CN112730682B - 一种抗病毒药物临床研究血浆样本中奥司他韦及代谢物奥司他韦酸浓度的生物分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗病毒药物临床研究血浆样本中奥司他韦及代谢物奥司他韦酸浓度的生物分析方法，通过LC‑MS/MS对血浆中奥司他韦及代谢物奥司他韦酸进行分析。本发明方法优选采用蛋白沉淀预处理方法，以奥司他韦‑d5和奥司他韦酸‑d3为内标，采用Luna PFP色谱柱，梯度洗脱，电喷雾电离源(ESI)串联质谱检测。本发明操作简便、分析速度快、灵敏度高、线性范围合适，满足临床研究大批量样品分析需求。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种抗病毒药物临床研究血浆样本中奥司他韦及代谢物奥司他韦酸浓度的生物分析方法。
背景技术
磷酸奥司他韦是一种病毒神经氨酸酶抑制剂，可以通过降低病毒对靶细胞的穿透力，并抑制病毒的释放，达到抗病毒的生物效应。磷酸奥司他韦胶囊由瑞士巴塞尔豪夫迈罗氏有限公司开盒吉利德公司联合开发，1999年经FDA批准上市，商品名为
临床用于治疗各类流行性感冒，同时该药也是世界卫生组织推荐的治疗人禽流感的药物和应对流感大流行的国家储备药物。奥司他韦在人体内大部分代谢为活性产物奥司他韦酸。仿制药临床研究及治疗性药物监测时需要测定受试者或患者血浆中奥司他韦及奥司他韦酸的浓度以研究其药动学行为。为了加速其临床应用，需要一种简便、准确、快速、灵敏度高的生物分析方法。
目前，液相色谱-串联质谱技术为分析人血浆中奥司他韦及奥司他韦酸的主要方法。李敬来等2010年开发了测定血浆奥司他韦酸的方法，该法不能测定奥司他韦的浓度。李雪宁等2002年开发液相色谱-荧光法同时测定两种物质的分析方法，但该法灵敏度较低奥司他韦及奥司他韦酸的分析灵敏度分别为5.00和50.0ng/mL，进而需要受试者提高药物的服用剂量到300mg才能获得其药动学性质，这降低了受试者的安全性。Lindegardh等2007年建立了快速测定血浆中奥司他韦及奥司他韦酸的方法，但该方法的预处理过程采用了复杂且高成本的固相萃取技术，并且分析方法的灵敏度仍然不够高，奥司他韦及奥司他韦酸的分析灵敏度分别为1.00和10.0ng/mL。Kromdijk等2012年开发的方法灵敏度较低奥司他韦及奥司他韦酸的分析灵敏度分别为3.00和30.0ng/mL，且分析时间较长为9min，不适合大批量临床研究样本分析。Zhe-Yi Hu等2012年开发了灵敏度较高的分析方法，定量下限为0.340ng/mL，但该方法采用甲醇为蛋白沉淀法提取试剂，提取后样品未经水溶液稀释，容易挥发，不利于保存，且该法分析时间较长为4.5min。另外该法的线性范围选择不合适，两个待测物均为0.340-1000ng/mL，而受试者血浆中奥司他韦酸的浓度水平约为奥司他韦的5-10倍，奥司他韦的定量上限高于其达峰浓度的约10倍，奥司他韦酸的定量下限过低，这不利于样本的准确分析。
综上所述，现有技术有以下缺点为无法兼顾、灵敏度、分析速度，且部分技术前处理操作复杂、线性范围选择不合理、提取后样本不易保存等。这些缺点不利于临床研究大批量样本的准确分析。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种抗病毒药物临床研究血浆样本中奥司他韦及代谢物奥司他韦酸浓度的生物分析方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种抗病毒药物临床研究血浆样本中奥司他韦及代谢物奥司他韦酸浓度的生物分析方法，包括以下步骤：
预处理，在96孔板中加入血浆，加入内标溶液，加入乙腈:甲醇(1:2，v/v)，涡流及离心后取上清液到另一干净96孔板中，加入超纯水，涡流混匀。
