大鼠灌胃糖敏灵后的药动学特点
灌胃给药大鼠糖敏灵后5种黄酮苷的药物动力学行为。结果表明，大鼠灌胃给予糖敏灵后，5种黄酮苷药动学过程均符合二室开放模型；柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的药时曲线趋势一致，大鼠体内迅速达峰，之后血药浓度快速下降，在10h时血药浓度呈现微弱的回升，提示柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷在大鼠体内存在微弱的肝肠循环。柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷在肠内菌群作用下脱糖基化生成苷元被吸收，其中大部分苷元与葡萄糖醛酸结合，因此血浆中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量较低。本研究中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷给药剂量分别为175mg·kg-1，23.2mg·kg-1，185mg·kg-1，而其Cmax和AUC0～∞值明显很低，可能与上述原因有关，也可能是由于糖敏灵制剂中其他成分抑制柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的吸收，或加速其转化成为苷元。
黄芩苷和汉黄芩苷的药时曲线趋势一致，在大鼠体内都呈现明显的双峰现象，黄芩苷和汉黄芩苷的Tmax均为10~30min，出现双峰的时间均为6~8h。由T1/2可知，黄芩苷的口服消除速率比汉黄芩苷快。黄芩苷和汉黄芩苷极性较大，很难直接吸收入血，其在肠道菌群葡萄糖醛酸酶作用下水解成为苷元黄芩素和汉黄芩素，苷元一部分在小肠粘膜UDPG-葡萄糖醛酸转移酶作用下重新转化为糖苷被吸收入血，一部分被粘膜细胞中MRP2蛋白排到肠腔，还有一部分苷元吸收入血后被肝微粒体转化为糖苷或其他代谢物。在一定范围内pH值越低，黄芩苷吸收越好，黄芩苷10~30min时出现吸收峰提示在胃或十二指肠上部吸收，可能与pH值有关；在6~8h时出现双峰，提示在结肠部位受肠道菌群水解而被重新吸收，存在肝肠循环。
表1方法精密度与准确度
表2.待测物和内标的提取回收率(n=6)
表3.大鼠血浆中待测物和内标的基质效应(n=6)
表4.大鼠血浆中样品稳定性(n=3)
表5.大鼠灌胃给药糖敏灵后，柚皮橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷的平均药时曲线(n=8,ng·mL-1)
表6.大鼠灌胃给药糖敏灵后，大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的药动学参数(n=8)
实施例1：
LC-MS/MS条件
色谱柱：ZORBAX SB-C18(150×2.1mm,5μm,Agilent)
预柱：Security Guard-C18(4.0mm×3.0mm i.d,5μm,Phenomenex)
流动相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序：0~3.0min，24%B；3.0~3.1min，24%B–40%B；3.1~10.0min，40%B-60%B。
柱温：25℃
流速：300μL·min-1
离子源：电喷雾离子化源(ESI)
电离模式：正、负离子切换模式
MS/MS：选择反应监测(SRM)。0~4.0min，采用负离子模式，用于定量分析的离子分别为m/z579→271(柚皮苷)，m/z609→301(橙皮苷和新橙皮苷)，m/z417→255(内标，甘草苷)；4.1~10.0min，采用正离子模式，用于定量分析的离子分别为m/z447→271(黄芩苷)，m/z461→285(汉黄芩苷)。
质谱参数：负离子模式下，参数喷雾电压为4000V，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为35eV，35eV，35eV，12eV；正离子模式下，参数喷雾电压为3500V，黄芩苷和汉黄芩苷的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为28eV，21eV；扫描时间：0.5s。正、负离子模式下，其它质谱参数相同：离子源电压为10eV，毛细管温度为350℃，鞘气为N2(45psi)，辅助气为N2(15psi)，碰撞气体压力为Ar1.0mTorr。
溶液的制备
