JP6277894B2 - 上皮間葉転換の有無を判別する方法 - Google Patents
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Description
[1] i)細胞の培養物から調製された代謝物質混合物中のセリンを測定する工程、およびii)測定結果を参照と比較する工程を含む、
該細胞が上皮間葉転換したものであるか否かを決定する方法。
[2] i)組織サンプルから調製された代謝物質混合物中のセリンを測定する工程、およびii)測定結果を参照と比較する工程を含む、該組織サンプルから上皮間葉転換した細胞が検出されるか否かを分析する方法。
[3] 前記代謝物質混合物中のフェニルアラニンを測定し、その測定結果を参照と比較する工程をさらに含む、[1]または[2]に記載の方法。
[4] 前記代謝物質混合物中のアスパラギン酸を測定し、その測定結果を参照と比較する工程をさらに含む、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5] 前記代謝物質混合物中のイソロイシン、バリン、ロイシン、アロイソロイシン、プロリン、トレオニン、4-ヒドロキシプロリン、システイン、グルタミン、d-グルコース、チロシン、β-D-マンノフラノシド、グリシン、アセチルアスパラギン酸、D-(-)-タガトース、フマル酸、アミノマロン酸、リンゴ酸、メチオニン、アスパラギン、クエン酸、グリセロール、L-プロリン、トリプトファンおよびコレステロールからなる群より選択される1以上の代謝物質を測定し、その測定結果を参照と比較する工程をさらに含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 上皮間葉転換した細胞について、さらにCD19、CD20、CD24(HSA)、CD38、CD44(PGP1)、CD90(THY1)、CD133(プロミニン1)、EpCAM(上皮細胞接着分子)、EカドヘリンおよびATP-結合カセットB5(ABCB5)からなる群より選択される1以上の遺伝子マーカーを調べることにより、前記上皮間葉転換した細胞が癌幹細胞であるか否かを決定する、[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7] 薬剤候補化合物のスクリーニング方法であって、以下の工程、
(a)癌細胞と薬剤候補化合物とを接触させた条件下で前記細胞を培養する工程、
(b)前記培養条件下で癌細胞の増殖が抑制されるまたは癌細胞の数が低減される場合、当該増殖の抑制された細胞または数が低減された細胞について、工程(a)により得られる細胞培養物から代謝物質混合物を調製し、該代謝物質混合物についてセリンを測定する工程、および
(c)測定結果を参照と比較する工程、
を含み、
参照との比較により細胞培養物から上皮間葉転換した細胞が検出されないときは、薬剤候補化合物が癌細胞中の上皮間葉転換した細胞に作用するものであると決定する、前記スクリーニング方法。
[8] 前記代謝物質混合物中のフェニルアラニンを測定し、その測定結果を参照と比較する工程をさらに含む、[7]に記載の方法。
[9] 前記代謝物質混合物中のアスパラギン酸を測定し、その測定結果を参照と比較する工程をさらに含む、[7]または[8]に記載の方法。
[10] ガスクロマトグラフィー−質量分析(GCMS)、液体クロマトグラフィー−質量分析(LC-MS)、キャピラリー電気泳動分析−質量分析(CE-MS)、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析(FT-ICR-MS)または高速液体クロマトグラフィー−質量分析(HPLC-MS)を用いて代謝物質の測定を行う、[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
細胞は肝癌細胞の株化細胞(HepG2)を使用した(ATCCより入手、ATCC登録番号HB-8065)。培地はDMEM培地に抗生物質、10%FBS、L-アラニルグルタミンを加えたものを使用した。肝癌細胞(HepG2)をEMT化誘導サイトカインBMP-9(R&D systems)で刺激することで、EMT化を誘導した(非特許文献3、Li Q et al. Cancer Sci. 2013)。細胞のEMT化の条件は50 ng/mLのBMP-9を培地に加え、3日間培養を行うというものであった。HepG2細胞のEMT化は、創傷治癒(Wound healing)法及び、アルカリホスファターゼ活性測定により確認した。
次に、以下の手順でEMT化した細胞の代謝物を調製した。具体的には、細胞内代謝物は培養細胞をPBSで培地を洗浄除去後回収し(細胞数は4 x 106であった)、80% MeOH(-80℃)を加えて超音波処理を行い、遠心分離した上清を回収することで抽出した。本操作は同じサンプルに対して、3回反復して行った。細胞外に分泌された培地中の代謝物は、培地(100μL)にMeOH(-80℃)(400 μL)を加え、ボルテックスで10分間激しく混合し、16,000 g、10分間遠心分離した上清を回収した。抽出したそれぞれの代謝物には内部標準物質として、2-イソプロピルリンゴ酸(1 μg)を各サンプルに加え、SpeedVacで遠心乾固し、測定するまで-80℃で保存した。