色谱，将待测样品液相色谱分离，采用Luna PFP色谱柱，梯度洗脱，流动相A为含0.3％甲酸和2mM醋酸铵的水溶液，流动相B为甲醇和乙腈的混合溶液，色谱运行时间3min；
质谱，采用电喷雾离子源，正离子检测，喷射电压5500V，气体1(Gas1)60psi，气体2(Gas2)70psi，气帘气体(Curtain Gas)40psi，离子源温度550℃，碰撞诱导解离10psi，驻留时间100ms，奥司他韦定量分析离子对m/z 313.2→208.2，碰撞能量(CE)19eV，去簇电压(DP)50V，奥司他韦酸定量分析离子对285.1→138.2，碰撞能量(CE)27eV，去簇电压(DP)40V，奥司他韦-d5定量分析离子对318.2→213.2，碰撞能量(CE)19eV，去簇电压(DP)50V，奥司他韦酸-d3定量分析离子对288.1→138.1，碰撞能量(CE)27eV，去簇电压(DP)70V。
优选地，所述的一种抗病毒药物临床研究血浆样本中奥司他韦及代谢物奥司他韦酸浓度的生物分析方法，所述预处理步骤，取50.0μL血浆样品，加入50.0μL内标溶液，加入150μL乙腈:甲醇(1:2，v/v)，涡流及离心后取50.0μL上清液到另一干净96孔板中，加入150μL超纯水，涡流混匀。
优选地，所述的一种抗病毒药物临床研究血浆样本中奥司他韦及代谢物奥司他韦酸浓度的生物分析方法，所述内标溶液为奥司他韦-d5和奥司他韦酸-d3溶液。
优选地，所述的一种抗病毒药物临床研究血浆样本中奥司他韦及代谢物奥司他韦酸浓度的生物分析方法，所述色谱步骤，色谱柱类型为Luna PFP。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
1、本发明具有预处理操作简便的特点，仅需要一步提取及一步稀释即可进行分析，提取后样本易于保存，分析速度较快，分析时间仅为3min，因此本发明适合大批量临床研究样品分析。
2、本发明灵敏度较高、奥司他韦和奥司他韦酸定量下限分别为0.400和/2.50ng/mL，检测限经计算分别为0.0400和0.500ng/mL，柱上待测物的量按照稀释倍数20以及进样量5μL计算为0.0100和0.125pg，灵敏度的提高可以降低受试者的服药量，增加临床研究的安全性，本发明线性范围选择合理，能够更准确的分析药物的浓度。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是奥司他韦产物离子扫描质谱图。
图2是奥司他韦酸产物离子扫描质谱图。
图3是奥司他韦-d5产物离子扫描质谱图。
图4是奥司他韦酸-d3产物离子扫描质谱图。
图5是空白血浆样品中奥司他韦(左)和奥司他韦-d5(右)的MRM色谱图。
图6是空白血浆样品中奥司他韦酸(左)和奥司他韦酸-d3(右)的MRM色谱图。
图7是定量下限样品中奥司他韦(左)和奥司他韦-d5(右)的MRM色谱图。
图8是定量下限样品中奥司他韦酸(左)和奥司他韦酸-d3(右)的MRM色谱图。
图9是1名健康受试者单次口服75mg磷酸奥司他韦胶囊后奥司他韦和奥司他韦酸的药物浓度-时间曲线。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
液相色谱-串联质谱检测血浆中药物浓度的方法开发通常可分为三个部分，即提取方法(即预处理方法)、液相色谱方法和质谱方法。本发明针对现有技术缺点，从以上这三个方面着手建立分析方法。
实施例
前处理
本发明中使用血浆用量仅为50.0μL适合临床研究生物分析工作，本发明中的提取方法选用蛋白沉淀法、该方法对极性较弱的奥司他韦及极性较强的奥司他韦酸均有较高的回收率，并且具有操作简单、提取时间短、无须耗时的浓缩步骤。配合96孔板使用，适合临床研究中高通量样品预处理。
如图1至图4，具体前处理方法步骤如下：