(1)标准系列溶液的配制取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷各适量，精密称定，分别置于10mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为0.172mg·mL-1，0.105mg·mL-1，0.126mg·mL-1，0.681mg·mL-1，0.221mg·mL-1的对照品溶液。分别精密量取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷对照品溶液0.3，0.1，0.8，2.0，0.4mL，置于同一10mL量瓶中，甲醇-水(1∶1)稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为5.160μg·mL-1，1.050μg·mL-1，10.08μg·mL-1，136.2μg·mL-1，8.84μg·mL-1的混合对照品储备液。
分别精密量取适量混合对照品储备液，用去离子水稀释制成混合对照品溶液，其中柚皮苷浓度为2.580,7.740,25.80,64.50,129.0,258.0,516.0ng·mL-1，橙皮苷浓度为0.5250,1.575,5.250,13.12,26.25,52.50,105.0ng·mL-1，新橙皮苷浓度为5.040,15.12,50.40,126.0,252.0,504.0,1008ng·mL-1，黄芩苷浓度为68.10,204.3,681.0,1703,3405,6810,1.362×104ng·mL-1，汉黄芩苷浓度为4.420,13.26,44.20,110.5,221.0,442.0,884ng·mL-1。
(2)内标溶液的配制取甘草苷适量，精密称定，置10mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，获得浓度为0.206mg·mL-1的储备液。精密量取储备液0.2mL，置于100mL量瓶中，去离子水稀释至刻度，获得浓度为412.0ng·mL-1的内标溶液。
各储备液及标准系列溶液置4℃冰箱保存备用。
血浆样品预处理
取肝素抗凝血浆100μL，置2.0mL塑料EP管中，依次加入流动相(乙腈：水=3:7)100μL，内标溶液100μL(甘草苷水溶液，412.0ng·mL-1)，0.6M盐酸水溶液50μL，加去离子水600μL，涡旋30s混匀后，上处理好的SPE C18小柱(SPE小柱使用前先用1.0mL甲醇活化，再用1.0mL去离子水平衡)，先用1.0mL去离子水洗脱，然后用1.0mL甲醇洗脱。甲醇洗脱液于45℃氮气吹干，残渣用100μL乙腈–水(3:7)溶解，12000r·min-1离心5min，取上清液20μL进样，记录色谱图。
实施例2：
LC-MS/MS条件
色谱柱：ZORBAX SB-C18(150×2.1mm,5μm,Agilent)
预柱：Security Guard-C18(4.0mm×3.0mm i.d,5μm,Agilent)
流动相：0.01%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序：0~3.0min，30%B；3.0~3.1min，24%B–60%B；3.1~10.0min，60%B–80%B。
柱温：20℃
流速：250μL·min-1
离子源：电喷雾离子化源(ESI)
电离模式：正、负离子切换模式
MS/MS：选择反应监测(SRM)。0~4.0min，采用负离子模式，用于定量分析的离子分别为m/z579→271(柚皮苷)，m/z609→301(橙皮苷和新橙皮苷)，m/z417→255(内标，甘草苷)；4.1~10.0min，采用正离子模式，用于定量分析的离子分别为m/z447→271(黄芩苷)，m/z461→285(汉黄芩苷)。
质谱参数：负离子模式下，参数喷雾电压为4000V，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为35eV，35eV，35eV，12eV；正离子模式下，参数喷雾电压为3500V，黄芩苷和汉黄芩苷的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为28eV，21eV；扫描时间：0.5s。正、负离子模式下，其它质谱参数相同：离子源电压为10eV，毛细管温度为350℃，鞘气为N2(45psi)，辅助气为N2(15psi)，碰撞气体压力为Ar1.0mTorr。
溶液的制备
(1)标准系列溶液的配制同实施例1。
(2)内标溶液的配制同实施例1。
血浆样品预处理
取肝素抗凝血浆100μL，置2.0mL塑料EP管中，依次加入乙腈–水(3:7)溶液100μL，内标溶液100μL(甘草苷水溶液，412.0ng·mL-1)，5M甲酸水溶液50μL，加去离子水600μL，涡旋30s混匀后，上处理好的SPE C18小柱(SPE小柱使用前先用1.0mL甲醇活化，再用1.0mL去离子水平衡)，先用1.0mL去离子水洗脱，然后用1.0mL甲醇洗脱。甲醇洗脱液于45℃氮气吹干，残渣用100μL乙腈–水(3:7)溶解，12000r·min-1离心5min，取上清液20μL进样，记录色谱图。
实施例3：
LC-MS/MS条件
色谱柱：WondaSil-C18(150×2.1mm,5μm，岛津)
预柱：Security Guard-C18(4.0mm×3.0mm i.d,5μm,Phenomenex)
