CN105699575A - 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法及试剂盒 - Google Patents

高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法；采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的唾液中皮质醇，利用高效液相色谱将皮质醇与杂质分离，内标法定量，以皮质醇的同位素作为内标，以标准品与内标的浓度比为X轴，标准品与内标的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算皮质醇的含量。本发明方法灵敏度高、特异性强、准确性好，前处理过程简单；分析时间短，5min内即可完成皮质醇的分析，精密度及加标回收率满足检测要求。

Description

高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及唾液检测的技术领域，特别涉及一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法。
背景技术
目前常用的检测唾液中皮质醇的方法有酶联免疫法、电化学发光免疫法等，这些方法受到多种客观条件的影响，如温度、pH值、离子强度、试剂免疫活性等。免疫法不可避免唾液基质中结构相似物质的干扰，灵敏度低。不同厂家生产的试剂盒检测结果偏差较大，缺乏统一标准，导致检测结果偏差较大，参考价值较低。
发明内容
本发明的目的是解决现有唾液中皮质醇检测方法技术中存在的部分问题，提供一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法及试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法，包括如下步骤：
采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的唾液中皮质醇，利用高效液相色谱将皮质醇与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算皮质醇的含量；
(1)具体色谱条件为：
流动相A：体积比为0.05％的甲酸水；
流动相B：甲醇，纯度为色谱纯，浓度为100％；
色谱柱型号：PhenomenexKinetex-C18，50×2.1mm，2.6μm；
采用梯度洗脱的方式，见表1；
流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为20μl；
表1流动相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；喷雾电压为5000V；碰撞气为3；气帘气为10；离子源气流GS1为70，GS2为70；离子源温度为500℃；目标物皮质醇m/z363.1→121.1、同位素内标d4-皮质醇m/z367.3→121.1；皮质醇及内标的去簇电压、碰撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表2；
表2皮质醇及内标的质谱参数
优选地，所述经预处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500μl于2ml离心管中，加入50ng/ml的内标溶液10μl，混匀后，加1ml萃取液，涡旋混合5min，13000r/min离心10min，取上清800μl；氮气吹干，以100μl10％甲醇水复溶，涡旋3min；13000r/min，离心3min，进样检测。
优选地，所述内标溶液配制：称取皮质醇同位素内标，甲醇溶解后配制1mg/ml的储备液用甲醇；用甲醇将储备液用甲醇稀释至50ng/ml即得实验用内标溶液。
优选地，所述萃取液为乙酸乙酯：正己烷为7:3的混合液。
优选地，所述氮气吹干温度为40～50℃。
本发明的另一方面包括：
高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.05％V/V甲酸水；
洗脱液B：甲醇，色谱纯；
(2)标准品母液：皮质醇的甲醇溶液；
配制：精确称取10mg皮质醇标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得1mg/ml的母液；
(3)内标液：d4-皮质醇的甲醇溶液；
配制：精确称取10mgd4-皮质醇的标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得1mg/ml的母液，用甲醇依次稀释得50ng/ml的内标溶液；
(4)稀释液：
稀释液1：空白唾液基质溶液，将0.4g牛血清蛋白用水定容至10ml制得；
稀释液2：甲醇；
(5)萃取液：乙酸乙酯：正己烷＝7:3；
(6)质控品：皮质醇的空白唾液基质溶液，分低中高浓度的QC(L)、QC(M)、QC(H)，浓度分别为：1ng/ml、2.5ng/ml、10ng/ml；
皮质醇母液稀释至100ng/ml得溶液A；
QC(H)：取100μl溶液A，用稀释液1定容至1ml；
QC(M)：取25μl溶液A，用稀释液1定容至1ml；
QC(L)：取10μl溶液A，用稀释液1定容至1ml。
本发明的有益效果：通过对前处理方法的改良，前处理更加简单、快捷，可实现批量处理；同时ESI利用离子蒸发，液相离子化，适用于高分子量测定，大大提高了检测信号的灵敏度；方法学考察结果显示，该方法精密度、准确度、稳定性均满足定量分析要求；本发明方法具有准确度高、重现性好，稳定、可靠的特点，可用于唾液中皮质醇的检测。与酶联免疫法相比，不仅提高灵敏度，操作简单，对操作环境要求不是很高，一般实验室均可完成，而且节约分析成本，所需分析时间较短，利于开展大批量样本检测，适于进行人群中相关疾病的筛查；为肾上腺应激能力评估、焦虑指数评估提供可靠检测方法。采用本发明试剂盒进行检测，灵敏、高效、操作简单试剂用量少，结果准确可靠。
