CN114414671A - 两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，包括：采用超高效液相色谱串联质谱检测分析高脂高糖饲料联合小剂量链脲佐菌素诱导雄性SD大鼠形成2型糖尿病及应用两色金鸡菊干预8周后的尿液内源性代谢产物，获得色谱图；利用多元变量统计分析方法，经过一系列降维，从多个变量中筛选并鉴定出31个发生显著变化的内源性代谢物；并通过MetaboAnalyst开源在线代谢组学分析网站，富集得到与两色金鸡菊治疗2型糖尿病大鼠相关的重要代谢途径。本发明利用代谢组学的分析方法研究两色金鸡菊治疗2型糖尿病过程中相关的代谢变化，有助于阐明在治疗2型糖尿病的过程中两色金鸡菊所调控的相关代谢物及异常代谢网络。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法。
背景技术
代谢组学(metabolomics)是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。相比于其他组学，代谢组学能够通过揭示内在和外在因素影响下代谢整体的变化轨迹来反映某种病理生理过程中所发生的一系列生物事件，因此能够更准确直接地反映生命体终端和表型信息。目前，广泛应用于代谢组学数据采集的技术平台有液相色谱－质谱(LC/MS)联用技术、气相色谱－质谱(GC/MS)联用技术、核磁共振技术等。鉴于代谢物种类多样且浓度差异大，代谢组学研究需要依托高灵敏度、高分辨率的分析技术。随着技术的不断发展，超高效液相色谱(UPLC)和高分辨质谱如四极杆飞行时间质谱(Q-TOF-MS)由于其灵敏度高、分离速度快、进样体积小的优点得到广泛应用，尤其是在代谢组学的研究领域发挥着重要的作用。
2型糖尿病(T2DM)是一种常见慢性代谢性疾病，由于胰岛素缺乏导致的机体代谢紊乱，严重威胁人类健康，长久以来，医药研究者致力于糖尿病发病机制及有效药物的研究，然而目前还没有一种有效的药物或手段能治愈。因此积极预防糖尿病和延缓糖尿病及其并发症的发生发展，仍需研究者们不断的探索。由于糖尿病病机复杂，因此，寻找T2DM发生发展过程中的标志性代谢物及阐明有着确切疗效的药物的作用机制对T2DM的早期诊断、预防及治疗有着重要意义，代谢组学技术的发展为T2DM的预测、诊断及药物治疗机制的阐明提供了可能，越来越多的糖尿病相关代谢标志物被鉴定出来。
两色金鸡菊(Coreopsis tinctoria Nutt.)又名昆仑雪菊，为菊科金鸡菊属植物的干燥头状花序，始载于《新华本草纲要》，味甘，性平，归大肠经，具有清热解毒、活血化瘀等的功效，可治疗燥热烦渴、高血压、高血糖、心慌、胃肠不适等症状。两色金鸡菊(CT)作为新疆地区临床应用广泛的维吾尔族民族药，其药用价值正在被逐渐发现，当地人常将其作为茶饮饮用以预防和治疗糖尿病，目前关于两色金鸡菊对糖尿病发挥药理作用的研究并不多见，两色金鸡菊治疗糖尿病作用机制的尿液代谢组学研究未见报道，它对哪些异常的代谢网络进行了调节，其作用机制有待深入阐明。
发明内容
本发明的目的在于提供两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，利用代谢组学的分析方法研究两色金鸡菊治疗2型糖尿病过程中相关的代谢变化，有助于阐明在治疗2型糖尿病的过程中两色金鸡菊所调控的相关代谢物及异常代谢网络。
为了实现根据本发明的这些目的和其他优势，提供了两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，包括：
采用超高效液相色谱串联质谱检测分析高脂高糖饲料联合小剂量链脲佐菌素诱导雄性SD大鼠形成2型糖尿病及应用两色金鸡菊干预8周后的尿液内源性代谢产物，获得色谱图；
利用多元变量统计分析方法，经过一系列降维，从多个变量中筛选并鉴定出31个发生显著变化的内源性代谢物；
