CN108802230A - 生物样品中丹参素及其代谢产物的检测方法 - Google Patents

生物样品中丹参素及其代谢产物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物样品中丹参素及其代谢产物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对生物样品进行处理；和(2)采用超高效液相色谱‑质谱联用仪检测所述待测溶液。本发明的检测方法能够检测到生物样品中较多的丹参素代谢产物，从而为阐明丹参素的代谢途径奠定基础。

Description

生物样品中丹参素及其代谢产物的检测方法
技术领域
本发明涉及生物样品中丹参素及其代谢产物的检测方法。
背景技术
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，是我国传统的活血化瘀药。现代研究表明，丹参的主要化学成分为脂溶性的二萜醌类和水溶性的酚酸类。丹参素作为丹参的指标性成分，具有抗炎、抑制血栓形成、神经保护、抗肿瘤、改善心脏功能以及扩张冠状动脉等多种药理作用，常被作为丹参药材或丹参复方制剂的质控指标。然而，目前丹参素的体内代谢过程和代谢产物尚不明确，亟需进一步研究。
《高效液相色谱法研究比格犬口服丹参素的药物代谢动力学》(游畅等，中药新药与临床药理，2011年5月，第22卷第3期，第310～314页)公开了测定比格犬血浆中丹参素含量的方法，该方法中的色谱条件重在将血浆中的丹参素进行较好的分离，并获得良好的峰形，而对于丹参素的代谢产物的分离并不关注，更未公开化学成分结构鉴定方面的内容。
《创新药物丹参素钠的体内分析及其代谢研究》(魏华，第二军医大学，2010年6月，第51～63页)公开了大鼠尾静脉注射给药后尿液和胆汁中丹参素钠代谢产物的结构解析方法，其色谱条件中流动相采用甲醇：水(含0.1vol％甲酸)＝20:80等梯度洗脱，质谱条件采用两级质谱检测，并最终在尿液中检测到6个代谢产物，在胆汁中检测到1个代谢产物。
此外，《液相色谱-电喷雾串联质谱分析丹参素在大鼠尿液中代谢产物》(王相阳等，第十届全国药物和化学异物代谢学术会议暨第三届ISSX/CSSX联合学术会议)的摘要记载了在大鼠尿液中检测到了丹参素原型及其6个代谢产物。
现有的丹参素代谢产物的检测方法能够检测到的丹参素代谢产物非常少，这些信息用来阐述丹参素在体内的代谢机制是远远不够的。
发明内容
本发明的目的是建立一种生物样品中丹参素及其代谢产物的检测方法，该方法能够检测到较多的丹参素代谢产物，从而为阐明丹参素的代谢途径奠定基础。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种生物样品中丹参素及其代谢产物的检测方法，包括如下步骤：
(1)对生物样品进行处理：将C18固相萃取柱用1～3倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～3倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～2倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以0.5～4倍柱体积的去离子水和0.5～4倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用0.02～0.2倍柱体积的体积浓度为2vol％～7vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液；其中，所述生物样品包括人或动物吸收丹参素后的含有丹参素及其代谢产物的含药血浆样品和/或含药尿液样品；
(2)采用超高效液相色谱-质谱联用仪检测所述待测溶液，其中：
色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱；流动相：0.1vol％甲酸水溶液A与乙腈B；柱温：25℃；梯度洗脱程序：0～2min，5vol％～20vol％B；2～15min，20vol％～85vol％B；流速：0.30mL/min；进样量：3μL；
质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)负离子模式；鞘气流速：30arb；辅助气流速：10arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：350℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z50～800；分辨率30000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的2个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：35～45％。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述的生物样品还包括空白生物样品，其是指人或动物正常饮食下的空白血浆样品和/或空白尿液样品。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，涡旋振荡时间为2～10min，离心转速为10000～18000r/min，离心时间为8～20min。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1～2倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～2倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～0.6倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以0.6～1.5倍柱体积的去离子水和0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.02～0.1倍柱体积的体积浓度为3vol％～5vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3～4min，14000～15000r/min下离心12～15min，取上清液作为待测溶液。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，将C18固相萃取柱用1.67倍柱体积的甲醇进行活化，再用1.67倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.33倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1倍柱体积的去离子水和1倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.03倍柱体积的体积浓度为5％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3min，14000r/min下离心15min，取上清液作为待测溶液。
