JP7368678B1 - Ｃｄ４＋ｔ細胞集団中の特定の細胞亜集団の相対量の測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中の特定の細胞亜集団の相対量をより効率的に測定する方法およびそのためのキットを提供する。【解決手段】本発明は、被験体由来のサンプル中のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋細胞亜集団の相対量の決定方法であって、 前記ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＸＣＲ３－細胞亜集団を選択する工程と、前記ＣＸＣＲ３－細胞亜集団において、ＣＣＲ４－細胞亜集団とＣＣＲ４＋細胞亜集団との境界を設定する工程と、前記境界を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋細胞亜集団の相対量を測定する工程とを包含する、方法を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中の医学的に重要な細胞亜集団の相対量の測定に関する。

ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中には、いくつかの医学的に重要な細胞集団が存在することが知られている。例えば、ＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ細胞亜集団や、ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋細胞亜集団の相対量は、特に癌治療への応答性のために有用な、医学的に重要な細胞亜集団である（特許文献１、特許文献２）。

これらの細胞亜集団は、典型的には、末梢血を８ｍｌ以上採血し、採血した場所で遠心機等を用いて実験的な手技を持つ人がＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）まで分離して凍結してから、その凍結細胞を測定機関に輸送し、輸送後に必要に応じて保管した後に、培養して染色し、ＦＡＣＳ測定が行われることによって分離される。

国際公開第２０１８／１４７２９１号 国際公開第２０２２／０５４７９６号

本発明は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中の特定の細胞亜集団の相対量をより効率的に測定する方法およびそのためのキットを提供することを課題とする。

本発明者らは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋細胞亜集団の相対量を測定するために、まずＣＸＣＲ３^＋／^－の細胞群を分離することが有利であることを見出した。

本発明者らはまた、全血サンプルによって首尾よくＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中の特定の細胞亜集団の相対量を測定するための、好ましいサンプルの保管条件を見出した。

本発明は例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体由来のサンプル中のＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋細胞亜集団の相対量の決定方法であって、
前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中のＣＸＣＲ３^－細胞亜集団を選択する工程と、
前記ＣＸＣＲ３^－細胞亜集団において、ＣＣＲ４^－細胞亜集団とＣＣＲ４^＋細胞亜集団との境界を設定する工程と、
前記境界を用いて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋細胞亜集団の相対量を測定する工程と
を包含する、方法。
（項目２）
前記サンプルは前記被験体の末梢血の全血サンプルまたは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）サンプルである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記サンプルは全血サンプルである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記サンプルは、前記被験体からの採取後１日以上保管されたものである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記サンプルは、前記被験体からの採取後１日～６日保管されたものである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記サンプルは、前記被験体からの採取後１日～３日保管されたものである、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記サンプルは、約１０℃～約４０℃で保管されたものである、項目４に記載の方法。
（項目８）
前記サンプルは、約１２℃～約２５℃で保管されたものである、項目４に記載の方法。
（項目９）
前記サンプルは、約１０μｌ～約５００μｌである、項目３に記載の方法。
（項目１０）
被験体由来のサンプル中のＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋細胞亜集団の相対量の決定方法であって、
前記被験体の全血サンプルを用意する工程と、
前記全血サンプルのＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋細胞亜集団の相対量を測定する工程と
を包含する、方法。
（項目１１）
前記サンプルは、前記被験体からの採取後１日以上保管されたものである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記サンプルは、前記被験体からの採取後１日～６日保管されたものである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記サンプルは、前記被験体からの採取後１日～３日保管されたものである、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記サンプルは、約１０℃～約４０℃で保管されたものである、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記サンプルは、約１２℃～約２５℃で保管されたものである、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記サンプルは、約１０μｌ～約５００μｌである、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
ＣＤ４に対する検出剤、ＣＣＲ４に対する検出剤、およびＣＣＲ６に対する検出剤を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキット。
（項目１８）
ＣＸＣＲ３に対する検出剤をさらに含む、項目１７に記載のキット。
（項目１９）
前記検出剤が抗体である、項目１６に記載のキット。

本発明によれば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中の医学的に重要な細胞亜集団（例えば、ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋細胞亜集団またはＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ細胞亜集団）のより正確な測定が可能になる。

また、採血する場所が限られる問題（遠心機等があって手技のある人がいる）、およびＰＢＭＣまでの分離の上手な人材・機関とそうでないところの差が大きいという問題が解決され、採血場所での手間なく施設間で変動の少ないサンプル取得が可能になる。

図１は、全血およびＰＢＭＣのＣＸＣＲ３ヒストグラムとＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６の散布図を示す。 図２は、全血の保存期間を変えた場合のＣＸＣＲ３ヒストグラムとＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６散布図を示す。 図３は、温度、日数を変えて保存した場合のＣＤ４ ｖｓ ＣＤ８の散布図を示す。 図４は、温度、日数を変えて保存した場合のＣＤ４^＋細胞に対するＣＤ６２Ｌのヒストグラムを示す。 図５は、温度、日数を変えて保存した場合のＣＤ８^＋細胞に対するＣＤ６２Ｌのヒストグラムを示す。 図６は、温度、日数を変えて保存した場合のＴｈ７Ｒを示す。 図７は、温度、日数を変えて保存した場合のＣＤ４^＋細胞についてのＣＣＲ７とＣＤ４５ＲＡの散布図を示す。 図８は、温度、日数を変えて保存した場合のＣＤ８^＋細胞についてのＣＣＲ７とＣＤ４５ＲＡの散布図を示す。 図９は、全血、および保存全血からＰＢＭＣ分離して凍結保存後に測定したものの比較を示す。 図１０は、ＣＤ４^＋細胞のＣＣＲ４、ＣＣＲ６、およびＣＸＣＲ３の発現を保存方法ごとに比較した図を示す。 図１１Ａは、ＣＤ４^＋細胞についてのＣＣＲ６ ｖｓ ＣＣＲ４散布図を示し、ゲートは示していない。 図１１Ｂは、ＣＤ４^＋ＣＸＣＲ３^－細胞についてのＣＣＲ６ ｖｓ ＣＣＲ４散布図を示し、ゲートは示していない。 図１１Ｃは、ＣＤ４^＋細胞についてのＣＣＲ６ ｖｓ ＣＣＲ４散布図を示し、ゲートも示している。 図１１Ｄは、ＣＤ４^＋ＣＸＣＲ３^－細胞についてのＣＣＲ６ ｖｓ ＣＣＲ４散布図を示し、ゲートも示している。 図１２は、自己微量採血検体のＷＢ ｐａｎｅｌ３染色の結果を示す。 図１３は、ヒトＣＤ４ Ｔ細胞のＴｈ分化を表す模式図である。 図１４は、末梢血ＣＤ４^＋Ｔ細胞クラスターと、各区画に発現しているケモカインレセプターを表す模式図である。

以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。

本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。

本明細書において、「バイオマーカー」とは、通常の生物学的過程、病理学的過程、もしくは治療的介入に対する薬理学的応答の指標として、客観的に測定され評価される特性をいう。

本明細書において「がん」または「癌」は、互換可能に用いられ、異型性が強く、増殖が正常細胞より速く、周囲組織に破壊性に浸潤し得あるいは転移をおこし得る悪性腫瘍またはそのような悪性腫瘍が存在する状態をいう。本発明においては、癌は固形癌および造血器腫瘍を含み、例えば非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎癌、ホジキン病、頭頸部癌、乳癌、胃癌、悪性黒色腫、大腸癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、消化管間質腫瘍、膵神経内分泌種腫瘍、皮膚癌などを含むがそれらに限定されない。

本明細書において、「がん免疫療法」または「癌免疫療法」とは、生物の有する免疫機構などの生体防御機構を用いて癌を治療する方法をいう。

本明細書において、「抗腫瘍免疫応答」とは、生体内の腫瘍に対する任意の免疫応答をいう。

本明細書において、「相関」するとは、２つの事象が統計学的に有意な相関関係を有することをいう。例えば、「Ａと相関するＢの相対量」とは、事象Ａが発生した場合に、Ｂの相対量が統計学的に有意に影響を受ける（例えば、増加ないし減少すること）ことをいう。

本明細書において、「細胞亜集団」とは、多様な特性の細胞を含む細胞集団中の、何らかの共通する特徴を有する任意の細胞の集合を指す。特定の名称が当技術分野で知られているものについては、かかる用語を用いて特定の細胞亜集団に言及することもでき、任意の性質（例えば、細胞表面マーカーの発現）を記載して特定の細胞亜集団に言及することもできる。

本明細書において、細胞に関する用語「相対量」は、「割合」と互換可能に使用される。代表的には、用語「相対量」および「割合」は、特定の細胞集団（例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団）を形成する細胞の数に対する、所期の細胞亜集団（例えば、ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋細胞亜集団）を形成する細胞の数を意味する。

本明細書において、「相対値」とは、ある値について、他の値を比較の対象として算出される値をいう。

本明細書において使用される場合、用語「検出剤」とは、広義には、目的の物質（例えば、細胞表面マーカーなど）を検出できるあらゆる因子をいう。

本明細書において、ある細胞亜集団の「量」とは、ある細胞の絶対数と、細胞集団における割合の相対量とを包含する。

本明細書において「フローサイトメトリー」とは、液体中に懸濁する細胞、個体およびその他の生物粒子の粒子数、個々の物理的・化学的・生物学的性状を計測する技術をいう。フローサイトメトリーの結果は、代表的には、ＦＳＣをＸ軸に、ＳＳＣをＹ軸にとったドットプロットとして表現され得る。各細胞は図の中の一つのドット（点）で示されており、それらの位置は、ＦＳＣとＳＳＣとの相対値によって決められる。比較的サイズが小さく内部構造が単純なリンパ球は左下部に、サイズが大きく内部に顆粒を持つ顆粒球は右上部に、またサイズは大きいが内部構造が単純な単球はリンパ球と顆粒球の間に、それぞれお互いに分離した集団を作って表示される。またフローサイトメトリーの結果は、ヒストグラムやドットプロットなどで表すことができる。