通过MetaboAnalyst开源在线代谢组学分析网站，富集得到与两色金鸡菊治疗2型糖尿病大鼠相关的重要代谢途径。
优选的，上述的两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法中，获得两色金鸡菊治疗糖尿病的差异代谢物代谢通路的具体步骤如下：
(1)两色金鸡菊浸膏的制备
精密称量两色金鸡菊样品置于烧杯中，倒入沸水，盖上锡箔纸，冲泡25～35min，将茶汤滤出，继续加沸水冲泡25～35min，模拟茶叶冲泡过程，滤出茶汤，合并两次茶汤，摇匀，滤液经温度50-55℃，真空度0.001-0.01Mpa减压回收纯水，浓缩至稠膏状，即得两色金鸡菊浸膏。
(2)糖尿病大鼠模型的建立
雄性SD大鼠，体重180-200g，高脂高糖饲料喂养4周以上，造成胰岛素抵抗，糖耐量检测合格后，尾静脉注射STZ(由pH4.5的柠檬酸缓冲液配制而成)诱导糖尿病，以空腹血糖高于16.7mmol/L为造模成功。
(3)动物分组、剂量设置及给药方法
将步骤(2)中造模成功的糖尿病大鼠随机分为以下4组：模型组、阳性对照组(200-300mg/kg)、两色金鸡菊低剂量组(500-1000mg/kg)、两色金鸡菊高剂量组(1000-4000mg/kg)，加上正常对照组，共5组，分别进行灌胃，持续干预4-10周(优选6-8周)，其中，两色金鸡菊组给予两色金鸡菊浸膏水溶液，阳性对照组给予二甲双胍水溶液，对照组和模型组给予相同体积的生理盐水。
(4)血糖、血脂及总胆固醇测定
给药前及给药期间使用血糖仪每周测定1次血糖，监测各组血糖值、血脂值以及总胆固醇值，采血当天各组大鼠禁食(不禁水)12h，使用迈瑞BS-240VET动物专用全自动生化仪测定总胆固醇和甘油三酯。
(5)大鼠尿液的采集、保存和前处理
第八周时利用代谢笼收集各组大鼠的24小时尿液，分装保存于2mL的离心管中，每管1.5mL，-80℃冰箱保存；测定前取出尿液样本于冰上解冻，取100μL尿液至1.5mL的EP管中，加入20μL的内标溶液，涡旋振荡1min；之后加入乙腈溶液进行沉淀蛋白，继续涡旋1min，离心，吸取上清液氮吹干，加入100μL的乙腈溶液复溶，离心，吸取上清液于自动进样瓶中，待进样分析。
(6)超高效液相色谱串联质谱检测分析
建立超高效液相色谱串联质谱技术，对各组大鼠尿液样本依次进行液质联用数据采集。
(7)数据的预处理
采用Shimadzu公司的Labsolutions软件自带的文件格式转换器将所获得的质谱原始相机数据转换为mzML格式的数据文件，并导入MS-DIAL软件进行去噪音、基线校正、质谱峰提取、峰对齐处理，获得初步的代谢组学数据矩阵；之后使用MetaboAnalyst数据库处理数据，进一步作零值填充、归一化及对数转换。
(8)多元变量统计分析代谢轮廓差异
将进行预处理后的数据导入SIMCA-P14.1软件，进行数据预处理，建立无监督的主成分分析(PCA)，能够真实的反映样本聚类情况；分别将正常组、模型组与两色金鸡菊治疗组进行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，进一步确证两色金鸡菊对糖尿病大鼠的干预效果。
(9)筛选并鉴定潜在生物标志物
为了筛选出两色金鸡菊对糖尿病大鼠的干预过程中有显著变化的差异代谢物，分别以模型组和两色金鸡菊治疗组进行有监督的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，同时构建S-plot图，对两组间的差异代谢物进行筛选；
对获得的潜在生物标志物所对应的分子量及二级碎片，通过检索公共数据库HMDB、METLIN及metDNA方法进行鉴定，并与相关文献进行参考比对，最终可鉴定出31个与两色金鸡菊治疗糖尿病进程相关的差异代谢产物。
(10)代谢通路富集分析
