CN109633038B - 生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法 - Google Patents

生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109633038B
CN109633038B CN201910099523.9A CN201910099523A CN109633038B CN 109633038 B CN109633038 B CN 109633038B CN 201910099523 A CN201910099523 A CN 201910099523A CN 109633038 B CN109633038 B CN 109633038B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polydatin
column
biological sample
column volume
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910099523.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109633038A (zh
Inventor
张加余
梅晓丹
王喻淇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing University of Chinese Medicine
Original Assignee
Beijing University of Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing University of Chinese Medicine filed Critical Beijing University of Chinese Medicine
Priority to CN201910099523.9A priority Critical patent/CN109633038B/zh
Publication of CN109633038A publication Critical patent/CN109633038A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109633038B publication Critical patent/CN109633038B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对生物样品进行处理；和(2)采用超高效液相色谱‑质谱联用仪检测所述待测溶液。本发明的检测方法能够检测到生物样品中较多的虎杖苷代谢产物，从而为阐明虎杖苷的代谢途径奠定基础。

Description

生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法
技术领域
本发明涉及生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法。
背景技术
虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎和根。从虎杖中分离出来的虎杖苷被认为是虎杖主要的一种天然活性成分，具有较强的生物活性。现代药理学研究表明，虎杖苷对心肌细胞、血管平滑肌细胞、抗血小板聚集、改善微循环等有显著作用,此外还能减轻多种因素造成的组织器官损伤，具有保护肝细胞，降血脂及抗脂质过氧化等作用，常被作为虎杖药材或虎杖苷复方制剂的质控指标。然而，目前，虎杖苷的体内代谢过程和代谢产物尚不明确。继续进一步研究。
文献《LC-MS/MS测定大鼠血浆中虎杖苷浓度》(药学实践杂志，2012，30(1)，45-48)公开了测定大鼠血浆中虎杖苷浓度的LC-MS/MS方法，该方法采用二苯乙烯苷为内标，血浆样品用乙腈沉淀蛋白，流动相为甲醇-乙腈-0.1％甲酸水溶液，流速0.3ml/min，柱温30℃。该方法重点将血浆中的虎杖苷进行较好的分离，但没有考虑虎杖苷代谢产物的分离。
文献《液相色谱-串联质谱法同时测定血浆中白藜芦醇苷及其代谢产物》(分析化学，2007年9月，35(9)，1309-1313)公开了采用液质联用检测并分离血浆中白藜芦醇苷及其代谢产物白藜芦醇的方法。流动相为乙腈和水，梯度洗脱方法为：0～2min，30vol％～60vol％乙腈；2～6min，60vol％～100vol％乙腈；6～14min，100vol％～30vol％乙腈，流速0.2ml/min，柱温30℃。该方法仅针对血浆中白藜芦醇苷及白藜芦醇进行分离分析，而不涉及白藜芦醇苷在体内大量代谢产物的分离。
文献《大鼠肠道菌对虎杖苷的生物转化研究》(中国药学杂志，2012年4月，47(8)，631-634)中通过离体和整体实验观察了大鼠肠内菌对虎杖苷的代谢以及虎杖苷在大鼠胃肠道内的生物转化进行初步研究，并采用HPLC和LC-MS/MS技术对胃、肠容物及粪便中所含的虎杖苷以及白藜芦醇的含量进行测定。该方法的LC-MS方法采用流动相为0.02％氨溶液-乙腈，梯度洗脱。本方法同样仅研究虎杖苷及其代谢物白藜芦醇两种成分，代谢成分简单，不涉及白藜芦醇苷在体内大量代谢产物的分离。
因此，需要一种全面检测虎杖苷代谢产物的检测方法。
发明内容
本发明的目的是建立一种生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法，该方法能够较全面地检测虎杖苷的代谢产物。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法，包括如下步骤：
(1)对生物样品进行处理：将C18固相萃取柱用1～3倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～3倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～2倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～3倍柱体积的去离子水和0.5～2倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用0.02～0.2倍柱体积的体积浓度为2vol％～7vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液；其中，所述生物样品包括生物体吸收虎杖苷后的含有虎杖苷及其代谢产物的含药血浆样品和/或含药尿液样品；
(2)采用超高效液相色谱-质谱联用仪检测所述待测溶液，其中：
色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱；流动相：0.1vol％甲酸水溶液A与乙腈B；柱温：40℃；梯度洗脱程序：0～2min，5vol％～20vol％B；2～15min，20vol％～54vol％B；流速：0.35mL/min；进样量：2μL；