本明細書において「被験体」とは、任意の動物であり得、典型的には哺乳動物である。哺乳動物は、限定しないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。特定の実施態様において、被験体はヒトである。

本明細書において、「癌治療」とは、癌患者に対して腫瘍を除去または縮小させるために行われる任意の治療を指し、がん免疫療法、放射線療法、分子標的薬治療、外科的手術、細胞移入、またはこれらの治療の任意の組み合わせなどを含むがこれらに限られるものではない。

（Ｔｈ７Ｒ）
本明細書において、「エフェクター細胞」とは、抗原刺激を受けていないナイーブ細胞が分化して実際に免疫に関わる働きを得た免疫細胞をいい、特にヒトのヘルパーＴ細胞では主にＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７の３種類が知られている。それぞれインターフェロンγ（ＩＦＮγ）やインターロイキン１７（ＩＬ－１７）など特徴的なサイトカインを放出することができる。またＴｈ１はＴ－ｂｅｔを、Ｔｈ２はＧＡＴＡ－３を発現するなど、各Ｔｈサブセットに特徴的な転写因子が存在するが、Ｔ－ｂｅｔとＧＡＴＡ－３の両方を発現している細胞も存在し、そのような細胞は「Ｔｈ１／Ｔｈ２」または「Ｔｈ１／２」と表現される。本明細書において「Ｔｈ１／Ｔｈ１７」または「Ｔｈ１／１７」はＴｈ１に特徴的なＴ－ｂｅｔと、Ｔｈ１７に特徴的なＲＯＲγｔの両方を発現している。

またＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７などのエフェクター細胞は、発現するケモカインレセプター（ＣＣＲ）の種類によっても分類することができ、例えばＴｈ１はＣＸＣＲ３を、Ｔｈ２はＣＣＲ４を、Ｔｈ１７はＣＣＲ４及びＣＣＲ６を、それぞれ発現している。Ｔｈサブセットの分類は例えば図１３（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３４：３１７－３３４ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ，Ｆｉｇ．１）のように表すことができる。本明細書において「Ｔｈ１／Ｔｈ１７」または「Ｔｈ１／１７」はＴｈ１に特徴的なＣＸＣＲ３と、Ｔｈ１７に特徴的な２つのＣＣＲのうちＣＣＲ６を発現している。また本明細書において、ＣＣＲ６ ＳＰ（Ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）とは、ＣＣＲによるＴｈタイプ分類において従来は分類されていなかったタイプであり、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、及びＣＸＣＲ３のうちＣＣＲ６のみを発現するＴｈサブセットである。また本明細書において、ＴＰ（Ｔｒｉｐｌｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）とは、ＣＣＲによるＴｈタイプ分類において従来は分類されていなかったタイプであり、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、及びＣＸＣＲ３の３つを発現するＴｈサブセットである。

国際公開第２０２２／０５４７９６号において、Ｔｈクラスターの中でも、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰ ＣＤ４^＋Ｔ細胞クラスターが無増悪生存期間と高い相関を示すことがわかった。各区画に発現しているケモカインレセプターを図にまとめたものが図１４である（国際公開第２０２２／０５４７９６号の図１７に対応）。この図からも明らかなとおり、破線で囲っている部分がＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗの細胞集団であり、この中には、ケモカインレセプターの発現が異なる４つのクラスター（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ）が存在することがわかる。この中の区画ＤがＣＸＣＲ３^＋ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋で表されるＴｈ１／１７であり、区画ＨがＣＸＣＲ３^－ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋で表されるＣＣＲ６ ＳＰである。

本明細書において「Ｔｈ７Ｒ」とは、Ｔｈ１／１７細胞亜集団（ＣＤ４^＋ＣＸＣＲ３^＋ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋）と、ＣＣＲ６ ＳＰ細胞亜集団（ＣＤ４^＋ＣＸＣＲ３^－ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋）とを組み合わせた細胞亜集団である。血中Ｔｈ７Ｒ細胞亜集団は、全身性免疫を司っているものと考えられ、例えば、癌免疫療法の効果予測、特に免疫チェックポイント阻害剤（抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体等）の効果予測、化学放射線治療、または分子標的薬（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤）治療等の癌治療に対する応答予測に使用できる他、Ｂ型肝炎患者、クラミジア肺感染症マウスモデル、日和見感染症患者、デング熱患者、アセチルコリン抗体陽性重症筋無力症患者に見られるなど、医学的に重要な細胞亜集団である。

このように、Ｔｈ７ＲはＣＸＣＲ３^＋細胞亜集団とＣＸＣＲ３^－細胞亜集団の双方を包含する概念であるため、ＣＤ４^＋細胞亜集団の中のＴｈ７Ｒ細胞の割合を測定する際には、基本的にはＣＸＣＲ３が発現されているかどうかを測定することは必須ではない。しかしながら、本明細書に開示されるとおり、ＣＸＣＲ３^－細胞亜集団に対してＣＣＲ４のゲーティングを行うことにより、ＣＸＣＲ３について発現を確認せずにＣＤ４^＋細胞全体に対してＣＣＲ４のゲーティングを行う場合よりも明確にゲートを決定することができた（実施例５参照）。したがって、Ｔｈ７Ｒ細胞亜集団を測定する際には、
１．ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中のＣＸＣＲ３^－細胞亜集団を選択し、
２．ＣＸＣＲ３^－細胞亜集団において、ＣＣＲ４^－細胞亜集団とＣＣＲ４^＋細胞亜集団との境界を設定（ゲーティング）し、
３．設定された境界（ゲート）を用いて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋細胞亜集団の相対量を測定する、
という一連の工程が好ましいことが本発明によって明らかになった。

（癌）
本発明において対象とされる癌としては、メラノーマ（悪性黒色腫）、非小細胞肺癌、腎細胞癌、悪性リンパ腫（ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫）、頭頸部癌、泌尿器科癌（膀胱癌、尿路上皮癌、前立腺癌）、小細胞肺癌、胸腺癌、胃癌、食道癌、胃食道接合部癌、肝癌（肝細胞癌、肝内胆管細胞癌）、原発性脳腫瘍（膠芽腫、中枢神経系原発リンパ腫）、悪性胸膜中皮腫、婦人科癌（卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、）、軟部肉腫、胆道癌、多発性骨髄腫、乳癌、大腸癌などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

（全血サンプル）
Ｔ細胞の分画・分離のためのサンプルは、常法によって、被験体から適切に採取することができる。例えば、被験体の末梢血、骨髄、腫瘍組織、造血組織、脾臓、正常組織、リンパ液等から行うことができる。末梢血からのサンプル採取は、非侵襲的で簡便であるため、有利であり得る。

本発明においては、末梢血由来の全血サンプルまたはそこから調製されたＰＢＭＣサンプルが使用され得、好ましくは全血サンプルが使用され得る。全血サンプルは、抗凝固剤入採血管で採血され得る。本発明においては、当該分野で公知の任意の抗凝固剤を使用することができるが、好ましくはヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、ＡＣＤ－Ａなどであり、より好ましくはヘパリンであり得る。

本明細書の実施例から明らかなように、測定する対象の細胞マーカーによって全血サンプルの好ましい保管条件は変動し得る。Ｔｈ７Ｒについては、広範な温度帯で、また長期間保管しても測定結果の変動が少なかった。したがって、ＣＤ４^＋細胞中のＴｈ７Ｒを測定する場合には、全血サンプルを約１０℃～約４０℃で、より好ましくは約１２℃～約２５℃で保管することができる。また、Ｔｈ７Ｒを測定する場合には、約１２℃～約２５℃で保管した場合、全血サンプルを採血から１週間以内（好ましくは６日以内、より好ましくは採血から３日以内）であれば十分に測定することができ、これは以下に説明する他のマーカーの場合と比較すれば予想外である。また、採血後ただちに測定が行えるかどうかは採血場所や採血施設に依存するため、採血の直後でなく１日以上経過した後にも安定して測定を行うことができる点は利点であり得る。従って、本発明において、Ｔｈ７Ｒ測定のための全血サンプルの保管期間は、例えば１日～１週間、１日～６日、１日～３日等であり得る。

ＣＤ４^＋細胞中のＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗを測定する場合には、Ｔｈ７Ｒの場合よりも高い温度帯の方が好ましいことが分かった。具体的には、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗを測定する場合には、全血サンプルを約１５℃～約４０℃、より好ましくは約１８℃～約３７℃で保管することができる。また、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗを測定する場合には、約１８℃～約３７℃で保管した場合、全血サンプルを採血から１週間以内（好ましくは採血から３日以内）であれば十分に測定することができる。また、採血後ただちに測定が行えるかどうかは採血場所や採血施設に依存するため、採血の直後でなく１日以上経過した後にも安定して測定を行うことができる点は利点であり得る。従って、ＣＤ４^＋細胞中のＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗを測定するための全血サンプルの保管期間は、例えば１日～１週間、１日～６日、１日～３日等であり得る。