将筛选鉴定出的潜在生物标志物输入MetaboAnalyst数据库，并对各代谢物名字标准化，对代谢途径进行分析，并通过代谢通路富集分析和拓扑分析的结果，找到最相关的代谢途径，共富集得到4条代谢通路，其中重要的代谢途径确定为甘油磷脂代谢通路(Glycerophospholipid metabolism)。
优选的，上述两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，所述步骤(5)大鼠各组尿液样本沉淀蛋白混匀后，在4℃、14000r·min-1离心15min，加乙腈复溶之后继续在4℃、14000r·min-1下离心15min。
优选的，上述两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，所述步骤(5)中内标溶液制备方法为：精密称取氘代氧化三甲胺、亮氨酸-脑啡肽各1mg，加入甲醇1mL超声溶解，得到质量浓度为1mg·mL-1的氘代氧化三甲胺、亮氨酸-脑啡肽储备液；再次精密吸取适量氘代氧化三甲胺、亮氨酸-脑啡肽储备液，加甲醇稀释，得到1μg·mL-1的内标溶液，于4℃冰箱中保存待用。
优选的，上述两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，所述步骤(6)中超高效液相色谱串联质谱技术是采用Shimadzu公司超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱联用仪(型号：LCMS-9030)来建立。
优选的，上述两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，所述步骤(6)中超高效液相色谱条件包括：色谱柱为Shim-pack GIST C18柱(规格为2.1mm×100mm，固定相粒径1.9μm)，保护柱为Shim-pack GIST-HP(G)C18柱(规格为2.1mm×10mm，粒径为1.9μm)，柱温设置为35℃，流动相A水(含体积分数为0.1％的色谱甲酸)，B为乙腈，流动相流速为0.2mL·min-1，梯度洗脱程序为0-7min，5-45％B；7-14min，45-95％B；14-15.5min，95％B；15.5-16min，95-5％B；16-20min，5％B。自动进样室温度设为4℃，进样量为2μL。
优选的，上述两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，所述步骤(6)中质谱条件为所有数据在电喷雾离子源(ESI)正、负离子以数据依赖采集(DDA)模式下进行全扫描采集，其中离子源接口电压-3.0kV；干燥气和雾化气都由氮气充当，干燥气流速10L·min-1，雾化气流速3.0L·min-1；以空气作为加热气，流速10L·min-1；以氩气作为碰撞气；脱溶剂管温度250℃，加热块温度400℃，接口温度为300℃；扫描模式：MS Scan(m/z 80-560；550-1000)，MS/MS(m/z 50-560；50-1000)；碰撞能量为35±17V。校准方法以外标法校准质量数(调谐液为NaI，浓度400mg·L-1)，分辨率＞30000，质量误差＜2×10-6。
优选的，上述两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，所述步骤(7)中进行数据预处理的主要数据处理参数如下：保留时间范围0-20min，质量数范围80-1000Da，峰高最低限制3000，数据经70％过滤原则处理，归一化模式为面积归一化，采用最小值的1/2填充0值，pareto缩放比例模式。
优选的，上述两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，所述步骤(9)中差异代谢物的筛选条件为：选择变量重要性投影(VIP)值≥1，差异倍数(FC)≥2或小于等于0.5，且差异在两组间具有统计学意义(t检验p Value＜0.05)。
本发明的有益效果是：
