CN112782305A - 一种灵敏快速适合药动学研究的血浆中舒芬太尼浓度分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种灵敏快速适合药动学研究的血浆中舒芬太尼浓度分析方法，包括以下步骤：步骤1：血浆样品前处理；步骤2：色谱分离；步骤3：质谱检测。本发明检测方法灵敏度高且前处理操作简单、样品用量小、仪器分析通量高，适合舒芬太尼贴剂临床药动学研究。

Description

一种灵敏快速适合药动学研究的血浆中舒芬太尼浓度分析 方法

技术领域

本发明涉及一种灵敏快速适合药动学研究的血浆中舒芬太尼浓度分析方法。

背景技术

舒芬太尼一种强效的μ受体激动剂，具有极易通过神经细胞膜和血脑屏障的特点，是芬太尼类药物中镇痛效果最强的药物。舒芬太尼注射液于1984年经美国FDA批准上市。由于舒芬太尼药效很强、较低浓度的血浆药物即可达到药效，因此临床药物监测所使用的分析方法通常需要具有较高的灵敏度。舒芬太尼贴剂为一种改良型新药，目前处于临床研究过程中。通过体表给药的方式，降低药物的毒副作用、延长作用时间，具有乐观的临床应用前景。然而体表给药局部作用较好，其生物利用度较低，因此血液浓度较低，这对分析方法的灵敏度有进一步的挑战。为了支持舒芬太尼贴剂的药动学研究，需要建立一种超灵敏、前处理简单、样本用量小、仪器分析速度快速的分析方法。

液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)由于其优异灵敏度被广泛的用于分析血液、乳汁、尿液等生物基质中的舒芬太尼药物浓度。LC-MS/MS法通常分为3个主要步骤，即样品前处理、色谱分离和质谱检测。为了达到灵敏的分析生物基质中舒芬太尼浓度的目的，目前已报道的技术中，样品前处理方法通常使用了0.2mL以上较大的样本体积，并且使用了复杂的样品浓缩技术，如液-液萃取法和固相萃取法，因此不适合临床药动学研究中使用。已报道技术目的多为药物滥用监测，常常同时分析多种神经系统药物。为了满足多种不同极性药物的同时监测，色谱常常使用梯度洗脱，且需要较长的色谱分离时间，这降低了仪器分析的通量。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏快速适合药动学研究的血浆中舒芬太尼浓度分析方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种灵敏快速适合药动学研究的血浆中舒芬太尼浓度分析方法，包括以下步骤：

步骤1：血浆样品前处理，在96孔板中加入血浆样品，内标溶液，加入甲醇，涡流振荡，离心，取出上清，加入超纯水，涡流混匀，进样10.0μL，进行LC-MS/MS分析；

步骤2：色谱分离；

色谱条件，色谱柱：Venusil ASB-C18柱，3μm，50×4.6mm；柱温：40℃；流动相A相选用2mM醋酸铵水溶液含0.2％甲酸，流动相B项为乙腈含0.1％甲酸，采用体积比为40：60的A：B相等度洗脱，色谱运行时间为3min，自动进样器温度为4℃，流动相的流速为：0.60mL/min；

步骤3：质谱检测；

质谱条件：电喷雾电离源；电压为5500V；离子源温度为500℃；Curtain Gas和CID压力分别为40和10psi；扫描模式为MRM；监测离子反应分别为：舒芬太尼，m/z 387.3→238.1；芬太尼，m/z 337.4→188.1；CE为25eV；DP为100V；扫描时间为200ms。

优选地，步骤1血浆样品前处理，取50.0μL血浆样品，分别加入50.0μL内标工作液、200μL甲醇，涡流混匀，以3900rpm转速离心10min，取出上清100μL转移至96孔板中，加入50.0μL超纯水，涡流混匀，取10.0μL进行LC-MS/MS分析。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1、本发明采用简单的蛋白沉淀法处理血浆样品，且没有复杂的浓缩过程，前处理通量较高，且仪器分析速度快，分析时间仅为3min。

2、本发明样品消耗量小，仅为50.0μ/L，适合临床药动学研究使用。

3、本发明检测方法灵敏度较高，适合舒芬太尼贴剂临床研究样本检测，定量下限为5.00pg/mL，定量下限样品信噪比约为20、检测限经计算为0.750pg/mL，色谱进样量仅为10.0μ/L、柱上舒芬太尼的量为5.5fg。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明舒芬太尼的产物离子全扫描质谱图；

