JP7044518B2 - 細胞集塊の突起形成能評価方法 - Google Patents
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Description
[1] 細胞集塊の突起形成能を評価する方法であって、
(a)蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程と、
(b)前記工程(a)において取得された平面断層画像を画像解析を用いて解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程と、
(c)前記工程(b)において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起部の形状を定量的に解析して突起形成能を評価する工程と、
を有し、
前記工程(a)において、焦点位置の異なる2枚以上の前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得し、
前記工程(b)において、前記工程(a)において取得した2枚以上の平面断層画像を重ね合わせることにより、前記細胞集塊の立体画像を構築し、当該立体画像を解析して前記細胞集塊を認識し、当該細胞集塊内に内接球を設け、当該内接球の直径を予め設定した閾値と比較し、前記細胞集塊の領域が突起部と球状領域のいずれかであるかを判別する
細胞集塊の突起形成能評価方法。
[2] 前記工程(c)において、前記細胞集塊の突起形成能を、当該細胞集塊に形成されている各突起の長さ、最大幅、又は枝分かれの有無に基づいて評価する、前記[1]の細胞集塊の突起形成能評価方法。
[3] 前記工程(c)において、前記細胞集塊の突起形成能を、当該細胞集塊に形成されている突起の本数、方向性、最大長、突起1本当たりの長さの平均値、及び突起1本当たりの枝分かれの本数の平均値からなる群より選択される1種以上に基づいて評価する、前記[1]の細胞集塊の突起形成能評価方法。
[4] 細胞集塊の突起形成能を評価する方法であって、
(a)蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程と、
(b)前記工程(a)において取得された平面断層画像を画像解析を用いて解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程と、
(c)前記工程(b)において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起部の形状を定量的に解析して突起形成能を評価する工程と、
を有し、
前記工程(c)において、前記細胞集塊の突起形成能を、当該細胞集塊の総体積と、当該細胞集塊の略球状の中心部の体積と、当該細胞集塊の突起部の体積とからなる群より選択される2種以上の体積の割合に基づいて評価する、
細胞集塊の突起形成能評価方法。
[5] 前記工程(a)において、焦点位置の異なる2枚以上の前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得し、
前記工程(b)において、前記工程(a)において取得した2枚以上の平面断層画像を重ね合わせることにより、前記細胞集塊の立体画像を構築し、当該立体画像を解析して前記細胞集塊の突起部を判別する、
前記[1]~[4]のいずれかの細胞集塊の突起形成能評価方法。
[6] 前記工程(a)において撮像される前記細胞集塊が、さらに、細胞骨格が蛍光標識された細胞集塊である、前記[1]~[5]のいずれかの細胞集塊の突起形成能評価方法。
[7] 前記工程(a)において撮像される前記細胞集塊が、さらに、核酸が蛍光標識されており、かつ前記工程(a)において、前記核酸から発される蛍光の平面断層画像も取得する、前記[1]~[6]のいずれかの細胞集塊の突起形成能評価方法。
[8] さらに、前記細胞集塊の核酸から発される蛍光の平面断層画像を解析して、前記細胞集塊を構成する各細胞の生死を判別する工程を有する、前記[7]の細胞集塊の突起形成能評価方法。
[9] 前記細胞集塊が、ゲルに包埋されている、前記[1]~[8]のいずれかの細胞集塊の突起形成能評価方法。
[10] 前記工程(a)における突起部が蛍光物質で標識された細胞集塊が、ゲルに包埋されている細胞集塊を外部から刺激した後に、当該細胞集塊に形成された突起部を蛍光物質で標識したものであり、
前記細胞集塊を外部から刺激した状態における突起形成能を評価する、前記[9]の細胞集塊の突起形成能評価方法。
[11] 前記外部からの刺激が、生理活性物質であり、
前記工程(a)において撮像される前記細胞集塊が、生理活性物質を接触させた後に形成された突起部を蛍光物質で標識した細胞集塊である、前記[10]の細胞集塊の突起形成能評価方法。
[12] 前記生理活性物質が、抗がん剤である、前記[11]の細胞集塊の突起形成能評価方法。
[13] 前記外部からの刺激が、非電離放射線又は電離放射線であり、
前記工程(a)において撮像される前記細胞集塊が、ゲルに包埋されている細胞集塊の少なくとも一部に非電離放射線又は電離放射線を照射した後に、当該細胞集塊に形成された突起部を蛍光物質で標識したものである、前記[10]の細胞集塊の突起形成能評価方法。
[14] 細胞集塊の突起形成能を評価する方法であって、
(a)蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程と、
(b)前記工程(a)において取得された平面断層画像を画像解析を用いて解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程と、
(c)前記工程(b)において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起部の形状を定量的に解析して突起形成能を評価する工程と、
を有し、