上述两色金鸡菊代谢物的检测分析方法，可快速准确鉴定2型糖尿病大鼠尿液中的相关生物标志物，分析其可能的代谢途径，探讨两色金鸡菊对2型糖尿病大鼠代谢紊乱的影响，从代谢组学角度全面地揭示阐明CT干预T2DM发生发展及作用机制，为后期研究两色金鸡菊治疗糖尿病的作用机制拓展新的方向和思路。
附图说明
图1为实施例1中基于超高效液相色谱串联质谱正离子模式下(A：MS 80-560；B:MS550-1000)采集的模型组大鼠的尿液代谢图谱。
图2为实施例1中基于超高效液相色谱串联质谱负离子模式下(A：MS 80-560；B:MS550-1000)采集的模型组大鼠的尿液代谢图谱。
图3为实施例1中五组大鼠尿液代谢物的PCA图。NC-正常组；Mod-模型组；Met-二甲双胍组；JH-两色金鸡菊高剂量组；JL-两色金鸡菊低剂量组。
图4为实施例1中分别为三组大鼠尿液PLS-DA图。NC-正常组；Mod-模型组；JH-两色金鸡菊高剂量组；JL-两色金鸡菊低剂量组。
图5为实施例1中模型组与治疗组大鼠尿液OPLS-DA模型的S-plot图。
图6为实施例1中MetaboAnalyst数据库中构建的代谢通路富集图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1
一种基于尿液代谢组学的两色金鸡菊治疗糖尿病的差异代谢物代谢通路及研究方法，采用超高效液相色谱串联质谱检测分析高脂高糖饲料联合小剂量链脲佐菌素诱导雄性SD大鼠形成2型糖尿病及应用两色金鸡菊干预8周后的尿液内源性代谢产物，获得色谱图；
利用多元变量统计分析方法，经过一系列降维，从多个变量中筛选并鉴定出31个发生显著变化的内源性代谢物；
通过MetaboAnalyst开源在线代谢组学分析网站，富集得到与两色金鸡菊治疗2型糖尿病大鼠相关的重要代谢途径。
获得两色金鸡菊治疗糖尿病的差异代谢物代谢通路的具体步骤如下：
(1)两色金鸡菊浸膏的制备
精密称量两色金鸡菊样品80g于2L烧杯中，倒入2L沸水，盖上锡箔纸，冲泡30min，将茶汤滤出，继续加2L沸水冲泡30min，模拟茶叶冲泡过程，滤出茶汤，合并两次茶汤，摇匀，滤液在温度50℃，真空度0.005Mpa下减压回收纯水，浓缩至稠膏状，即得两色金鸡菊浸膏。
(2)糖尿病大鼠模型的建立
SD雄性大鼠，体重180-200g，高脂高糖饲料喂养4周以上，造成胰岛素抵抗，糖耐量检测合格后，尾静脉注射STZ(由pH4.5的柠檬酸缓冲液配制)诱导糖尿病，以空腹血糖高于16.7mmol/L为造模成功。
(3)动物分组、剂量设置及给药方法
将步骤(2)中造模成功的糖尿病大鼠随机分为以下4组：模型组、阳性对照组(250mg/kg)、两色金鸡菊低剂量组(1000mg/kg)、两色金鸡菊高剂量组(2000mg/kg)，加上正常对照组，共5组。两色金鸡菊组和阳性对照组分别采用两色金鸡菊浸膏的水溶液与二甲双胍水溶液进行灌胃，对照组和模型组的大鼠通过灌胃的方式给予相同体积的生理盐水，持续干预8周。
(4)血糖、血脂及总胆固醇测定
给药前及给药期间每周测定1次血糖，监测各组血糖值、血脂值以及总胆固醇值，采血当天各组大鼠禁食(不禁水)12h，使用血糖仪测定大鼠血糖，使用迈瑞BS-240VET动物专用全自动生化仪测定总胆固醇和甘油三脂。与正常组相比，模型组总胆固醇水平升高，与模型组相比，两色金鸡菊低剂量组的总胆固醇水平表现出下降趋势，它的治疗作用表现出了显著性(p＜0.05)。
(5)大鼠尿液的采集、保存和前处理
第八周时利用代谢笼收集各组大鼠的24小时尿液，分装保存于2mL的离心管中，每管1.5mL，-80℃冰箱保存。测定前取出尿液样本于冰上解冻，取100μL尿液至1.5mL的EP管中，加入20μL的内标溶液(氘代氧化三甲胺、亮氨酸-脑啡肽混合储备液1μg·mL-1)，涡旋振荡1min。之后加入400μL的乙腈溶液进行沉淀蛋白，继续涡旋1min，然后在4℃，14000r·min-1离心15min，吸取上清液氮吹干，加入100μL的乙腈溶液复溶，在4℃，14000r·min-1下离心15min，吸取上清液于自动进样瓶中，待进样分析。