1、96孔板中加入50.0μL血浆样品，50.0μL内标溶液(OSL-d5和OSC-d3浓度分别为5.00/50.0ng/mL)，150μL乙腈:甲醇(1:2，v/v)；
2、涡流混匀，离心10min(4℃，3900rpm)；
3、取50.0μL上清液到另一干净96孔板中；
4、加入150μL超纯水，涡流混匀。
5、进样体积为5.0μL。
质谱
采用电喷雾离子源，正离子检测，喷射电压-4500V，气体1(Gas1)60psi，气体2(Gas2)70psi，气帘气体(Curtain Gas)40psi，离子源温度550℃，碰撞诱导解离10psi，驻留时间100ms，奥司他韦定量分析离子对m/z 313.2→208.2，碰撞能量(CE)19eV，去簇电压(DP)50V，奥司他韦酸定量分析离子对285.1→138.2，碰撞能量(CE)27eV，去簇电压(DP)40V，奥司他韦-d5定量分析离子对318.2→213.2，碰撞能量(CE)19eV，去簇电压(DP)50V，奥司他韦酸-d3定量分析离子对288.1→138.1，碰撞能量(CE)27eV，去簇电压(DP)70V。
色谱
色谱，将待测样品液相色谱分离，采用Luna PFP色谱柱，梯度洗脱，流动相A为含0.3％甲酸和2mM醋酸铵的水溶液，流动相B为甲醇和乙腈的混合溶液。
奥司他韦极性较弱在常规的反相色谱柱上保留显著，奥司他韦酸由于含有羧酸基团，极性较奥司他韦强，保留较弱。本发明色谱分离采用Luna PFP色谱柱，对待测物和内标均有较好的保留，且峰形尖锐。色谱采用的流动相A中加入了0.3％甲酸，可以将离子态奥司他韦酸转变为分子态，进而降低其极性增强色谱保留。由于奥司他韦和奥司他韦酸极性有一定差别，为了实现短时间内使两种待测洗脱，采用了快速梯度洗脱的模式。该模式下仪器分析通量较高，色谱运行时间仅为3.0min，检测快速，适用于临床研究大批量样品分析。
实施例一：
缩写说明
1材料
1.1仪器
色谱仪：LC-30AD快速液相色谱系统，日本岛津公司。
质谱仪：6500型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾电离源(Turbo Ion Spray)加拿大Sciex公司。
数据处理采用软件：Analyst(version 1.6.3)，加拿大Sciex公司。
离心机：HerμLe Z2326K型台式离心机，德国贺默公司。
分析天平：CD225D型分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司。
1.2对照品和试剂
奥司他韦(含量98.18％)和奥司他韦酸(纯度98.09％)购自MCE公司。奥司他韦-d5和奥司他韦酸-d3购自TRC公司。甲醇(HPLC级)、乙腈(HPLC级)购自美国Sigma公司。甲酸(HPLC级)购自TCI公司。醋酸铵(HPLC级)购自ROE公司。去离子水(18.2mΩ,TOC≤50ppb)由Milli-Q超纯水系统制备。
2方法
2.1溶液及样品的配制
标准系列样品：精密称取各对照品适量，以甲醇分别溶解并定容，配制成奥司他韦和奥司他韦酸浓度均约为1.00mg/mL的贮备液。精密吸取各自贮备液适量，以人空白血浆逐级稀释得到混合标准系列样品，奥司他韦和奥司他韦酸浓度范围分别为0.400-160ng/mL和2.50-500ng/mL。
质控样品：采用与标准系列样品相似方法配制奥司他韦和奥司他韦酸3个浓度水平混合质控样品。定量下限浓度为0.400/2.50ng/mL，低质控(low quality control，LQC)浓度为1.20/7.50，中质控(medium quality control，MQC)浓度为12.0/75.0ng/mL，高质控(high quality control，HQC)浓度为120/375ng/mL。
