CN112136043A - 用于检测和定量肝功能代谢产物的质谱测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种通过质谱测定样品中一种或多种分析物的量的方法，所述一种或多种分析物选自12,13‑DiHOME、3‑羟基丁酸盐(BHBA)、3‑羟基辛酸盐、3‑甲基戊二酰肉碱、3‑脲基丙酸盐、7‑α‑羟基‑4‑胆甾烯‑3‑酮(7‑Hoca)、柠檬酸盐、岩藻糖、富马酸盐、γ‑生育酚、谷氨酸盐、戊二酸盐、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、马来酸盐、丙二酸盐、甘露糖、乳清酸盐、2,3‑吡啶二羧酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、棕榈油酸盐、亚麻酸盐、黄嘌呤、木糖醇及其组合。该方法包括在适于从一种或多种分析物的每一种产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下，使样品经受电离源；通过质谱测量来自一种或多种分析物的每一种的一种或多种离子的量；和使用一种或多种离子的测量的量来测定样品中一种或多种分析物的量。本发明还描述了一种试剂盒，该试剂盒包含一种或多种分析物的每一种的一种或多种同位素标记的类似物作为内部标准品。

Description

用于检测和定量肝功能代谢产物的质谱测定方法
背景
本发明提供以下描述本发明背景的信息以帮助理解本发明，这些信息不能被认为构成或描述了本发明的现有技术。
肝功能可能受到各种生活方式、疾病和病症(包括例如饮食、酒精滥用、脂肪肝疾病、感染、药物和癌症)的影响。通常，在人经历肝功能障碍的症状之前，可能会损坏大量的肝组织。当前，评估肝功能的最常见测试包括血液中特定酶和蛋白质的测量。这些测试包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)和血清胆碱酯酶(ChE)总胆固醇、总甘油三酯、白蛋白、白蛋白/球蛋白比、总蛋白、直接胆红素和总胆红素。
当前的肝脏血液测试可以提供肝脏疾病包括非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、纤维化和肝硬化的第一指征，但是该测试不能检测肝功能的早期变化并且不能区分疾病。当进一步评估未显示明显的肝脏疾病原因(例如药物、病毒性肝炎或过量饮酒)，并且当肝脏的X射线或影像学研究显示存在脂肪时，则怀疑是NASH，但证明NASH诊断并将其与单纯性脂肪肝分开的唯一手段是肝脏活检。确定肝纤维化的存在和分期也需要肝脏活检。当前，血液测试或扫描不能可靠地提供此信息。肝脏活检是一种侵入性手术，其需要将针头插入穿过皮肤和切除一小块肝脏。该手术是痛苦的，并且与过多出血的风险相关。因此，需要一种不太侵入性的方法(即不需要进行肝脏活检的方法)来评估肝功能，以作为当前可用临床测定的补充。
NAFLD的流行(其涵盖从简单的、良性的肝脂肪变性到以脂质蓄积、炎症、肝细胞膨胀和不同程度的纤维化为特征的NASH的整个组织学谱)与肥胖病流行相伴而持续增加。尽管越来越认识到与肥胖相关的肝病，但对NAFLD和NASH的发病机理知之甚少，并且尚无FDA批准的以NASH作为适应症的疗法。由于需要进行侵入性肝脏活检，NASH的诊断仍然很复杂并且具有很大的风险。因此，可用于评估肝功能(包括诊断和分期NAFLD的能力)的基于血液代谢产物生物标志物概况的鉴定是一项重大且尚未得到满足的医疗需求。
本文描述了用于检测和定量分析物的方法，所述分析物可用于评估生物样品中的肝功能。测量的分析物可以包括一组包含选自以下的一种或多种分析物：12,13-DiHOME、3-羟基丁酸盐(BHBA，3-HB)、3-羟基辛酸盐(3-羟基辛酸)、3-甲基戊二酰肉碱、3-脲基丙酸盐(3-脲基丙酸)、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、柠檬酸盐(柠檬酸)、岩藻糖、富马酸盐(富马酸)、γ-生育酚、谷氨酸盐(谷氨酸)、戊二酸盐(戊二酸)、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐(甘氨鹅去氧胆酸)、甘胆酸盐(甘胆酸)、次黄嘌呤、马来酸盐(马来酸)、丙二酸盐(丙二酸)、甘露糖、乳清酸盐(乳清酸)、2,3-吡啶二羧酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐(牛磺鹅去氧胆酸)、牛磺胆酸盐(牛磺胆酸)、棕榈油酸盐(棕榈油酸)、亚麻酸盐(亚麻酸)、黄嘌呤、木糖醇。这些分析物的组合可与传统的临床生化测定一起使用，这些生化测定包括总胆固醇、总甘油三酯、白蛋白、白蛋白/球蛋白比、总蛋白、直接胆红素、总胆红素、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)和血清胆碱酯酶(ChE)。这些方法的结果允许评估肝功能，包括评估炎症、损伤、氧化应激、纤维化、脂肪变性和NASH的存在、不存在或水平(期)。这种方法的优点包括它的非侵入性性质和易于在常规临床实践中用于评估肝功能。此外，代谢产物测定需要的样品量很小，不需要衍生化，并且能够使用质谱分析方法执行。
概述
在本发明的第一方面，提供了一种方法，其包括通过质谱检测和测定样品中的一组分析物的量，该分析物包括选自以下的一种或多种分析物：12,13-DiHOME、3-羟基丁酸盐(BHBA)、3-羟基辛酸盐、3-甲基戊二酰肉碱、3-脲基丙酸盐、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、柠檬酸盐、岩藻糖、富马酸盐、γ-生育酚、谷氨酸盐、戊二酸盐、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、马来酸盐、丙二酸盐、甘露糖、乳清酸盐、2,3-吡啶二羧酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、棕榈油酸盐、亚麻酸盐、黄嘌呤、木糖醇及其组合。在一个实施方案中，该方法包括在适于从一种或多种分析物的每一种产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下，使样品经受电离源。在另一个实施方案中，分析物在电离之前未经衍生化。还提供了从生物样品中提取分析物并在通过质谱检测之前对分析物进行色谱分离的方法。
在一个实施方案中，质谱是串联质谱。
在一个实施方案中，该方法包括通过质谱使用单次注射测定样品中多种分析物的量，例如，选自12,13-DiHOME、3-羟基辛酸、柠檬酸、岩藻糖、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、丙二酸、棕榈油酸、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、黄嘌呤、木糖醇和亚麻酸的一种或多种分析物的量。
在一个实施方案中，该方法包括通过质谱使用单次注射测定样品中多种分析物的量，例如，选自12,13-DiHOME、3-甲基戊二酰L-肉碱、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、γ-生育酚、谷氨酸、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、丝氨酸和牛磺胆酸盐的一种或多种分析物的量。
在一个实施方案中，该方法包括通过质谱使用单次注射测定样品中多种分析物的量，例如，选自2,3-吡啶二羧酸、3-羟基丁酸盐、岩藻糖、富马酸、谷氨酸、戊二酸盐、甘油、次黄嘌呤、马来酸、丙二酸、甘露糖、乳清酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、3-脲基丙酸、黄嘌呤和木糖醇的一种或多种分析物的量。