(6)超高效液相色谱串联质谱检测分析
采用Shimadzu公司超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱联用仪(型号：LCMS-9030)建立超高效液相色谱串联质谱技术，对各组大鼠尿液样本依次进行液质联用数据采集。如图1、图2所示。
超高效液相色谱条件：色谱柱为Shim-packGIST C18柱(规格为2.1mm×100mm，固定相粒径1.9μm)，保护柱为Shim-pack GIST-HP(G)C18柱(规格为2.1mm×10mm，粒径为1.9μm)，柱温设置为35℃，流动相A水(含体积分数为0.1％的色谱甲酸)，B为乙腈，流动相流速为0.2mL·min-1，梯度洗脱程序为0-7min，5-45％B；7-14min，45-95％B；14-15.5min，95％B；15.5-16min，95-5％B；16-20min，5％B。自动进样室温度设为4℃，进样量为2μL。
质谱条件：所有数据在电喷雾离子源(ESI)正、负离子以数据依赖采集(DDA)模式下进行全扫描采集，其中离子源接口电压-3.0kV；干燥气和雾化气都由氮气充当，干燥气流速10L·min-1，雾化气流速3.0L·min-1；以空气作为加热气，流速10L·min-1；以氩气作为碰撞气；脱溶剂管温度250℃，加热块温度400℃，接口温度为300℃；扫描模式：MSScan(m/z80-560；550-1000)，MS/MS(m/z50-560；50-1000)；碰撞能量为35±17V。校准方法以外标法校准质量数(调谐液为NaI，浓度400mg·L-1)，分辨率＞30000，质量误差＜2×10-6。
(7)数据预处理
采用Shimadzu公司的Labsolutions软件自带的文件格式转换器将所获得的质谱原始下机数据转换为mzML格式的数据文件。并导入MS-DIAL软件进行去噪音、基线校正、质谱峰提取、峰对齐等处理，获得初步的代谢组学数据矩阵。之后使用MetaboAnalyst数据库处理数据，进一步作零值填充、归一化及对数转换等。其中主要的数据处理参数如下：保留时间范围0-20min，质量数范围80-1000Da，峰高最低限制3000，数据经70％过滤原则处理，归一化模式为面积归一化，采用最小值的1/2填充0值，pareto缩放比例模式。
(8)多元变量统计分析代谢轮廓差异
将进行预处理后的数据导入SIMCA-P14.1软件，对各组数据作Par缩放方法进行预处理，建立无监督的主成分分析(PCA)，能够真实的反映样本聚类情况，如图3所示，正常组和模型组分离良好，各给药组均呈现远离模型组的趋势。
为了进一步的确证两色金鸡菊对糖尿病大鼠的干预效果，分别将正常组，模型组与两色金鸡菊治疗组进行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，如图4所示，所建立的PLS-DA模型拟合能力指数分别为：两色金鸡菊低剂量组别中，R2X＝0.738，R2Y＝0.995，Q2＝0.97；两色金鸡菊低剂量组别中，R2X＝0.768，R2Y＝0.994，Q2＝0.975。R2X和R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q2表示模型的预测能力，这三个指标越接近于1时表示模型越稳定可靠，Q2＞0.5时可认为是有效的模型，Q2＞0.9时为出色的模型。结果表明，在构建的两组模型中，正常组与模型组均分离良好，且治疗组介于空白组和模型组之间，提示两色金鸡菊干预之后糖尿病模型大鼠的尿液代谢模式发生改变，表明两色金鸡菊对糖尿病大鼠尿液代谢紊乱有一定的调节作用。
(9)筛选并鉴定潜在生物标志物
