CN110231424B - 一种同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，本发明运用超高效液相色谱串联质谱法(UPLC‑MS/MS)快速同时检测口服双参平肺颗粒后大鼠血浆中芒果苷、丹参酮IIA、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、柚皮苷、甘草苷、隐丹参酮、知母皂苷BII和甘草酸的含量。该方法包括标准品储备液的配制、内标工作液的配制、标准曲线的制备、血浆样品处理和含量测定。本发明提供的方法灵敏度高、特异性强、重现性好、操作简单快速，符合体内生物样品测定要求，并能应用于双参平肺颗粒口服给药后的药代动力学研究。

Description

一种同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是中成药体内代谢研究技术领域，具体涉及一种能快速同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法。
背景技术
双参平肺方是南京中医药大学范欣生教授优选的经典名方加减方，由人参、丹参、桑白皮、地骨皮、橘红、知母、天冬、甘草八味药组成，制成具有清肺润燥，镇咳止呕功效的颗粒剂，用以治疗气阴不足、痰瘀交阻之肺纤维化，临床疗效显著。
研究发现，双参平肺颗粒的主要成分是皂苷类、酚酸类、丹参酮类、黄酮类等化合物。人参皂苷Rg1，丹参酮IIA、隐丹参酮与丹酚酸B，柚皮苷，芒果苷与知母皂苷BII，甘草苷与甘草酸，分别是2015版《中国药典》中人参、丹参、橘红、知母、甘草的质控成分，大量文献对其药理活性进行了报道。但关于口服双参平肺颗粒后大鼠血浆中这9种成分的药代动力学研究还未见报道。为明确这9种功效成分在体内的代谢过程，须建立同时监测口服双参平肺颗粒后入血成分的浓度的方法，为双参平肺颗粒的后续研究提供可靠依据。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，具体采用乙酸乙酯一步萃取法进行血浆前处理，选用多潘立酮单一内标，运用UPLC-MS/MS正负离子快速切换分析模式快速同时完成血浆中双参平肺颗粒主要活性成分的检测方法。并应用本发明方法开展药代动力学研究。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
一种同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)标准品储备液的配制
分别精密称取人参皂苷Rg1、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮IIA、芒果苷、知母皂苷BII、柚皮苷、甘草苷、甘草酸各10mg，分别置于10ml容量瓶中，加适量甲醇超声溶解，并定容至刻度线，分别制得1.00mg/ml标准品储备液；
(2)内标工作液的配制
精密称取多潘立酮1mg于10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并定容配成0.1mg/mL储备液；精密移取内标储备液适量，用甲醇稀释，配成浓度为0.1μg/mL的内标溶液；
(3)标准曲线的制备
用大鼠空白血浆，将步骤(1)的各标准品储备液配制成7个终浓度的系列血浆标准曲线样品：人参皂苷Rg11.3-650ng/mL；丹酚酸B 5.0-2495ng/mL；隐丹参酮4.5-2250ng/mL；丹参酮IIA 2.0-1000ng/mL；芒果苷4.5-2250ng/mL；知母皂苷BII5.0-2250ng/mL；柚皮苷5.0-2497.5ng/mL；甘草苷2.5-1252.5ng/mL；甘草酸1.5-751.2ng/mL；
分别取各系列血浆标准曲线样品，加入步骤(2)的内标物和甲酸，混匀，加入乙酸乙酯提取，离心，取上清液在离心浓缩仪上挥干，残渣用甲醇复溶，离心，取上清液注入液相色谱串联质谱法中进行分析；以待测物与内标的峰面积之比值(Y)为纵坐标，以待测物浓度(X)为横坐标，采用加权最小二乘法进行回归计算，得各标准曲线，计算权重为1/X2；
(4)血浆样品处理：