前記工程(c)において、前記細胞集塊の突起形成能を、当該細胞集塊の総体積と、当該細胞集塊の略球状の中心部の体積との割合に基づいて評価する、細胞集塊の突起形成能評価方法。
[15] 細胞集塊の突起形成能を評価する方法であって、
(a)蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程と、
(b)前記工程(a)において取得された平面断層画像を画像解析を用いて解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程と、
(c)前記工程(b)において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起部の形状を定量的に解析して突起形成能を評価する工程と、
を有し、
前記工程(c)において、前記細胞集塊の突起形成能を、前記突起部の体積と、当該細胞集塊の略球状の中心部の体積との割合に基づいて評価する、細胞集塊の突起形成能評価方法。
[16] 細胞集塊の突起形成能を評価する方法であって、
(a)蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程と、
(b)前記工程(a)において取得された平面断層画像を画像解析を用いて解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程と、
(c)前記工程(b)において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起部の形状を定量的に解析して突起形成能を評価する工程と、
を有し、
前記工程(c)において、前記細胞集塊の突起形成能を、前記突起部の体積と、当該細胞集塊の総体積との割合に基づいて評価する、細胞集塊の突起形成能評価方法。
(a)蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程。
(b)前記工程(a)において取得された平面断層画像を解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程。
(c)前記工程(b)において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起形成能を評価する工程。
がん細胞の細胞集塊に対して、各種抗がん剤で処理した後の突起形成能を調べた。がん細胞としては、ヒト乳がん細胞から樹立された培養細胞株MDA-MB231細胞を用いた。MDA-MB231細胞の培養は、10%FBS含有DMEMを培養培地とし、37℃、5容量%CO2環境下で行った。
抗がん剤は、L-Sulforaphane(Sigma社製)、Batimastat(Sigma社製)、MitomycinC(Wako社製)、Paclitaxel(Wako社製)、及びStaurosporine(Wako社製)の5種を用いた。
培養培地に、2000個のMDA-MB231細胞と、5μLの10×Spheroid Formation ECM」(Trevigen社製)を混合して、最終量が50μLになるようにDMEM(phenol red free)で調整したがん細胞溶液を、スフェロイド形成用U底プレート「PrimeSurface(登録商標)Uプレート」(住友ベークライト社製)の各ウェルに、1ウェル当たり50μLずつ注入した後、72時間培養し、細胞集塊(スフェロイド)を形成させた。
細胞集塊を包埋したゲル上に、L-Sulforaphane(終濃度10μM)、Batimastat(終濃度4μM)、MitomycinC(終濃度10μM)、Paclitaxel(終濃度4μM)、又はStaurosporine(終濃度1μM)を含有する培養培地を100μL添加し、さらに、「Nuclear ID green/ red生死判定試薬」(ENZO社製)を0.1μL(培養培地の1/1000量)添加した上で、48時間培養し、浸潤させた。添加した生死判定試薬により、生細胞は赤蛍光、死細胞は緑蛍光に染色された。抗がん剤を添加しない以外は同様にして、生死判定試薬のみを含有する培養培地で培養したものを対照とした。
生死判定試薬を添加しない以外は<抗がん剤処理と生死判定>と同様にして、各種抗がん剤を含む培養培地でゲルに包埋された細胞集塊を48時間培養した。その後、ゲルを吸わないように培養培地のみを吸引除去した後、ゲルの上に4% パラホルムアルデヒド溶液を150μL添加し、室温で30分間静置して細胞集塊を固定した。固定された細胞集塊をPBS(-)で1回洗浄した後、0.1% Triton X-100/PBSを150μL添加して室温で1時間透過処理を行った。透過処理後の細胞集塊をPBS(-)で1回洗浄した後、アクチン染色のためにActistain670(Cytoskeleton社製)をPBSで100倍希釈したものを添加し、4℃で一晩反応させた。
<抗がん剤処理と生死判定>及び<抗がん剤処理とアクチン染色>で調製した蛍光標識サンプルを、共焦点レーザー顕微鏡「FV1200」(オリンパス社製)で撮像した。20倍対物レンズ(LUCPLFLN×20)で、Zスライス2μmで撮像した。合計Zスライス枚数は、60~100枚であった。
それぞれの蛍光標識サンプルに対して撮像された一連の平面断層画像群を重ね合わせて立体画像を構築した。得られた立体画像に対して、二値化処理し、二値化画像を得た。
生死判定試薬処理した蛍光標識サンプルから得られた二値化画像について、赤蛍光の細胞核と緑蛍光の細胞核の数を計測した。定量結果を表1に示す。この結果、抗がん剤未処理サンプルでは、死細胞は少なかったのに対して、Batimastat処理サンプルでは死細胞が全体の24%程度で抗がん剤未処理の場合よりも多く、Staurosporine処理サンプルでは死細胞が70%程度と非常に多かった。これらの結果は、BatimastatとStaurosporineの抗がん効果によって細胞死が誘導されたことを意味し、MDA-MB231細胞は、BatimastatとStaurosporineに対して感受性であること、BatimastatよりもStaurosporineに対する感受性の方が高いことが示された。