在一些实施方案中，测定两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或七种或更多种分析物的量。当测定两种或更多种分析物的量时，该两种或更多种分析物可以被称为“多种分析物”。在对多种分析物进行定量的情况下，这些分析物可以被称为“一组”或“一组分析物”。
在一个实施方案中，运行时间可以是9分钟或更短。在另一个实施方案中，运行时间可以小于8分钟。
在实施方案中，样品可以是血浆样品或血清样品。样品体积可以是10μl至200μl。例如，样品体积可以是10μl，15、20、25、30、40、50μl，60、70、80、90、100、120、140、160、180或200μl或10至200μl之间的任何其他体积。
详述
本发明描述了用于测量样品中一种或多种分析物的量的方法，所述一种或多种分析物选自：12,13-DiHOME、3-羟基丁酸盐(BHBA)、3-羟基辛酸盐、3-甲基戊二酰肉碱、3-脲基丙酸盐、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、柠檬酸盐、岩藻糖、富马酸盐、γ-生育酚、谷氨酸盐、戊二酸盐、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、马来酸盐、丙二酸盐、甘露糖、乳清酸盐、2,3-吡啶二羧酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、棕榈油酸盐、亚麻酸盐、黄嘌呤、木糖醇及其组合。本发明描述了使用单次注射方法定量样品中单一和多种分析物的质谱方法。这些方法可以使用液相色谱步骤(例如UPLC或HILIC)结合质谱方法进行选定分析物的分离(纯化、富集)，从而提供适用于自动化定量样品中的多种分析物的高通量测定系统。
本文提出的方法提供了优于当前测量这些分析物的方法的优点。能够在单次注射中定量测量各种组合的多种分析物的能力减少获得分析结果所需的时间、在实验室一次性用品(例如试管、移液器吸头、试剂)、实验室仪器和人力资源方面使用较少的资源。这些改进使得通过降低测定成本和增加样品分析的仪器和实验室能力来节省成本。
在进一步详细描述本发明之前，定义以下术语。
定义：
术语“固相提取”是指样品制备过程，其中使用固体颗粒色谱填充材料(即固相或固定相)根据其物理和化学性质分离复杂混合物(即流动相)的组分。固体颗粒填充材料可以容纳在盒式装置(例如，柱)中。
术语“分离”是指将复杂混合物分离为其组分分子或代谢产物的过程。常见的示例性实验室分离技术包括电泳和色谱。
术语“色谱”是指一种物理分离方法，其中待分离的组分(即化学成分)分布在两相之间，其中一个是固定的(固定相)，而另一个是沿确定的方向移动(流动相)。流动相可以是气体(“气相色谱”，“GC”)或液体(“液相色谱”，“LC”)。色谱输出数据可用于本文所述方法的实施方案中。
术语“液相色谱”或“LC”是指当流体均匀地移动通过细分物质的柱或通过毛细管通道时，选择性抑制流体溶液的一种或多种组分的过程。抑制是由于当流动相相对于固定相移动时，混合物组分在一个或多个固定相与流动相之间的分布而产生的。“液相色谱”的实例包括“反相液相色谱”或“RPLC”、“高效液相色谱”或“HPLC”、“超高效液相色谱”或“UPLC”或“UHPLC”或亲水相互作用色谱或“HILIC”。
术语“保留时间”是指自将样品引入分离装置以来在色谱过程中经过的时间。样品组分的保留时间是指在将样品注入分离装置的时间与样品组分从分离装置的包含固定相的部分洗脱(例如流出)的时间之间在色谱过程中经过的时间。
术语样品组分的“保留指数”是指通过内插(通常是对数的)获得的数值，该数值将样品组分的保留时间或保留因子与在样品组分峰之前和之后洗脱的标准品的保留时间相关联，这是利用已知标准品的分离特性来消除系统误差的机制。
术语“分离指数”是指与通过分离技术分离的化学组分相关的度量。对于色谱分离技术，分离指数可以是保留时间或保留指数。对于非色谱分离技术，分离指数可以是化学组分行进的物理距离。
如本文中所使用的，术语“分离信息”和“分离数据”是指相对于分离指数指示化学组分的存在或不存在的数据。例如，分离数据可以指示在特定时间洗脱的具有特定质量的化学组分的存在。分离数据可能指示随着时间洗脱的化学组分的量上升、达到峰值然后下降。针对分离指数(例如时间)绘制的化学组分的存在的图可以显示图形峰。因此，在分离数据的上下文中，术语“峰信息”和“峰数据”与术语“分离信息”和“分离数据”同义。
术语“质谱”(MS)是指一种用于测量和分析分子的技术，其涉及使靶分子电离或使其电离并断裂，然后基于其质荷比分析离子以产生用作“分子指纹”的质谱图。测定客体(object)的质荷比可以通过测定该客体吸收电磁能的波长来完成。有几种常用的方法来测定离子的质荷比，一些方法测量离子轨迹与电磁波的相互作用，另一些方法测量离子行进给定距离所花费的时间，或者两者结合。可以针对数据库搜索来自这些碎片质量测量的数据，以获得靶分子的鉴定。
术语“以负模式操作”或“以负多反应监测(MRM)模式操作”或“以负电离模式操作”是指其中产生和检测负离子的那些质谱方法。术语“以正模式操作”或“以正多反应监测(MRM)模式操作”或“以正电离模式操作”是指其中产生和检测正离子的那些质谱方法。
术语“质量分析仪”是指质谱仪中通过离子的质荷比(“m/z”)来分离离子混合物的设备。
术语“m/z”是指通过将离子的质量数除以其电荷数而形成的无量纲量。长期以来，它一直被称为“质荷比”。
如本文所用，术语“源”或“电离源”是指质谱仪中使待分析样品电离的装置。电离源的实例包括电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、加热电喷雾电离(HESI)、大气压光电离(APPI)、火焰电离检测器(FID)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)等。
如本文所用，术语“检测器”是指质谱仪中检测离子的装置。
术语“离子”是指包含电荷的任何客体，其能够例如通过向该客体添加电子或从该客体去除电子而形成。
术语“质谱图”是指由质谱仪产生的数据图，通常在x轴上包含m/z值，在y轴上包含强度值。
术语“扫描图”是指与特定分离指数相关的质谱图。例如，使用色谱分离技术的系统可能生成多个扫描图，每个扫描图处于不同的保留时间。
术语“运行时间”是指从样品注射到仪器数据生成的时间。
术语“串联MS”是指执行第一MS步骤(称为“初级MS”)，然后执行一个或多个后续MS步骤(通常称为“次级MS”)的操作。在初级MS中，在生成初级质谱图期间检测并记录代表一种(和可能超过一种)化学组分的离子。由离子代表的物质经受次级MS，其中感兴趣的物质经历碎片化，以使该物质分解为子组分，这些子组分被检测并记录为次级质谱图。在真正的串联MS中，初级MS中感兴趣的离子与次级MS期间生成的所得峰之间存在明确的关系。初级MS中感兴趣的离子对应于“母”或前体离子，而次级MS中产生的离子则对应于母离子的子组分并在本文中被称为“子离子”或“产物离子”。
因此，串联MS允许生成代表复杂混合物中化学组分的母子关系的数据结构。该关系可以由树状结构表示，该树状结构示出了母离子和子离子彼此之间的关系，其中子离子代表母离子的子组分。例如，可以对子离子重复进行串联MS，以确定“第三代”离子。因此，串联MS不限于两级碎片化，而是一般用于指多级MS，也称为“MSn”。术语“MS/MS”是“MS2”的同义词。为简单起见，下文中的术语“子离子”是指由次级或更高阶(即非初级)MS产生的任何离子。
一种或多种生物标志物的“水平”是指在样品中测量的生物标志物的绝对或相对量或浓度。