图2是本发明的内标芬太尼的产物离子全扫描质谱图；

图3是本发明的舒芬太尼(上)和芬太尼(下)在人血浆中空白人血浆样品的MRM色谱图；

图4是本发明舒芬太尼(上)和芬太尼(下)在定量下限样品中的MRM色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

如图1至图2，一种灵敏快速适合药动学研究的血浆中舒芬太尼浓度分析的方法，包括以下步骤：

步骤1：血浆样品前处理，在96孔板中加入血浆样品，内标溶液，加入甲醇，涡流振荡，离心，取出上清，加入超纯水，涡流混匀，进样10.0μL，进行LC-MS/MS分析；

步骤2：色谱分离；

色谱条件，色谱柱：Venusil ASB-C18柱，3μm，50×4.6mm；柱温：40℃；流动相A相选用2mM醋酸铵水溶液含0.2％甲酸，流动相B项为乙腈含0.1％甲酸，采用体积比为40：60的A：B相等度洗脱；自动进样器温度为4℃，流动相的流速为：0.60mL/min；

步骤3：质谱检测；

质谱条件：电喷雾电离源；电压为5500V；离子源温度为500℃；Curtain Gas和CID压力分别为40和10psi；扫描模式为MRM；监测离子反应分别为：舒芬太尼，m/z 387.3→238.1；芬太尼，m/z 337.4→188.1；CE为25eV；DP为100V；扫描时间为200ms。

上述前处理条件，样品消耗量仅为50.0μL，且没有浓缩的过程、前处理方法为简单的蛋白沉淀法、步骤简单成本低、仪器分析时间仅为3min，通量高。色谱方法中缓冲盐的浓度及甲酸的浓度经过仔细的优化，可获得最佳的信噪比。色谱柱经优化采用Venusil ASB-C18柱，舒芬太尼和芬太尼在色谱上保留显著且色谱峰尖锐。

实施例一

缩写说明

1材料

1.1仪器

日本岛津公司LC-30AD超高效液相色谱系统及AB Sciex 6500型三重四级杆串联质谱仪，配有ESI源。

数据处理采用Analyst 1.6.3软件。

北京赛多利斯仪器有限公司CP225D型分析天平。

日本Hitachi公司CT15RE型离心机。

1.2标准品和试剂

枸橼酸舒芬太尼(含量99.2％)；枸橼酸芬太尼(含量100％)；甲醇和乙腈采购于美国Sigma公司；甲酸采购于日本TCI公司；醋酸铵采购于美国ROE公司；去离子水由Millipore纯水仪制备。上述试剂均为色谱纯。

2方法

2.1溶液的配制

标准曲线样品配制

称取枸橼酸舒芬太尼对照品，以甲醇溶解并定容，浓度约为1.00mg/mL。吸取上述舒芬太尼贮备液适量，以甲醇-水(50/50，v/v)逐级稀释得到系列浓度标准溶液，舒芬太尼浓度分别0.100、0.200、0.500、2.00、5.00、20.0、32.0、40.0ng/mL。以空白血浆稀释上述工作溶液获得舒芬太尼浓度分别5.00、10.0、25.0、100、250、1000、1600和2000pg/mL的标准曲线样品。

内标工作液

称取芬太尼对照品，以甲醇溶解并定容，浓度为0.200mg/mL的内标贮备液。精密吸取内标贮备液适量，以甲醇-水(50/50，v/v)分步稀释，获得浓度为1.00ng/mL的内标工作液。

2.2血浆样品处理

1)96孔板中加入50.0μL血浆样品，50.0μL内标溶液(芬太尼的浓度为1.00ng/mL)，200μL甲醇；

2)涡流混匀，离心10min(4℃，3900rpm)；

3)取100μL上清液加入到已有50.0μL超纯水的96孔板中，涡流混匀。

2.3色谱及质谱条件

色谱条件

质谱条件

2.4方法学验证

选择性

分别取空白人血浆、LLOQ样品相应色谱图(图3和图4)。舒芬太尼和内标芬太尼的保留时间分别为1.9和1.6min，空白血浆谱图中该保留时间处无干扰峰。

标准曲线

以舒芬太尼理论浓度为横坐标(x)，舒芬太尼与芬太尼峰面积比为纵坐标(y)，进行直线回归计算(权重因子W＝1/x2)，舒芬太尼的典型回归方程为y＝0.0015x+0.00109，r＝0.9991，舒芬太尼在5.00～2000pg/mL范围内明显线性。

