CN115840011A - 一种利用液相色谱-串联质谱分析血浆样本中替米沙坦浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用液相色谱‑串联质谱分析血浆样本中替米沙坦浓度的方法。其包括：向血浆样本中加入内标溶液和乙腈进行涡流，离心后收集上清液，得到预处理后的待测样品；采用液相色谱‑串联质谱检测，将待测样品进行液相色谱分离，然后进行质谱检测，基于检测峰面积比绘制标准曲线获得回归方程，最终计算获得待测样品中的替米沙坦浓度。本发明具有预处理操作简便的特点，提取后样本易于保存，分析速度较快，适合大批量临床研究样品分析；此外灵敏度较高、替米沙坦定量下限为1.00ng/mL。

Description

一种利用液相色谱-串联质谱分析血浆样本中替米沙坦浓度 的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种利用液相色谱-串联质谱分析血浆样本中替米沙坦浓度的方法，所述替米沙坦用于治疗轻、中度高血压。

背景技术

替米沙坦(Telmisartan)是一种新的高选择性、特异性AT1受体阻断剂，由德国勃林格殷格翰公司开发，商品名为美卡素(Micardis)，于1998年11月10日获FDA批准，2001年9月6日获中国批准。替米沙坦的药效为同类药物中最长；临床研究显示，替米沙坦能够全日24小时降压，包括清晨时分心血管病最高危的时候。替米沙坦降压疗效可靠，耐受性好，能有效治疗轻、中度高血压病。仿制药临床研究及治疗性药物监测时需要测定受试者或患者血浆中替米沙坦的浓度以研究其药动学行为。为了加速其临床应用，需要一种简便、准确、快速、灵敏度高的生物分析方法。

目前，液相色谱-串联质谱技术为分析人血浆中替米沙坦的主要方法。金晓玲等2008年开发了测定血浆替米沙坦的方法，该法血浆用量大，预处理血浆使用量200ul，替米沙坦的分析灵敏度仅为2.50ng/mL，且该法使用非同位素内标地西泮。段晓涛等2003年建立了测定血浆中替米沙坦的方法，该方法的预处理过程采用了相对较为繁琐的二氯甲烷-乙醚液液萃取法，操作繁琐，不利于短时间内处理大量的血浆样品。李新春等2006年开发了高效液相色谱-荧光法测定人血浆替米沙坦浓度，该法预处理血浆用量500ul，采用二氯甲烷作为提取溶媒降低分析成本，但该法分析时间长达10min一针，不利于大批量血浆样品分析。樊志军2007年开发了HPLC-MS法测定人血浆中替米沙坦，该法取0.3mL血浆加入乙腈蛋白沉淀后取上清直接进样，操作简单，但该法血浆用量过大，增加了临床样本的采血量，不利于临床生物样品的检测。

综上所述，现有技术中针对血浆样本中替米沙坦的浓度检测方法无法兼顾灵敏度、分析速度，且部分技术前处理操作复杂等。这些缺点不利于临床检测大批量血浆样本中替米沙坦的浓度的准确分析。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一种利用液相色谱-串联质谱分析血浆样本中替米沙坦浓度的方法。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一方面，本发明提供一种利用液相色谱-串联质谱分析血浆样本中替米沙坦浓度的方法，其包括如下步骤：

向血浆样本中加入内标溶液和乙腈进行涡流，离心后收集上清液，得到预处理后的待测样品；

采用液相色谱-串联质谱检测，首先将待测样品进行液相色谱分离，然后进行质谱检测，基于检测峰面积比绘制标准曲线获得回归方程，最终计算获得待测样品中的替米沙坦浓度。

上述的方法中，优选地，所述内标溶液为替米沙坦-¹³C-d3。

上述的方法中，优选地，所述预处理的具体方法包括：

向96孔板中加入50.0μL血浆样本，接着加入50.0μL的内标溶液和300μL的乙腈，涡流混匀后离心收集上清液，将200μL上清液置于到另一干净96孔板中，得到待测样品。

上述的方法中，优选地，所述离心的时间为10min，离心温度为4℃，离心速度为3900rpm。

上述的方法中，优选地，所述内标溶液的浓度为90.0ng/mL。

上述的方法中，优选地，进行液相色谱分离所采用的色谱柱为：Venusil MP-C18(2)色谱柱，5.0μm，4.6×100mm；所采用的流动相为：A相：含0.1％甲酸的5mM醋酸铵的水溶液，B相：含0.1％甲酸的乙腈溶液。