如本文所用，“分析物”或“代谢产物”是指12,13-DiHOME、3-羟基丁酸盐(BHBA)、3-羟基辛酸盐、3-甲基戊二酰肉碱、3-脲基丙酸盐、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、柠檬酸盐、岩藻糖、富马酸盐、γ-生育酚、谷氨酸盐、戊二酸盐、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、马来酸盐、丙二酸盐、甘露糖、乳清酸盐、2,3-吡啶二羧酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、棕榈油酸盐、亚麻酸盐、黄嘌呤、木糖醇及其组合。该术语不包括大分子，例如大蛋白质(例如，具有超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的分子量的蛋白质)、大核酸(例如具有超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的分子量的核酸)或大多糖(例如，具有超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的分子量的多糖)。
“样品”或“生物样品”是指从受试者分离的生物材料。生物样品可以包含适合用于检测期望的生物标志物的任何生物材料，并且可以包含来自受试者的细胞和/或非细胞材料。样品可以从任何合适的生物流体或组织分离，例如，血液、血液血浆(血浆)、血液血清(血清)、尿液、脑脊髓液(CSF)、粪便或组织。
“受试者”是指任何动物，但优选是哺乳动物，例如人、猴、小鼠、狗、兔或大鼠。
I.样品制备和质量控制(QC)
通过将分析物与样品中可能存在的大分子(例如蛋白质、核酸、脂质)分离来制备含有分析物的样品提取物。样品中的部分或全部分析物可能与蛋白质结合。在MS分析之前，可以使用各种方法来破坏分析物与蛋白质之间的相互作用。例如，可以从样品中提取分析物以产生液体提取物，同时沉淀和去除可能存在的蛋白质。可以使用例如乙酸乙酯或甲醇的溶液来沉淀蛋白质。为了沉淀样品中的蛋白质，将乙酸乙酯或甲醇溶液添加到样品中，然后可以将混合物在离心机中离心以将包含提取的分析物的液体上清液与沉淀的蛋白质分离。
在其他实施方案中，分析物可以从蛋白质释放而无需沉淀蛋白质。例如，可以将甲酸溶液添加到样品中以破坏蛋白质和分析物之间的相互作用。或者，可以将硫酸铵、甲酸溶于乙醇的溶液或甲酸溶于甲醇的溶液添加到样品中，以破坏蛋白质和分析物之间的离子相互作用，而无需沉淀蛋白质。在一个实例中，可以使用乙腈、甲醇、水和甲酸的溶液从样品中提取分析物。
在一些实施方案中，可以使提取物经受各种方法，包括如本文所述的液相色谱、电泳、过滤、离心和亲和分离，以相对于样品中的一种或多种其他组分纯化或富集所选分析物的量。
为了评估检测和定量分析物的方法的例如精度、准确性、校准范围或分析灵敏度，可以使用质量控制(QC)样品。可以基于样品中检测到的给定分析物的定量下限(LLOQ)或定量上限(ULOQ)来确定要在QC样品中使用的给定分析物的浓度。在一个实例中，LLOQ可以由标准品(例如，标准品A)的浓度表示，而ULOQ可以由第二种标准品(例如，标准品H)的浓度表示。低QC值可以设置在约3X LLOQ的浓度，中等QC值可以设置在高QC的约25-50％的浓度，而高QC值可以设置在ULOQ的约80％的浓度。可以基于在一组代表性样品中测量的样品结果的频率和分析测量范围(AMR)的组合来选择QC目标浓度水平。
II.色谱
在质谱之前，可以使分析物提取物经受一种或多种分离方法，例如电泳、过滤、离心、亲和分离或色谱。在一个实施方案中，分离方法可包括液相色谱(LC)，包括例如超高效液相色谱(UHPLC)。
在一些实施方案中，UHPLC可以使用反相柱色谱系统、亲水相互作用色谱(HILIC)或混合相柱色谱系统进行。
用于LC的柱加热器(或柱管理器)可以设置在约25℃到约80℃的温度。例如，柱加热器可以设置在约30℃、40℃、50℃、60℃、70℃等。
在一个实例中，可以使用HILIC系统进行UHPLC。在另一个实例中，可以使用反相柱色谱系统进行UHPLC。该系统可以包括两个或更多个流动相。流动相可以被称为例如流动相A、流动相B、流动相A’和流动相B’。
在使用两个流动相A和B的示例性实施方案中，流动相A可以包含溶于水的碳酸氢铵，而流动相B可以包含溶于甲醇和水的碳酸氢铵。碳酸氢铵的浓度可以在1mM至10mM的范围内，并且甲醇的浓度可以在1％至99％的范围内。在一些实例中，流动相A中的碳酸氢铵的浓度可以是3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或8.5mM。在一些实例中，流动相B中的碳酸氢铵浓度可以是3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或8.5mM，甲醇的浓度可以是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一个实例中，线性梯度洗脱可用于色谱。线性梯度洗脱的起始条件可包括流动相(例如，流动相B)的浓度和/或流动相通过柱(例如，流动相B)的流速。可以优化起始条件以用于分离和/或保留一种或多种分析物。梯度条件也可以进行优化以用于分析物的分离和/或保留，并且可以根据所选流速而变化。例如，初始条件可以是0.5％的流动相B和350μL/min的流速。流动相B可增加至50-75％，在约4分钟时增加至约75-99％，保持1-2分钟。流动相B可在6.2分钟时恢复至0.5％，此时其可以保持1-2分钟，用于进行平衡以用于下一次样品注射。总运行时间可以是7.5分钟或更少。
在另一个实例中，流动相A可包含全氟戊酸(PFPA)、甲酸和水，流动相B可包含PFPA、甲酸和甲醇。PFPA的浓度可以为约0.01％至约0.500％，并且甲酸的浓度可以为约0.001％至约1.0％。在一些实例中，流动相A中的全氟戊酸(PFPA)浓度可以为0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％或0.3％，并且甲酸的浓度可以为0.001％、0.005％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％。在其他实例中，流动相B中的PFPA浓度可以为0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％或0.3％，甲酸的浓度可以为0.001％、0.005％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％。线性梯度洗脱可用于色谱。例如，初始条件可以是5％的流动相B和450μL/min的流速。流动相B可在约5分钟时增加至约75-99％，并维持约3分钟。流动相B可以在8分钟时恢复到5％，此时其可以维持约一分钟用于进行平衡以用于下一次样品注射。总运行时间可以是9分钟或更少。
在其他实施方案中，流动相A可包含甲酸铵、乙腈、甲醇和水，流动相B可包含甲酸铵和乙腈。流动相A中的甲酸铵浓度范围为0.1mM至100mM，乙腈浓度范围为0％至100％。在一些实例中，流动相A中的甲酸铵的浓度可以为1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或50mM，并且乙腈的浓度可以为60％、70％、80％或90％。在其他实例中，流动相B中的甲酸铵浓度可以为1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或50mM，并且乙腈的浓度可以为30％、40％、50％或60％。线性梯度洗脱可用于色谱。例如，初始条件可以是5％的流动相B和500μL/min的流速。流动相B可在约3-4分钟时增加至约40-60％，在4-6分钟时增加至约75-99％，并维持约1分钟。流动相B可以在6-7分钟时恢复到5％，此时其可以维持约一分钟用于进行平衡以用于下一次样品注射。总运行时间可以是7.5分钟或更少。