检测限

定量下限样品舒芬太尼浓度为5.00pg/mL，信噪比分别为20。按照信噪比为3计算检测限分别为0.750pg/mL。柱上待测物的量按照稀释倍数9以及进样量10μL计算为5.5fg。

准确度、精密度及稳定性

以人空白血浆，稀释舒芬太尼工作液，配制成LQC、MQC、HQC(舒芬太尼浓度为15.0、150和1500pg/mL)以及LLOQ(舒芬太尼浓度为5.00pg/mL)，方法验证每一分析批测定四浓度质控样本各六样本。LLOQ日内、日间精密度以相对标准差(RSD)<20％方可接受，准确度(RE)在-20％～20％之间方可接受。其余各浓度水平的QC样品各成分日内、日间精密度(RSD)<15％方可接受，准确度(RE)在-15％～15％之间方可接受。

见表1，结果表明本方法测定舒芬太尼的精密度和准确度均可接受，舒芬太尼的LLOQ为5.00pg/mL，其中，表1是测定人血浆中舒芬太尼的精密度和准确度。

表1

稳定性

取LQC和HQC样品，考察其室温放置21h、反复冻融5次以及-70℃放置66天的稳定性。

见表2，结果表明，在上述条件下舒芬太尼均稳定，RE在-7.7％～4.9％之间，表2是舒芬太尼在人血浆中的稳定性(n＝6)。

表2

回收率与基质效应

分析低、中、高浓度的QC样品个六样本。同时另取空白血浆50.0μL，按血浆样品处理，向上清液中加入舒芬太尼对照溶液及内标工作液，涡流混合，进样测定，2种样品中的舒芬太尼平均峰面积比即为回收率。结果表明，三浓度水平提取回收率分别为103％、105％、104％，不同浓度水平CV％为0.9％。内标回收率为101％。

取不同来源人空白血浆(n＝6)，按血浆样品处理(不加入内标)，向上清液中加入对照溶液和混合内标工作液，进样测定。另取50.0μL去离子水，按上述方法处理，进样测定。以两种样品舒芬太尼峰面积比值计算基质因子。舒芬太尼在LQC和HQC浓度下基质因子分别为108％和107％，其RSD均小于3.4％，表明在本试验条件下，可忽略基质效应对舒芬太尼测定的影响。

方法验证总结

本发明方法经过方法学验证，方法灵敏度极高、选择性好、准确、精密、稳定性好、线性良好，各项指标均符合2015年中国药典附录《9012生物样品定量分析方法验证指导原则》要求

本发明至少具有以下优点：

1、本发明采用简单的蛋白沉淀法处理血浆样品，且没有复杂的浓缩过程，前处理通量较高，且仪器分析速度快，分析时间仅为3min。

2、本发明样品消耗量小，仅为50.0μ/L，适合临床药动学研究使用。

3、本发明检测方法灵敏度较高，适合舒芬太尼贴剂临床研究样本检测，定量下限为5.00pg/mL，定量下限样品信噪比约为20、检测限经计算为0.750pg/mL，色谱进样量仅为10.0μ/L、柱上舒芬太尼的量为5.5fg。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种灵敏快速适合药动学研究的血浆中舒芬太尼浓度分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：血浆样品前处理，在96孔板中加入血浆样品，内标溶液，加入甲醇，涡流振荡，离心，取出上清，加入超纯水，涡流混匀，进样10.0μL，进行LC-MS/MS分析；

步骤2：色谱分离；

色谱条件，色谱柱：VenusilASB-C18柱，3μm，50×4.6mm；柱温：40℃；流动相A相选用2mM醋酸铵水溶液含0.2％甲酸，流动相B项为乙腈含0.1％甲酸，采用体积比为40：60的A：B相等度洗脱；自动进样器温度为4℃，流动相的流速为：0.60mL/min；

步骤3：质谱检测；

质谱条件：电喷雾电离源；电压为5500V；离子源温度为500℃；Curtain Gas和CID压力分别为40和10psi；扫描模式为MRM；监测离子反应分别为：舒芬太尼，m/z 387.3→238.1；芬太尼，m/z 337.4→188.1；CE为25eV；DP为100V；扫描时间为200ms。

2.根据权利要求1所述的一种灵敏快速适合药动学研究的血浆中舒芬太尼浓度分析方法，其特征在于，其特征在于：所述步骤1血浆样品前处理，取50.0μL血浆样品，分别加入50.0μL内标工作液、200μL甲醇，涡流混匀，以3900rpm转速离心10min，取出上清100μL转移至96孔板中，加入50.0μL超纯水，涡流混匀，取10.0μL进行LC-MS/MS分析。

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