取灌胃双参平肺颗粒的大鼠待测血浆样品，加入步骤(2)的内标物和甲酸，混匀，加入乙酸乙酯提取，离心，取上清液在离心浓缩仪上挥干，残渣用甲醇复溶，离心，取上清液作为血浆测试样品；
(5)取步骤(4)得到的血浆测试样品进样，采用液相色谱串联质谱法进行分析，记录各待测成分和内标的峰面积，代入步骤(3)制得的回归方程中，检测血浆中芒果苷、丹参酮IIA、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、柚皮苷、甘草苷、隐丹参酮、知母皂苷BII和甘草酸的含量。
作为优选方案，以上所述的同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，步骤(2)的液相条件为：ACQUITYTM UPLC超高效液相色谱系统，ACQUITYTM UPLC BEH C18色谱柱，规格：2.1mm×100mm,填料直径：1.7μm，柱温：35℃；流动相：0.1％甲酸水溶液为A相，乙腈为B相，梯度洗脱：0-1min，10％-30％B；2-7min，30％B-95％B；7-8.2min,95％-10％B，流速为0.4mL/min，进样体积为5μL，检测时间为8min；
质谱条件为：XevoTM TQ质谱系统，离子源ESI源，扫描方式为多反应监测MRM方式，毛细管电压3kV，离子源温度150℃，去溶剂气温度550℃。
作为优选方案，以上所述的同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，所述的步骤(1)中：内标物为多潘立酮；所述待测血浆样品与甲酸的体积比为10:1；待测血浆样品与乙酸乙酯的体积比为1:5；加入乙酸乙酯提取及残渣复溶方法均为超声法；混匀方式为涡旋，涡旋时间均为30s-2min；离心条件均为转速10000-13000rpm，离心时间10-15min。
内标溶液的配制方法为：精密称取多潘立酮1mg于10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并定容配成0.1mg/mL储备液；精密移取内标储备液适量，用甲醇稀释，配成浓度为0.1μg/mL的内标溶液。
作为优选方案，以上所述的同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，所述的步骤(2)中质谱检测为多反应监测MRM方式，MRM监测扫描方式为：
芒果苷：离子化方式：ESI+，定量离子对423.22→273.10，锥孔电压：30V，碰撞能量：28eV，保留时间(tR)：2.16min；
丹参酮IIA：离子化方式：ESI+，定量离子对295.22→277.22，锥孔电压：28V，碰撞能量：20eV，保留时间(tR)：5.82min；
人参皂苷Rg1：离子化方式：ESI-，定量离子对845.53→799.49，锥孔电压：80V，碰撞能量：35eV，保留时间(tR)：2.91min；
丹酚酸B：离子化方式：ESI-，定量离子对717.28→519.16，锥孔电压：26V，碰撞能量：18eV，保留时间(tR)：3.08min；
柚皮苷：离子化方式：ESI-，定量离子对579.29→271.12，锥孔电压：40V，碰撞能量：28eV，保留时间(tR)：2.89min；
甘草苷：离子化方式：ESI+，定量离子对419.16→136.94，锥孔电压：28V，碰撞能量：20eV，保留时间(tR)：2.64min；
隐丹参酮：离子化方式：ESI+，定量离子对297.16→251.11，锥孔电压：30V，碰撞能量：26eV，保留时间(tR)：5.54min；
知母皂苷BII：离子化方式：ESI-，定量离子对919.58→757.51，锥孔电压：85V，碰撞能量：40eV，保留时间(tR)：2.90min；
甘草酸：离子化方式：ESI+，定量离子对823.35→453.35，锥孔电压：18V，碰撞能量：30eV，保留时间(tR)：3.91min；
内标物为多潘立酮：离子化方式：ESI+，定量离子对426.16→175.09，锥孔电压：75V，碰撞能量：35eV，保留时间(tR)：3.18min。
作为优选方案，以上所述的同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，其特征在于，人参皂苷Rg1、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮IIA、芒果苷、知母皂苷BII、柚皮苷、甘草苷、甘草酸各化合物的标准曲线为：