III.质谱和定量
一种或多种分析物可以通过例如质谱电离。使用质谱仪进行质谱，质谱仪包括电离源，其用于使分级分离的样品电离并生成带电分子以用于进一步分析。样品的电离可通过例如电喷雾电离(ESI)来进行。其他离子源可包括例如大气压化学电离(APCI)、加热电喷雾电离(HESI)、大气压光电离(APPI)、火焰电离检测器(FID)或基质辅助激光解吸电离(MALDI)。可以基于多种考虑因素来确定电离方法的选择。示例性考虑因素包括待测量的分析物、样品类型、检测器类型以及正或负模式的选择。在一些实例中，质谱方法可以被分成两个或更多个时段以增加灵敏度。
可以以正或负模式将一种或多种分析物电离以产生一种或多种离子。例如，可以以正模式电离分析物12,13-DiHOME、3-甲基戊二酰肉碱、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、γ-生育酚、谷氨酸、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、丝氨酸和牛磺胆酸盐。在另一个实例中，可以以负模式电离分析物12,13-DiHOME、3-羟基丁酸盐(BHBA)、3-羟基辛酸盐、3-脲基丙酸盐、柠檬酸盐、岩藻糖、富马酸盐、谷氨酸盐、戊二酸盐、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、马来酸盐、丙二酸盐、甘露糖、乳清酸盐、2,3-吡啶二羧酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、棕榈油酸盐、亚麻酸盐、黄嘌呤、木糖醇。在一些实例中，分析物可以在单次注射中以正模式和负模式电离。
在一个实例中，可以以负模式电离分析物12,13-DiHOME、3-羟基辛酸、柠檬酸、岩藻糖、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、丙二酸、棕榈油酸、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、黄嘌呤、木糖醇和亚麻酸并且可以在单次注射中测量。在另一个实例中，可以以正模式电离分析物12,13-DiHOME、3-甲基戊二酰L-肉碱、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、γ-生育酚、谷氨酸、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、丝氨酸和牛磺胆酸盐并且可以在单次注射中测量。在另一个实例中，可以以负模式电离分析物2,3-吡啶二羧酸、3-羟基丁酸盐、岩藻糖、富马酸、谷氨酸、戊二酸盐、甘油、次黄嘌呤、马来酸、丙二酸、甘露糖、乳清酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、3-脲基丙酸、黄嘌呤和木糖醇并且可以在单次注射中测量。
可以针对给定的分析方法和/或所使用的特定质谱仪优化质谱仪的仪器设置。该仪器可以使用各种气体，例如氮气、氦气、氩气或零空气。在一个实施方案中，可以使用ABSciex QTrap 5500质谱仪进行质谱。在一个实例中，质谱仪可以以正多反应监测(MRM)模式操作。离子喷雾电压设置可以在约0.5kV至约6.0kV的范围内；在一个实施方案中，电压可以设置为5.5kV。源温度可以在约350℃至约600℃的范围内；在一个实施方案中，源温度可以设置为500℃。气帘气可以在约10至约55psi的范围内；在一个实施方案中，气帘气设置为30psi。喷雾器和去溶剂化气体流速可以在约0至约90psi的范围内。在一个实施方案中，流速可以设置为70。CAD气体设置可以在从高至低的范围内；在一个实施方案中，将碰撞活化解离(CAD)气体设置为中等。去簇电压可以在约20V至约190V的范围内。碰撞能量(CE)可以在约10V至约70V的范围内。入口电势(EP)可以为约10V。碰撞池出口电势(CXP)设置可以在约2V至约30V的范围内。
在另一个实例中，MS仪器可以在负MRM模式下操作。离子喷雾电压设置可以在-0.5kV至-5.5kV的范围内；在一个实施方案中，电压可以设置为-4.5kV。源温度范围可以在约350℃至600℃的范围内；在一个实施方案中，源温度可以设置为500℃。气帘气可以在10至40的范围内；在一个实施方案中，气帘气可以设置为30。喷雾器和去溶剂化气体流速可以在40至90的范围内。在一个实施方案中，流速可以设置为70；在另一个实施方案中，流速可以设置为80。在另一个实例中，喷雾器气体流速可以设置为80，去溶剂化气体流速可以设置为65。CAD气体可以在从低到高的范围内。在一个实例中，CAD可以设置为例如中等。在另一个实例中，CAD可以设置为高。去簇电势可以在约-10V到约-290V的范围内。碰撞能量(CE)可以在约-10V至约-130V的范围内。入口电势(EP)可以为约-10V。碰撞池出口电势(CXP)设置可以在约-5V至约-35V的范围内。
在样品已经被电离之后，可以分析带正电或带负电的离子以确定质荷比。用于测定质荷比的示例性合适分析仪包括四极杆分析仪、离子阱分析仪和飞行时间分析仪。可以使用例如选择性模式或扫描模式来检测离子。示例性扫描模式包括MRM和选定的反应监测(SRM)。
分析结果可以包括由串联MS产生的数据。在示例性实施方案中，串联MS可以是精确质量串联MS。例如，精确质量串联质谱可以使用四极杆飞行时间(Q-TOF)分析仪。串联MS允许生成代表复杂混合物中化学组分的母子关系的数据结构。该关系可以由树状结构表示，该树状结构示出了母离子和子离子彼此之间的关系，其中子离子代表母离子的子组分。
例如，初级质谱图可以包含五个不同的离子，其可以呈现为五个图形峰。初级MS中的每个离子可以是母离子。每个母离子可以进行次级MS，其产生显示了该特定母离子的子离子的质谱图。
可以扩展母/子关系以描述分离的组分(例如，从色谱状态洗脱的组分)和在初级MS中检测到的离子之间的关系，以及待分析的样品和分离的组分之间的关系。
质谱仪通常向用户提供离子扫描(即，在给定范围内具有特定质量/电荷的每个离子的相对丰度)。质谱数据可以通过多种方法与原始样品中分析物的量相关。在一个实例中，使用校准标准品来生成标准曲线(校准曲线)，以便可以将给定离子的相对丰度转换为原始分析物的绝对量。在另一个实例中，校准标准品可以是外部标准品，并且可以基于从那些标准品产生的离子来生成标准曲线，以计算一种或多种分析物的量。在另一个实例中，外部标准品可以是未标记的分析物。
可以将内部标准品添加到校准标准品和/或测试样品中。内部标准品可用于考虑样品处理过程中分析物的损失，以便获得样品中测量的分析物的更准确值。分析物峰面积与校准标准品水平中内部标准品峰面积的比率可用于生成校准曲线和定量样品。分析物的一种或多种同位素标记的类似物(例如12,13-DiHOME-d4、13C2-谷氨酸盐、13C415N2-脲基丙酸、3-羟基辛酸-d12、7a-羟基-4-胆甾烯-3-酮-d7、柠檬酸-2,2,4,4-d4酸、d4-3-羟基丁酸盐、D-核糖-13C5、岩藻糖-13C6、富马酸-13C4、γ-生育酚-d4、甘油13C3、甘氨鹅去氧胆酸酸-d4、甘胆酸-d4、次黄嘌呤-13C5,15N4、L-谷氨酸-d5、L-丝氨酸(2,3,3-d3)、马来酸2,3-d2、丙二酸-d4、甘露糖13C6、棕榈油酸-d14、喹啉酸13C315N、牛磺酸-1,1,2,2-d4、牛磺鹅去氧胆酸盐-d4、牛磺胆酸盐-d4、木糖醇-d7、d4-亚麻酸、黄嘌呤13C15N2、乳清酸盐-13C15N2和3-甲基-戊二酰基N-(甲基-d3)-肉碱可用作内部标准品。