アクチン染色した蛍光標識サンプルから得られた二値化画像を、一画像に細胞集塊全体が収まる程度に縮小した画像を、突起部解析用画像とした。この突起部解析用画像中の蛍光標識された領域を、細胞集塊領域として認識し、この細胞集塊領域に、境界に内接する球のうち、半径が最大となる内接球を重ならないようにして設け、複数の半径が最大となる内接球を得た。設定された各内接球の外部に位置するそれぞれの点を、最も近い内接球の領域に含まれるように各内接球を含む領域を分割して球状領域を設定した。内接球の直径の閾値を、細胞2~3個のサイズ相当である50μmに設定しておき、この閾値未満である球状領域を突起部として分割し、当該閾値以上である球状領域を突起部以外の領域(非突起部)として分割した。
分割された突起部と非突起部の体積に基づいて、中心球体積比を算出した。具体的には、中心球体積比は、[非突起部の体積(ボクセル)]/([突起部の体積(ボクセル)]+[非突起部の体積(ボクセル)])で算出した。算出した結果を図3に示す。図中、「Ctrl」は抗がん剤未処理サンプルを、「bb」はBatimastat処理サンプルを、「mytC」はMitomycinC処理サンプルを、「pac」はPaclitaxel処理サンプルを、「sts」はStaurosporine処理サンプルを、「sul」はL-Sulforaphane処理サンプルを、それぞれ示す。この結果、抗がん剤未処理サンプルでは中心球体積比は小さく、突起が多く形成されていた。これに対して、抗がん剤処理サンプルではいずれも中心球体積比は抗がん剤未処理サンプルよりも大きく、形成される突起が少なかったことが定量的に求められた。特に、MitomycinC処理サンプルとBatimastat処理サンプルは、残る3種の抗がん剤処理サンプルよりも中心球体積比が高く、突起形成がより強く抑制されていた。これらの結果から、これら5種の抗がん剤で処理したMDA-MB231細胞は、未処理の場合よりも突起形成能が低下すると評価された。つまり、MDA-MB231細胞は、これら5種の抗がん剤により突起形成能が低下しており、これら5種の抗がん剤全てに対して感受性であること、特にMitomycinCとBatimastatに対する感受性が高いことがわかった。
アクチン染色した蛍光標識サンプルから取得された一連の平面断層画像群のうち、Z軸方向に対して下部、中心部、上部の3枚を選択し、それぞれの平面断層画像に基づいて突起部を判別し、分割された突起部と非突起部の体積に基づいて、中心球体積比を算出した。算出した結果を図4に示す。各抗がん剤処理サンプルの3本のカラムのうち、左側のカラムが細胞集塊の下部の平面断層画像からの結果、真ん中のカラムが細胞集塊の中心部の平面断層画像からの結果、右側のカラムが細胞集塊の上部の平面断層画像からの結果、である。この結果、立体画像に基づいた結果と同様に、抗がん剤未処理サンプルよりも抗がん剤処理サンプルのほうが中心球体積比が大きく、形成される突起が少ないという傾向が観察された。ただし、測定値のばらつき(標準偏差)が大きく、また断面の位置ごとに中心球体積比が大きく異なっており、かつ、抗がん剤未処理サンプルと抗がん剤処理サンプルの差も大分小さかった。これらの結果から、平面断層画像に基づくよりも立体画像に基づくほうが、信頼性の高い評価結果が得られることが明らかである。
Claims (16)
- 細胞集塊の突起形成能を評価する方法であって、
(a)蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程と、
(b)前記工程(a)において取得された平面断層画像を画像解析を用いて解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程と、
(c)前記工程(b)において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起部の形状を定量的に解析して突起形成能を評価する工程と、
を有し、
前記工程(a)において、焦点位置の異なる2枚以上の前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得し、
前記工程(b)において、前記工程(a)において取得した2枚以上の平面断層画像を重ね合わせることにより、前記細胞集塊の立体画像を構築し、当該立体画像を解析して前記細胞集塊を認識し、当該細胞集塊内に内接球を設け、当該内接球の直径を予め設定した閾値と比較し、前記細胞集塊の領域が突起部と球状領域のいずれかであるかを判別する、
細胞集塊の突起形成能評価方法。 - 前記工程(c)において、前記細胞集塊の突起形成能を、当該細胞集塊に形成されている各突起の長さ、最大幅、又は枝分かれの有無に基づいて評価する、請求項1に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
- 前記工程(c)において、前記細胞集塊の突起形成能を、当該細胞集塊に形成されている突起の本数、方向性、最大長、突起1本当たりの長さの平均値、及び突起1本当たりの枝分かれの本数の平均値からなる群より選択される1種以上に基づいて評価する、請求項1に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
- 細胞集塊の突起形成能を評価する方法であって、
(a)蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程と、
(b)前記工程(a)において取得された平面断層画像を画像解析を用いて解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程と、
(c)前記工程(b)において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起部の形状を定量的に解析して突起形成能を評価する工程と、