Figure BDA0002139712310000031
Figure BDA0002139712310000041
方法学验证：本发明考察了提取回收率、基质效应、精密度、准确度和稳定性。结果表明，所建立的方法专属性强、灵敏度高、稳定性好，符合体内生物样品测定要求，可用于双参平肺颗粒主要成分(芒果苷、丹参酮IIA、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、柚皮苷、甘草苷、隐丹参酮、知母皂苷BII、甘草酸)的药代动力学研究。
检测条件的优化
1、内标物的选择
采用内标法进行含量测定一方面可以消除基质带来的干扰，另一方面可以消除系统误差。本发明通过大量实验筛选内标物，分别考察了多潘立酮、氯霉素及双氯酚酸钠作为内标，以其色谱行为、质谱响应及回收率为指标综合考察，最终选择多潘立酮作为内标物。
2、UPLC-MS/MS条件优化
(1)MS/MS条件优化
预实验中采用正负两种电离方式，在不同电离电压和离子源温度条件下分别比较目标待测物的响应值。结果表明，在正离子模式下芒果苷、丹参酮IIA、隐丹参酮、甘草苷、甘草酸、多潘立酮灵敏度较高，人参皂苷Rg1、丹酚酸B、柚皮苷、知母皂苷BII在负离子模式下灵敏度更高。再对定量碎片离子进行了选择和优化，结果表明，芒果苷生成的碎片离子273.10、丹参酮IIA生成的277.22、人参皂苷Rg1生成的799.49、丹酚酸B生成的519.16、柚皮苷生成的271.12、甘草苷生成的136.94、隐丹参酮生成的251.11、知母皂苷BII生成的757.51、甘草酸生成的453.35、多潘立酮生成的175.09响应值较高且稳定。因此，最终选择423.22→273.10(芒果苷)、295.22→277.22(丹参酮IIA)、845.53→799.49(人参皂苷Rg1)、717.28→519.16(丹酚酸B)、579.29→271.12(柚皮苷)、419.16→136.94(甘草苷)、297.16→251.11(隐丹参酮)、919.58→757.51(知母皂苷BII)、823.35→453.35(甘草酸)、426.16→175.09(多潘立酮)作为定量分析的离子对。
(2)UPLC条件优化
由于9种目标待测物的极性、色谱行为等有较大的差异，流动相的pH显著影响到峰形及响应。故预实验中，本发明采用了不同型号和长度的色谱柱，并对流动相体系及流动相pH调节剂进行了优化，以峰形、保留时间、响应度为评价指标，最终以0.1％甲酸水溶液A相-乙腈B相为流动相，使用Waters公司的ACQUITYTM UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)分析时间较短(6min)、响应较高、峰形对称。
3、提取条件的选择
生物样品前处理方法的优劣是定量分析方法可行的关键。预实验，分别考察了液-液萃取和蛋白沉淀两种前处理方法，蛋白沉淀法虽简单但也稀释了目标待测物，导致低于定量下限检测不到目标待测物，尤其对丹酚酸B影响大，故选择液-液萃取法进行样品前处理。分别考察了不同提取溶剂，结果发现丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯-二氯甲烷的提取率均低于乙酸乙酯；同时考察了酸化试剂种类、浓度及体积对目标待测物提取率的影响，结果显示，10％盐酸、5％盐酸、0.1％甲酸对目标待测物的提取率均小于甲酸；同时也考察了血浆样品与乙酸乙酯的体积比，结果发现当体积比为1:5提取效率最高。最终，本发明在血浆样品前处理时，先用20μL甲酸酸化200μL血浆样品，再用1mL乙酸乙酯萃取，各目标待测物的提取率大于75％。
本发明所述的双参平肺颗粒由人参6重量份、丹参10重量份、桑白皮10重量份、地骨皮10重量份、橘红10重量份、知母10重量份、天冬10重量份、甘草5重量份组成，按下述工艺制备成的颗粒剂：
取知母饮片，加水提取二次，第一次加水12倍，第二次加水10倍，每次1.5小时，滤过，滤液合并，减压浓缩得浸膏一，备用；
取人参、丹参二味饮片，加体积浓度70％乙醇提取二次，第一次为6倍量，第二次为5倍量，每次1.5小时，滤过，滤液合并，减压浓缩得浸膏二，备用；