来自MS仪器的分析数据可以被发送到计算机并使用计算机软件进行处理。在一个实例中，使用统计回归方法使分析物与内部标准品的峰面积比率针对校准标准品的浓度进行拟合以用于定量。在另一个实例中，统计回归是加权线性最小二乘回归。使用校准曲线计算出的斜率和截距可用于计算实验样品中分析物的未知浓度。
在获得一种或多种肝分析物的小组的浓度之后，可以将浓度值输入多元算法以生成肝功能评分(Liver Function Score)。例如，可以测定选自12,13-DiHOME、3-羟基丁酸盐(BHBA)、3-羟基辛酸盐、3-甲基戊二酰肉碱、3-脲基丙酸盐、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、柠檬酸盐、岩藻糖、富马酸盐、γ-生育酚、谷氨酸盐、戊二酸盐、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、马来酸盐、丙二酸盐、甘露糖、乳清酸盐、2,3-吡啶二羧酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、棕榈油酸盐、亚麻酸盐、黄嘌呤和木糖醇的两种分析物、三种分析物、四种分析物、五种分析物或六种或更多种分析物的浓度。在一个实例中，一种或多种传统临床生物化学测定(包括总胆固醇、总甘油三酯、白蛋白、白蛋白/球蛋白比、总蛋白、直接胆红素、总胆红素、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)和血清胆碱酯酶(ChE))可以与使用本文所述方法获得的分析物的浓度值结合使用。可以使用本领域已知的方法进行传统的临床生物化学测定，包括例如使用来自Abbott的ARCHITECT分析仪。
IV.试剂盒
本文描述了用于测定一种或多种肾分析物或多种肾分析物的小组的试剂盒，所述分析物选自12,13-DiHOME、3-羟基丁酸盐(BHBA)、3-羟基辛酸盐、3-甲基戊二酰肉碱、3-脲基丙酸盐、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、柠檬酸盐、岩藻糖、富马酸盐、γ-生育酚、谷氨酸盐、戊二酸盐、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、马来酸盐、丙二酸盐、甘露糖、乳清酸盐、2,3-吡啶二羧酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、棕榈油酸盐、亚麻酸盐、黄嘌呤、木糖醇及其组合。例如，试剂盒可以包含包装材料和足以用于一次或多次测定的量的经测量的量的一种或多种分析物标准品或内部标准品物。在示例性实施方案中，内部标准品可以被标记(例如同位素标记或放射性标记)，试剂盒可以包含预制的流动相溶液，和/或试剂盒可以包含流动相试剂和制备流动相溶液的说明书。试剂盒还可包含以有形形式记录的说明书(例如，在纸上，例如说明书小册子或电子介质)以用于使用试剂测量一种或多种分析物。
在示例性实施方案中，与试剂盒一起使用的一种或多种内部标准品可包括选自以下的一种或多种内部标准品：12,13-DiHOME-d4、13C2-谷氨酸盐、13C415N2-脲基丙酸、3-羟基辛酸-d12、7a-羟基-4-胆甾烯-3-酮-d7、柠檬酸-2,2,4,4-d4酸、d4-3-羟基丁酸盐、D-核糖-13C5、岩藻糖-13C6、富马酸-13C4、γ-生育酚-d4、甘油13C3、甘氨鹅去氧胆酸酸-d4、甘胆酸-d4、次黄嘌呤-13C5,15N4、L-谷氨酸-d5、L-丝氨酸(2,3,3-d3)、马来酸2,3-d2、丙二酸-d4、甘露糖13C6、棕榈油酸-d14、喹啉酸13C315N、牛磺酸-1,1,2,2-d4、牛磺鹅去氧胆酸盐-d4、牛磺胆酸盐-d4、木糖醇-d7、d4-亚麻酸、黄嘌呤13C15N2、乳清酸盐-13C15N2和3-甲基-戊二酰基N-(甲基-d3)-肉碱及其组合。
在一个实施方案中，本文描述了用于测定一种或多种肾分析物的小组的试剂盒，所述分析物选自12,13-DiHOME、3-羟基辛酸、柠檬酸、岩藻糖、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、丙二酸、棕榈油酸、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、黄嘌呤、木糖醇、亚麻酸及其组合。试剂盒使用的内部标准品可以选自12,13-DiHOME-d4、3-羟基辛酸-d12、柠檬酸-2,2,4,4-d4酸、岩藻糖-13C6、甘油13C3、甘氨鹅去氧胆酸-d4、甘胆酸-d4、丙二酸-d4、棕榈油酸-d14、L-丝氨酸(2,3,3-d3)、牛磺酸1,1,2,2-d4、牛磺鹅去氧胆酸盐-d4、牛磺胆酸盐-d4、黄嘌呤-13C15N2、木糖醇-d7和d4-亚麻酸。
在另一个实施方案中，本文描述了用于测定一种或多种肾分析物的小组的试剂盒，所述分析物选自12,13-DiHOME、3-甲基戊二酰L-肉碱、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、γ-生育酚、谷氨酸、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、丝氨酸、牛磺胆酸盐及其组合。与试剂盒一起使用的内部标准品可以选自12,13-DiHOME-d4、3-甲基-戊二酰基N-(甲基-d3)-肉碱、7a-羟基-4-胆甾烯-3-酮-d7、γ-生育酚-d4、谷氨酸-d5、甘氨鹅去氧胆酸-d4、甘胆酸-d4、次黄嘌呤-13C5,15N4、L-L-丝氨酸(2,3,3-d3)和牛磺胆酸盐-d4。
在另一个实施方案中，本文描述了用于测定一种或多种肾分析物的小组的试剂盒，所述分析物选自2,3-吡啶二羧酸、3-羟基丁酸盐、岩藻糖、富马酸、谷氨酸、戊二酸盐、甘油、次黄嘌呤、马来酸、丙二酸、甘露糖、乳清酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、3-脲基丙酸、黄嘌呤、木糖醇及其组合。与试剂盒一起使用的内部标准品可以选自喹啉酸13C315N、d4-3-羟基丁酸盐、岩藻糖-13C6、富马酸-13C4、L-谷氨酸-d5、13C2-谷氨酸盐、甘油13C3、次黄嘌呤-13C5,15N4、马来酸2,3-d2、丙二酸-d4、甘露糖13C6、乳清酸盐-13C15N2、D-核糖-13C5、L-丝氨酸(2,3,3-d3)、牛磺酸-1,1,2,2-d4、13C415N2-脲基丙酸、黄嘌呤-13C15N2和木糖醇-d7。
实施例
I.样品制备
A.试剂和仪器
质谱级(98％)的甲酸和甲酸铵(>98％)从Sigma-Aldrich获得；HPLC级甲醇和乙腈获自JT Baker；而盐酸6N(已认证)获自Fisher Scientific。使用来自VWR Scientific的Multi-Tube Vortexer进行混合。板的离心在来自Thermo Scientific的Sorvall ST 40R离心机中用3617桶式转子进行。内部标准品是从商业来源获得的。
B.样品制备
将样品在冰上解冻并涡旋。为了从研究样品和QC样品中提取分析物，向样品中添加450μL甲醇和30μL含有适当内部标准品的工作内部标准品(WIS)溶液。WIS溶液可以包含一种或多种内部标准品，并且可以包含针对本文所述的每种分析物的一种或多种内部标准品。通过加入450μL甲醇和30μL无内部标准品的WIS溶剂提取空白样品。WIS浓度的测定可以基于例如在校准范围内的分析物的浓度。例如，WIS和分析物的浓度可以约为该分析物的校准标准品C和D的浓度。
测定了分析物的校准范围。表1列出了每种分析物的校准范围。对于每种分析物，LLOQ代表校准范围的低端，而ULOQ代表校准范围的高端。本领域普通技术人员将理解如何在无需过度实验的情况下测定每种分析物的校准范围。在一个实例中，可以使用八个校准器(标准品A-H)来覆盖校准范围。可以以20倍的相应校准浓度制备校准加标溶液。