根据本发明的检测方法，优选地，所述C18固相萃取柱(SPE)为Grace PureTM SPEC18-Low固相萃取小柱(500mg/3mL)；所述色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)负离子模式；鞘气流速：30arb；辅助气流速：10arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：350℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z 50～800；分辨率30000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的2个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：38～42％。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(2)中，归一化碰撞能量为39～40％。
根据本发明的检测方法，优选地，所述检测方法还包括如下步骤：
(3)对质谱数据进行数据处理：采用分子式预测模块，对质谱解离得到的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[0～20]，H[0～30]，O[0～15]，N[0～3]，S[0～1]，环和不饱和键数[0～15]，质量精度误差在10ppm以内。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述质谱仪为高分辨质谱仪。
本发明的检测方法能够对生物样品中的丹参素及其众多代谢产物进行有效检测；本发明优选的实施方式能够从含药血浆样品中检测到5个丹参素代谢产物，从含药尿液样品中检测到21个代谢产物。本发明的检测方法为阐明丹参素的体内代谢机制奠定基础，并为进一步进行丹参素的体内药代动力学评价、药学研究、质量标准、工业化生产质控指标的制定以及临床方案的制定提供依据。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明提供一种生物样品中丹参素及其代谢产物的检测方法，包括如下步骤：(1)对生物样品的处理步骤，和(2)采用超高效液相色谱-质谱联用仪进行检测的步骤。任选地，包括(3)对质谱数据进行数据处理的步骤。
＜生物样品的处理步骤＞
本发明中，生物样品包括含药生物样品，含药生物样品是指人或动物吸收丹参素后的含有丹参素及其代谢产物的含药血浆样品和/或含药尿液样品。
本发明中，生物样品还可以包括空白生物样品，空白生物样品是指人或动物正常饮食下的空白血浆样品和/或空白尿液样品。
本发明中，所述动物优选为哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猴等。
本发明的含药血浆样品可以通过如下制备方法得到：将含有丹参素及其代谢产物的血液置于肝素钠抗凝EP管中，静置，离心，上清液即为所述血浆样品。其中，静置时间可以为8～120min，优选为8～60min，更优选为10～20min。离心转速可以为2000～5000r/min，优选为时间为3000～4500r/min，更优选为3500～4000r/min。离心时间可以为10～40min，优选为12～30min，更优选为15～20min。优选地，离心操作在0～6℃下、更优选为2～4℃下进行。
本发明的空白血浆样品可以通过如下制备方法得到：将空白血液(人或动物正常饮食下的血液)置于肝素钠抗凝EP管中，静置，离心，上清液即为所述血浆样品。其中，静置时间可以为8～120min，优选为8～60min，更优选为10～20min。离心转速可以为2000～5000r/min，优选为时间为3000～4500r/min，更优选为3500～4000r/min。离心时间可以为10～40min，优选为12～30min，更优选为15～20min。优选地，离心操作在0～6℃下、更优选为2～4℃下进行。
本发明的含药尿液样品可以通过如下制备方法得到：将含有丹参素及其代谢产物的尿液离心，上清液即为所述尿液样品。离心转速可以为2000～5000r/min，优选为时间为3000～4500r/min，更优选为3500～4000r/min。离心时间可以为10～40min，优选为12～30min，更优选为15～20min。优选地，离心操作在0～6℃下、更优选为2～4℃下进行。
本发明的空白尿液样品可以通过如下制备方法得到：将空白尿液离心，上清液即为所述尿液样品。离心转速可以为2000～5000r/min，优选为时间为3000～4500r/min，更优选为3500～4000r/min。离心时间可以为10～40min，优选为12～30min，更优选为15～20min。优选地，离心操作在0～6℃下、更优选为2～4℃下进行。
本发明中，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1～3倍柱体积、优选为1～2倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～3倍柱体积、优选为1～2倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～2倍柱体积、优选为0.2～0.6倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以0.5～4倍柱体积、优选为0.6～1.5倍柱体积的去离子水和0.5～4倍柱体积、优选为0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用0.02～0.2倍柱体积、优选为0.02～0.1倍柱体积的体积浓度为2vol％～7vol％、优选为3vol％～5vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液。所述生物样品为含药生物样品或空白生物样品，相应地，所述待测溶液为含药待测溶液或空白待测溶液。
本发明中，所述的C18固相萃取柱(SPE)可以采用现有文献公开的方法制备或者来自市售，优选采用Grace PureTM SPE C18-Low固相萃取小柱(500mg/3mL)。
本发明中，优选地，所述吹干的方式为常温下采用氮气吹干。
本发明中，所述涡旋振荡时间可以为2～8min，优选为3～6分钟，再优选为3～4min。离心转速可以为10000～18000r/min，优选为12000～16000r/min，更优选为14000～15000r/min。离心时间可以为8～20min，优选为10～18min，更优选为12～15min。
根据本发明优选的实施方式，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1～2倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～2倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～0.6倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以0.6～1.5倍柱体积的去离子水和0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.02～0.1倍柱体积的体积浓度为3vol％～5vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3～4min，14000～15000r/min下离心12～15min，取上清液作为待测溶液。
根据本发明的一个实施方式，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1.67倍柱体积的甲醇进行活化，再用1.67倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.33倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1倍柱体积的去离子水和1倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.03倍柱体积的体积浓度为5％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3min，14000r/min下离心15min，取上清液作为待测溶液。
采用本发明方法对生物样品进行处理，一方面能够特异性地除去生物样品中的蛋白等杂质组分，避免蛋白与反相色谱填料的死吸附而保护色谱柱，另一方面还能减少生物样品中的丹参素及其代谢产物的损失，并对待测溶液中的微量的丹参素及其代谢产物进行富集，从而得到适合采用超高效液相色谱-质谱联用仪进行检测的待测溶液。
＜检测步骤＞
本发明的检测方法采用超高效液相色谱-质谱联用仪(UHPLC-LTQ-Orbitrap)检测上述待测溶液。所述待测溶液为含药待测溶液或空白待测溶液。具体地，将含药待测溶液和空白待测溶液分别注入超高效液相色谱-质谱联用仪，分别得到相应的图谱，通过二者的对比，确定丹参素代谢产物的位置。这是本领域技术人员公知的，不再赘述。
本发明中，色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱(优选规格为2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相：0.1vol％甲酸水溶液(A)与乙腈(B)；柱温：25℃；梯度洗脱程序：0～2min(5vol％～20vol％B)，2～15min(20vol％～85vol％B)；流速：0.30mL/min；进样量：3μL。
本发明中，所述色谱柱可以为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。
采用本发明的色谱条件，能够在短时间内实现丹参素及其众多代谢产物的有效分离，有利于进行质谱解析。
本发明中，质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)负离子模式；鞘气流速：30arb；辅助气流速：10arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：350℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z 50～800；分辨率30000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的2个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：35～45％。
根据本发明优选的实施方式，质谱条件中，归一化碰撞能量为38～42％。更优选地，归一化碰撞能量为39～41％。发明人发现，对于丹参素及其代谢产物，在该条件下能够获得足够丰富的多级质谱碎片离子信息，同时还可保证碎片离子不会发生过度解离，有效地降低了化学成分的结构解析难度。
本发明中，所述质谱仪优选为高分辨质谱仪，例如美国ThermoFisher公司的LTQ-Orbitrap XL质谱仪，其配有电喷雾离子源(ESI)和Xcalibur 2.1工作站。
采用本发明的质谱条件设定，能够得到足够丰富且总量合适的碎片离子信息，有利于后续对生物样品中丹参素及其代谢产物进行化学结构解析。
本发明的检测方法还可以包括如下步骤：
(3)质谱数据的处理步骤，包括：对质谱数据进行数据处理：采用分子式预测模块，对质谱解离得到的所有的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[0～20]，H[0～30]，O[0～15]，N[0～3]，S[0～1]，环和不饱和键数[0～15]，质量精度误差在10ppm以内。该步骤可以利用采用Xcalibur 2.1工作站进行。本发明的处理方法，特别是上述相关参数的设定，能够在不遗漏重要的碎片离子信息的基础上，使组分的化学结构解析难度有效降低。
采用本发明的检测方法，能够从含药血浆样品中检测到5个丹参素代谢产物，从含药尿液样品中检测到21个代谢产物，从而为丹参素的药效物质基础和作用机制研究奠定了基础，并为进一步进行丹参素的体内药代动力学评价、药学研究、质量标准、工业化生产质控指标的制定以及临床方案的制定提供依据。
以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行示例性说明。
实施例1
1实验仪器及材料
DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱分析系统：美国ThermoFisher公司；
LTQ-Orbitrap XL质谱仪：美国Thermo Fisher公司，配有电喷雾离子源(ESI)和Xcalibur 2.1工作站；
Grace PureTM SPE C18-Low固相萃取小柱(500mg/3mL)；
Milli-Q Synthesis超纯水纯化系统：美国Millipore公司；
R200D型电子分析天平(1/10万)：德国Sartorius公司；
KQ-250DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。
丹参素对照品：成都曼思特生物科技有限公司产品(纯度大于98％)；
甲酸(色谱纯)：德国Merck公司；
甲醇(质谱纯)和乙腈(质谱纯)：美国Thermo Fisher公司。
Sprague Dawley(SD)大鼠(雄性，体重220～250g)，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK(京)2012-0001。
2实验方法
2.1生物样品的制备
称取350mg丹参素对照品，加入8mL 0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，摇匀，制成混悬液，作为给药样品。
实验前，将8只SD大鼠随机分为空白组(4只)和丹参素给药组(4只)，在动物房内适应性喂养1周。受试前，将大鼠置于代谢笼中，禁食12h，全程不禁水。给药组以350mg/kg的剂量给大鼠灌胃丹参素CMC-Na混悬液；空白组大鼠灌胃等体积0.5％CMC-Na溶液。
灌胃给药后的两组大鼠，分别于0.5、1.0、1.5、2.0、4.0h眼眶取血0.5mL，置于肝素钠抗凝EP管中，静置15min，离心15min(3000r/min，4℃)。合并上述5个时间点的上清液，涡旋振荡3min，分别得到空白血浆和含药血浆；收集大鼠0～24h内两组大鼠的尿液，离心15min(3000r/min，4℃)，取上清液，分别得到空白尿液和含药尿液。将生物样品-80℃冷冻储存，备用。
2.2生物样品的处理
取C18SPE固相萃取柱，先用5mL甲醇进行活化，再用5mL去离子水进行平衡。取4℃下解冻的1mL尿液或血浆加入到固相萃取柱，依次以3mL去离子水和3mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，于室温下用氮气吹干，残渣用100μL 5vol％乙腈溶液复溶，涡旋振荡3min，14000r/min离心15min，取上清液进行分析。
2.3液质联用分析条件
2.3.1色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相：0.1vol％甲酸水溶液(A)与乙腈(B)；柱温：25℃；梯度洗脱程序：0～2min(5vol％～20vol％B)，2～15min(20vol％～85vol％B)；流速：0.30mL/min；进样量：3μL。
2.3.2质谱条件