上述的方法中，优选地，进行液相色谱分离洗脱条件为：

等度洗脱：A相：B相＝20：80(v/v)；

洗脱时间：3.00min；

流速：0.7000mL/min；

进样量：1.00μL；

自动进样器温度：4℃；

柱温：40℃。

上述的方法中，优选地，进行质谱检测的质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源(ESI)；

喷射电压：5500V；

喷雾气(Gas1)：55psi；

辅助气(Gas2)：60psi；

检测方式：正离子；

离子源温度：500℃；

碰撞诱导解离(CAD)：9psi；

气帘气(Curtain Gas)：30psi；

驻留时间：200ms。

上述的方法中，优选地，进行质谱检测采用定量分析离子对，所述定量分析离子对为：

替米沙坦m/z 515.0→276.1，CE 60eV，DP 60V；

替米沙坦-¹³C-d3 m/z 519.3→280.2，CE 60eV，DP 60V。

上述的方法中，优选地，标准曲线具体制作为：

以待测样品理论浓度为横坐标，待测样品与内标物的峰面积比为纵坐标，进行回归分析计算获得直线回归方程。

另一方面，本发明还提供上述的方法在分析血浆样本中替米沙坦浓度中的应用；所述替米沙坦用于治疗轻、中度高血压。

本发明的有益效果：

(1)本发明具有预处理操作简便的特点，仅需要一步提取即可进行分析，分析速度较快，分析时间仅为3min，因此本发明适合大批量临床研究样品分析。

(2)本发明灵敏度较高、替米沙坦定量下限为1.00ng/mL，检测限经计算为0.0400ng/mL，柱上待测物的量按照稀释倍数8以及进样量1μL计算为0.00500pg，灵敏度的提高可以降低受试者的服药量，增加临床研究的安全性，本发明线性范围选择合理，能够更准确的分析药物的浓度。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为替米沙坦产物离子扫描质谱图；

图2为替米沙坦-¹³C-d3产物离子扫描质谱图；

图3为空白血浆样品中替米沙坦(左)和替米沙坦-¹³C-d3(右)的MRM色谱图；

图4为定量下限样品中替米沙坦(左)和替米沙坦-¹³C-d3(右)的MRM色谱图；

图5为1名健康受试者单次口服40mg替米沙坦胶囊后替米沙坦的药物浓度-时间曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

液相色谱-串联质谱检测血浆中药物浓度的方法开发通常可分为三个部分，即提取方法(即预处理方法)、液相色谱方法和质谱方法。本发明针对现有技术缺点，从以上这三个方面着手建立分析方法。

实施例

一、预处理：

本发明中使用血浆用量仅为50.0μL适合临床研究生物分析工作，本发明中的提取方法选用蛋白沉淀法、该方法对极性较弱的替米沙坦有较高的回收率，并且具有操作简单、提取时间短、无须耗时的浓缩步骤。配合96孔板使用，适合临床研究中高通量样品预处理。

具体前处理方法步骤如下：

1、96孔板中加入50.0μL血浆样品，50.0μL内标溶液(TMS-¹³C-d3的浓度为90.0ng/mL)，300μL乙腈；

2、涡流混匀，离心10min(4℃，3900rpm)；

3、取200μL上清液到另一干净96孔板中；

5、进样体积为1.0μL。

二、色谱分析：

色谱，将待测样品液相色谱分离，采用Venusil MP-C18(2)色谱柱，等度洗脱，流动相A为含0.1％甲酸和5mM醋酸铵的水溶液溶液，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈溶液。

替米沙坦极性较弱在常规的反相色谱柱上保留显著。本发明色谱分离采用Venusil MP-C18(2)色谱柱，对待测物和内标均有较好的保留，且峰形尖锐。色谱采用的流动相中加入了0.1％甲酸利于正离子的质子化。该模式下仪器分析通量较高，色谱运行时间仅为3.0min，检测快速，适用于临床研究大批量样品分析。

三、质谱分析：

采用电喷雾离子源，正离子检测，喷射电压5500V，气体1(Gas1)55psi，气体2(Gas2)60psi，气帘气体(Curtain Gas)30psi，离子源温度500℃，碰撞诱导解离9psi，驻留时间200ms，替米沙坦定量分析离子对m/z 515.0→

276.1，碰撞能量(CE)60eV，去簇电压(DP)60V，替米沙坦-13C-d3定量分析离子对519.3→280.2，碰撞能量(CE)60eV，去簇电压(DP)60V。

下面通过具体实施例，详细说明本发明：

实施例1：

缩写说明：

缩写	全文	中文说明
			LLOQ	lower limit of quantification	定量下限
LQC	low quality control	低质控
			AMQC	accessorial middle quality control	次中浓度质控
MQC	medium quality control	中质控
			HQC	high quality control	高质控
RSD	relative standard deviation	相对标准偏差
			RE	relative Error	相对偏差