を有し、
前記工程(c)において、前記細胞集塊の突起形成能を、当該細胞集塊の総体積と、当該細胞集塊の略球状の中心部の体積と、当該細胞集塊の突起部の体積とからなる群より選択される2種以上の体積の割合に基づいて評価する、
細胞集塊の突起形成能評価方法。 - 前記工程(a)において、焦点位置の異なる2枚以上の前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得し、
前記工程(b)において、前記工程(a)において取得した2枚以上の平面断層画像を重ね合わせることにより、前記細胞集塊の立体画像を構築し、当該立体画像を解析して前記細胞集塊の突起部を判別する、
請求項1~4のいずれか一項に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。 - 前記工程(a)において撮像される前記細胞集塊が、さらに、細胞骨格が蛍光標識された細胞集塊である、請求項1~5のいずれか一項に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
- 前記工程(a)において撮像される前記細胞集塊が、さらに、核酸が蛍光標識されており、かつ前記工程(a)において、前記核酸から発される蛍光の平面断層画像も取得する、請求項1~6のいずれか一項に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
- さらに、前記核酸から発される蛍光の平面断層画像を解析して、前記細胞集塊を構成する各細胞の生死を判別する工程を有する、請求項7に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
- 前記細胞集塊が、ゲルに包埋されている、請求項1~8のいずれか一項に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
- 前記工程(a)における突起部が蛍光物質で標識された細胞集塊が、ゲルに包埋されている細胞集塊を外部から刺激した後に、当該細胞集塊に形成された突起部を蛍光物質で標識したものであり、
前記細胞集塊を外部から刺激した状態における突起形成能を評価する、請求項9に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。 - 前記外部からの刺激が、生理活性物質であり、
前記工程(a)において撮像される前記細胞集塊が、生理活性物質を接触させた後に形成された突起部を蛍光物質で標識した細胞集塊である、請求項10に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。 - 前記生理活性物質が、抗がん剤である、請求項11に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
- 前記外部からの刺激が、非電離放射線又は電離放射線であり、
前記工程(a)において撮像される前記細胞集塊が、ゲルに包埋されている細胞集塊の少なくとも一部に非電離放射線又は電離放射線を照射した後に、当該細胞集塊に形成された突起部を蛍光物質で標識したものである、請求項10に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。 - 細胞集塊の突起形成能を評価する方法であって、
(a)蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程と、
(b)前記工程(a)において取得された平面断層画像を画像解析を用いて解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程と、
(c)前記工程(b)において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起部の形状を定量的に解析して突起形成能を評価する工程と、
を有し、
前記工程(c)において、前記細胞集塊の突起形成能を、当該細胞集塊の総体積と、当該細胞集塊の略球状の中心部の体積との割合に基づいて評価する、細胞集塊の突起形成能評価方法。 - 細胞集塊の突起形成能を評価する方法であって、
(a)蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程と、
(b)前記工程(a)において取得された平面断層画像を画像解析を用いて解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程と、
(c)前記工程(b)において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起部の形状を定量的に解析して突起形成能を評価する工程と、
を有し、
前記工程(c)において、前記細胞集塊の突起形成能を、前記突起部の体積と、当該細胞集塊の略球状の中心部の体積との割合に基づいて評価する、細胞集塊の突起形成能評価方法。 - 細胞集塊の突起形成能を評価する方法であって、
(a)蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程と、
(b)前記工程(a)において取得された平面断層画像を画像解析を用いて解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程と、
(c)前記工程(b)において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起部の形状を定量的に解析して突起形成能を評価する工程と、
を有し、
前記工程(c)において、前記細胞集塊の突起形成能を、前記突起部の体積と、当該細胞集塊の総体積との割合に基づいて評価する、細胞集塊の突起形成能評価方法。
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