电喷雾离子源(ESI)负离子模式；鞘气流速：30arb；辅助气流速：10arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：350℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z 50～800；分辨率30000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的2个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：39％。
2.4高分辨质谱数据处理
利用Xcalibur 2.1工作站对质谱数据进行数据处理：采用分子式预测模块，对所有的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[0～20]，H[0～30]，O[0～15]，N[0～3]，S[0～1]，环和不饱和键数[0～15]，质量精度误差在10ppm以内。
3实验结果
通过空白生物样品与含药生物样品图谱，结合色谱保留时间、精确分子量、多级碎片离子等信息的分析，共鉴定了原型在内的22个代谢产物：从大鼠血浆中鉴定5个，从尿液中鉴定了21个，具体见表1和2。
表1
表2
注：+表示检测到；-表示未检测到。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (10)

1.一种生物样品中丹参素及其代谢产物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对生物样品进行处理：将C18固相萃取柱用1～3倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～3倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～2倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以0.5～4倍柱体积的去离子水和0.5～4倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用0.02～0.2倍柱体积的体积浓度为2vol％～7vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液；其中，所述生物样品包括人或动物吸收丹参素后的含有丹参素及其代谢产物的含药血浆样品和/或含药尿液样品；
(2)采用超高效液相色谱-质谱联用仪检测所述待测溶液，其中：
色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱；流动相：0.1vol％甲酸水溶液A与乙腈B；柱温：25℃；梯度洗脱程序：0～2min，5vol％～20vol％B；2～15min，20vol％～85vol％B；流速：0.30mL/min；进样量：3μL；
质谱条件为：电喷雾离子源负离子模式；鞘气流速：30arb；辅助气流速：10arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：350℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z 50～800；分辨率30000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的2个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：35～45％。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的生物样品还包括空白生物样品，其是指人或动物正常饮食下的空白血浆样品和/或空白尿液样品。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，涡旋振荡时间为2～10min，离心转速为10000～18000r/min，离心时间为8～20min。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1～2倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～2倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～0.6倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以0.6～1.5倍柱体积的去离子水和0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.02～0.1倍柱体积的体积浓度为3vol％～5vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3～4min，14000～15000r/min下离心12～15min，取上清液作为待测溶液。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1.67倍柱体积的甲醇进行活化，再用1.67倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.33倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1倍柱体积的去离子水和1倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.03倍柱体积的体积浓度为5％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3min，14000r/min下离心15min，取上清液作为待测溶液。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述C18固相萃取柱为Grace PureTM SPE C18-Low固相萃取柱；所述色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述质谱条件为：电喷雾离子源负离子模式；鞘气流速：30arb；辅助气流速：10arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：350℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z50～800；分辨率30000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的2个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：38～42％。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，归一化碰撞能量为39～40％。
9.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括如下步骤：
(3)对质谱数据进行数据处理：采用分子式预测模块，对质谱解离得到的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[0～20]，H[0～30]，O[0～15]，N[0～3]，S[0～1]，环和不饱和键数[0～15]，质量精度误差在10ppm以内。
10.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述质谱仪为高分辨质谱仪。
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