取药渣与桑白皮、地骨皮、橘红、天冬和甘草合并，加水提取二次，第一次加水12倍，第二次加水10倍，每次1.5小时，滤过，滤液合并，减压浓缩得浸膏三；
将上述浸膏一、浸膏二和浸膏三合并，混匀，减压浓缩至50℃相对密度1.16-1.28的稠膏，加入糊精及阿斯巴甜，混匀，制成颗粒，干燥，整粒，分装，即得。
以上各步骤的提取方法为煎煮或回流提取法。
本发明优点在于：
1、由于芒果苷、丹参酮IIA、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、柚皮苷、甘草苷、隐丹参酮、知母皂苷BII、甘草酸的极性等差异，给血浆前处理方法带来了难度，本发明优选了乙酸乙酯一步萃取法进行血浆前处理，选用多潘立酮单一内标，运用UPLC-MS/MS正负离子快速切换分析模式快速同时完成血浆中双参平肺颗粒主要活性成分的检测。本发明绘制了芒果苷、丹参酮IIA、丹酚酸B、柚皮苷、知母皂苷BII、甘草酸的血药浓度-时间曲线，确定各个成分的药代动力学参数，为双参平肺颗粒体内药动学过程研究提供了依据；
2、本发明考察了口服双参平肺颗粒后大鼠血浆中主要成分同时测定的专属性、最低定量限、精密度、准确度、提取回收率、基质效应及稳定性验证，方法学结果表明，建立的分析方法有较好的灵敏度、准确度和精密度，均符合生物样品测定要求。测定结果准确可靠，可有效评价双参平肺颗粒中主要功效成分在生物体内的药动学过程。
附图说明
图1是测定血浆中各成分的MRM色谱图。(A)为空白血浆色谱图；(B)为空白血浆加入混合对照品及内标的色谱图；(C)为大鼠口服双参平肺颗粒后30min的血浆色谱图。
图2是大鼠血浆中芒果苷的血药浓度-时间曲线。
图3是大鼠血浆中丹酚酸B的血药浓度-时间曲线。
图4是大鼠血浆中丹参酮IIA的血药浓度-时间曲线。
图5是大鼠血浆中柚皮苷的血药浓度-时间曲线。
图6是大鼠血浆中甘草酸的血药浓度-时间曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作详细说明，但本发明并不局限于此。
下述实施1和2中所用的双参平肺颗粒双参平肺颗粒由人参6重量份、丹参10重量份、桑白皮10重量份、地骨皮10重量份、橘红10重量份、知母10重量份、天冬10重量份、甘草5重量份组成，按下述工艺制备成的颗粒剂：
取知母饮片，加水煎煮提取二次，第一次加水12倍，第二次加水10倍，每次1.5小时，滤过，滤液合并，减压浓缩得浸膏一，备用；
取人参、丹参二味饮片，加体积浓度70％乙醇回流提取二次，第一次为6倍量，第二次为5倍量，每次1.5小时，滤过，滤液合并，减压浓缩得浸膏二，备用；
取药渣与桑白皮、地骨皮、橘红、天冬和甘草合并，加水煎煮提取二次，第一次加水12倍，第二次加水10倍，每次1.5小时，滤过，滤液合并，减压浓缩得浸膏三；
将上述浸膏一、浸膏二和浸膏三合并，混匀，减压浓缩至50℃相对密度1.16-1.28的稠膏，加入糊精及阿斯巴甜，混匀，制成颗粒，干燥，整粒，分装，即得。
实施例中采用的仪器：
ACQUITYTM UPLC超高效液相色谱系统(美国Waters公司)；ACQUITYTM UPLC BEHC18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，XevoTM TQ质谱系统和Masslynx4.1质谱工作站软件；LABCONCO Centri Vap离心浓缩仪(美国LABCONCO公司)；ML204，MS105分析天平(梅特勒-托尼多仪器有限公司)；EPED超纯水机(南京易普易达科技发展有限公司)；WH-1微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂)。
实施例中所用的试剂：
乙腈(德国，Merck)、乙酸乙酯(德国，Merck)、甲酸(美国，Tedia)，均为色谱纯，水由Milli-Q超纯水系统制得。
下述实施例中所用的9种待测物标准品：
柚皮苷(批号：110722-201312)、隐丹参酮(批号：110852-200806)、甘草苷(批号：111610-201106)、知母皂苷BII(批号：111839-201706)、丹酚酸B(批号：111562-201716)均购于中国食品药品检定研究院；芒果苷(批号：16071102)、甘草酸(批号16082502)、人参皂苷Rg1(批号：16061907)、丹参酮IIA(批号：16072805)均购于四川维克奇生物科技有限公司，以上对照品纯度均大于98％。