内标溶液：精密称取奥司他韦-d5和奥司他韦酸-d3对照品，以甲醇溶解并定容，配制成浓度约为1.00mg/mL的内标贮备液。精密吸取上述各内标贮备液适量，加甲醇：水(50:50，v/v)稀释，获得奥司他韦-d5和奥司他韦酸-d3浓度分别为5.00和50.0ng/mL的内标溶液。
2.2血浆样品处理
2.3色谱及质谱条件
色谱条件
质谱条件
2.4方法学验证
按照中国药典9012指导原则对本方法进行了方法学验证，内容包括稳定性、选择性、线性、准确度、精密度、回收率基质效应等。
选择性
取六个来源不同的空白血浆及各自配制的定量下限样品处理后进样分析。色谱共流出干扰物的峰面积须小于定量下限待测物峰面积的20％，小于内标峰面积的5％。
标准曲线
以待测物理论浓度为横坐标(x)，待测物与内标物的峰面积比为纵坐标(y)，进行回归分析计算的直线回归方程(权重因子W＝1/x2)。方法验证每一分析批对标准曲线样品双样本分析。
精密度和准确度
方法验证每一分析批测定五个浓度质控样本各六样本。定量下限批内、批间精密度以相对标准差(RSD)计算小于20％方可接受，准确度以相对偏差计算(RE)在-20％～20％之间方可接受。其余各浓度水平的QC样品各成分批内、批间精密度需小于15％方可接受，准确度在-15％～15％之间方可接受。
稳定性
考察各待测物在血浆样品中的稳定性时，将LQC和HQC置于不同温度及环境中，放置结束后进行三样本分析。共考察四种放置条件，分别为：冰水浴放置24h，提取后进样器内放置98h，经历5次冷冻-解冻循环(从-75±10℃到冰水浴)，-75±5℃放置73天。
回收率
取空白血浆50.0μL，提取后(不加内标溶液)加入待测物溶液和内标溶液，使最终浓度与LQC、MQC和HQC相同，进样测定。另提取LQC、MQC和HQC各6份，进样测定。以2种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。
基质效应
取6个不同来源空白血浆，提取后(不加内标溶液)，加入和LQC和HQC相同浓度的待测物溶液和内标溶液，涡流混合后测定。另取去离子水代替血浆，按上述方法处理。以两种方法获得的峰面积比值计算基质因子，通过内标归一化的基质因子的RSD评估基质效应，小于15％方可接受。
2.5临床研究
应用建立的方法分析临床研究血浆样本中奥司他韦及奥司他韦酸的浓度，用于奥司他韦人体药动学研究。临床研究经过医院伦理委员会批准，受试者在试验前均被告知试验风险，自愿签署知情同意书。40名健康受试者给予75mg磷酸奥司他韦胶囊。于给药前(0h)、给药后36h内不同时间点，采集静脉血取血各4mL，置肝素抗凝离心管中，离心(3000rpm，4℃)10min后分离血浆，-75±10℃保存。
3结果与讨论
3.1方法学验证
方法的选择性
如图5至图8所示，奥司他韦、奥司他韦酸、奥司他韦-d5和奥司他韦酸-d3保留时间分别约为2.3、1.5、2.3和1.5min，保留时间处无共流出干扰峰。
标准曲线
测定奥司他韦临床研究血浆样本中奥司他韦和奥司他韦酸的线性范围分别为0.400-160ng/mL和2.50-500ng/mL。待测物标准曲线典型直线回归方程分别为：
奥司他韦:y＝0.107x+0.00575；
奥司他韦酸:y＝0.016x+0.00256；
检测限
定量下限样品中奥司他韦和奥司他韦酸浓度分别为0.400和2.50ng/mL，信噪比分别为30和15。按照信噪比为3计算检测限分别为0.0400和0.500ng/mL。柱上待测物的量按照稀释倍数20以及进样量5μL计算为0.0100和0.125pg。
方法的精密度与准确度
精密度准确度结果均符合接受标准，结果见表1。
表1是测定人血浆中奥司他韦和奥司他韦酸精密度和准确度
表1
处理回收率