附图说明
图1为皮质醇及内标d4-皮质醇标准品的总离子流色谱图；
图2为唾液中皮质醇及内标d4-皮质醇的总离子流色谱图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法，包括如下步骤：
采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的唾液中皮质醇，利用高效液相色谱将皮质醇与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算皮质醇的含量；
(1)具体色谱条件为：
流动相A：体积比为0.05％的甲酸水；
流动相B：甲醇，纯度为色谱纯，浓度为100％；
色谱柱型号：PhenomenexKinetex-C18(50×2.1mm，2.6μm)；
采用梯度洗脱的方式，见表1；
流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为20μl；
表1流动相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5000V；碰撞气为3；气帘气为10，离子源气流GS1为70，GS2为70；离子源温度为500℃；目标物皮质醇m/z363.1→121.1、同位素内标d4-皮质醇m/z367.3→121.1；皮质醇及内标的去簇电压、碰撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表2；
表2皮质醇及内标的质谱参数
所述经预处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500μl于2ml离心管中，加入10μl内标溶液(50ng/ml)，混匀后，加1ml萃取液(乙酸乙酯：正己烷＝7:3)，涡旋混合5min，13000r/min离心10min，取上清800μl；氮气吹干(40～50℃)，以10％甲醇水100μl进行复溶，涡旋3min；13000r/min，离心3min，进样检测。所述内标溶液配制：称取皮质醇同位素内标，甲醇溶解，配制1mg/ml的储备液用甲醇；用甲醇将储备液用甲醇稀释至50ng/ml即得实验用内标溶液。
高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.05％V/V甲酸水；
洗脱液B：甲醇，色谱纯；
(2)标准品母液：皮质醇的甲醇溶液；
配制：精确称取10mg皮质醇标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得1mg/ml的母液；
(3)内标液：d4-皮质醇的甲醇溶液；
配制：精确称取10mgd4-皮质醇的标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得1mg/ml的母液，用甲醇依次稀释得50ng/ml的内标溶液；
(4)稀释液：
稀释液1：空白唾液基质溶液，将0.4g牛血清蛋白用水定容至10ml制得；
稀释液2：甲醇；
(5)萃取液：乙酸乙酯：正己烷＝7:3；
(6)质控品：皮质醇的空白唾液基质溶液，分低中高浓度的QC(L)、QC(M)、QC(H)，浓度分别为：ng/ml、2.5ng/ml、10ng/ml；
皮质醇母液稀释至100ng/ml得溶液A；
QC(H)：取100μl溶液A，用稀释液1定容至1ml；
QC(M)：取25μl溶液A，用稀释液1定容至1ml；
QC(L)：取10μl溶液A，用稀释液1定容至1ml；
唾液皮质醇分析试剂盒组分如下表：
具体实施例
1、仪器及参数设置：
高效液相色谱仪(Agilent1100)，色谱柱(50×2.1mm，2.6μm；Kinetex菲罗门)，流动相为体积比为0.05％甲酸水和甲醇，柱温为40℃，流速为200μl·min-1，分析时间为5min，液相条件为梯度洗脱(0～0.2min,10％甲醇；0.2～1min,10％～90％甲醇；1～4min，90％甲醇；4～4.2min，90％～10％甲醇；4.2～5min，10％甲醇)。
质谱仪(4000Qtrap，AB公司)，使用ESI源，在正离子条件下，检测模式为MRM。
检测离子对(m/z)：皮质醇：363.2→121.1；内标(d4-皮质醇)：367.3→121.1；
气帘气(CUR)为10、碰撞气(CAD)为3、离子喷雾电压(IS)为5000V，温度为500℃，GS1为70，GS2为70。
皮质醇及内标的质谱参数
2、唾液样本处理
取唾液样本500μl，加内标溶液10μl，混合60s，1ml萃取液(乙酸乙酯：正己烷＝7:3)，涡旋混合5min，以13000转/分离心10min，取上清800μl；氮气吹干(40℃)，10％甲醇水100μl进行复溶，涡旋5min；以13000转/分离心3min，取上清进样。标准品配制：准确称取皮质醇，用甲醇溶解后配制1mg/ml的储备液。依次稀释至所需浓度。
方法验证
1.总离子流色谱图：皮质醇及内标d4-皮质醇的标准品及唾液样品中的峰形对称，基本没有杂质干扰，表明该条件能够用于皮质醇的定量分析。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用Analyst软件以标准品与内标的浓度比为X轴，标准品与内标峰面积比为Y轴，建立曲线，计算唾液中皮质醇的浓度。皮质醇在0.31～10ng/ml范围内线性较好，相关系数在0.99以上，满足定量要求。