内标：多潘立酮(批号：100304-201103，中国药品生物制品检定所，纯度＞98％)。
下述实施例中所用的试验动物：
健康雄性SD大鼠，SPF级别，体重220-250g，购自上海杰思捷实验动物有限公司。
实施例1：口服双参平肺颗粒后大鼠血浆中主要成分含量测定方法的建立
包括以下步骤：
给药与血浆样品的采集
大鼠适应性喂养一周，实验前给药前禁食12h，自由饮水，给药8h后统一进食。第二天将实验动物随机分为2组，每组10只，分别按5g/kg和15g/kg剂量灌胃给药双参平肺颗粒，分别在给药后5、15、30min和1、1.5、2、4、8、12、24h眼后静脉丛取血0.3mL。采集的血样分别收集在装有肝素钠的EP管中，37℃水浴中保温30min后，5000rmp离心10min，分离其血浆，置于-80℃冰箱中保存待测。
1.1 UPLC-MS/MS条件：
色谱柱为ACQUITYTM UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0-1min：10％-30％B，2-7min：30％B-95％B，7-8.2min：95％-10％B；流速为0.4mL/min；柱温：35℃；进样体积为5μL；检测时间为8min；
质谱条件：XevoTM TQ质谱系统，离子源ESI源，扫描方式为多反应监测(MRM)方式，毛细管电压3kV，离子源温度150℃，去溶剂气温度550℃。所述MRM方法参数见表1。
表1化合物质谱参数
Figure BDA0002139712310000071
1.2溶液的制备
1.2.1标准品储备液的配制
分别精密称取人参皂苷Rg1、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮IIA、芒果苷、知母皂苷BII、柚皮苷、甘草苷、甘草酸各10mg，分别置于10ml容量瓶中，加适量甲醇超声溶解，并定容至刻度线，分别制得1.00mg/ml标准品储备液；
1.2.2内标工作液的配制
精密称取多潘立酮1mg于10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并定容配成0.1mg/mL储备液；精密移取内标储备液适量，用甲醇稀释，配成浓度为0.1μg/mL的内标溶液。
1.2.3血浆系列标准曲线和质控工作液的配制
用大鼠空白血浆配制7个终浓度的系列血浆标准曲线样品：人参皂苷Rg11.3-650ng/mL；丹酚酸B 5.0-2495ng/mL；隐丹参酮4.5-2250ng/mL；丹参酮IIA 2.0-1000ng/mL；芒果苷4.5-2250ng/mL；知母皂苷BII5.0-2250ng/mL；柚皮苷5.0-2497.5ng/mL；甘草苷2.5-1252.5ng/mL；甘草酸1.5-751.2ng/mL；
同法配制低、中、高3个不同浓度的QC样本：其中含人参皂苷Rg16.5ng/m，65ng/m，650ng/mL；丹酚酸B 24.95ng/m，249.5ng/m，2495ng/mL；隐丹参酮22.5ng/m，225ng/m，2250ng/mL；丹参酮IIA10ng/m，100ng/m，1000ng/mL；芒果苷22.5ng/m，225ng/m，2250ng/mL；知母皂苷BII 22.5ng/mL，225ng/mL，2250ng/mL；柚皮苷24.97ng/mL,249.75ng/mL,2497.5ng/mL；甘草苷12.52ng/mL,125.25ng/mL,1252.5ng/mL；甘草酸7.51ng/mL,75.12ng/mL，751.2ng/mL。
1.3血浆样品预处理
取口服双参平肺颗粒后的大鼠血浆样品200μL，精密加入多潘立酮内标溶液(0.1μg/mL)10μL，甲酸20μL，涡旋混匀1min，再加入乙酸乙酯1mL超声提取5min，13000rpm离心10min，取上清液在离心浓缩仪上挥干，残渣用100μL70％甲醇复溶，超声2min，13000rpm离心10min，取上清液5μL进样分析。
1.4分析方法的验证