为了筛选出两色金鸡菊对糖尿病大鼠的干预过程中有显著变化的差异代谢物，分别以模型组和两色金鸡菊治疗组进行有监督的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，同时构建S-plot图，对模型组与两给药组间的差异代谢物进行筛选，如图5所示，图中样本所处的位置离原点越远，获得的变量重要性投影(VIP)值也会越高，对区分两组样本所做的贡献越大。差异代谢物的筛选条件为：选择VIP值≥1，差异倍数(FC)≥2或≤0.5，且差异在两组间具有统计学意义(t检验p Value＜0.05)。
根据变量所对应的分子量及二级碎片，通过检索公共数据库HMDB、METLIN及metDNA对获得的潜在生物标志物进行鉴定，并与相关文献进行参考比对，最终共鉴定出31个与两色金鸡菊治疗糖尿病进程相关的差异代谢产物，包括1,6-Anhydro-β-D-glucose、formononetin、Asn-Leu-Pro-Ile-Asn、Westiellamide、Phe-Tyr-Lys-Arg、Gly-Leu-Arg-Val-Phe、Glu-Lys-Leu-Thr-His、Ala-Pro-Arg-Lys-Lys、13Z-Docosenamide、His-Lys-Leu-Val-Val、PC(18:1(9Z)/14:0)、Ile-Gly-Lys-Ile-Phe、1,26-Dicaffeoylhexacosanediol、MycolactoneF、Lys-Tyr-Gln-Glu-Ala、Asp-Tyr-Asn-Leu-Leu、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-methyl、ArtemoinA、PC(16:0/18:0)、Glucocerebrosides、CoenzymeQ6、1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycerol、DG(16:0/0:0/20:3n9)、VinaginsenosideR12、OleoylEthylAmide、Decahydronaphthalene-2-carboxylicacid、DG(16:0/16:0/0:0)、Phytol、xi-3-Methyl-3-cyclohexen-1-ol、Dimethyldithiophosphate、Tridemorph。其中8个代谢产物的含量在糖尿病大鼠模型组中降低，23个代谢产物含量升高，两色金鸡菊给药后均显示回调作用。
(10)代谢通路富集分析
将筛选鉴定出的潜在生物标志物输入MetaboAnalyst数据库，并对各代谢物名字标准化，对代谢途径进行分析，并通过代谢通路富集分析和拓扑分析的结果，找到最相关的代谢途径。共富集得到4条代谢通路，其中重要的代谢途径，确定为甘油磷脂代谢通路(Glycerophospholipid metabolism)，如图6所示。
甘油磷脂代谢途径的相关代谢产物是一类磷脂酰胆碱类物质，磷脂在自然界中无处不在，是细胞脂质双层的关键成分，并参与代谢和信号传导。有研究报道糖尿病疾病患者中的甘油磷脂含量会发生异常变化，且它的中间产物与糖尿病相关的炎症、氧化应激等密切相关。本研究也检测到相关代谢物的显著变化，磷脂酰胆碱PC(18:1(9Z)/14:0)、PC(16:0/18:0)在2型糖尿病模型组中上调，两色金鸡菊干预后显著下调，提示CT主要通过调节脂质代谢紊乱来改善T2DM的进程，可以将磷脂PC(18:1(9Z)/14:0)、PC(16:0/18:0)的含量作为两色金鸡菊对糖尿病治疗效果的判定依据。
以上所述实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于，包括：
采用超高效液相色谱串联质谱检测分析高脂高糖饲料联合小剂量链脲佐菌素诱导雄性SD大鼠形成2型糖尿病及应用两色金鸡菊干预8周后的尿液内源性代谢产物，获得色谱图；
利用多元变量统计分析方法，经过一系列降维，从多个变量中筛选并鉴定出31个发生显著变化的内源性代谢物；
通过MetaboAnalyst开源在线代谢组学分析网站，富集得到与两色金鸡菊治疗2型糖尿病大鼠相关的重要代谢途径。
2.如权利要求书1所述的两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于，获得两色金鸡菊治疗糖尿病的差异代谢物代谢通路的具体步骤如下：
(1)两色金鸡菊浸膏的制备
两色金鸡菊样品置于烧杯中，倒入沸水，盖上锡箔纸，冲泡后将茶汤滤出，滤液经减压回收纯水，浓缩至稠膏状，即得两色金鸡菊浸膏；
(2)建立糖尿病大鼠模型；
(3)动物分组、剂量设置及给药方法
将步骤(2)中造模成功的糖尿病大鼠随机分为以下4组：模型组、阳性对照组、两色金鸡菊低剂量组、两色金鸡菊高剂量组，加上正常对照组，共5组，分别进行灌胃，持续干预4-10周，其中，两色金鸡菊组给予两色金鸡菊浸膏水溶液，阳性对照组给予二甲双胍水溶液，对照组和模型组给予相同体积的生理盐水；
(4)血糖、血脂及总胆固醇测定
给药前及给药期间使用血糖仪每周测定1次血糖，监测各组血糖值、血脂值以及总胆固醇值，采血当天各组大鼠禁食12h，测定大鼠血糖、总胆固醇和甘油三脂；
(5)大鼠尿液的采集、保存和前处理
利用代谢笼收集各组大鼠的24小时尿液，分装保存于2mL的离心管中，每管1.5mL，-80℃冰箱保存；测定前取出尿液样本于冰上解冻，取100μL尿液至1.5mL的EP管中，加入20μL的内标溶液，涡旋振荡1min；之后加入乙腈溶液进行沉淀蛋白，继续涡旋1min，离心，吸取上清液氮吹干，加入100μL的乙腈溶液复溶，离心，吸取上清液于自动进样瓶中，待进样分析；
(6)超高效液相色谱串联质谱检测分析
建立超高效液相色谱串联质谱技术，对各组大鼠尿液样本依次进行液质联用数据采集；
(7)数据的预处理
采用Shimadzu公司的Labsolutions软件自带的文件格式转换器将所获得的质谱原始相机数据转换为mzML格式的数据文件，并导入MS-DIAL软件进行去噪音、基线校正、质谱峰提取、峰对齐处理，获得初步的代谢组学数据矩阵；之后使用MetaboAnalyst数据库处理数据，进一步作零值填充、归一化及对数转换；
(8)多元变量统计分析代谢轮廓差异
将进行预处理后的数据导入SIMCA-P14.1软件，进行数据预处理，建立无监督的主成分分析，能够真实的反映样本聚类情况；分别将正常组、模型组与两色金鸡菊治疗组进行偏最小二乘法判别分析，进一步确证两色金鸡菊对糖尿病大鼠的干预效果；
(9)筛选并鉴定潜在生物标志物
为了筛选出两色金鸡菊对糖尿病大鼠的干预过程中有显著变化的差异代谢物，分别以模型组和两色金鸡菊治疗组进行有监督的正交偏最小二乘法判别分析，同时构建S-plot图，对两组间的差异代谢物进行筛选；
对获得的潜在生物标志物所对应的分子量及二级碎片，通过检索公共数据库HMDB、METLIN及metDNA方法进行鉴定，并与相关文献进行参考比对，最终可鉴定出31个与两色金鸡菊治疗糖尿病进程相关的差异代谢产物；
(10)代谢通路富集分析
将筛选鉴定出的潜在生物标志物输入MetaboAnalyst数据库，并对各代谢物名字标准化，对代谢途径进行分析，并通过代谢通路富集分析和拓扑分析的结果，找到最相关的代谢途径，共富集得到4条代谢通路，其中重要的代谢途径确定为甘油磷脂代谢通路。
3.根据权利要求2所述的两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(5)大鼠各组尿液样本沉淀蛋白混匀后，在4℃、14000r·min-1离心15min，加乙腈复溶之后继续在4℃、14000r·min-1下离心15min。