质谱条件为：电喷雾离子源负离子模式；鞘气流速：45arb；辅助气流速：25arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3.5kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：325℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z 50～800；分辨率30000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的2个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：30～40％。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述的生物样品还包括空白生物样品，其是指生物体正常饮食下的空白血浆样品和/或空白尿液样品。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，涡旋振荡时间为2～10min，离心转速为10000～18000r/min，离心时间为8～20min。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1～2倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～2倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～0.6倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～2倍柱体积的去离子水和0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.02～0.1倍柱体积的体积浓度为3vol％～5vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3～4min，12000～14000r/min下离心12～15min，取上清液作为待测溶液。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，将C18固相萃取柱用1.67倍柱体积的甲醇进行活化，再用1.67倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.33倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1.67倍柱体积的去离子水和1倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.03倍柱体积的体积浓度为5％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3min，14000r/min下离心15min，取上清液作为待测溶液。
根据本发明的检测方法，优选地，所述C18固相萃取柱为Grace PureTM SPE C18-Low固相萃取小柱；所述色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述归一化碰撞能量：33～39％。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述归一化碰撞能量为37～38％。
根据本发明的检测方法，优选地，所述检测方法还包括如下步骤：
(3)对质谱数据进行数据处理：采用分子式预测模块，对质谱解离得到的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[0～30]，H[0～30]，O[0～20]，S[0～1]，环和不饱和键数[0～15]，质量精度误差在5ppm以内。
根据本发明的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述质谱仪为高分辨质谱仪。
本发明的检测方法能够对生物样品中的虎杖苷及其众多代谢产物进行有效检测。根据本发明优选的实施方式，能够从含药血浆样品和含药尿液样品中检测到包括原型在内的41个虎杖苷代谢产物。本发明的检测方法为阐明虎杖苷的体内代谢机制奠定基础，并为进一步进行虎杖苷的体内药代动力学评价、药学研究、质量标准、工业化生产质控指标的制定以及临床方案的制定提供依据。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明提供一种生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法，包括如下步骤：(1)对生物样品的处理步骤，和(2)采用超高效液相色谱-质谱联用仪进行检测的步骤。任选地，包括(3)对质谱数据进行数据处理的步骤。
＜生物样品的处理步骤＞
本发明中，生物样品包括含药生物样品，含药生物样品是指生物体(例如人或动物)吸收虎杖苷后的含有虎杖苷及其代谢产物的含药血浆样品和/或含药尿液样品。
本发明中，生物样品还可以包括空白生物样品，空白生物样品是指生物体(例如人或动物)正常饮食下的空白血浆样品和/或空白尿液样品。
本发明中，所述动物优选为哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猴等。
本发明的含药血浆样品可以通过如下制备方法得到：将含有虎杖苷及其代谢产物的血液置于肝素钠抗凝EP管中，静置，离心，所得上清液即为所述血浆样品。其中，静置时间可以为8～120min，优选为8～60min，更优选为10～20min。离心转速可以为2000～5000r/min，优选为时间为3000～4500r/min，更优选为3500～4000r/min。离心时间可以为10～40min，优选为12～30min，更优选为15～20min。离心所需温度为0～6℃、更优选为2～4℃。
本发明的空白血浆样品可以通过如下制备方法得到：将空白血液(人或动物正常饮食下的血液)置于肝素钠抗凝EP管中，静置，离心，上清液即为所述血浆样品。其中，静置时间可以为8～120min，优选为8～60min，更优选为10～20min。离心转速可以为2000～5000r/min，优选为时间为3000～4500r/min，更优选为3500～4000r/min。离心时间可以为10～40min，优选为12～30min，更优选为15～20min。离心所需温度为0～6℃、更优选为2～4℃下进行。
本发明的含药尿液样品可以通过如下制备方法得到：将含有虎杖苷及其代谢产物的尿液离心，所得上清液即为所述尿液样品。离心转速可以为2000～5000r/min，优选为时间为3000～4500r/min，更优选为3500～4000r/min。离心时间可以为10～40min，优选为12～30min，更优选为15～20min。离心所需温度为0～6℃下、更优选为2～4℃。
本发明的空白尿液样品可以通过如下制备方法得到：将空白尿液离心，上清液即为所述尿液样品。离心转速可以为2000～5000r/min，优选为时间为3000～4500r/min，更优选为3500～4000r/min。离心时间可以为10～40min，优选为12～30min，更优选为15～20min。离心所需温度为0～6℃、更优选为2～4℃。