按照美国FDA生物样品分析方法的指导原则进行分析方法学考察。
1.4.1专属性
分别制备大鼠空白血浆、加混合对照品及内标的加药血浆、灌胃双参平肺颗粒后30min大鼠血浆各200μL，按1.3项下方法处理，进样，记录色谱图。结果显示9种目标待测物与内标成分的分离度高，峰形良好，血浆中内源性物质不干扰目标待测物与内标的测定。结果如图1所示。
1.4.2标准曲线线性
分别取“1.2.3”项下的血浆系列标准曲线样品，按“1.3”项下处理方法，按照“1.1”项下的分析方法，进行测定；以待测物与内标的峰面积之比值(Y)为纵坐标，以待测物浓度(X)为横坐标，采用加权最小二乘法进行回归计算，计算权重为1/X2。结果如表2所示。
表2回归方程、线性范围及最小检测限(n＝3)
Figure BDA0002139712310000092
由表2可知，R2均大于0.9929，大鼠血浆中9种目标待测物浓度与峰面积的比值呈良好线性关系，最低定量限范围为0.7-2.5ng/mL。结果表明所建立的分析方法具有较高灵敏度，可用于血浆中低浓度药物的检测。
1.4.3精密度与准确度
根据指导原则，选择3个浓度的QC样品考察精密度和准确度。取“1.2.3”项下低、中、高3种浓度的QC样品，每个浓度6个样本，按“1.3”项下的处理方法，依“1.1”项下的分析方法进行测定，连续3天内平行处理、测定3批血浆样品，分别计算日内、日间的精密度和准确度，结果如表3所示。
表3日内精密度与日间精密度
Figure BDA0002139712310000091
Figure BDA0002139712310000101
由表3可知，9种目标待测物的日内精密度2.28％～12.06％,日间精密度1.72％～14.24％,准确度87.741％～114.11％,均符合生物样品测定精密度和准确度的要求。
1.4.4提取回收率与基质效应
取“1.2.3”项下低、中、高3种浓度的QC样品，每浓度6样本，按“1.3”项下的处理方法制备低、中、高3种浓度的测定液，依“1.1”项下的分析方法进行测定，记录峰面积；另取大鼠空白血浆200μL，按“1.3”项下的处理方法去除蛋白后，加入与QC样品相同质量浓度的混合标准品溶液，离心浓缩仪上挥干，用100μL70％甲醇溶液复溶，进样5μL测定，记录峰面积；以前后两次的峰面积百分比计算回收率，结果见表4，三个浓度提取回收率平均值符合生物样品对于提取回收率的要求。
取大鼠空白血浆200μL，按“1.3”项下的处理方法去除蛋白后，加入与QC样品相同质量浓度的混合标准品溶液，离心浓缩仪上挥干，用100μL70％甲醇溶液复溶，进样5μL测定，记录峰面积；同时用甲醇配制低、中、高三个水平混合标准品溶液，进样5μL测定，记录峰面积；以前后两次测定的峰面积之比计算基质效应。结果如表4所示。
表4提取回收率与基质效应(n＝6)
Figure BDA0002139712310000111
由表4可知：目标待测物的回收率均大于77％，符合分析要求；目标待测物的基质效应均在73％-109％之间，表明所测化合物的含量测定基本不受内源性物质的干扰。
1.4.5稳定性考察
本发明分别考察了“1.2.3”项下低、中、高3个浓度的QC样品在短期放置稳定性(4℃放置24h)、长期冻存放置稳定性(-80℃冷冻15d)、反复冻融稳定性(-80℃冰冻至室温25℃溶解，反复3次)。每个样品平行6个样本，按“1.3”项下的处理方法，依“1.1”项下的分析方法进行测定，计算样品中目标待测物的浓度，结果见表5。
表5稳定性考察结果(n＝6，平均值±SD)
Figure BDA0002139712310000121
从表5可知，9个目标待测物测定结果RSD值均符合要求，说明在上述条件下样品的储存、处理相对稳定，对分析无显著性影响。
实施例2口服双参平肺颗粒后大鼠血浆中主要成分的药代动力学
1、给药与血浆样品的采集
大鼠适应性喂养一周，实验前给药前禁食12h，自由饮水，给药8h后统一进食。第二天将实验动物随机分为2组，每组10只，分别按5g/kg和15g/kg剂量灌胃给药上述双参平肺颗粒，分别在给药后5、15、30min和1、1.5、2、4、8、12、24h眼后静脉丛取血0.3mL。采集的血样分别收集在装有肝素钠的EP管中，37℃水浴中保温30min后，5000rmp离心10min，分离其血浆，置于-80℃冰箱中保存待测。