4.根据权利要求2所述的两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(5)中内标溶液制备方法为：精密称取氘代氧化三甲胺、亮氨酸-脑啡肽各1mg，加入甲醇1mL超声溶解，得到质量浓度为1mg·mL-1的氘代氧化三甲胺、亮氨酸-脑啡肽储备液；再次精密吸取适量氘代氧化三甲胺、亮氨酸-脑啡肽储备液，加甲醇稀释，得到1μg·mL-1的内标溶液，于4℃冰箱中保存待用。
5.根据权利要求2所述的两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(6)中超高效液相色谱条件包括：色谱柱为Shim-pack GIST C18柱(规格为2.1mm×100mm，固定相粒径1.9μm)，保护柱为Shim-pack GIST-HP(G)C18柱(规格为2.1mm×10mm，粒径为1.9μm)，柱温设置为35℃，流动相A水(含体积分数为0.1％的色谱甲酸)，B为乙腈，流动相流速为0.2mL·min-1，梯度洗脱程序为0-7min，5-45％B；7-14min，45-95％B；14-15.5min，95％B；15.5-16min，95-5％B；16-20min，5％B。自动进样室温度设为4℃，进样量为2μL。
6.根据权利要求2所述的两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(6)中质谱条件为所有数据在电喷雾离子源(ESI)正、负离子以数据依赖采集(DDA)模式下进行全扫描采集，其中离子源接口电压-3.0kV；干燥气和雾化气都由氮气充当，干燥气流速10L·min-1，雾化气流速3.0L·min-1；以空气作为加热气，流速10L·min-1；以氩气作为碰撞气；脱溶剂管温度250℃，加热块温度400℃，接口温度为300℃；扫描模式：MS Scan(m/z 80-560；550-1000)，MS/MS(m/z 50-560；50-1000)；碰撞能量为35±17V。校准方法以外标法校准质量数(调谐液为NaI，浓度400mg·L-1)，分辨率＞30000，质量误差＜2×10-6。
7.根据权利要求2所述的两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(7)中进行数据预处理的主要数据处理参数如下：保留时间范围0-20min，质量数范围80-1000Da，峰高最低限制3000，数据经70％过滤原则处理，归一化模式为面积归一化，采用最小值的1/2填充0值，pareto缩放比例模式。
8.根据权利要求2所述的两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法，其特征在于：所述步骤(9)中差异代谢物的筛选条件为：选择变量重要性投影(VIP)值≥1，差异倍数(FC)≥2或≤0.5，且差异在两组间具有统计学意义(t检验p Value＜0.05)。
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| CN115032351A (zh) * | 2022-06-10 | 2022-09-09 | 内蒙古科技大学包头医学院 | 一种蒺藜皂苷d抗肺纤维化作用机制的研究方法 |
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| KR20180061062A (ko) * | 2016-11-28 | 2018-06-07 | 콜마비앤에이치 주식회사 | 여주 추출물, 구절초 추출물 및 작약 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 당뇨 예방 또는 개선용 조성물 |
| CN108508055A (zh) * | 2018-03-27 | 2018-09-07 | 广西医科大学 | 一种基于代谢组学的广西瑶山甜茶抗糖尿病潜在标志物代谢通路及研究方法 |
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