3.精密度试验：取500μl混合唾液基质，分别加入低、中、高三个浓度的皮质醇标准品溶液，使其理论浓度为1、2.5、10ng/ml，每个浓度平行做6个样本，得到精密度结果。
4.回收率试验：取500μl混合唾液基质，分别加入0、低、中、高浓度的标准品溶液，使其理论浓度0、1、2.5、10ng/ml，每个浓度平行做6个样本，重复操作3次。结果显示，唾液皮质醇的加标回收率在90％～113％之间，3次重复试验的RSD在4.5％～12.6％范围内。
表3唾液基质中皮质醇的加样回收率(n＝6)
现存检测方法(酶联免疫法、电化学发光免疫法)受到多种客观条件的影响，如温度、pH值、离子强度、试剂免疫活性等。免疫法不可避免唾液基质中结构相似物质的干扰，灵敏度低。不同厂家生产的试剂盒检测结果偏差较大，缺乏统一标准，导致检测结果参考性较低。高效液相串联质谱技术将液相的分离功能与质谱的检测功能高效结合。唾液样本在分析之前，采用液液萃取的方式进行净化处理，采用萃取剂(乙酸乙酯：正己烷＝7:3)进行液液萃取得到较纯净的样本。通过比较乙酸乙酯、正己烷及不同乙酸乙酯与正己烷不同比例(乙酸乙酯：正己烷＝1:1、3:7、7:3)混合后的提取效果，得到最佳的提取条件。建立液相色谱及质谱条件，选择性能较好的色谱柱，以0.05％甲酸水和甲醇为流动相，采用梯度洗脱的方式，使皮质醇与杂质较好分离；优化质谱条件，选择适宜的离子对m/z：363.2/121.1(皮质醇)，367.3/121.1(皮质醇氘代同位素内标)，使皮质醇检测时灵敏度达到较高水平。加入皮质醇氘代同位素内标，减少误差的产生。样本在检测时，经过色谱柱时被测物与杂质分离，之后进入质谱。定量时，采用内标法，减少误差的产生。通过分析色谱图，对峰面积进行积分，代入标准曲线准确计算被测样本的浓度。总之，该法能够用于检测唾液中皮质醇的含量，为临床提供可靠的检测方法。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (6)

1.高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的唾液中皮质醇，利用高效液相色谱将皮质醇与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算皮质醇的含量；
(1)具体色谱条件为：
流动相A：体积比为0.05％的甲酸水；
流动相B：甲醇，纯度为色谱纯，浓度为100％；
色谱柱型号：PhenomenexKinetex-C18(50×2.1mm，2.6μm)；
采用梯度洗脱的方式，见表1；
流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为20μl；
表1流动相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5000V；碰撞气为3；气帘气为10；离子源气流GS1为70，GS2为70；离子源温度为500℃；目标物皮质醇m/z363.1→121.1、同位素内标d4-皮质醇m/z367.3→121.1；皮质醇及内标的去簇电压、碰撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表2；
表2皮质醇及内标的质谱参数
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经预处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500μl于2ml离心管中，加入50ng/ml的内标溶液10μl，混匀后，加1ml萃取液，涡旋混合5min，13000r/min离心10min，取上清800μl；氮气吹干，以100μl10％甲醇水复溶，涡旋3min；13000r/min，离心3min，进样检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述内标溶液配制：称取皮质醇同位素内标，甲醇溶解后配制成1mg/ml的储备液用甲醇；用甲醇将储备液用甲醇稀释至50ng/ml即得实验用内标溶液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述萃取液为乙酸乙酯：正己烷为7:3的混合液。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氮气吹干温度为40～50℃。
6.高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.05％V/V甲酸水；
洗脱液B：甲醇，色谱纯；
(2)标准品母液：皮质醇的甲醇溶液；
配制：精确称取10mg皮质醇标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得1mg/ml的母液；
(3)内标液：d4-皮质醇的甲醇溶液；
配制：精确称取10mgd4-皮质醇的标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得1mg/ml的母液，用甲醇依次稀释得50ng/ml的内标溶液；
(4)稀释液：
稀释液1：空白唾液基质溶液，将0.4g牛血清蛋白用水定容至10ml制得；
稀释液2：甲醇；
(5)萃取液：乙酸乙酯：正己烷＝7:3；
(6)质控品：皮质醇的空白唾液基质溶液，分低中高浓度的QC(L)、QC(M)、QC(H)，浓度分别为：1ng/ml、2.5ng/ml、10ng/ml；
皮质醇母液稀释至100ng/ml得溶液A；
QC(H)：取100μl溶液A，用稀释液1定容至1ml；
QC(M)：取25μl溶液A，用稀释液1定容至1ml；
QC(L)：取10μl溶液A，用稀释液1定容至1ml。
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