3.2血浆样品预处理
取血浆样品200μL，精密加入多潘立酮内标溶液(0.1μg/mL)10μL，甲酸20μL，涡旋混匀1min，再加入乙酸乙酯1mL超声提取5min，13000rpm离心10min，取上清液在离心浓缩仪上挥干，残渣用100μL70％甲醇复溶，超声2min，13000rpm离心10min，取上清液5μL进样分析。
3.3药代动力学研究
按“3.2”项下的血浆样品预处理方法，采用实施例1中的“1.1”项下建立的UPLC-MS/MS条件进行检测，每个分析批样品测定时建立随行标准曲线，并随行测定高、中、低三个浓度的QC样品。记录各待测成分和内标的峰面积，代入实施1表2中的回归方程，计算大鼠给药后不同时间点各成分的血药浓度，采用DAS2.0软件对获得的各时间点的血药浓度进行非房室模型拟合,采用统计矩法计算药代动力学参数。
共检测到5种目标待测物：芒果苷、丹酚酸B、丹参酮IIA、柚皮苷、甘草酸，其平均血药浓度-时间曲线见图2-图6，依次为芒果苷(图2)、丹酚酸B(图3)、丹参酮IIA(图4)、柚皮苷(图5)及甘草酸(图6)，主要药动学参数见表6。
从图2-图6可知，灌胃双参平肺颗粒15min后，大鼠血浆中均能测到芒果苷、丹酚酸B、丹参酮IIA、柚皮苷、甘草酸，说明这5种成分均能够快速吸收入血并实现快速消除；同时随着给药剂量的增加，5种成分的AUC值增大，表明其吸收增加。从表6可知，15g/kg与5g/kg给药剂量下，5种成分的T1/2没有显著差异，说明这5种成分的消除不受剂量限制；Cmax值显示除芒果苷外，其余4个成分快速吸收不受剂量限制。
表6大鼠给药双参平肺颗粒后检测到的5种成分的药代动力学参数
Figure BDA0002139712310000141
本发明建立了大鼠血浆中人参皂苷Rg1、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮IIA、芒果苷、知母皂苷BII、柚皮苷、甘草苷、甘草酸的UPLC-MS/MS含量测定方法，本发明的灵敏度高、特异性强、重现性好、操作简单快速，符合体内生物样品测定要求，并能应用于双参平肺颗粒口服给药后的药代动力学研究。

Claims (3)

1.一种同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）标准品储备液的配制
分别精密称取人参皂苷Rg1、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮IIA、芒果苷、知母皂苷BII、柚皮苷、甘草苷、甘草酸各10mg，分别置于10ml容量瓶中，加适量甲醇超声溶解，并定容至刻度线，分别制得1.00mg/ml标准品储备液；
（2）内标工作液的配制
精密称取多潘立酮1mg于10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并定容配成0.1mg/mL储备液；精密移取内标储备液适量，用甲醇稀释，配成浓度为0.1μg/mL的内标溶液；
（3）标准曲线的制备
用大鼠空白血浆，将步骤（1）的各标准品储备液配制成7个终浓度的系列血浆标准曲线样品：人参皂苷Rg1 1.3-650ng/mL；丹酚酸B 5.0-2495ng/mL；隐丹参酮4.5-2250ng/mL；丹参酮IIA 2.0-1000ng/mL；芒果苷4.5-2250ng/mL；知母皂苷BII 5.0-2250ng/mL；柚皮苷5.0-2497.5ng/mL；甘草苷2.5-1252.5 ng/mL；甘草酸1.5-751.2ng/mL；
分别取各系列血浆标准曲线样品，加入步骤（2）的内标物，并加入甲酸，混匀，加入乙酸乙酯提取，离心，取上清液在离心浓缩仪上挥干，残渣用甲醇复溶，离心，取上清液注入液相色谱串联质谱法中进行分析；以待测物与内标的峰面积之比值Y为纵坐标，以待测物浓度X为横坐标，采用加权最小二乘法进行回归计算，得各标准曲线，计算权重为1/X2；
（4）血浆样品处理：
取灌胃双参平肺颗粒的大鼠待测血浆样品，加入步骤（2）的内标物，并加入甲酸，涡旋混匀，加入乙酸乙酯超声提取5min，13000rpm离心10min，取上清液在离心浓缩仪上挥干，残渣用70%甲醇复溶，超声2min，13000rpm离心10min，取上清液作为血浆测试样品；
（5）含量测定：
取步骤(4)得到的血浆测试样品进样，采用液相色谱串联质谱法进行分析，记录各待测成分和内标的峰面积，代入步骤（3）制得的回归方程中，检测血浆中芒果苷、丹参酮IIA、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、柚皮苷、甘草苷、隐丹参酮、知母皂苷BII和甘草酸的含量；
液相色谱条件为：ACQUITYTM UPLC超高效液相色谱系统，ACQUITYTM UPLC BEH C18色谱柱，规格：2.1mm×100mm, 填料直径：1.7μm，柱温：35℃;流动相：0.1%甲酸水溶液为A相，乙腈为B相，梯度洗脱：0-1min，10%→30%B；2-7min，30%B→95%B；7-8.2min, 95%→10%B，流速为0.4mL/min，进样体积为5μL，检测时间为8min；
质谱条件为：XevoTM TQ质谱系统，离子源ESI源，扫描方式为多反应监测MRM方式，毛细管电压3kV，离子源温度150℃，去溶剂气温度550℃；
MRM监测扫描方式为：
芒果苷：离子化方式：ESI+，定量离子对423.22→273.10，锥孔电压：30V，碰撞能量：28eV，保留时间(tR)：2.16min；
丹参酮IIA：离子化方式：ESI+，定量离子对295.22→277.22，锥孔电压：28V，碰撞能量：20eV，保留时间(tR)：5.82min；
人参皂苷Rg1：离子化方式：ESI-，定量离子对845.53→799.49，锥孔电压：80V，碰撞能量：35eV，保留时间(tR)：2.91min；
丹酚酸B：离子化方式：ESI-，定量离子对717.28→519.16，锥孔电压：26V，碰撞能量：18eV，保留时间(tR)：3.08min；
柚皮苷：离子化方式：ESI-，定量离子对579.29→271.12，锥孔电压：40V，碰撞能量：28eV，保留时间(tR)：2.89min；
甘草苷：离子化方式：ESI+，定量离子对419.16→136.94，锥孔电压：28V，碰撞能量：20eV，保留时间(tR)：2.64min；
隐丹参酮：离子化方式：ESI+，定量离子对297.16→251.11，锥孔电压：30V，碰撞能量：26eV，保留时间(tR)：5.54min；
知母皂苷BII：离子化方式：ESI-，定量离子对919.58→757.51，锥孔电压：85V，碰撞能量：40eV，保留时间(tR)：2.90min；
甘草酸：离子化方式：ESI+，定量离子对823.35→453.35，锥孔电压：18V，碰撞能量：30eV，保留时间(tR)：3.91min；
内标物为多潘立酮：离子化方式：ESI+，定量离子对426.16→175.09，锥孔电压：75V，碰撞能量：35eV，保留时间(tR)：3.18min。
2.根据权利要求1所述的同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，其特征在于，所述的步骤（4）中，待测血浆样品与甲酸的体积比为10:1；待测血浆样品与乙酸乙酯的体积比为1:5。
3.根据权利要求1或2所述的同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，其特征在于，双参平肺颗粒由人参6重量份、丹参10重量份、桑白皮10重量份、地骨皮10重量份、橘红10重量份、知母10重量份、天冬10重量份、甘草5重量份组成，按下述工艺制备成的颗粒剂：
取知母饮片，加水提取二次，第一次加水12倍，第二次加水10倍，每次1.5小时，滤过，滤液合并，减压浓缩得浸膏一，备用；
取人参、丹参二味饮片，加体积浓度70%乙醇提取二次，第一次为６倍量，第二次为５倍量，每次1.5小时，滤过，滤液合并，减压浓缩得浸膏二，备用；
取药渣与桑白皮、地骨皮、橘红、天冬和甘草合并，加水提取二次，第一次加水12倍，第二次加水10倍，每次1.5小时，滤过，滤液合并，减压浓缩得浸膏三；
将上述浸膏一、浸膏二和浸膏三合并，混匀，减压浓缩至50℃相对密度1.16-1.28的稠膏，加入糊精及阿斯巴甜，混匀，制成颗粒，干燥，整粒，分装，即得。
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