代謝物の測定はGCMSを用いるため、代謝物のトリメチルシリル誘導体化を行った。サンプルに20 μg/μLメトキシアミン塩酸塩(20 μL)(ピリジンに溶解)を加え、超音波でサンプルをよく分散させ、90分間37℃条件下で、12,000 rpmで振盪しながらインキュベートした。次に60 μLのMSTFA(GL Science)を加え、180分間37℃、12,000 rpmで振盪しながらインキュベートした。反応終了後、サンプルを16,000 gで10分間遠心分離し、上清をGCMS用の測定サンプルとした。
GCMSの測定データはデータ解析ソフトGCMSsolutionとNIST11、GCMS代謝成分データベース(島津製作所)を用いてピークを波形処理し、検出された代謝物の同定及び、定量を行った。有意差(p value)はStudent's t検定で計算した。
上記手順に従って調製した代謝物のGCMS分析を行い、BMP-9で刺激していないHepG2細胞とEMT化HepG2細胞とについて、細胞内及び細胞外分泌代謝物のスキャン分析を行った。その結果、細胞内代謝物のトータルイオンクロマトグラム(TIC)と細胞外代謝物のTICについて、それぞれ多数の特徴的なピークが観察された。GCMS分析で検出された主要ピークは細胞内代謝物で130ピーク、細胞外代謝物(培地成分を含む)で132ピークあった。検出されたピークのうち、NIST11及びGCMS代謝成分データベース(島津製作所)のEIスペクトルピークとの類似度が75以上の代謝物、約80種類を同定することができた。EMT化細胞とHepG2細胞の代謝物のスキャン及びSIMモードで測定し比較定量を行った結果、細胞内で栄養素をエネルギー源に変換するときに生成される一次代謝物、アミノ酸が、細胞のEMT化によって変化することが示唆された。
Claims (9)
- i)細胞の培養物から調製された代謝物質混合物中のセリンをガスクロマトグラフィー−質量分析(GCMS)を用いて測定する工程、およびii)測定結果を参照と比較する工程を含む、
該細胞が上皮間葉転換したものであるか否かを決定する方法、
ここで、測定された、細胞の培養物から調製された代謝物質混合物中のセリンが参照と比較して有意に低いことは、該細胞が上皮間葉転換したものであることの指標となる、前記方法。 - i)組織サンプルから調製された代謝物質混合物中のセリンをガスクロマトグラフィー−質量分析(GCMS)を用いて測定する工程、およびii)測定結果を参照と比較する工程を含む、該組織サンプルから上皮間葉転換した細胞が検出されるか否かを分析する方法、
ここで、測定された、組織サンプルから調製された代謝物質混合物中のセリンが参照と比較して有意に低いことは、該組織サンプルに上皮間葉転換した細胞が含まれることの指標となる、前記方法。 - 前記代謝物質混合物中のフェニルアラニンを測定し、その測定結果を参照と比較する工程をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記代謝物質混合物中のアスパラギン酸を測定し、その測定結果を参照と比較する工程をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記代謝物質混合物中のイソロイシン、バリン、ロイシン、アロイソロイシン、プロリン、トレオニン、4-ヒドロキシプロリン、システイン、グルタミン、d-グルコース、チロシン、β-D-マンノフラノシド、グリシン、アセチルアスパラギン酸、D-(-)-タガトース、フマル酸、アミノマロン酸、リンゴ酸、メチオニン、アスパラギン、クエン酸、グリセロール、L-プロリン、トリプトファンおよびコレステロールからなる群より選択される1以上の代謝物質を測定し、その測定結果を参照と比較する工程をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 上皮間葉転換した細胞について、さらにCD19、CD20、CD24(HSA)、CD38、CD44(PGP1)、CD90(THY1)、CD133(プロミニン1)、EpCAM(上皮細胞接着分子)、EカドヘリンおよびATP-結合カセットB5(ABCB5)からなる群より選択される1以上の遺伝子マーカーを調べることにより、前記上皮間葉転換した細胞が癌幹細胞であるか否かを決定する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 薬剤候補化合物のスクリーニング方法であって、以下の工程、
(a)癌細胞と薬剤候補化合物とを接触させた条件下で前記細胞を培養する工程、
(b)前記培養条件下で癌細胞の増殖が抑制されるまたは癌細胞の数が低減される場合、当該増殖の抑制された細胞または数が低減された細胞について、工程(a)により得られる細胞培養物から代謝物質混合物を調製し、該代謝物質混合物についてセリンをガスクロマトグラフィー−質量分析(GCMS)を用いて測定する工程、および
(c)測定結果を参照と比較する工程、
を含み、
ここで、測定された、細胞培養物からの代謝物質混合物中のセリンが参照と比較して有意に低いことは、該細胞培養物が上皮間葉転換した細胞を含むことの指標となり、
参照との比較により細胞培養物から上皮間葉転換した細胞が検出されないときは、薬剤候補化合物が癌細胞中の上皮間葉転換した細胞に作用するものであると決定する、前記スクリーニング方法。 - 前記代謝物質混合物中のフェニルアラニンを測定し、その測定結果を参照と比較する工程をさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記代謝物質混合物中のアスパラギン酸を測定し、その測定結果を参照と比較する工程をさらに含む、請求項7または8に記載の方法。
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