表1.分析物的校准范围
Figure BDA0002774543920000181
Figure BDA0002774543920000191
可以基于LLOQ和ULOQ确定QC水平。低、中和高水平的QC样品可以从适当分析物浓度的人血清库中制备，并根据需要强化分析物。所有分析物的LLOQ样品可以在不含脂肪酸的BSA溶液(PBS中7.5％)中以与例如标准品A相同的浓度制备。QC样品可储存在-80℃。
为了进行样品分析，将25μL的提取样品转移至板的适当孔中。将板密封并在板振荡器上高速混合约2分钟。将板在4℃以4,000rpm离心10分钟；并将150μL上清液的等分式样转移到新的板中进行LC-MS/MS分析。为了评估样品回收率，可以用等于校准标准品E的浓度加标中等QC样品。将储备溶液、校准加标溶液和内部标准品溶液存储在4℃。
实施例1：从样品色谱纯化和分离分析物
使用UHPLC开发了色谱方法，以从单次注射分析一种或多种和多达十八种分析物。对于每种色谱方法，对于每个分析的样品，将1.0μL最终提取溶液的单一固定等分试样注射在UPLC色谱柱上。配备有二元溶剂泵单元、冷藏自动进样器和柱加热器的Agilent 1290Infinity UHPLC系统用于使用用于色谱方法1和2的反相柱(Waters ACQUITY BEH C18，1.7μm，2.1×100mm)和用于色谱方法3的HILIC柱(Waters ACQUITY
Figure BDA0002774543920000192
BEH Amide，1.7μm，2.1×150mm)的液相色谱。下面进一步举例说明每种色谱方法。
A.色谱方法1
在一个实例中，开发了液相色谱方法用于在同一次注射中纯化和分离一种或多种、两种或更多种和多达全部十六种选自12,13-DiHOME、3-羟基辛酸、柠檬酸、岩藻糖、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、丙二酸、棕榈油酸、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、黄嘌呤、木糖醇和亚麻酸及其组合的分析物。
流动相A是在水中的碳酸氢铵，而流动相B是在甲醇和水中的碳酸氢铵。线性梯度洗脱以0.5％流动相B和350μL/min流速的初始条件进行。总运行时间为7.5分钟。
色谱方法1以良好峰形分离多达十六种的多种分析物。对于12,13-DiHOME、3-羟基辛酸、柠檬酸、岩藻糖、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、丙二酸、棕榈油酸、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、黄嘌呤、木糖醇和亚麻酸，近似保留时间(以分钟计)分别为5.27、3.59、0.62、0.857、0.807、5.37、5.28、0.783、5.63、0.731、0.732、5.36、5.28、0.832、0.768和5.53。
B.色谱方法2
在另一个实例中，开发了液相色谱方法用于在同一次注射中纯化和分离一种或多种、两种或更多种和多达全部十种选自12,13-DiHOME、3-甲基戊二酰L-肉碱、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、γ-生育酚、谷氨酸、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、丝氨酸和牛磺胆酸盐及其组合的分析物。
流动相A为PFPA、甲酸和水，而流动相B为PFPA、甲酸和甲醇。线性梯度洗脱以0.5％流动相B和450μL/min流速的初始条件进行。总运行时间为9.0分钟。
色谱方法2以良好峰形分离多达十种的多种分析物。对于12,13-DiHOME、3-甲基戊二酰L-肉碱、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、γ-生育酚、谷氨酸、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、丝氨酸和牛磺胆酸盐，近似保留时间(以分钟计)分别为5.17、2.85、6.16、3.33、1.07、5.16、4.87、0.998、0.878和4.51。
C.色谱方法3
在另一个实例中，开发了液相色谱方法用于在同一次注射中纯化和分离一种或多种、两种或更多种和多达全部十八种选自2,3-吡啶二羧酸、3-羟基丁酸盐、岩藻糖、富马酸、谷氨酸、戊二酸盐、甘油、次黄嘌呤、马来酸、丙二酸、甘露糖、乳清酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、3-脲基丙酸、黄嘌呤和木糖醇及其组合的分析物。
流动相A为甲酸铵、乙腈、甲醇和水，而流动相B为甲酸铵和乙腈。线性梯度洗脱以0.5％流动相B和500μL/min流速的初始条件进行。总运行时间为7.5分钟。
色谱方法3以良好峰形分离多达十八种的多种分析物。对于2,3-吡啶二羧酸、3-羟基丁酸盐、岩藻糖、富马酸、谷氨酸、戊二酸盐、甘油、次黄嘌呤、马来酸、丙二酸、甘露糖、乳清酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、3-脲基丙酸、黄嘌呤和木糖醇，近似保留时间(以分钟计)分别为3.49、1.58、1.75、3.27、3.22、3.41、1.29、1.59、2.62、3.72、2.39、1.74、1.56、3.25、2.04、2.44、2.14和2.00。
实施例2：分析物的MS/MS测量
使用具有Turbo V源(ESI)的AB Sciex QTrap 5500质谱仪，按照以下方法所述对样品提取物进行质谱。从仪器获取原始数据，并使用Analyst 1.6.2软件(AB Sciex)进行处理。为了定量，通过加权(1/x2)线性最小二乘回归将分析物与内部标准品的峰面积比率针对校准标准品的浓度进行拟合。校准曲线的所得斜率和截距用于计算实验样品中的未知浓度。
A.MS/MS方法1
开发了一种方法以在单次注射中检测一种或多种、两种或更多种和多达全部十六种分析物的水平，这些分析物选自12,13-DiHOME、3-羟基辛酸、柠檬酸、岩藻糖、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、丙二酸、棕榈油酸、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、黄嘌呤、木糖醇和亚麻酸及其组合。
相同的MS/MS方法用于在分开的单次注射中检测一种或多种、两种或更多种和多达全部十八种分析物的水平，这些分析物选自2,3-吡啶二羧酸、3-羟基丁酸盐、岩藻糖、富马酸、谷氨酸、戊二酸盐、甘油、次黄嘌呤、马来酸、丙二酸、甘露糖、乳清酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、3-脲基丙酸、黄嘌呤和木糖醇及其组合。
将来自实施例1色谱方法1中所述的色谱柱的洗脱液直接和自动地引入质谱仪的电喷雾源中。在另一个实例中，将来自实施例1色谱方法3中所述的色谱柱的洗脱液直接和自动引入质谱仪的电喷雾源中。甲醇或异丙醇用于针洗涤。仪器以负多反应监测(MRM)模式运行。离子喷雾电压设置为-4.5kV，源温度设置为500℃，气帘气(例如氮气)设置为30psi，喷雾器和去溶剂化气体(例如氮气)流速设置为70psi，碰撞活化解离(CAD)气体(例如氮气)设置为中等。