LQC、MQC和HQC浓度水平：奥司他韦的提取回收率分别为97.9％、100.9％和100.7％；奥司他韦酸的提取回收率分别为85.3％、89.0％和90.8％；；奥司他韦-d5和奥司他韦酸-d3的回收率分别为104.8％和91.8％。
基质效应
LQC、HQC浓度水平下奥司他韦的内标归一化的基质因子分别为103.6％和102.1％，RSD分别为2.2％和1.5％；奥司他韦酸基内标归一化的质因子分别为95.2％和98.1％，RSD分别为0.9％和0.4％。以上结果表明，基质效应不干扰待测物分析的准确性。
血浆稳定性考察
血浆稳定性试验结果见表2，结果表明在考察条件下奥司他韦和奥司他韦酸均稳定。
其中表2是奥司他韦和奥司他韦酸在人血浆中的稳定性(n＝6)
表2
4人体药动学研究
将验证后的方法用于同时分析血浆中奥司他韦和奥司他韦酸，以评价奥司他韦药动学特征。1名健康受试者单次口服75mg奥司他韦胶囊，血浆药物浓度-时间曲线见图9，检测方法灵敏度可完整描绘奥司他韦及其代谢产物奥司他韦酸的药动学特性，并且线性范围的选择与实际样本的浓度水平接近，测定准确性高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种抗病毒药物临床研究血浆样本中奥司他韦及代谢物奥司他韦酸浓度的生物分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
预处理，在96孔板中加入血浆，加入内标溶液，加入乙腈:甲醇的体积比1:2，v/v，涡流及离心后取上清液到另一干净96孔板中，加入超纯水，涡流混匀，进样5.00μL；
色谱，将待测样品液相色谱分离，采用Luna PFP色谱柱，梯度洗脱，流动相A为含0.3％甲酸和2mM醋酸铵的水溶液，流动相B为甲醇和乙腈的混合溶液，色谱运行时间3min；
梯度洗脱条件：
0.50min：流速：0.5000mL/min；流动相B：20％；
1.20min：流速：0.5000mL/min；流动相B：40％；
1.50min：流速：0.5000mL/min；流动相B：40％；
1.80min：流速：0.5000mL/min；流动相B：80％；
2.30min：流速：0.5000mL/min；流动相B：80％；
2.31min：流速：0.5000mL/min；流动相B：20％；
3.00min：停止；
其中，进样量5.00μL；自动进样器温度：4℃；柱温：40℃；
质谱，采用电喷雾离子源，正离子检测，喷射电压5500V，气体1(Gas1)60psi，气体2(Gas2)70psi，气帘气体(Curtain Gas)40psi，离子源温度550℃，碰撞诱导解离10psi，驻留时间100ms，奥司他韦定量分析离子对m/z 313.2→208.2，碰撞能量(CE)19eV，去簇电压(DP)50V，奥司他韦酸定量分析离子对285.1→138.2，碰撞能量(CE)27eV，去簇电压(DP)40V，奥司他韦-d5定量分析离子对318.2→213.2，碰撞能量(CE)19eV，去簇电压(DP)50V，奥司他韦酸-d3定量分析离子对288.1→138.1，碰撞能量(CE)27eV，去簇电压(DP)70V。
2.根据权利要求1所述的一种抗病毒药物临床研究血浆样本中奥司他韦及代谢物奥司他韦酸浓度的生物分析方法，其特征在于：所述预处理，取50.0μL血浆样品，加入50.0μL内标溶液，加入150μL乙腈:甲醇的体积比1:2，v/v，涡流及离心后取50.0μL上清液到另一干净96孔板中，加入150μL超纯水，涡流混匀。
3.根据权利要求1或2所述的一种抗病毒药物临床研究血浆样本中奥司他韦及代谢物奥司他韦酸浓度的生物分析方法，其特征在于：所述内标溶液为奥司他韦-d5和奥司他韦酸-d3溶液。
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