本发明中，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1～3倍柱体积、优选为1～2倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～3倍柱体积、优选为1～2倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～2倍柱体积、优选为0.2～0.6倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～3倍柱体积、优选为1～2倍柱体积的去离子水和0.5～2倍柱体积、优选为0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用0.02～0.2倍柱体积、优选为0.02～0.1倍柱体积的体积浓度为2vol％～7vol％、优选为3vol％～5vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液。所述生物样品为含药生物样品或空白生物样品，相应地，所述待测溶液为含药待测溶液或空白待测溶液。
本发明中，所述的C18固相萃取柱(SPE)可以采用现有文献公开的方法制备或者来自市售，优选采用Grace PureTM SPE C18-Low固相萃取小柱(500mg/3mL)。
本发明中，优选地，所述吹干的方式为常温下采用氮气吹干。
本发明中，所述涡旋振荡时间可以为2～10min，优选为3～6分钟，再优选为3～4min。离心转速可以为10000～18000r/min，优选为12000～16000r/min，更优选为12000～14000r/min。离心时间可以为8～20min，优选为10～18min，更优选为12～15min。
根据本发明优选的实施方式，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1～2倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～2倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～0.6倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～2倍柱体积的去离子水和0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.02～0.1倍柱体积的体积浓度为3vol％～5vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3～4min，12000～14000r/min下离心12～15min，取上清液作为待测溶液。
根据本发明的一个具体实施方式，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1.67倍柱体积的甲醇进行活化，再用1.67倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.33倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1.67倍柱体积的去离子水和1倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.03倍柱体积的体积浓度为5vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3min，13500r/min下离心15min，取上清液作为待测溶液。
采用本发明方法对生物样品进行处理，一方面能够特异性地除去生物样品中的蛋白等杂质组分，避免蛋白与反相色谱填料的死吸附而保护色谱柱，另一方面减少生物样品中的虎杖苷及其代谢产物的损失，并对待测溶液中的微量的虎杖苷及其代谢产物进行富集，从而得到适合采用超高效液相色谱-质谱联用仪进行检测的待测溶液。
＜检测步骤＞
本发明的检测方法采用超高效液相色谱-质谱联用仪(UHPLC-LTQ-Orbitrap)检测上述待测溶液。所述待测溶液为含药待测溶液或空白待测溶液。具体地，将含药待测溶液和空白待测溶液分别注入超高效液相色谱-质谱联用仪，分别得到相应的图谱，通过二者的对比，确定虎杖苷代谢产物的位置。这是本领域技术人员公知的，不再赘述。
本发明中，色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱；流动相：0.1vol％甲酸水溶液A与乙腈B；柱温：40℃；梯度洗脱程序：0～2min，5vol％～20vol％B；2～15min，20vol％～54vol％B；流速：0.35mL/min；进样量：2μL。
本发明中，所述色谱柱可以为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。
采用本发明的色谱条件，能够在短时间内实现虎杖苷及其众多代谢产物的有效分离，有利于进行质谱解析。
本发明中，质谱条件为：电喷雾离子源负离子模式；鞘气流速：45arb；辅助气流速：25arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3.5kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：325℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z 50～800；分辨率30000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的2个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：30～40％。
根据本发明优选的实施方式，质谱条件中，归一化碰撞能量为33～39％。更优选地，归一化碰撞能量为37～38％。发明人发现，对于虎杖苷及其代谢产物，在该条件下能够获得足够丰富的多级质谱碎片离子信息，同时还可保证碎片离子不会发生过度解离，有效地降低了化学成分的结构解析难度。
本发明中，所述质谱仪优选为高分辨质谱仪，例如美国Thermo Fisher公司的LTQ-Orbitrap XL质谱仪，其配有电喷雾离子源(ESI)和Xcalibur 2.1工作站。
采用本发明的质谱条件设定，能够得到足够丰富且总量合适的碎片离子信息，有利于后续对生物样品中虎杖苷及其代谢产物进行化学结构解析。
本发明的检测方法还可以包括如下步骤：
(3)质谱数据的处理步骤，包括：对质谱数据进行数据处理：采用分子式预测模块，对质谱解离得到的所有的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[0～30]，H[0～30]，O[0～20]，S[0～1]，环和不饱和键数[0～15]，质量精度误差在5ppm以内。该步骤可以利用采用Xcalibur 2.1工作站进行。本发明的处理方法，特别是上述相关参数的设定，能够在不遗漏重要的碎片离子信息的基础上，有效降低组分的化学结构解析难度。
采用本发明的检测方法，能够从含药血浆样品和含药尿液样品中共检测到包括原型在内的41个代谢产物，从而为虎杖苷的药效物质基础和作用机制研究奠定了基础，并为进一步进行虎杖苷的体内药代动力学评价、药学研究、质量标准、工业化生产质控指标的制定以及临床方案的制定提供依据。