从仪器获取原始数据，并使用Analyst 1.6.2软件(AB Sciex)进行处理。为了定量，通过加权(1/x2)线性最小二乘回归将分析物与内部标准品的峰面积比率针对校准标准品的浓度进行拟合。校准曲线的所得斜率和截距用于计算实验样品中的未知浓度。生成的用于定量12,13-DiHOME、3-羟基辛酸、柠檬酸、岩藻糖、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、丙二酸、棕榈油酸、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、黄嘌呤、木糖醇和亚麻酸的示例性离子列于表2中。生成的用于定量2,3-吡啶二羧酸、3-羟基丁酸盐、岩藻糖、富马酸、谷氨酸、戊二酸盐、甘油、次黄嘌呤、马来酸、丙二酸、甘露糖、乳清酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、3-脲基丙酸、黄嘌呤和木糖醇的示例性离子列于表3中。母离子列在标题为“母离子(m/z)”的列中，而用于本实施例中的定量的子离子列在标有“用于定量的子离子(m/z)”的列中。本实施例中用于定量的子离子的选择针对整个分析测量范围内的灵敏度进行了优化；然而，可以选择其他子离子来代替或增加在实施例中用于定量的子离子。
表2.来自色谱方法1/MS方法1的分析物的母离子和子离子质荷比(m/z)
Figure BDA0002774543920000231
Figure BDA0002774543920000241
表3.来自色谱方法3/MS方法1的分析物的母离子和子离子质荷比(m/z)
Figure BDA0002774543920000242
Figure BDA0002774543920000251
Figure BDA0002774543920000261
B.MS/MS方法2
开发了一种方法以在同一次注射中检测一种或多种、两种或更多种和多达全部选自12,13-DiHOME、3-甲基戊二酰L-肉碱、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、γ-生育酚、谷氨酸、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、丝氨酸和牛磺胆酸盐及其组合的分析物的水平。将来自实施例1的色谱方法2中所述的色谱柱的洗脱液直接和自动地引入质谱仪的电喷雾源中。异丙醇用于针洗涤。
仪器以正MRM模式运行。离子喷雾电压设置为5.5kV，源温度设置为500℃，气帘气设置为30psi；喷雾器和去溶剂化气体流速设置为70psi，CAD气体设置为中等。
生成的用于定量12,13-DiHOME、3-甲基戊二酰L-肉碱、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、γ-生育酚、谷氨酸、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、丝氨酸和牛磺胆酸盐的示例性离子示于表4。母离子列在标题为“母离子(m/z)”的列中，而用于本实施例中的定量的子离子列在标有“用于定量的子离子(m/z)”的列中。本实施例中用于定量的子离子的选择针对整个分析测量范围内的灵敏度进行了优化；然而，可以选择其他子离子来代替或增加在实施例中用于定量的子离子。
表4.来自色谱方法2/MS方法2的分析物的母离子和子离子质荷比(m/z)
Figure BDA0002774543920000271
Figure BDA0002774543920000281
实施例3：实验样品中分析物的定量测量。
如上文I.B.样品制备部分中所述制备六个血清样品。使用实施例1和2中所述的LC和MS方法在实验样品中测量分析物。这些方法用于测定血清样品中分析物12,13-DiHOME、3-羟基丁酸盐(BHBA，3-HB)、3-羟基辛酸盐(3-羟基辛酸)、3-甲基戊二酰肉碱、3-脲基丙酸盐(3-脲基丙酸)、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、柠檬酸盐(柠檬酸)、岩藻糖、富马酸盐(富马酸)、γ-生育酚、谷氨酸盐(谷氨酸)、戊二酸盐(戊二酸)、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐(甘氨鹅去氧胆酸)、甘胆酸盐(甘胆酸)、次黄嘌呤、马来酸盐(马来酸)、丙二酸盐(丙二酸)、甘露糖、乳清酸盐(乳清酸)、2,3-吡啶二羧酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐(牛磺鹅去氧胆酸)、牛磺胆酸盐(牛磺胆酸)、棕榈油酸盐(棕榈油酸)、亚麻酸盐(亚麻酸)、黄嘌呤、木糖醇的绝对量(浓度)。
使用色谱方法1和MS方法1，在单次注射中测量了分析物12,13-DiHOME、3-羟基辛酸、柠檬酸、岩藻糖、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、丙二酸、棕榈油酸、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、黄嘌呤、木糖醇和亚麻酸，运行时间为7.5分钟。
使用色谱方法2和MS方法2，在单次注射中测量了分析物12,13-DiHOME、3-甲基戊二酰L-肉碱、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、γ-生育酚、谷氨酸、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、丝氨酸和牛磺胆酸盐，运行时间为9.0分钟。
使用色谱方法3和MS方法1，在单次注射中测量了分析物2,3-吡啶二羧酸、3-羟基丁酸盐、岩藻糖、富马酸、谷氨酸、戊二酸盐、甘油、次黄嘌呤、马来酸、丙二酸、甘露糖、乳清酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、3-脲基丙酸、黄嘌呤和木糖醇，运行时间为7.5分钟。
使用所描述的方法测定了六个血清样品中分析物的测量的量。将所有六个血清样品的测量的分析物水平取平均值，并在表5中示出了分析物的浓度(ng/mL)。
表5.来自代表性血清样品的结果
Figure BDA0002774543920000301

Claims (29)

1.一种通过质谱测定样品中一种或多种分析物的量的方法，所述一种或多种分析物选自12,13-DiHOME、3-羟基丁酸盐(BHBA)、3-羟基辛酸盐、3-甲基戊二酰肉碱、3-脲基丙酸盐、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、柠檬酸盐、岩藻糖、富马酸盐、γ-生育酚、谷氨酸盐、戊二酸盐、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、马来酸盐、丙二酸盐、甘露糖、乳清酸盐、2,3-吡啶二羧酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、棕榈油酸盐、亚麻酸盐、黄嘌呤、木糖醇及其组合，所述方法包括：
a)在适于从一种或多种分析物的每一种产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下，使样品经受电离源，其中在电离之前，分析物未经衍生化；
b)通过质谱测量来自一种或多种分析物的每一种的一种或多种离子的量；和