流动相：0.5%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序：0~3.0min，24%B；3.0~3.1min，24%B–60%B；3.1~10.0min，60%B。
柱温：30℃
流速：300μL·min-1
离子源：电喷雾离子化源(ESI)
电离模式：正、负离子切换模式
MS/MS：选择反应监测(SRM)。0~4.0min，采用负离子模式，用于定量分析的离子分别为m/z579→271(柚皮苷)，m/z609→301(橙皮苷和新橙皮苷)，m/z417→255(内标，甘草苷)；4.1~10.0min，采用正离子模式，用于定量分析的离子分别为m/z447→271(黄芩苷)，m/z461→285(汉黄芩苷)。
质谱参数：负离子模式下，参数喷雾电压为3000V，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为35eV，35eV，35eV，12eV；正离子模式下，参数喷雾电压为3500V，黄芩苷和汉黄芩苷的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为28eV，21eV；扫描时间：0.5s。正、负离子模式下，其它质谱参数相同：离子源电压为10eV，毛细管温度为350℃，鞘气为N2(45psi)，辅助气为N2(15psi)，碰撞气体压力为Ar1.0mTorr。
溶液的制备
(1)标准系列溶液的配制同实施例1。
(2)内标溶液的配制同实施例1。
血浆样品预处理
取肝素抗凝血浆100μL，置2.0mL塑料EP管中，依次加入乙腈–水(1:1)溶液100μL，内标溶液100μL(甘草苷水溶液，412.0ng·mL-1)，6M冰醋酸水溶液50μL，加去离子水400μL，涡旋30s混匀后，上处理好的SPE C18小柱(SPE小柱使用前先用1.0mL甲醇活化，再用1.0mL去离子水平衡)，先用1.0mL去离子水洗脱，然后用0.5mL甲醇洗脱。甲醇洗脱液于45℃浓缩干燥，残渣用100μL乙腈–水(1:1)溶解，取20μL进样，记录色谱图。
实施例4：
LC-MS/MS条件
色谱柱：ZORBAX SB-C18（150×2.1mm,5μm，Agilent）
预柱：Security Guard-C18(4.0mm×3.0mm i.d,5μm,Phenomenex)
流动相：0.1%冰醋酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序：0~3.0min，24%B；3.0~3.1min，24%B-40%B；3.1~10.0min，40%B–60%B。
柱温：25℃
流速：250μL·min-1
离子源：电喷雾离子化源(ESI)
电离模式：正、负离子切换模式
MS/MS：选择反应监测(SRM)。0~4.0min，采用负离子模式，用于定量分析的离子分别为m/z579→271(柚皮苷)，m/z609→301(橙皮苷和新橙皮苷)，m/z417→255(内标，甘草苷)；4.1~10.0min，采用正离子模式，用于定量分析的离子分别为m/z447→271(黄芩苷)，m/z461→285(汉黄芩苷)。
质谱参数：负离子模式下，参数喷雾电压为3000V，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为35eV，35eV，35eV，12eV；正离子模式下，参数喷雾电压为4000V，黄芩苷和汉黄芩苷的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为28eV，21eV；扫描时间：0.5s。正、负离子模式下，其它质谱参数相同：离子源电压为10eV，毛细管温度为350℃，鞘气为N2(40psi)，辅助气为N2(10psi)，碰撞气体压力为Ar1.0mTorr。
溶液的制备
(1)标准系列溶液的配制同实施例1。
(2)内标溶液的配制同实施例1。
血浆样品预处理
取肝素抗凝血浆100μL，置2.0mL塑料EP管中，依次加入去离子水100μL，内标溶液100μL(甘草苷水溶液，412.0ng·mL-1)，0.6M盐酸水溶液50μL，涡旋30s混匀后，上处理好的SPE C18小柱(SPE小柱使用前先用1.0mL甲醇活化，再用1.0mL去离子水平衡)，先用1.0mL去离子水洗脱，然后用0.5mL甲醇洗脱。甲醇洗脱液于45℃氮气吹干，残渣用100μL乙腈–水(3:7)溶解，取20μL进样，记录色谱图。
实施例5：
LC-MS/MS条件
色谱柱：Hypersil Gold-C18(100×2.1mm,5μm,Thermo)
预柱：Security Guard-C18(4.0mm×3.0mm i.d,5μm,Phenomenex)
流动相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序：0~3.0min，20%B；3.0~3.1min，20%B–50%B；3.1~10.0min，50%B–60%B。