以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行示例性说明。
实施例1
1实验仪器及材料
DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱分析系统：美国Thermo Fisher公司；
LTQ-Orbitrap XL质谱仪：美国Thermo Fisher公司，配有电喷雾离子源(ESI)和Xcalibur 2.1工作站；
Grace PureTM SPE C18-Low固相萃取小柱(500mg/3mL)；
Milli-Q Synthesis超纯水纯化系统：美国Millipore公司；
R200D型电子分析天平(1/10万)：德国Sartorius公司；
KQ-250DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。
虎杖苷对照品：成都曼思特生物科技有限公司产品(纯度大于98％)；
甲酸(色谱纯)：德国Merck公司；
甲醇(质谱纯)和乙腈(质谱纯)：美国Thermo Fisher公司。
Sprague Dawley(SD)大鼠(雄性，体重220～250g)，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK(京)2012-0001。
2实验方法
2.1生物样品的制备
称取350mg虎杖苷对照品，加入8mL 0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，摇匀，制成混悬液，作为给药样品。
实验前，将8只SD大鼠随机分为空白组(4只)和虎杖苷给药组(4只)，在动物房内适应性喂养1周。受试前，将大鼠置于代谢笼中，禁食12h，全程不禁水。给药组以350mg/kg的剂量给大鼠灌胃虎杖苷CMC-Na混悬液；空白组大鼠灌胃等体积0.5％CMC-Na溶液。
灌胃给药后的两组大鼠，分别于0.5、1.0、1.5、2.0、4.0h于眼眶静脉丛下取血0.5mL，置于肝素钠抗凝EP管中，静置15min，离心15min(3000r/min，4℃)。合并上述5个时间点的上清液，涡旋振荡3min，分别得到空白血浆和含药血浆；收集大鼠0～24h内两组大鼠的尿液，离心15min(3000r/min，4℃)，取上清液，分别得到空白尿液和含药尿液。将生物样品-80℃冷冻储存，备用。
2.2生物样品的处理
取C18固相萃取柱，先用5mL甲醇进行活化，再用5mL去离子水进行平衡。取4℃下解冻的1mL尿液或血浆加入到固相萃取柱，依次以5mL去离子水和3mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，于室温下用氮气吹干，残渣用100μL 5vol％乙腈溶液复溶，涡旋振荡3min，14000r/min离心15min，取上清液进行分析。
2.3液质联用分析条件
2.3.1色谱条件
色谱柱：C18色谱柱；流动相：0.1vol％甲酸水溶液A与乙腈B；柱温：40℃；梯度洗脱程序：0～2min，5vol％～20vol％B；2～15min，20vol％～54vol％B；流速：0.35mL/min；进样量：2μL；
2.3.2质谱条件
电喷雾离子源负离子模式；鞘气流速：45arb；辅助气流速：25arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3.5kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：325℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z50～800；分辨率30000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的2个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：37％。
2.4高分辨质谱数据处理
利用Xcalibur 2.1工作站对质谱数据进行数据处理：采用分子式预测模块，对所有的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[0～30]，H[0～30]，O[0～20]，S[0～1]，环和不饱和键数[0～15]，质量精度误差在5ppm以内。
3实验结果
通过空白生物样品与含药生物样品图谱，结合色谱保留时间、精确分子量、多级碎片离子等信息的分析，共鉴定了原型在内的41个代谢产物，具体见表1和表2。
表1
Figure GDA0003184467200000121
Figure GDA0003184467200000131
表2
Figure GDA0003184467200000141
Figure GDA0003184467200000151
Figure GDA0003184467200000161
Figure GDA0003184467200000171
Figure GDA0003184467200000181
Figure GDA0003184467200000191
注：+表示检测到；-表示未检测到。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (1)

1.一种生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对生物样品进行处理：将C18固相萃取柱用1.67倍柱体积的甲醇进行活化，再用1.67倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.33倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1.67倍柱体积的去离子水和1倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.03倍柱体积的体积浓度为5％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3min，14000r/min下离心15min，取上清液作为待测溶液；其中，所述生物样品包括生物体吸收虎杖苷后的含有虎杖苷及其代谢产物的含药血浆样品和含药尿液样品，所述C18固相萃取柱为GracePureTM SPE C18-Low固相萃取柱；
(2)采用超高效液相色谱-质谱联用仪检测所述待测溶液，其中：
色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱；流动相：0.1vol％甲酸水溶液A与乙腈B；柱温：40℃；梯度洗脱程序：0～2min，5vol％～20vol％B；2～15min，20vol％～54vol％B；流速：0.35mL/min；进样量：2μL；
质谱条件为：电喷雾离子源负离子模式；鞘气流速：45arb；辅助气流速：25arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3.5kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：325℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z 50～800；分辨率30000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的2个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：37～38％，质谱仪为高分辨质谱仪；