c)使用一种或多种离子的测量的量来测定样品中一种或多种分析物的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种分析物选自12,13-DiHOME、3-羟基辛酸、柠檬酸、岩藻糖、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、丙二酸、棕榈油酸、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、黄嘌呤、木糖醇和亚麻酸，其中一种或多种分析物的量在单次注射中测定。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种分析物选自12,13-DiHOME、3-甲基戊二酰L-肉碱、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、γ-生育酚、谷氨酸、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、丝氨酸和牛磺胆酸盐，其中一种或多种分析物的量在单次注射中测定。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种分析物选自2,3-吡啶二羧酸、3-羟基丁酸盐、岩藻糖、富马酸、谷氨酸、戊二酸盐、甘油、次黄嘌呤、马来酸、丙二酸、甘露糖、乳清酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、3-脲基丙酸、黄嘌呤和木糖醇，其中一种或多种分析物的量在单次注射中测定。
5.根据权利要求2或权利要求4所述的方法，其中所述电离源以负电离模式操作。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述电离源以正电离模式操作。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中测定两种或更多种分析物的量。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中测定三种或更多种分析物的量。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中测定四种或更多种分析物的量。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中测定五种或更多种分析物的量。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中测定六种或更多种分析物的量。
12.根据权利要求1所述的方法，其中用于测定一种或多种分析物的每一种的量的一种或多种离子是选自表2、3和4中的离子的一种或多种离子。
13.根据权利要求1中任一项所述的方法，其中所述样品在经受电离源之前已通过液相色谱纯化。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述液相色谱选自高效液相色谱、超高效液相色谱和湍流液相色谱。
15.根据权利要求1所述的方法，其中在所述样品经受电离源之前已通过高效液相色谱或超高效液相色谱纯化。
16.根据权利要求1中任一项所述的方法，其中使用内部标准品测定所述样品中一种或多种分析物的量。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述内部标准品包括一种或多种待测分析物中的至少一种的同位素标记的类似物。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包括生物样品。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述样品选自血液、血浆和血清。
20.根据权利要求1所述的方法，其中质谱是串联质谱。
21.根据权利要求1所述的方法，其还包括使用可用于肝功能的临床测定的其他方法分析样品。
22.根据权利要求21所述的方法，其中其他方法选自总胆固醇、总甘油三酯、白蛋白、白蛋白/球蛋白比、总蛋白、直接胆红素、总胆红素、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)和血清胆碱酯酶(ChE)。
23.一种试剂盒，其包含一种或多种分析物的每一种的一种或多种同位素标记的类似物作为内部标准品，以及包含包装材料和使用所述试剂盒的说明，所述一种或多种分析物选自12,13-DiHOME、3-羟基丁酸盐(BHBA)、3-羟基辛酸盐、3-甲基戊二酰肉碱、3-脲基丙酸盐、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、柠檬酸盐、岩藻糖、富马酸盐、γ-生育酚、谷氨酸盐、戊二酸盐、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、马来酸盐、丙二酸盐、甘露糖、乳清酸盐、2,3-吡啶二羧酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、棕榈油酸盐、亚麻酸盐、黄嘌呤、木糖醇及其组合。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述一种或多种分析物选自12,13-DiHOME、3-羟基辛酸、柠檬酸、岩藻糖、甘油、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、丙二酸、棕榈油酸、丝氨酸、牛磺酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、黄嘌呤、木糖醇、亚麻酸及其组合。
25.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述一种或多种分析物选自12,13-DiHOME、3-甲基戊二酰L-肉碱、7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(7-Hoca)、γ-生育酚、谷氨酸、甘氨鹅去氧胆酸盐、甘胆酸盐、次黄嘌呤、丝氨酸、牛磺胆酸盐及其组合。
26.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述一种或多种分析物选自2,3-吡啶二羧酸、3-羟基丁酸盐、岩藻糖、富马酸、谷氨酸、戊二酸盐、甘油、次黄嘌呤、马来酸、丙二酸、甘露糖、乳清酸盐、核糖、丝氨酸、牛磺酸、3-脲基丙酸、黄嘌呤、木糖醇及其组合。
27.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述内部标准品包括选自以下的一种或多种内部标准品：12,13-DiHOME-d4、3-羟基辛酸-d12、柠檬酸-2,2,4,4-d4酸、岩藻糖-13C6、甘油13C3、甘氨鹅去氧胆酸-d4、甘胆酸-d4、丙二酸-d4、棕榈油酸-d14、L-丝氨酸(2,3,3-d3)、牛磺酸1,1,2,2-d4、牛磺鹅去氧胆酸盐-d4、牛磺胆酸盐-d4、黄嘌呤-13C15N2、木糖醇-d7、d4-亚麻酸及其组合。
28.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述内部标准品包括选自以下的一种或多种内部标准品：12,13-DiHOME-d4、3-甲基-戊二酰基N-(甲基-d3)-肉碱、7a-羟基-4-胆甾烯-3-酮-d7、γ-生育酚-d4、谷氨酸-d5、甘氨鹅去氧胆酸-d4、甘胆酸-d4、次黄嘌呤-13C5,15N4、L-L-丝氨酸(2,3,3-d3)、牛磺胆酸盐-d4及其组合。
29.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述内部标准品包括选自以下的一种或多种内部标准品：喹啉酸13C315N、d4-3-羟基丁酸盐、岩藻糖-13C6、富马酸-13C4、L-谷氨酸-d5、13C2-谷氨酸盐、甘油13C3、次黄嘌呤-13C5,15N4、马来酸2,3-d2、丙二酸-d4、甘露糖13C6、乳清酸盐-13C15N2、D-核糖-13C5、L-丝氨酸(2,3,3-d3)、牛磺酸-1,1,2,2-d4、13C415N2-脲基丙酸、黄嘌呤-13C15N2、木糖醇-d7及其组合。
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