特定の実施形態において、Ｔｈ７Ｒ・ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ細胞亜集団の割合を測定することが有利であり得る。その場合には、約１８℃～約２５℃で保管することにより、採血から１週間以内（好ましくは採血から３日以内）であれば十分に測定することができる。従って、Ｔｈ７Ｒ・ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ細胞亜集団を測定するための全血サンプルの保管期間は、例えば１日～１週間、１日～６日、１日～３日等であり得る。

他方、ＣＤ４^＋細胞中のＣＣＲ７は採血から２日を超えると、採血直後のサンプルにおける測定結果からの変動が大きくなるため、ＣＤ４^＋細胞中のＣＣＲ７を測定する場合には、全血サンプルの３日以上の保管に適さないことが分かった。２日までであれば保管温度は１８℃～２５℃が安定していた。

ＣＤ８＋細胞については、ＣＤ８の蛍光強度の強さが安定しているのは２日が限度であった。２日以内の短期間においては、１８～２５℃の温度が適していた。

このように、細胞の種類や測定対象とするマーカーの種類によって、全血サンプルの保管温度や保管可能期間は変動するが、Ｔｈ７Ｒについては予想外に広範な温度範囲（約１０℃～約４０℃で、より好ましくは約１２℃～約２５℃）で長期（１週間以内、好ましくは６日以内、より好ましくは採血から３日以内、例えば１日～１週間、１日～６日、１日～３日等）保管することができることが明らかになった。

全血サンプルの採血量は当該分野で一般的に実施されている量を採用することができるが、典型的には約１６ｍｌ以下などである。しかしながら、本明細書の実施例６に示されているように、１００μｌ程度の微量であっても、Ｔｈ７Ｒの測定は安定して達成することができた。この量であれば、被験体自身で採血ができることになり、被験体への負担も小さいため有利である。そのため、本発明の好ましい実施形態において、全血サンプル量は約１０μｌ以上、約５０μｌ以上、より好ましくは約１００μｌ以上であり、そして約５００μｌ以下、より好ましくは約２００μｌ以下であり、好ましくは約１００μｌ～１５０μｌであり得る。本発明の全血サンプル採取のために使用可能なキットとしては、ＭＢＳキャピラリー（ヘパリンリチウム、１００－１５０μｌ採取ライン）（株式会社マイクロブラッドサイエンス）、微量採血管ヘパリンリチウム（分離剤なし)２５０μ「マイクロヘルスチューブ」（株式会社ヘルス・ウェーブ・ジャパン）、キャピジェクトＩＩ（テルモ）、ＢＤマイクロテイナ（登録商標）微量採血管ＢＤマイクロガード^ＴＭキャップ付きなどが挙げられるが、これらに限定されない。

これまでＴｈ７Ｒの特定のためには、医療従事者が採血し、直ちにＰＢＭＣに分離してから、必要に応じて凍結保存し、測定する場所に検体を輸送していた。この場合、採血した場所において安全キャビネット、冷却遠心分離機、超低温冷凍機が、測定場所において安全キャビネット、冷却遠心分離機、ＣＯ２培養器、超低温冷凍機、液体窒素タンク等の専門的な設備が必要であった。採血した場所で測定するとしても、安全キャビネットと冷却遠心分離機は必要であったし、測定に用いた残りを保存するのであれば超低温冷凍機と液体窒素タンクも必要であった。ところが、本発明のように全血サンプルを用いることができる場合、採血した場所で測定するのであれば、微量遠心分離機のみでよい。全血サンプルを用い、その後測定施設にサンプルを輸送するのであれば、採血場所において装置は不要である。このことは、従来の方法に比較して顕著な利点を有する。

比較例に示すように、抗凝固処理血液に安定化剤を加えて細胞を固定化した場合にはＣＤ４やＣＸＣＲ３の検出に問題があったため、本明細書において全血サンプルにおいて見いだされたＴｈ７Ｒの効率的な測定法は予想外に有利であった。

好ましい実施形態において、全血サンプルはフローサイトメーター等の測定機器による測定の前に、溶血処理や遠心操作の一方または両方を行わない。全血サンプルにおける白血球（本発明においてはＴ細胞）の解析においては、大量に存在する赤血球のデータの漏れこみが問題となり得る。多くの場合、赤血球を除去するために、溶血処理や遠心操作を行うが、それらの操作は煩雑であり、また細胞へのダメージやロス、凝集を起こすことがあり得る。本発明においては、血液を溶血も洗浄もせず簡単に血液を測定する方法（Ｎｏ－Ｗａｓｈ，Ｎｏ－Ｌｙｓｅ法）を用いても良い。Ｎｏ－Ｗａｓｈ，Ｎｏ－Ｌｙｓｅ法においては、全血を分注（５～１０μｌ程度）し、抗体反応を行い、バッファーで希釈したのちに測定を行う。測定においては、バイオレットレーザーを使用し白血球を分離してもよいし、トリガー染色で白血球を分離してもよい。

例えば、ブルーレーザーとバイオレットレーザーの側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ： ＳＳＣ）を同時に使用することで、全血サンプルから白血球を分離することが可能である。白血球と赤血球ではバイオレットレーザーにおいて、異なる散乱特性があり、赤血球はバイオレットレーザーの光を吸収するために、白血球に比べ光強度が低くなる。

あるいは、白血球とその他の細胞を区別する染色を行うことで、全血サンプルから白血球を分離することが可能である。白血球マーカーであるＣＤ４５抗体や各細胞群特異的なマーカーを使用することで、赤血球などをゲートアウトできる。また赤血球や血小板は核を持たないことから、生きたまま核を特異的に染色できる細胞透過性色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^ＴＭ、Ｖｙｂｒａｎｔ^ＴＭ、ＤｙｅＣｙｃｌｅ^ＴＭ色素など）を使用することで、白血球だけを特異的に染色できる。

（ＰＢＭＣ）
Ｔｈ７Ｒ等の細胞亜集団を測定する場合、採血から細胞の分画・測定までに長期間（例えば１週間超）が要される場合には、ＰＢＭＣを単離して凍結し、それを細胞の分画・測定の際に融解し、必要に応じて培養して使用することができる。この際に、本明細書の実施例５に示されるとおり、全血採取後に時間が経過したあとにＰＢＭＣ分離を行うと、Ｔｈ７Ｒの測定には好ましくない。したがって、本発明においては、単離ＰＢＭＣからＴｈ７Ｒ等の細胞マーカーの測定を行う場合には、採血後３時間以内に、より好ましくは２時間以内にＰＢＭＣ単離を行い、それを凍結保存することが好ましい。

ＰＢＭＣの単離および凍結保存は、当該分野で公知の方法によって行うことができ、例えばバキュティナスピッツ^ＴＭを用いて単核球を分離し、液体窒素を用いて凍結保存することができる（実施例１を参照のこと）。

（細胞の分画・分離）
ＣＸＣＲ３^＋ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋Ｔ細胞亜集団や、ＣＸＣＲ３^－ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋ Ｔ細胞亜集団等の細胞亜集団のそれぞれの細胞数を計測するには、全体の細胞からそれぞれの細胞の亜集団以外の細胞を実験的に除いておいて求めてもよい。例えば、ＣＤ４^＋ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌアイソレーションキット、ヒト（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）などのように、所定の抗体を用いることなく、末梢血から目的のＴ細胞亜集団に相当する細胞を分離してもよい。例えば、ＣＤ４^＋ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌアイソレーションキット、ヒト（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いると、ＣＤ４抗体とＣＤ６２Ｌ抗体を用いずに、末梢血からＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ Ｔ細胞亜集団に相当する細胞を分離することができる。全体の生細胞数を数えて記録しておき、またこのキットを用いて得られた細胞数を数え、記録することができる。同様なキットとして、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ／－Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌアイソレーションキット、ヒト（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ＣＤ２５^＋ＣＤ４９ｄ－Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌアイソレーションキット、ヒト（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）も選択できる。本発明の一実施形態においては、目的のＴ細胞亜集団のそれぞれの細胞数を計測することができるものであれば、いずれのキットも使用できる。

また、抗体を用いなくてもよい。抗体は、個々の細胞に発現している分子を特異的に認識して結合できるものであって、さらに抗体が細胞表面上、または細胞内で発現している分子に結合しているときに発色できるようにして検出し、発色している細胞の数を計測する。ここで、それらの細胞表面上、または細胞内で発現している分子はタンパク質であるので、そのタンパク質を発現している場合にはそれをコードしているｍＲＮＡも細胞内にできている。すなわち、個々の細胞内のｍＲＮＡを調べて、注目しているタンパク質分子をコードしているｍＲＮＡの有無を調べればよい。これを可能にしているのが、シングル・セルの遺伝子発現解析、つまり１細胞レベルのｍＲＮＡ解析である。単細胞の遺伝子発現解析としては、たとえば、１）Ｑｕａｒｔｚ－Ｓｅｑにより次世代シーケンシングを行う方法、２）Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃ１ ＳｙｓｔｅｍやＩＣＥＬＬ８ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍを用いて細胞を単離してＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ｖ４でライブラリー調製する方法、３）セルソーターで細胞を分離し、Ａｍｂｉｏｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ－ｔｏ－ＣＴキットを用い定量ＰＣＲで計測する方法、４）ＣｙＴＯＦ ＳＹＳＴＥＭ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社）などが挙げられる。

すなわち、血液を取得し、生細胞数を数え、セルソーター等で細胞を分離する。分離した個々の細胞に対し、例えば、Ａｍｂｉｏｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ－ｔｏ－ＣＴキットを用い、特定の遺伝子について発現量を定量ＰＣＲ法の装置で計測することができる。その結果に基づいて、個々の細胞がＣＸＣＲ３^＋ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋ Ｔ細胞亜集団や、ＣＸＣＲ３^－ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋Ｔ細胞亜集団のどの亜集団に該当するかを調べて、それぞれの亜集団に該当した細胞の数を数えることもできる。