(3)对质谱数据进行数据处理：采用分子式预测模块，对质谱解离得到的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[0～30]，H[0～30]，O[0～20]，S[0～1]，环和不饱和键数[0～15]，质量精度误差在5ppm以内；
所述的生物样品还包括空白生物样品，其是指生物体正常饮食下的空白血浆样品和空白尿液样品；
通过空白生物样品与含药生物样品图谱，结合色谱保留时间、精确分子量、多级碎片离子信息的分析，共鉴定了原型在内的41个代谢产物；
Figure FDA0003191867210000021
Figure FDA0003191867210000031
Figure FDA0003191867210000041
Figure FDA0003191867210000051
Figure FDA0003191867210000061
Figure FDA0003191867210000071
+表示检测到；-表示未检测到。
CN201910099523.9A 2019-01-31 2019-01-31 生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法 Active CN109633038B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910099523.9A CN109633038B (zh) 2019-01-31 2019-01-31 生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910099523.9A CN109633038B (zh) 2019-01-31 2019-01-31 生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109633038A CN109633038A (zh) 2019-04-16
CN109633038B true CN109633038B (zh) 2021-09-14

Family

ID=66064660

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910099523.9A Active CN109633038B (zh) 2019-01-31 2019-01-31 生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109633038B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015028324A2 (en) * 2013-08-30 2015-03-05 Evolva Sa A method for producing modified resveratrol
CN105699567A (zh) * 2016-01-05 2016-06-22 南京医科大学 分子印记纳米磁珠分散固相萃取与质谱联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法
CN106290604A (zh) * 2016-07-21 2017-01-04 林悦安 白藜芦醇评价抗氧自由基代谢的方法及其检测
CN107300590A (zh) * 2017-05-26 2017-10-27 广州中医药大学 一种从虎杖中提取虎杖苷和白藜芦醇的hplc检测方法
CN108802230A (zh) * 2018-06-27 2018-11-13 北京鸿测科技发展有限公司 生物样品中丹参素及其代谢产物的检测方法
CN108845062A (zh) * 2018-06-19 2018-11-20 广西壮族自治区食品药品检验所 测定复方虎杖氨敏片组分含量的高效液相色谱法
CN108982685A (zh) * 2018-06-27 2018-12-11 北京鸿测科技发展有限公司 生物样品中染料木素及其代谢产物的检测方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015028324A2 (en) * 2013-08-30 2015-03-05 Evolva Sa A method for producing modified resveratrol
CN105699567A (zh) * 2016-01-05 2016-06-22 南京医科大学 分子印记纳米磁珠分散固相萃取与质谱联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法
CN106290604A (zh) * 2016-07-21 2017-01-04 林悦安 白藜芦醇评价抗氧自由基代谢的方法及其检测
CN107300590A (zh) * 2017-05-26 2017-10-27 广州中医药大学 一种从虎杖中提取虎杖苷和白藜芦醇的hplc检测方法
CN108845062A (zh) * 2018-06-19 2018-11-20 广西壮族自治区食品药品检验所 测定复方虎杖氨敏片组分含量的高效液相色谱法
CN108802230A (zh) * 2018-06-27 2018-11-13 北京鸿测科技发展有限公司 生物样品中丹参素及其代谢产物的检测方法
CN108982685A (zh) * 2018-06-27 2018-12-11 北京鸿测科技发展有限公司 生物样品中染料木素及其代谢产物的检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Quantification of trans-resveratrol and its metabolites in human plasma using ultra-high performance liquid chromatography tandem quadrupole-orbitrap mass spectrometry;Ljubica Svilar 等;《Journal of Chromatography B》;20190101;第1104卷;第119-129页 *
Simultaneous Determination of Aesculin, Aesculetin, Fraxetin, Fraxin and Polydatin in Beagle Dog Plasma by UPLC-ESI-MS/MS and Its Application in a Pharmacokinetic Study after Oral Administration Extracts of Ledum palustre L.;Zhibin Wang 等;《Molecules》;20180930;第23卷(第9期);第1-12页 *