柱温：25℃
流速：250μL·min-1
离子源：电喷雾离子化源(ESI)
电离模式：正、负离子切换模式
MS/MS：选择反应监测(SRM)。0~4.0min，采用负离子模式，用于定量分析的离子分别为m/z579→271(柚皮苷)，m/z609→301(橙皮苷和新橙皮苷)，m/z417→255(内标，甘草苷)；4.1~10.0min，采用正离子模式，用于定量分析的离子分别为m/z447→271(黄芩苷)，m/z461→285(汉黄芩苷)。
质谱参数：负离子模式下，参数喷雾电压为3500V，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为35eV，35eV，35eV，12eV；正离子模式下，参数喷雾电压为4000V，黄芩苷和汉黄芩苷的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为28eV，21eV；扫描时间：0.5s。正、负离子模式下，其它质谱参数相同：离子源电压为10eV，毛细管温度为350℃，鞘气为N2(45psi)，辅助气为N2(10psi)，碰撞气体压力为Ar1.0mTorr。
溶液的制备
(1)标准系列溶液的配制同实施例1。
(2)内标溶液的配制同实施例1。
血浆样品预处理
取肝素抗凝血浆100μL，置2.0mL塑料EP管中，依次加入甲醇100μL，内标溶液100μL(甘草苷甲醇溶液，412.0ng·mL-1)，0.6M盐酸甲醇溶液50μL，涡旋10s混匀后，加入乙酸乙酯600μL，涡旋混合5min，8000r·min-1离心5min，分取上层乙酸乙酯溶液于45℃下氮气吹干，残渣用100μL乙腈–水(7:3)溶解，12000r·min-1离心5min，取上清液20μL进样，记录色谱图。
Claims (9)
1.一种液相色谱串联质谱法定量检测血浆样本中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷的方法，包括步骤(1)样品的制备和步骤(2)检测，其特征在于步骤(1)样品制备采用包括以下步骤的方法：
a.向待测样品中依次加入流动相、内标溶液，酸及水并混匀；
b.上C18固相萃取柱，先用水洗脱，再用低级醇洗脱；
c.收集醇洗脱液，并吹干；
d.步骤c的干燥物重新溶解，离心，取上清液测定；
步骤(2)检测所用的液相色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，流动相为A相0.01％-0.5％甲酸水-B相乙腈，采用梯度洗脱，洗脱程序为：
0～3.0min，24％B；
3.0～3.1min，24％B–40％B；
3.1～10.0min，40％B–60％B；
或
0～3.0min，30％B；
3.0～3.1min，30％B–60％B；
3.1～10.0min，60％B–80％B；
或
0～3.0min，24％B；
3.0～3.1min，24％B–60％B；
3.1～10.0min，60％B；
或
0～3.0min，20％B；
3.0～3.1min，20％B–50％B；
3.1～10.0min，50％B–60％B。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中所述内标为甘草苷。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中所述酸为盐酸。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中所述低级醇为甲醇。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d重新溶解所用溶剂为乙腈-水。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述流动相为0.1％甲酸水-乙腈，采用梯度洗脱，洗脱程序为：
0～3.0min，24％B；
3.0～3.1min，24％B–40％B；
3.1～10.0min，40％B–60％B。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)检测所用质谱采用电喷雾离子化源，电离模式为正、负离子切换模式。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于质谱参数如下：负离子模式下，参数喷雾电压为3500V，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷的碰撞诱导裂解电压分别为35eV，35eV，35eV，12eV；正离子模式下，参数喷雾电压为4000V，黄芩苷和汉黄芩苷的碰撞诱导裂解电压分别为28eV，21eV。
9.如权利要求1至8任意一项在测定糖敏灵制剂药代动力学中的应用。
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