本発明における、細胞亜集団の割合の測定、または基準値や閾値との比較は、規定されたシグナルを有する標準サンプルを用いて行ってもよい。所定の細胞亜集団に対応する蛍光シグナルを生じるように調製された標準（例えば、蛍光色素を付着させた粒子）と、細胞集団を含むサンプルとの間でのシグナルを比較し、標準との比較によって、サンプル中の細胞亜集団の量または割合を測定することができる。また、所定の基準値や閾値に対応する蛍光シグナルを生じるように調製された標準（例えば、蛍光色素を付着させた粒子）と、細胞集団を含むサンプルとの間でのシグナルを比較し、標準との比較によって、サンプル中のＴ細胞組成における本発明のマーカーの有無もしくは量を判定することが可能である。

本発明において、特定のマーカーについて、ｈｉｇｈ（高発現）またはｌｏｗ（低発現）を判定する場合、当業者は、当技術分野で一般的に用いられている発現強度の分類基準を用いて行うことができる。例えば、ＣＤ６２Ｌについて、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体を用いた場合の１０Ｅ２のシグナルに対応するシグナル強度を境界として、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗとＣＤ６２Ｌ^ｈｉｇｈとを明瞭に分割することが可能である（ＷＯ２０１８／１４７２９１）。

本発明の一実施形態において、当業者は、示される細胞の表面マーカーを適切に識別して、細胞を分画または計数することが可能である。

本明細書において「フローサイトメトリー」とは、液体中に懸濁する細胞，個体およびその他の生物粒子の粒子数，個々の物理的・化学的・生物学的性状を計測する技術をいう。フローサイトメトリー技術を用いて種々の細胞の解析が行われるようになっている。特に、血液細胞の分化の判定が、フローサイトメトリー技術により可能となっている。このような分化判定は、研究用のほか診断にも利用されはじめている。フローサイトメトリーの利点としては、例えば、芽球の占める割合を把握しやすいこと、特異性および感度が高いこと、再現性が高いこと、多数の細胞を解析することができること、所要時間が短いことなどが挙げられる。

この技術を用いた装置は、「フローサイトメーター」という。フローサイトメーターは、細胞の均一な浮遊液より、浮遊物（細胞）の光学特性を測定する機器である。細胞は液流に乗ってレーザー光の焦点を通過するが、その通過時に毎秒５００～４，０００個の細胞より前方散乱光、側方散乱光、及び１つ以上の異なる波長の蛍光の光学特性を、個々の細胞について同時に測定し、それら細胞の大きさ、内部構造、及び細胞膜・細胞質・核内に存在する種々の抗原あるいは核酸量等の、生物学的特性を迅速、かつ正確に測定することができる。

散乱光とは、レーザーが細胞に当たって周囲に散乱した光である。前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ：ＦＳＣ）はレーザー光軸に対して前方で検出し、散乱光強度は細胞の表面積に比例する。すなわち、相対的にＦＳＣの値が大きければ細胞も大きく、ＦＳＣの値が小さければ細胞も小さいと考えられる。側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳＣ）はレーザー光軸に対して９０度（直角）の位置で検出し、細胞の顆粒や細胞内構造の状態に散乱光強度が比例する。すなわち、相対的にＳＳＣの値が大きければ細胞の内部構造は複雑であり、ＳＳＣの値が小さければ細胞の内部構造は単純であると考えられる。

フローサイトメトリーの結果は、代表的には、ＦＳＣをＸ軸に、ＳＳＣをＹ軸にとったドットプロットとして表現され得る。各細胞は図の中の一つのドット（点）で示されており、それらの位置は、ＦＳＣとＳＳＣとの相対値によって決められる。比較的サイズが小さく内部構造が単純なリンパ球は左下部に、サイズが大きく内部に顆粒を持つ顆粒球は右上部に、またサイズは大きいが内部構造が単純な単球はリンパ球と顆粒球の間に、それぞれお互いに分離した集団を作って表示される。

蛍光とは、細胞に標識されている蛍光色素が照射されたレーザー光によって励起され、エネルギーを放出する際生じた光をいう。フローサイトメーター（例えば、製品名：Ｂｅｃｔｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）は、代表的には、４８８ｎｍの単一波長レーザー光と６３５ｎｍの単一波長レーザー光とを照射する。細胞はそれ自体も弱い蛍光を発する性質を有しているが（自家蛍光）、実際に細胞の持つ分子を蛍光を用いて特異的に検出しようとする場合は、あらかじめ何らかの形で細胞あるいはその持つ分子に蛍光色素を結合させる必要がある。例えば、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）は、４８８ｎｍの励起光を吸収し、主に５３０ｎｍの蛍光（緑色）を発する。抗体にあらかじめＦＩＴＣを標識しておけば、細胞の表面に存在する抗原量に応じて結合する抗体量に差が生じ、その結果ＦＩＴＣの蛍光強度が異なってくるため、その細胞の表面に存在する抗原量を推定することができる。例示的に使用され得るＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒは、異なる蛍光波長域を検出できる４本の蛍光検出器を搭載しており、異なった波長の光を発する複数の蛍光色素を用意しておけば、最大４つの異なる抗原を同時に検出することが可能である。４８８ｎｍの単一波長レーザー光によって励起されるＦＩＴＣ以外の蛍光色素として、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）は主に５８５ｎｍの蛍光を発し、ＰｅｒＣＰ（ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＰＥ－Ｃｙ５（ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎ－５）は主に６７０ｎｍの蛍光を発する。６３５ｎｍの単一波長レーザー光によって励起される蛍光色素であるＡＰＣ（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）は、主に６７０ｎｍの蛍光を発する。これらの蛍光色素が種々の抗体と組み合わされ、細胞の二重染色や三重染色に用いられる。Ｔリンパ球の表面に発現しているＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＸＣＲ３分子などを、これらと特異的に反応するモノクローナル抗体で検出することができる。

本発明の方法において、細胞マーカーの発現様式の決定は、フローサイトメーター、遺伝子解析、ＣｙＴＯＦ等のマーカータンパク質の発現の分布を解析するための任意の手法によって行われ得る。典型的には、本発明の方法における細胞マーカーの発現様式の決定は、ヒストグラムやドットプロットなどの、フローサイトメーター（フローサイトメトリーともいう）の結果を示す細胞分布図上で行うことができる。特に、ＣＸＣＲ３^－細胞亜集団の細胞分布図において、ＣＣＲ４^－細胞亜集団とＣＣＲ４^＋細胞亜集団との境界を設定（ゲーティング）し、その境界（ゲート）を利用してＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋細胞亜集団の相対量を測定する。

厳密にいうと、フローサイトメーターには、細胞を解析するだけの機器と、解析した細胞を分取（ソーティング）することが可能な機器の２種類があり、後者は「ＦＡＣＳ」と呼ばれる。本明細書において「ＦＡＣＳ」とは、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒの略で、レーザー光線を使ってリンパ球などの遊離細胞の表面抗原の解析をしたり、表面抗原の有無などによって、ある特定の細胞を分取する方法において用いられる装置をいう。

フローサイトメトリーの結果は、検出した光学的情報から１つ測定項目に対して、または２以上の測定項目毎に、ヒストグラム、ドットプロット（散布図）などの、粒子に由来する光の分布図として細胞を分布させて表すことができる。本明細書において「ヒストグラム」とは、フローサイトメーターを用いた蛍光測定において、各パラメータの光信号の強度をＸ軸に、細胞数をＹ軸にとったグラフをいう。このような形態により、総計で１万個以上の細胞を計数することが可能である。本明細書において「ドットプロット」とは、二種類の蛍光色素の蛍光強度をＸ軸とＹ軸にとったプロットをいう。二重染色および三重染色をした場合には、それぞれの蛍光強度をＸあるいはＹ軸におき、個々の細胞が二次元グラフ上の一つ一つの点に対応するような表示方法を用いて解析することができる。本明細書において「ゲーティング」、「境界を設定する」、または「ゲートする」とは、このそれぞれの分布図に対して、測定項目に応じて適切な測定を行うために、分布図の中に測定項目に応じた一定の分布領域を選択することをいう。

例えば、末梢血もしくは骨髄液を採取後、溶血法か比重遠心法にて赤血球を除いた後に蛍光標識抗体（目的とする抗原に対する抗体とそのコントロール抗体）と反応させ、十分に洗浄してからフローサイトメトリーを用いて観察することができる。検出された散乱光や蛍光は電気信号に変換されコンピュータにより解析される。その結果は、ＦＳＣの強さは細胞の大きさを表しＳＳＣの強さは細胞内構造を表すことによりリンパ球、単球、顆粒球を区別することが可能である。その後、必要に応じて目的とする細胞集団にゲーティングし、それらの細胞における細胞マーカー発現様式を検討する。

本発明の方法の実施において、当業者は、示される細胞の表面マーカーを適切に識別して、細胞を分画または計数することが可能である。

Ｎｏ－Ｗａｓｈ，Ｎｏ－Ｌｙｓｅ法について上述したとおり、本発明は全血またはＰＢＭＣを対象としてＴ細胞中の特定の細胞亜集団の比率を測定することを目的とするものであるため、ＣＤ４５抗体を添加することによって、データ解析を容易にしてもよい。ＣＤ４５抗体は、Ｔ細胞を含むリンパ球に反応し、赤血球と血小板には反応しないため、計測対象をＣＤ４５^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞亜集団に限定することによって赤血球や血小板などの不要な細胞を解析対象から排除することができる。