1 材料

1.1 仪器

色谱仪：LC-30AD快速液相色谱系统，日本岛津公司。

质谱仪：5500型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾电离源(ESI)加拿大Sciex公司。

数据处理采用软件：Analyst(version 1.6.3)，加拿大Sciex公司。

离心机：HerμLe Z2326K型台式离心机，德国贺默公司。

分析天平：CD225D型分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司。

1.2对照品和试剂

替米沙坦(含量99.9％)购自中国食品药品检定研究院。替米沙坦-¹³C-d3购自TLC公司。甲醇(HPLC级)、乙腈(HPLC级)购自美国Sigma公司。甲酸(HPLC级)购自TCI公司。醋酸铵(HPLC级)购自ROE公司。去离子水(18.2mΩ,TOC≤50ppb)由Milli-Q超纯水系统制备。

2 方法

2.1 溶液及样品的配制

标准系列样品：精密称取各对照品适量，以甲醇分别溶解并定容，配制成替米沙坦约为1.00mg/mL的贮备液。精密吸取各自贮备液适量，以人空白血浆逐级稀释得到混合标准系列样品，替米沙坦浓度范围分别为1.00-200ng/mL。

质控样品：采用与标准系列样品相似方法配制替米沙坦4个浓度水平混合质控样品。定量下限浓度为1.00ng/mL，低质控(low quality control，LQC)浓度为3.00ng/mL，次中质控(accessorial medium quality control，AMQC)浓度为15.0ng/mL，中质控(mediumquality control，MQC)浓度为100ng/mL，高质控(high quality control，HQC)浓度为150ng/mL。

内标溶液：精密称取替米沙坦-¹³C-d3对照品，以甲醇溶解并定容，配制成浓度约为0.100mg/mL的内标贮备液。精密吸取上述内标贮备液适量，加乙腈：水(50:50，v/v)稀释，获得替米沙坦-¹³C-d3浓度分别为90.0ng/mL的内标溶液。

2.2血浆样品处理

2.3色谱及质谱条件

色谱条件：

质谱条件：

2.4.方法学验证

按照中国药典9012指导原则对本方法进行了方法学验证，内容包括稳定性、选择性、线性、准确度、精密度、回收率基质效应等。

选择性

取六个来源不同的空白血浆及各自配制的定量下限样品处理后进样分析。色谱共流出干扰物的峰面积须小于定量下限待测物峰面积的20％，小于内标峰面积的5％。

标准曲线

以待测物理论浓度为横坐标(x)，待测物与内标物的峰面积比为纵坐标(y)，进行回归分析计算的直线回归方程(权重因子W＝1/x²)。方法验证每一分析批对标准曲线样品双样本分析。

精密度和准确度

方法验证每一分析批测定五个浓度质控样本各六样本。定量下限批内、批间精密度以相对标准差(RSD)计算小于20％方可接受，准确度以相对偏差计算(RE)在-20％～20％之间方可接受。其余各浓度水平的QC样品各成分批内、批间精密度需小于15％方可接受，准确度在-15％～15％之间方可接受。

稳定性

考察各待测物在血浆样品中的稳定性时，将LQC和HQC置于不同温度及环境中，放置结束后进行三样本分析。共考察四种放置条件，分别为：室温放置23h，提取后进样器内放置92h，经历6次冷冻-解冻循环(从-80℃设置温度到室温)，-80℃(设置温度)放置164天。

回收率

取空白血浆50.0μL，提取后(不加内标溶液)加入待测物溶液和内标溶液，使最终浓度与LQC、MQC和HQC相同，进样测定。另提取LQC、MQC和HQC各6份，进样测定。以2种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。

基质效应

取6个不同来源空白血浆，提取后(不加内标溶液)，加入和LQC和HQC相同浓度的待测物溶液和内标溶液，涡流混合后测定。另取去离子水代替血浆，按上述方法处理。以两种方法获得的峰面积比值计算基质因子，通过内标归一化的基质因子的RSD评估基质效应，小于15％方可接受。

2.5临床研究

应用建立的方法分析临床研究血浆样本中替米沙坦的浓度，用于替米沙坦人体药动学研究。临床研究经过医院伦理委员会批准，受试者在试验前均被告知试验风险，自愿签署知情同意书。72名健康受试者给予40mg替米沙坦胶囊。于给药前(0h)、给药后96h内不同时间点，采集静脉血取血各4mL，置K₂EDTA抗凝离心管中，离心(1700g，4℃)10min后分离血浆，-60℃及以下超低温冰箱保存。

3 结果与讨论

3.1 方法学验证

方法的选择性

如图3至图4所示，替米沙坦、替米沙坦-¹³C-d3保留时间分别约为2.29min和2.27min，保留时间处无共流出干扰峰。

标准曲线

替米沙坦产物离子扫描质谱图见图1，替米沙坦-¹³C-d3产物离子扫描质谱图见图2；测定替米沙坦临床研究血浆样本中替米沙坦的线性范围分别为1.00-200ng/mL。待测物标准曲线典型直线回归方程分别为：

替米沙坦:y＝0.0101x+0.000144；

检测限

定量下限样品中替米沙坦浓度为1.00ng/mL，信噪比分别为75。按照信噪比为3计算检测限分别为0.0400ng/mL。柱上待测物的量按照稀释倍数8以及进样量1μL计算为0.00500pg。

方法的精密度与准确度

精密度准确度结果均符合接受标准，结果见表1。

表1是测定人血浆中替米沙坦精密度和准确度

表1：

处理回收率

LQC、MQC和HQC浓度水平：替米沙坦的提取回收率分别为95.6％、96.0％和96.5％；替米沙坦-¹³C-d3的回收率分别为100.3％。

基质效应

LQC、HQC浓度水平下替米沙坦的内标归一化的基质因子分别为100.0％和99.4％，RSD分别为0.9％和1.8％。以上结果表明，基质效应不干扰待测物分析的准确性。

血浆稳定性考察

血浆稳定性试验结果见表2，结果表明在考察条件下替米沙坦稳定。

其中表2是替米沙坦在人血浆中的稳定性(n＝6)

表2：

4人体药动学研究

将验证后的方法用于分析血浆中替米沙坦，以评价替米沙坦药动学特征。1名健康受试者单次口服40mg替米沙坦胶囊，血浆药物浓度-时间曲线见图5，检测方法灵敏度可完整描绘替米沙坦的药动学特性，并且线性范围的选择与实际样本的浓度水平接近，测定准确性高。

本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种利用液相色谱-串联质谱分析血浆样本中替米沙坦浓度的方法，其包括如下步骤：

向血浆样本中加入内标溶液和乙腈进行涡流，离心后收集上清液，得到预处理后的待测样品；

采用液相色谱-串联质谱检测，将待测样品进行液相色谱分离，然后进行质谱检测，基于检测峰面积比绘制标准曲线获得回归方程，最终计算获得待测样品中的替米沙坦浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述内标溶液为替米沙坦-¹³C-d3。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述预处理的具体方法包括：

向96孔板中加入50.0μL血浆样本，接着加入50.0μL的内标溶液和300μL的乙腈，涡流混匀后离心收集上清液，将200μL上清液置于到另一干净96孔板中，得到待测样品；

优选地，所述离心的时间为10min，离心温度为4℃，离心速度为3900rpm。

4.根据权利要求1～3所述的方法，其中，所述内标溶液的浓度为90.0ng/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，进行液相色谱分离所采用的色谱柱为：VenusilMP-C18(2)色谱柱，5.0μm，4.6×100mm；所采用的流动相为：A相：含0.1％甲酸的5mM醋酸铵的水溶液，B相：含0.1％甲酸的乙腈溶液。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，进行液相色谱分离洗脱条件为：

等度洗脱：A相：B相＝20：80(v/v)；

洗脱时间：3.00min；

流速：0.7000mL/min；

进样量：1.00μL；

自动进样器温度：4℃；

柱温：40℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，进行质谱检测的质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源(ESI)；

喷射电压：5500V；

喷雾气(Gas1)：55psi；

辅助气(Gas2)：60psi；

检测方式：正离子；

离子源温度：500℃；

碰撞诱导解离(CAD)：9psi；

气帘气(Curtain Gas)：30psi；

驻留时间：200ms。

8.根据权利要求1或6所述的方法，其中，进行质谱检测采用定量分析离子对，所述定量分析离子对为：

替米沙坦m/z 515.0→276.1，CE 60eV，DP 60V；

替米沙坦-¹³C-d3 m/z 519.3→280.2，CE 60eV，DP 60V。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，标准曲线具体制作为：

以待测样品理论浓度为横坐标，待测样品与内标物的峰面积比为纵坐标，进行回归分析计算获得直线回归方程。

10.权利要求1～9任一项所述的方法在分析血浆样本中替米沙坦浓度中的应用；所述替米沙坦用于治疗轻、中度高血压。

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