虎杖质量控制方法与相关药物代谢动力学研究;张文婷;《中国博士学位论文全文数据库》;20091015(第10期);第75-81页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109633038A (zh) 2019-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ou-yang et al. Pharmacokinetic study of rutin and quercetin in rats after oral administration of total flavones of mulberry leaf extract
CN109239224B (zh) 酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法
CN108802230B (zh) 生物样品中丹参素及其代谢产物的检测方法
CN109633041B (zh) 衍生化hplc法测定药物中双氢睾酮的方法
Zhao et al. Simultaneous determination of six bioactive constituents of Guizhi Fuling Capsule in rat plasma by UHPLC–MS/MS: Application to a pharmacokinetic study
Xue et al. An improved ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization/quadrupole-time-of-flight high-definition mass spectrometry method for determining ingredients of herbal Fructus corni in blood samples
Jeong et al. A sensitive UPLC–ESI–MS/MS method for the quantification of cinnamic acid in vivo and in vitro: Application to pharmacokinetic and protein binding study in human plasma
Zhang et al. Chemical characterization of phenolic compounds in Erigeron injection by rapid-resolution LC coupled with multi-stage and quadrupole-TOF-MS
CN110031568B (zh) 一种测定人血浆中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦浓度的方法
Liang et al. Quantitative determination of characteristic components from compound of Lysionotus pauciflorus Maxim. by LC–MS/MS and its application to a pharmacokinetic study
Guo et al. Pharmacokinetic comparisons of mangiferin and mangiferin monosodium salt in rat plasma by UPLC‐MS/MS
Jia et al. Comparative pharmacokinetic study of five flavonoids in normal rats and rats with gastric ulcer following oral administration of Mongolian medicine, Shudage-4 by UPLC–ESI–MS/MS
CN109633038B (zh) 生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法
CN107543889A (zh) 一种大株红景天胶囊指纹图谱及其构建方法
CN109633039B (zh) 生物样品中羟基多甲氧基黄酮化合物及其代谢产物的检测方法
CA2685357C (en) Method of detecting blood plasma schizandrin b after administration of fuzheng huayu (fzhy)
AU2021103565A4 (en) Method for detecting polydatin and metabolites thereof in biological sample
CN108469473B (zh) 一种利用rrlc-dad-esi-q-tof-ms检测金银花在大鼠血清中的代谢产物的方法
CN106501389A (zh) 一种中药炮制机理研究方法
Shang et al. UHPLC/Q-TOF MS-based plasma metabolic profiling analysis of the bleeding mechanism in a rat model of yeast and ethanol-induced blood heat and hemorrhage syndrome
Wu et al. Simultaneous determination of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1, paeoniflorin, albiflorin and oxypaeoniflorin in rat plasma by liquid chromatography–tandem mass spectrometry: Application to a pharmacokinetic study of wen‐Yang‐Huo‐Xue soft capsule
CN108982685A (zh) 生物样品中染料木素及其代谢产物的检测方法
Gao et al. Simultaneous determination and pharmacokinetics study of four quinones in rat plasma by ultra high performance liquid chromatography with electrospray ionization tandem mass spectrometry after the oral administration of Qianzhi capsules
CN114414671A (zh) 两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法
Redko et al. Identification and quantification of an adulterant in a dietary supplement marketed for sexual enhancement

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant