JP5307426B2 - 補体活性検査方法 - Google Patents
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オリバー・マンチェスら(Oliver Manches et al.)、ブラッド(Blood)、第101巻、第3号、第949〜954ページ、2003年 ジェームズ・M・フォーランら(James M. Foran et al.)、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー(British Journal of Hematology)、第114巻、第881ページ、2001年 アダム・D/ケネディら(et al.)、ジャーナル・オブ・イミュノロジー(Journal of Immunology)、第172巻、第3280〜3288ページ、2004年
(1)抗体医薬により誘導される補体活性を光学顕微鏡又はイメージングサイトメーターを用いて検査する方法であって、(a)細胞培養容器内に、抗体医薬に対する抗原を発現している標的培養細胞と、前記抗体医薬に対する抗原を発現していない対照培養細胞と、蛍光物質で標識した抗体医薬を添加して培養する工程と、(d)前記工程(a)の後、前記細胞培養容器内の細胞ごとに、前記蛍光物質で標識した抗体医薬の結合の有無により前記標的培養細胞か前記対照培養細胞かの識別と生死の判定を行う工程と、(b)前記工程(d)の後、前記細胞培養容器内に、検査対象者由来の補体含有物を添加する工程と、(c)前記工程(b)の後、前記工程(d)において生死を判定した細胞培養容器内の標的培養細胞において、細胞ごとに生死を判定し、前記工程(d)において生細胞であり、前記工程(b)の後に死細胞となった細胞数を計数する工程と、を有し、前記工程(c)が、(c2−1)前記工程(b)の後、前記工程(d)において生死を判定した細胞培養容器内の標的培養細胞において、細胞ごとに生死を判定し、死細胞の割合を求める工程と、(c2−2)前記工程(b)の後、前記工程(d)において生死を判定した細胞培養容器内の対照培養細胞において、細胞ごとに生死を判定し、死細胞の割合を求める工程と、(c2−3)前記工程(c2−2)により求められた対照培養細胞における死細胞の割合を考慮して、前記工程(c2−1)により求められた標的培養細胞における死細胞の割合に基づいて前記補体含有物の補体活性を評価する工程と、であることを特徴とする補体活性検査方法、
(2)細胞の生死を、染色試薬を前記細胞培養容器内に添加し、細胞染色の有無により判定することを特徴とする前記(1)記載の補体活性検査方法、
(3)前記染色試薬が核染色試薬であることを特徴とする前記(2)記載の補体活性検査方法、
(4)前記標的培養細胞が、人工的にヒトCD20遺伝子を導入し、発現させたCD20陽性細胞であることを特徴とする前記(1)〜(3)のいずれか記載の補体活性検査方法、
(5)前記工程(a)において、前記染色試薬を前記細胞培養容器内に、あらかじめ添加することを特徴とする前記(2)〜(4)のいずれか記載の補体活性検査方法、
(6)前記染色試薬が、生細胞のみ又は死細胞のみを選択的に染色し得る試薬であることを特徴とする前記(2)〜(5)のいずれか記載の補体活性検査方法、
(7)前記細胞培養容器は、光学的観察に適した培養容器であることを特徴とする前記(1)〜(6)のいずれか記載の補体活性検査方法、
(8)前記細胞培養容器にミネラルオイルを添加して、培養培地の蒸発を抑制しつつ培養することを特徴とする前記(1)〜(7)のいずれか記載の補体活性検査方法、
を、提供するものである。
まず、工程(a)として、細胞培養容器内に、抗体医薬に対する抗原を発現している標的培養細胞と、抗体医薬を添加して培養する。標的培養細胞と抗体医薬は、細胞培養容器内へ同時に添加してもよく、該細胞培養容器内で予め標的培養細胞を培養し、その後抗体医薬を添加してもよい。例えば、培養培地に、標的培養細胞と抗体医薬を添加した培養物を、細胞培養容器内へ添加してもよい。また、標的培養細胞を、予め細胞培養容器内で培養後、抗体医薬を添加してもよい。これにより、細胞培養容器内の標的培養細胞に、細胞表面に発現している抗原を介して抗体医薬を結合させ、感作標的培養細胞とすることができる。
その他、MTTアッセイ等のように、生細胞が有する酵素活性を利用して、細胞培養容器内の全生細胞による酵素反応量を、プレートリーダー等を用いて測定し、該測定結果に基づき、死細胞の割合を求める方法等もある。例えば、補体含有物を添加しなかった場合の酵素反応量に対する、補体含有物を添加した場合の酵素反応量の割合が生細胞の割合率となり、1からこの生細胞の比率を引いた値が死細胞の割合となる。
さらに、工程(a)において、同時にHoechst33342に代表されるような生細胞染色色素を添加しておくことにより、イメージングサイトメーターによる細胞の認識を容易にすることも可能である。
式(1)・・・ CDC効率(%)=(D−B)/A×100
抗体医薬としてリツキシマブを、標的培養細胞としてCD20陽性細胞であるRaji細胞をそれぞれ用いて、健常者ボランティア6名から提供された凍結血清(No.1〜No.6)の補体活性を検査した。リツキシマブは、Roche社のリツキサンを用いた。
具体的には、5μg/mLとなるようにPI(Dojin社製)を、さらに10μg/mLとなるようにリツキシマブを加えたフェノールレッド非含有RPMI1640培地(インビトロジェン社製)に、常法により培養されたRaji細胞を懸濁し、6×104個/100μLとなるように細胞懸濁液を調製した。次に、100μLの該細胞懸濁液を、ガラスボトムディッシュD1111000(松浪硝子工業社製)のガラスボトムディッシュ中央部(ガラス部分)に投入した。
このガラスボトムディッシュを、ステージインキュベータシステムMI−IBC/OLYMPUS・GM2000(東海ヒット社製)を搭載したレーザー共焦点顕微鏡FV1000(OLYMPUS社製)上に設置し、PI蛍光染色像及び透過光像を撮影し、生細胞数(A1)と死細胞数(B1)をそれぞれカウントした。
続いて、10μLの溶解した各凍結血清を、それぞれ、細胞をなるべく動かさないように静かに、ステージインキュベータ中の細胞懸濁液に添加し、10分間静置した。その後、PI蛍光染色像及び透過光像を撮影し、生細胞数(C1)と死細胞数(D1)をそれぞれカウントした。得られた細胞数を用いて、下記の式よりそれぞれのCDC効率を算出した。
CDC効率(%) = (D1−B1)/A1×100
標的培養細胞としてRaji細胞に代えてDaudi細胞を用いたこと、及び、実施例1で用いた6種の凍結血清のうち、No.1、4〜6の4種を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、凍結血清の補体活性を検査した。
図2は、各凍結血清(No.1、4〜6)に対して、独立した3回の試行の結果算出されたCDC効率を示した図である。これらの結果から明らかであるように、抗体医薬としてリツキシマブを、標的培養細胞としてRaji細胞を、それぞれ用いて、本発明の補体活性検査方法を行うことにより、血清中の補体活性を検出することができる。
ここで、患者由来の補体の活性は、健常者由来の補体よりも低くなっていることが予想される。したがって、健常者由来の補体含有物を用いた場合に、CDC効率が80%以上、好ましくは90%以上と高く、また標準偏差(SD)が10%以下、好ましくは5%以下となるような培養細胞は、抗体医薬投与対象者の補体活性が健常者より低い場合に、その差を明確に示すことに有効であり、このような培養細胞を標的培養細胞として用いることにより、抗体医薬投与対象者の補体活性をより適正に評価し得る。
実施例1で用いた凍結血清No.1を室温又は氷上で保存した後のCDC効率を求めた。
具体的には、凍結血清No.1を、室温で2、5、11時間、氷上で0、3、6、10時間、それぞれ保存した後、抗体医薬としてリツキシマブを、標的培養細胞としてDaudi細胞をそれぞれ用いて、実施例1と同様にしてCDC効率を算出した。
図3は、各保存処理後の血清に対して、独立した3回の試行の結果算出されたCDC効率を示した図である。図中「◆」が室温保存した血清の結果であり、「□」が氷上保存した血清の結果である。この結果、室温保存した血清では、保存時間依存的にCDC効率が低下していたが、氷上保存した血清では、3〜10時間の保存時間においてCDC効率に大きな変化は観察されなかった。
これらの結果は、血清等の補体含有物の取り扱いは室温よりも氷上で行うことが好ましいという見解と合致する。したがって、これらの結果から、本発明の補体活性検査方法が、適正に補体活性を検査し得ること、及び、本発明の補体活性検査方法を用いることにより、補体含有物の保存条件の補体活性に対する影響を評価し得ることが明らかである。
実施例1で用いた凍結血清No.1の凍結再融解後のCDC効率を求めた。
具体的には、凍結血清No.1を、1〜4回凍結再融解を繰り返した後、抗体医薬としてリツキシマブを、標的培養細胞としてDaudi細胞をそれぞれ用いて、実施例1と同様にしてCDC効率を算出した。
図4は、各回数の凍結再融解後の血清に対して、独立した3回の試行の結果算出されたCDC効率を示した図である。この結果、凍結再融解を繰り返す回数依存的にCDC効率が低下することが観察された。
これらの結果は、血清等の生体試料中の補体活性は、凍結融解処理を繰り返すことにより低下し易いという見解と合致する。したがって、これらの結果から、本発明の補体活性検査方法が、適正に補体活性を検査し得ること、及び、本発明の補体活性検査方法を用いることにより、補体含有物の凍結融解処理の補体活性に対する影響を評価し得ることが明らかである。
Claims (8)
- 抗体医薬により誘導される補体活性を光学顕微鏡又はイメージングサイトメーターを用いて検査する方法であって、
(a)細胞培養容器内に、抗体医薬に対する抗原を発現している標的培養細胞と、前記抗体医薬に対する抗原を発現していない対照培養細胞と、蛍光物質で標識した抗体医薬を添加して培養する工程と、
(d)前記工程(a)の後、前記細胞培養容器内の細胞ごとに、前記蛍光物質で標識した抗体医薬の結合の有無により前記標的培養細胞か前記対照培養細胞かの識別と生死の判定を行う工程と、
(b)前記工程(d)の後、前記細胞培養容器内に、検査対象者由来の補体含有物を添加する工程と、
(c)前記工程(b)の後、前記工程(d)において生死を判定した細胞培養容器内の標的培養細胞において、細胞ごとに生死を判定し、前記工程(d)において生細胞であり、前記工程(b)の後に死細胞となった細胞数を計数する工程と、
を有し、
前記工程(c)が、
(c2−1)前記工程(b)の後、前記工程(d)において生死を判定した細胞培養容器内の標的培養細胞において、細胞ごとに生死を判定し、死細胞の割合を求める工程と、
(c2−2)前記工程(b)の後、前記工程(d)において生死を判定した細胞培養容器内の対照培養細胞において、細胞ごとに生死を判定し、死細胞の割合を求める工程と、
(c2−3)前記工程(c2−2)により求められた対照培養細胞における死細胞の割合を考慮して、前記工程(c2−1)により求められた標的培養細胞における死細胞の割合に基づいて前記補体含有物の補体活性を評価する工程と、
であることを特徴とする補体活性検査方法。 - 細胞の生死を、染色試薬を前記細胞培養容器内に添加し、細胞染色の有無により判定することを特徴とする請求項1に記載の補体活性検査方法。
- 前記染色試薬が核染色試薬であることを特徴とする請求項2記載の補体活性検査方法。
- 前記標的培養細胞が、人工的にヒトCD20遺伝子を導入し、発現させたCD20陽性細胞であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の補体活性検査方法。
- 前記工程(a)において、前記染色試薬を前記細胞培養容器内に、あらかじめ添加することを特徴とする請求項2〜4のいずれか一項に記載の補体活性検査方法。
- 前記染色試薬が、生細胞のみ又は死細胞のみを選択的に染色し得る試薬であることを特徴とする請求項2〜5のいずれか一項に記載の補体活性検査方法。
- 前記細胞培養容器は、光学的観察に適した培養容器であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載の補体活性検査方法。
- 前記細胞培養容器にミネラルオイルを添加して、培養培地の蒸発を抑制しつつ培養することを特徴とする請求項1〜7のいずれか一項に記載の補体活性検査方法。
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