（キット）
本発明の一実施形態において、本発明のキットは、本発明の方法に従って用意されたサンプルに使用するための、ＣＤ４、ＣＣＲ４、およびＣＣＲ６に対する検出剤を含むことができ、他の実施形態において、本発明のキットはさらにＣＸＣＲ３、ＣＤ６２Ｌに対する検出剤を含むこともできる。１つの実施形態では、検出剤は抗体である。好ましくは、抗体は適切に標識されマーカーの検出を容易にする。

（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔＥＳａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。

本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

（測定パネル）
本実施例においては、以下表１のパネル（ＷＢ ｐａｎｅｌ２またはＷＢ ｐａｎｅｌ３）を用いた。

（実施例１ 全血法とＰＢＭＣを分離する方法の比較）
抗凝固剤（ヘパリンナトリウム）入採血管で採血したものを全血とし、全血をすぐにＰＢＭＣ分離して凍結保存した場合と比較した。解析したサンプルは、同じ被験体（Ｈ－３４）から採血で得た８ｍｌの血液をヘパリン処理したものであり、これを二分し、一方はヘパリン処理後の全血とし、他方はＰＢＭＣの分離に用いた。

全血の方は、１００μｌの全血に対し、染色用抗体を添加し、１５分間遮光して室温で染色した。次に２ｍｌの溶血試薬（Ｌｙｓｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｃａｔ．３４９２０２）を添加し、１０分間遮光して室温に置くことによって赤血球を溶血処理した。次に、５００×ｇ、室温で５分間遠心分離し上清を捨てた。さらに２ｍｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳを加えて懸濁してから、同じ条件で遠心分離した。この懸濁、遠心分離をもう一度繰り返し、上清を除いてから、２５０μｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳに懸濁し、測定した。

他方、ＰＢＭＣ取得のため、残りの全血を１５ｍｌコニカルチューブへ移し、血液量に対し２倍量の生理食塩水を加えて混合した。この混合液を２本のＬｅｕｃｏｓｅｐリンパ球分離チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｃａｔ．１６３２８８－０１３）へ分注し、８００×ｇ、室温で１５分間遠心分離した。上部の血漿と細胞からなる層をピペッティングで攪拌し、Ｌｅｕｃｏｓｅｐリンパ球分離チューブ２本分を５０ｍｌのコニカルチューブ１本に回収した。回収した細胞液に１５ｍｌの５％ＦＢＳ／ＰＢＳを加えて、５００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去後、１０ｍｌの５％ＦＢＳ／ＰＢＳを加えて懸濁し、細胞数をカウントしてから当日測定分と凍結分とに細胞液を分配した。

当日測定分は、再度１０ｍｌの５％ＦＢＳ／ＰＢＳを加えて遠心分離してから、上清を除去後、５０μｌのＰＢＳを加えて懸濁し、さらにＦＡＣＳ ｔｕｂｅに移して、直ちに染色用抗体を添加し、２０分間遮光して室温で染色した。その後１ｍｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳを加えて懸濁してから、５００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去後、２５０μｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳを加えて懸濁し、測定した（これをＰＢＭＣ染色工程とする）。以上をＦｒｅｓｈのＰＢＭＣとした。

凍結分は、５００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去後、セルバンカー２を１ｍｌ加えて懸濁した。これをクライオチューブに全量分注し、４℃に冷却してあるＢＩＣＥＬＬに入れた後、速やかに－８０℃のディープフリーザーに入れた。翌日、液体窒素タンクに移し凍結保存した。５日後、３７℃の恒温水槽で融解してから１２ｍｌの１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク、Ｃａｔ．３０２６４－８５）に懸濁し、５００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍｌの１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて懸濁し、細胞数をカウントした後細胞液を二分した。一方は５００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した後ＰＢＳを１００μｌ加えて懸濁し、ＰＢＭＣ染色工程を実施して測定した。これをＦｒｏｚｅｎとした。また、もう一方は細胞液を２４穴プレートに分注して３７℃、５％ＣＯ_２存在下で４８時間培養した。その後、細胞を含む培養液を１５ｍｌのコニカルチューブに全量回収し、ＰＢＳを加えて１０ｍｌにメスアップした後、細胞数をカウントした。その後、５００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した後１００μｌのＰＢＳを加えて懸濁し、ＰＢＭＣ染色工程を実施して測定を行った。これをＰＢＭＣ Ｃｕｌｔｕｒｅとした。以後も同じである。

ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＸＣＲ３の抗体を用いて染色し（表１ＷＢ ｐａｎｅｌ２）、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０を用いて測定した。測定結果をＦｌｏｗＪｏ^ＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析し、図を描いた。

全血とＰＢＭＣのＦｒｅｓｈの図は似ている（図１）。つまり上の行から順に、ＣＤ４^＋細胞全体についてＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６の散布図を描いたもの、ＣＤ４^＋細胞についてＣＸＣＲ３のヒストグラムを描いたもの、そのヒストグラムにおけるＣＸＣＲ３^－を集めてＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６の散布図を描いたもの、同じくＣＸＣＲ３^＋を集めてＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６の散布図を描いたもの、以上のどれも全血とＦｒｅｓｈのパターンは似ている。
ところが、ＰＢＭＣ の Ｆｒｏｚｅｎはどの図においても、全血やＰＢＭＣのＦｒｅｓｈとは異なる。ＰＢＭＣのＣｕｌｔｕｒｅについては、３つ（ＣＤ４^＋、ＣＸＣＲ３^－、ＣＸＣＲ３^＋）のＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６の散布図において、ＣＣＲ６はＰＢＭＣのＦｒｅｓｈとＦｒｏｚｅｎの中間のパターンを示すが、ＣＣＲ４^＋はＰＢＭＣのＦｒｅｓｈやＦｒｏｚｅｎに比べると減る。またＣＸＣＲ３のヒストグラムはＰＢＭＣのＦｒｏｚｅｎに近い。

以上より、以下の事項が明らかになった。
・全血はＰＢＭＣのＦｒｅｓｈと似ている。
・ＰＢＭＣを凍結保存すると、全血やＦｒｅｓｈとは異なり、培養後もＦｒｅｓｈとは異なる。
・ＣＸＣＲ３の分離は、凍結保存後悪くなり、培養しても戻らない。
・ＣＣＲ４^＋の数は凍結保存しても減らないが、培養後に減る。
・ＣＣＲ６^＋の数は凍結保存後減り、培養後はやや戻るが採血直後よりは少ない。

（実施例２ 保存期間の影響の検討）
本実施例においては、全血の保存期間を変えて測定し、保存期間の影響を調べた。

全血は、採血直後、室温（２０～２２℃）で３日保管したもの、および室温で６日保管したものを用意した。直後または保管してから、溶血させ、染色、測定を行った。実施例１において用意した全血サンプル（Ｈ－３０）と、それとは別の日に採血した全血サンプル（Ｈ－３４）とをそれぞれ用いて実験を行った。測定パネルには、ＷＢ ｐａｎｅｌ２を用いた（表１）。採血直後、保管後において大きな違いは認められなかった（図２）。

さらにサンプル数を増やし、Ｔｈ７Ｒの細胞数のカウントを行って、全血の保存日数を比較した。

全血は、実施例１において用意した全血サンプル（Ｈ－３０）と、それとは別の日に採血した全血サンプル（Ｈ－３４）とを引き続き使用した。結果を表２に示す。この表のＨ－３４は図２の結果を数値で示したものである。

表２においては、全血とＰＢＭＣの比較も行った（表２下段「２．全血法０日目、全血からＰＢＭＣ分離後のＦｒｅｓｈ、Ｆｒｏｚｅｎ、Ｃｕｌｔｕｒｅのデータ」）。ＰＢＭＣの処理方法は実施例１において述べたとおりである。表２下段のＨ－３４は実施例１（図１）の結果を数値で示したものである。測定パネルとしてＷＢ ｐａｎｅｌ２を用いた。図１に相当するヒストグラムと散布図を、各検体について作成した。ＦｌｏｗＪｏを用いて図を描き、細胞数を取得した。ＣＸＣＲ３^－とＣＸＣＲ３^＋の細胞数は、ＣＸＣＲ３のヒストグラムにおいて取得した。

表２上段（１．全血を０、３、６日間室温保存）においては、ＣＤ４^＋全体を１０，０００個以上取得してから、後で表の作成時にＣＤ４^＋全体を１０，０００個となるように調整した。

表２下段（２．全血法０日目、全血からＰＢＭＣ分離後のＦｒｅｓｈ、Ｆｒｏｚｅｎ、Ｃｕｌｔｕｒｅのデータ）においては、ＦｌｏｗＪｏにてＣＤ４^＋全体を１０，０００個前後取得した上で得られた数を示してある。

Ｔｈ１／１７は、ＣＸＣＲ３^＋についてのＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６の散布図においてＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋の領域の細胞数である。ＣＸＣＲ３^＋に対する割合を示した。

ＣＣＲ６ ＳＰ（Ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）は、ＣＸＣＲ３^－についてのＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６の散布図においてＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋の領域の細胞数である。ＣＸＣＲ３^－に対する割合を示した。

Ｔｈ７Ｒは、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰの合計の個数を示した。

Ｔｈ１は、ＣＸＣＲ３^＋についてのＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６の散布図においてＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^－の領域の細胞である。ＣＸＣＲ３^＋に対する割合を示した。

ＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^－は、ＣＸＣＲ３^＋についてのＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６の散布図においてＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^－の領域の細胞である。ＣＸＣＲ３^＋に対する割合を示した。

ＴＰ（Ｔｒｉｐｌｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）は、ＣＸＣＲ３^＋についてのＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６の散布図においてＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^＋の領域の細胞である。ＣＸＣＲ３^＋に対する割合を示した。

ＴＮ（Ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）は、ＣＸＣＲ３^－についてのＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６の散布図においてＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^－の領域の細胞である。ＣＸＣＲ３^－に対する割合を示した。

Ｔｈ２は、ＣＸＣＲ３^－についてのＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６の散布図においてＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^－の領域の細胞である。ＣＸＣＲ３^－に対する割合を示した。

Ｔｈ１７は、ＣＸＣＲ３^－についてのＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６の散布図においてＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^＋の領域の細胞である。ＣＸＣＲ３^－に対する割合を示した。

（考察）
１．全血の保存日数による違い
全血を採血当日に測定、３日室温保存後測定、６日室温保存後測定したものを比較したところ、保存期間が長くなるとともに、ＣＸＣＲ３^＋が減少したが、Ｔｈ１／１７のＣＸＣＲ３^＋に占める割合は微増の傾向にあった（表２）。ＣＸＣＲ３^－は増加し、ＣＣＲ６ ＳＰのＣＸＣＲ３^－に占める割合も増加した。またＴｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰの和であるＴｈ７Ｒはやや増加した。つまりＣＸＣＲ３^＋は減少、ＣＸＣＲ３^－は増加、Ｔｈ７ＲであるＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋の合計は増加した。ただし図２からわかるように、いずれも増減はわずかであり、後に述べるようにＰＢＭＣのＦｒｏｚｅｎやＣｕｌｔｕｒｅに比べると、ＰＢＭＣのＦｒｅｓｈのデータに近い。すなわち、他の処理法に比べると全血の保存中の変化は小さいことが分かる。

ＣＸＣＲ３^＋に占めるＴｈ１、およびＣＸＣＲ３^－に占めるＴＮ、つまりＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^－の割合はやや増加した。したがってＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^－の割合は増加した。

ＣＸＣＲ３^＋中のＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^－の割合、およびＣＸＣＲ３^－中のＴｈ２の割合は減少した。つまりＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^－の割合は減少した。

ＣＸＣＲ３^＋に占めるＴＰ（ＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^＋）の割合、およびＣＸＣＲ３^－に占めるＴｈ１７の割合はいずれも減少した。

先のＴｈ１／１７、ＣＣＲ６ ＳＰの結果と合わせて、ＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６においての割合を見ると、ＣＸＣＲ３が－であるか＋であるかに関わらず、割合の増減傾向は一致しており、ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^－とＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋が増加、ＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^－とＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^＋が減少した。つまりＣＣＲ４^＋が減少、ＣＣＲ４^－が増加した。ただしＰＢＭＣと比べた場合ほどの違いはなかった。

２．全血とＰＢＭＣの比較
全血はＰＢＭＣのＦｒｅｓｈと比較すると、ＣＸＣＲ３^＋が多く、ＣＸＣＲ３^－が少なかった（表２）。またＴｈ１／１７、ＣＣＲ６ ＳＰがやや多く、Ｔｈ７Ｒもやや多かった。しかし差としては小さかった。

またＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６で分けた領域の細胞の割合について見ると、全血はＰＢＭＣのＦｒｅｓｈと比較すると、Ｔｈ１、ＴＰ、ＴＮはほぼ同じ、ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４＋ＣＣＲ６－は少ない、Ｔｈ２はやや少ない、Ｔｈ１７はやや少ないという結果であった。しかしながら、この違いはＰＢＭＣのＦｒｏｚｅｎやＣｕｌｔｕｒｅとの比較に比べると、差は小さい。

次にＰＢＭＣのＦｒｏｚｅｎとＣｕｌｔｕｒｅを含めて比較する。ＣＸＣＲ３^＋については、Ｆｒｅｓｈに比べてＰＢＭＣのＦｒｏｚｅｎは、検体によって異なるが、Ｃｕｌｔｕｒｅでは大きく減る。反対にＣＸＣＲ３^－のＦｒｏｚｅｎはＦｒｅｓｈに近く、ＣｕｌｔｕｒｅはＦｒｅｓｈより多い。Ｔｈ１／１７のＣＸＣＲ３＋に対する割合について見ると、ＰＢＭＣのＦｒｏｚｅｎはＦｒｅｓｈよりも著しく少なく、ＣｕｌｔｕｒｅはＦｒｏｚｅｎより多いがＦｒｅｓｈよりは少ない。ＣＣＲ６ ＳＰの割合はＴｈ１／１７と似ていて、Ｆｒｏｚｅｎは著しく少なく、ＣｕｌｔｕｒｅはＦｒｅｓｈよりやや少ない程度である。Ｔｈ７Ｒの個数については、ＦｒｏｚｅｎはＦｒｅｓｈより著しく少なく、ＣｕｌｔｕｒｅはＦｒｏｚｅｎよりは多いがＦｒｅｓｈよりは少ない。

すなわち、ＣＸＣＲ３^＋の数は培養後に大きく減ったため、Ｔｈ１／１７の個数は凍結保存後に大きく減り、培養後わずかに増えるが分離直後程度までは戻らなかった。他方、凍結保存によってＣＣＲ６ ＳＰの割合は大きく減り、培養後ＣＣＲ６ ＳＰの割合は凍結保存前程度まで増える検体と少しだけ増える検体があった。また、ＣＤ４＋細胞の数を固定して測定した状況において、分離直後に比べて培養後にはＣＸＣＲ３^－の数が増え、ＣＣＲ６ ＳＰの数は検体によって増えたものと減少したものがある。このため、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰの和であるＴｈ７Ｒは凍結保存後減り、培養後増えるが、分離直後までは戻らなかった。つまり、Ｔｈ７ＲをＰＢＭＣで測定する場合、分離直後の凍結保存前に測定することが望ましい。

次にＰＢＭＣのＦｒｏｚｅｎとＣｕｌｔｕｒｅを含めて、ＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６におけるＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋以外の領域にある細胞について比較した。Ｔｈ１のＣＸＣＲ３^＋に対する割合はＦｒｅｓｈに比べて、Ｆｒｏｚｅｎでやや増え、ＣｕｌｔｕｒｅはＦｒｏｚｅｎよりやや低いがＦｒｅｓｈよりは高い。ＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^－の割合は、Ｆｒｏｚｅｎで増え、Ｃｕｌｔｕｒｅでは著しく減った。ＴＰの割合は、Ｆｒｏｚｅｎで著しく減り、Ｃｕｌｔｕｒｅでは増えたがＦｒｅｓｈよりかなり小さい。ＣＸＣＲ３^－のＴＮ、Ｔｈ２、Ｔｈ１７については、ＣＣＲ４とＣＣＲ６の発現パターンがＣＸＣＲ３^＋の場合に対応するそれぞれＴｈ１、ＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^－、ＴＰの増減と同じ傾向にあった。このことはＴｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰとの関係にも当てはまる。つまり凍結保存や培養の影響は、ＣＸＣＲ３の有無に関連しなかった。まとめるとＣＣＲ４^＋の細胞は、凍結保存の影響を受けないが培養すると減少した。ＣＣＲ６^＋の細胞は、凍結保存すると減少し、培養すると回復した。しかしＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^＋はＣＣＲ４^＋細胞、ＣＣＲ６^＋細胞の両方の減少の影響があり、凍結保存で減少し、培養した後の回復がなかった。

（実施例３ 保存期間の影響（２））
実施例２のデータを使用し、Ｔｈ７Ｒの細胞数のカウントでの比較を行った。

表３の左側（全血）は表２上段（１．全血を０、３、６日間室温保存）と同じ測定のものであり、右側（全血とＰＢＭＣ）は表２下段（２．全血法０日目、全血からＰＢＭＣ分離後のＦｒｅｓｈ、Ｆｒｏｚｅｎ、Ｃｕｌｔｕｒｅのデータ）と同じ測定のものである。測定においてはＷＢ ｐａｎｅｌ２（表１）を用いた。

ここでは、ＣＸＣＲ３による分離は行わず、ＣＤ４^＋全体に対して、ＣＣＲ４ ｖｓ ＣＣＲ６の散布図を描いた。この図は図１と図２に示した。図１と図２に示したもの以外もＦｌｏｗＪｏで同様の図を描き、細胞数を計数した。ＣＸＣＲ３^－／^＋を分離しないので、Ｔｈ７Ｒの細胞数のみ示した（表３）。

全血については、採血直後、保存後に大きな違いは認められなかった。すなわち採血後６日経過しても測定に問題が起こらなかった。

ＰＢＭＣのＦｒｅｓｈのＴｈ７Ｒについては、全血に比べてやや少ない程度であった。

ＰＢＭＣのＦｒｏｚｅｎのＴｈ７Ｒは、全血やＦｒｅｓｈよりも大きく減った。その後得られたＣｕｌｔｕｒｅの数は、全血やＦｒｅｓｈの程度には戻らなかった。

すなわち、ＰＢＭＣに分離する場合、Ｔｈ７Ｒの測定は分離直後に行う必要がある。全血を保存後ＰＢＭＣ分離した場合、望ましい測定結果が得られなかった（実施例５参照）ので、採血直後にＰＢＭＣを分離し、すぐに測定することが望ましい。一方、全血であれば６日後でも採血直後と同程度の結果が得られるので、６日の間に室温で輸送してから測定することも可能であることが明らかになった。

（実施例４ 保存温度の影響（３））
本実施例においては、全血の保存における最適な温度帯を調べた。試験は２回行った。１回目の試験では、１０、１５、２０、２５、３０、３７℃において、１、２、３、６日経過後に測定した。２回目の試験では、１２、１５、１８℃において、１、３、６日経過後に測定した。ヘパリン処理した血液を２５０μｌずつＣＲＹＯｔｕｂｅに分注し、各温度に設定した水浴またはインキュベータ中で保存した。測定にはＷＢ ｐａｎｅｌ２およびＷＢ ｐａｎｅｌ３を用いた（表１）。

１回目の試験では、１５℃保存の場合に、水滴が蓋内部に付着し、血液部分が濃縮された可能性が考えられた。そのため温度維持に工夫を導入して水滴が付かないようにした２回目の試験を行った。

１．ＣＤ４、ＣＤ８の発現について
温度、日数を変えて保存した場合のＣＤ４ ｖｓ ＣＤ８の散布図を図３に示す。横軸がＣＤ４の分布、縦軸がＣＤ８の分布を示す。

図３の枠内の条件を安定であると評価した。ＣＤ４の染色についてはＣＤ４^＋の頻度と染色パターンから見ると、１２℃から２５℃の間で３日間安定であった。またＣＤ８については、どの温度においても２日を経過するとＣＤ８の蛍光強度が下がり、発現量が下がったと思われる。なお、以降の解析では蛍光強度の低下に応じてＣＤ８^＋としてゲートする範囲を移動させた。

２．ＣＤ４におけるＣＤ６２Ｌの発現について
ＣＤ４^＋細胞に対し、ＣＤ６２Ｌの染色パターンをヒストグラムで表した（図４）。横軸がＣＤ６２の分布、縦軸が計数を示す。

図４の枠内の条件を安定であると評価した。ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗについては、温度が高い方が、日数が経過した場合の分離が良好であることがわかった。また、３７℃に近いと保存日数が増加しても染色は安定していた。

３．ＣＤ８におけるＣＤ６２Ｌの発現について
ＣＤ８^＋細胞に対し、ＣＤ６２Ｌの染色パターンをヒストグラムで表した（図５）。横軸がＣＤ６２の分布、縦軸が計数を示す。

図５の枠内の条件を安定であると評価した。ＣＤ８^＋細胞は、ＣＤ８^＋の位置が低下した場合、それに応じて範囲をずらしてＣＤ８^＋細胞を選択した。ＣＤ４^＋細胞の場合と同様に、３７℃に近いと保存日数が増加しても染色は安定していたが、２日を超えると全体的に蛍光強度の強さが減少した。

４．ＣＤ４におけるＴｈ７Ｒの発現について
ＣＤ４^＋細胞に対して、ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋画分に入る細胞、つまりＴｈ７Ｒ細胞に注目したヒストグラムを求めた（図６）。横軸がＣＣＲ６の分布、縦軸がＣＣＲ４の分布を示す。

図６の枠内の条件を安定であると評価した。Ｔｈ７Ｒは保存日数３日を含む長い保存期間において、幅広い温度の保存で良好に測定できた。

５．ＣＤ４におけるＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡの発現について
ＣＤ４^＋細胞に対して、ＣＣＲ７とＣＤ４５ＲＡの散布図を作成した（図７）。すなわち、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、ナイーブの細胞を観察した。横軸がＣＣＲ７の分布、縦軸がＣＤ４５ＲＡの分布を示す。

図７の枠内の条件を安定であると評価した。ＣＣＲ７の染色の分離は、保存日数を追うごとに悪くなった。そのため、エフェクターメモリー細胞（ＣＣＲ７^－ＣＤ４５ＲＡ^－）やエフェクター細胞（ＣＣＲ７^－ＣＤ４５ＲＡ^＋）は増加した。ＣＤ４５ＲＡに関しては、低温であると発現が低下する傾向にあり、２０℃付近であると頻度は安定していた。よって、ナイーブ細胞（ＣＣＲ７^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋）は２０℃付近が良好で、それより低くても高くても頻度が減少した。

６．ＣＤ８におけるＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡの発現について
ＣＤ８^＋細胞に対して、ＣＣＲ７とＣＤ４５ＲＡの散布図を作成した（図８）。すなわち、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、ナイーブ、ＥＭＲＡの細胞を観察した。横軸がＣＣＲ７の分布、縦軸がＣＤ４５ＲＡの分布を示す。

図８の枠内の条件を安定であると評価した。保存日数が２日目まではＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡの発現が良好で、１日とほぼ同等であったが、２日目以降になるとＣＣＲ７の発現は大幅に減少し、ＣＤ４５ＲＡも緩やかに減少した。

７．まとめ
ＣＤ８^＋細胞の測定については、ＣＤ８の蛍光強度の強さが安定しているのは２日が限度であった。２日以下の短期間においては、１８～２５℃の温度が適していた。

ＣＤ４については１２℃から２５℃の間で３日間安定であったが、ＣＤ４^＋細胞における各マーカーの安定性については個別に変動した。

ＣＤ６２Ｌについては温度が高い方が、日数が経過した場合の分離が良好であり、３７℃付近が保存日数が増加しても安定していた。

ＣＣＲ７の染色の分離は、保存日数を追うごとに悪くなった。温度としては１８℃～２５℃が安定していた。

Ｔｈ７Ｒは保存日数３日を含む長い保存期間において、幅広い温度（１２℃～２５℃）の保存で良好に測定できた。

（実施例５ 保存全血からのＰＢＭＣ分離）
全血を測定した後に残余検体の利用性を検討した。前述の通り、全血のまま保存するといくつかの細胞マーカーについては劣化していき測定できない。そこで、保存後、ＰＢＭＣに分離し、保存することを検討した。

健常人２名からヘパリン採血管を用いて採血した。次の４通りを用意した。
＃１：採血直後に測定。
＃２：＃１を３日間室温（２０．４－２１．０℃）で保存後に測定。
＃３：＃２からＰＢＭＣ分離して、２３日間凍結保存し、融解後測定。
＃４：＃３を４８時間培養し、測定。
測定にはＷＢ ｐａｎｅｌ２を用いた（表１）。

結果を図９に示す。

以下の表４に、保存方法ごとに得られた細胞頻度を示す。なお、表４においての各項目は以下を示す。
ＣＤ４５： ＣＤ４５のＳｉｎｇｌｅｔｓに対する比率
Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ： ＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓのＣＤ４５に対する比率
ＣＤ４： ＣＤ４のＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓに対する比率
ＣＸＣＲ３^＋： ＣＸＣＲ３^＋のＣＤ４に対する比率
Ｔｈ１／１７： Ｔｈ１／１７のＣＤ４に対する比率
ＣＸＣＲ３^－： ＣＸＣＲ３^－のＣＤ４に対する比率
ＣＣＲ６ ＳＰ： ＣＣＲ６ ＳＰのＣＤ４に対する比率

ＣＤ４^＋細胞のＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＸＣＲ３発現を保存方法ごとに比較した結果を図１０に示す。

図９と図１０は同じ検体である。表４は２検体の細胞頻度を示した。図９と表４によると、＃３の保存全血から分離したＰＢＭＣにおいてはＣＸＣＲ３^＋細胞が著しく減った。＃４の培養により若干増えたが、＃１や＃２の全血に比べると少なかった。

ＣＸＣＲ３^＋ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋であるＴｈ１／１７は、ＣＸＣＲ３^＋と同じ傾向にあった。ただし培養後の割合は培養前に近かった。

またＣＣＲ６ ＳＰ（ＣＸＣＲ３^－ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋）もＣＸＣＲ３^－にもかかわらず、ＣＸＣＲ３^＋と同様の傾向があった。

そこでどのマーカーが検体の処理条件による影響を受けたかを明らかにするために、図１０を示した。＃１の採血直後と、＃２から＃４を比較した。この図によると、＃２全血３日間保存は＃１とどのマーカーも変わらなかった。またＣＣＲ４は、＃３も＃４も＃１と変わらなかった。しかし、ＣＣＲ６^＋とＣＸＣＲ３^＋は、＃３と＃４は＃１に比べて著しく減った。＃４は＃３に比べ若干ＣＣＲ６^＋とＣＸＣＲ３^＋が増えたが、＃１や＃２に比べると少なかった。

以上より、３日後のＰＢＭＣ分離は、ＣＸＣＲ３^＋およびＣＣＲ６^＋の細胞の量が減るため、ＣＸＣＲ３とＣＣＲ６の測定には好ましくない可能性が示された。したがって、全血を保存後に分離したＰＢＭＣはＴｈ７Ｒ測定には適さない。保存するためには、採血直後に血液を２つに分け、一方をＣＤ８も含めて全血検体として測定する場合は２日以内、またはＣＤ８を測定しない全血検体の場合は３日以内に測定し、残りの血液は採血直後にＰＢＭＣに分離して凍結保存することが望ましい。

（実施例６ ＣＸＣＲ３測定の重要性）
Ｔｈ７Ｒの定義は、ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋ＣＤ４^＋であり、ＣＸＣＲ３^＋もＣＸＣＲ３^－も含む。そのため本実施例において、Ｔｈ７Ｒの測定においてはＣＸＣＲ３測定は不要とも考えられるところ、ＣＸＣＲ３の測定に意義があるかどうかを調べた。

健常人６名からヘパリン採血管を用いて採血し、ＷＢ ｐａｎｅｌ２（表１）を用いて直ちに測定を行った。データ解析と作図はＦｌｏｗＪｏを用いた。結果を図１１Ａ～１１Ｄに示す。図１１はＣＤ４^＋またはＣＸＣＲ３^－細胞についてのＣＣＲ６ ｖｓ ＣＣＲ４散布図である。
図１１Ａ：ＣＤ４^＋Ｔ細胞。ゲートを示していない。
図１１Ｂ：ＣＸＣＲ３^－ＣＤ４^＋Ｔ細胞。ゲートを示していない。
図１１Ｃ：図１１Ａと同じ。ＣＸＣＲ３^－において作成したゲートを示した。
図１１Ｄ：図１１Ｂと同じ。ＣＸＣＲ３^－において作成したゲートを示した。

図１１Ｂによると、検体によるが概ね、ＣＸＣＲ３^－ＣＣＲ４^ｈｉｇｈＣＣＲ６^－細胞が１つの集団として明瞭となり、ＣＸＣＲ３^－ＣＣＲ４^ｍｅｄＣＣＲ６^－細胞の集団と分かれる。他方、図１１Ａによると、ＣＤ４^＋全体に対して描いた散布図においては、ＣＣＲ４^ｈｉｇｈＣＣＲ６^－細胞とＣＣＲ４^ｍｅｄＣＣＲ６^－細胞の２つの集団の切れ目がわかりにくい。このため、図１１Ｂにおいては、ＣＣＲ４^ｈｉｇｈの集団のゲートを決めやすく、この図においてゲートを決めたものが図１１Ｄであり、そのゲートを図１１Ｃにも記載した。

したがって、ＣＸＣＲ３を測定したほうがＣＸＣＲ３^－に対してＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋のゲートを作りやすい。そのため、ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋の集団の特定には、ＣＸＣＲ３を測定したほうが望ましいことが明らかになった。この傾向はＰＢＭＣよりも全血サンプルを用いた場合の方が顕著であり、採血から３日以上経過した場合には特に、ＰＢＭＣよりも全血サンプルの方がＣＸＣＲ３^－に対してＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋のゲートを決めやすかった。

（実施例７ 微量採血デバイスを用いた自己採血検体の測定）
これまでの実験により、全血に対する測定が可能であり、また少量でできることも判明した。そこで本実施例においては、微量採血デバイスの利用の可能性を検討した。この本実施例で用いたような微量採血デバイスによれば、被験体自身で採血ができ、簡便である。

採血は、ＢＤセーフティランセット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて自身の指先を穿刺し、血液をＭＢＳキャピラリー（ヘパリンリチウム、１００－１５０μｌ採取ライン）（株式会社マイクロブラッドサイエンス）で採取することによって行った。採血後、直ちにＷＢ ｐａｎｅｌ３（表１）で染色し、測定した。測定結果を図１２に示す。１００μｌ～１５０μｌのごく微量の採血でも問題なく測定が可能であった。

１５０μｌの血液（３滴程度）を自身で採血した検体の測定が可能となった。この手法により、医療従事者が不在でも、実験室において採血し、すぐに測定が可能である。従来のＰＢＭＣを用いた方法では、培養が必要なパネルもあったため、急いでコントロールが必要となっても対応できなかった。また日々、コントロールを用意するには、健常者から１６ｍｌ程度を頻繁に採血する必要があった。しかしこの方法を用いれば、コントロールが急いで必要な場合に３滴採血すれば済む。

（比較例 細胞の固定化）
抗凝固処理済みの血液にパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）もしくはＢＤ Ｃｅｌｌ ＦＩＸ（１０．０％ホルムアルデヒド、３．５５％メタノール、０．９３％アジ化ナトリウムを含む溶液）を添加し、所定の温度で３日間保存後ＰＢＭＣ処理を行った後染色し、測定を行った。

（１）パラホルムアルデヒド
被験体２名（Ｈ－１５、Ｈ－３４）から４ｍｌの採血管（ニプロ、Ｃａｔ．３１－７６４）４本ずつ血液を得て、ヘパリンナトリウム処理した。それぞれを１ｍｌずつ１０本に分注した。これに４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液にＰＢＳを加えて、パラホルムアルデヒドの最終濃度が０．５％、１％、１．５％、２％になるように２本ずつ調製し、２本には何も加えなかった。０から２％の濃度のものを１本ずつ４℃または室温にて、３日間放置した。

パラホルムアルデヒド濃度が０から２％のものについては、いずれも室温にしてから血液の２倍の生理食塩水を加えた。これらをＬｅｕｃｏｓｅｐリンパ球分離チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｃａｔ．１６３２８８－０１３）に加えた。

以上のチューブに対し、室温で８００ｘｇ、１５分間の遠心分離を行った。上部の血漿と細胞からなる層をピペッティングで攪拌し、１５ｍｌのコニカルチューブ１本に回収した。回収した懸濁液に回収した懸濁液と同量以上または５ｍｌの５％ＦＢＳ／ＰＢＳを加えて、５００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去後、１０ｍｌの５％ＦＢＳ／ＰＢＳを加えて懸濁し、細胞数をカウントした。

また同じ日に８ｍｌのＢＤバキュテイナ（抗凝固剤及び分離剤入り採血管（ＢＤ、Ｃａｔ．３６２７５３））２本ずつ血液を得て、ヘパリンナトリウム処理した。２，２００×ｇ、２０℃、２０分遠心分離し、上部の血漿と細胞からなる層をピペッティングで攪拌し、５０ｍｌのコニカルチューブ１本に回収した。回収した懸濁液に１５ｍｌの５％ＦＢＳ／ＰＢＳを加えて、５００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去後、１０ｍｌの５％ＦＢＳ／ＰＢＳを加えて懸濁し、細胞数をカウントした。この８ｍｌのバキュテイナで採血した分については、当日測定分と凍結分とに懸濁液を分配した。

３日間放置した分、および８ｍｌのＢＤバキュテイナ当日測定分は、カウント後、遠心分離してから、上清を除去後、５０μｌのＰＢＳを加えて懸濁し、さらにＦＡＣＳｔｕｂｅに移して、直ちに染色用抗体を添加し、２０分間遮光して４℃で染色した。その後１ｍｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳを加えて懸濁してから、５００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去後、２５０μｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳを加えて懸濁し、測定した。
８ ｍｌのＢＤバキュテイナ凍結分は、５００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去後、クライオチューブ１本あたり約５．０×１０^６個／ｍｌの細胞濃度になるようにセルバンカー２を加えて懸濁した。これをクライオチューブに１ｍｌずつ分注し、４℃に冷却してあるＢＩＣＥＬＬに入れた後、速やかに－８０℃のディープフリーザーに入れた。翌日、液体窒素タンクに移し凍結保存した。２日後、３７℃の恒温水槽で融解してから１２ｍｌの１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク、Ｃａｔ．３０２６４－８５）に懸濁し、５００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍｌの１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて懸濁し、細胞数をカウントした後、細胞液を２４穴プレートに分注して３７℃、５％ＣＯ２存在下で４８時間培養した。その後、細胞を含む培養液を１５ｍｌのコニカルチューブに全量回収し、細胞数をカウントした。その後、５００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した後１００μＬのＰＢＳを加えて懸濁し、ＰＢＭＣ染色工程を実施して測定を行った。これをＰＢＭＣ Ｃｕｌｔｕｒｅとした。以後も同じである。サンプル一覧は次の通りである。
Ｎｏ．検体名 ３日放置の内容、またはその他の処理
１ Ｈ－１５ ＰＢＭＣ分離後凍結保存、解凍後２日間培養（ＰＢＭＣ Ｃｕｌｔｕｒｅ）
２ Ｈ－１５ ＰＢＭＣ分離後保存なし（ＰＢＭＣ Ｆｒｅｓｈ）
３ Ｈ－１５ ２％パラホルムアルデヒド、４°Ｃ
４ Ｈ－１５ １．５％パラホルムアルデヒド、４°Ｃ
５ Ｈ－１５ １％パラホルムアルデヒド、４°Ｃ
６ Ｈ－１５ ０．５％パラホルムアルデヒド、４°Ｃ
７ Ｈ－１５ ０％パラホルムアルデヒド、４°Ｃ
８ Ｈ－１５ ２％パラホルムアルデヒド、室温
９ Ｈ－１５ １．５％パラホルムアルデヒド、室温
１０ Ｈ－１５ １％パラホルムアルデヒド、室温
１１ Ｈ－１５ ０．５％パラホルムアルデヒド、室温
１２ Ｈ－１５ ０％パラホルムアルデヒド、室温
１３ Ｈ－３４ ＰＢＭＣ分離後凍結保存、解凍後２日間培養（ＰＢＭＣ Ｃｕｌｔｕｒｅ）
１４ Ｈ－３４ ＰＢＭＣ分離後保存なし（ＰＢＭＣ Ｆｒｅｓｈ）
１５ Ｈ－３４ ２％パラホルムアルデヒド、４°Ｃ
１６ Ｈ－３４ １．５％パラホルムアルデヒド、４°Ｃ
１７ Ｈ－３４ １％パラホルムアルデヒド、４°Ｃ
１８ Ｈ－３４ ０．５％パラホルムアルデヒド、４°Ｃ
１９ Ｈ－３４ ０％パラホルムアルデヒド、４°Ｃ
２０ Ｈ－３４ ２％パラホルムアルデヒド、室温
２１ Ｈ－３４ １．５％パラホルムアルデヒド、室温
２２ Ｈ－３４ １％パラホルムアルデヒド、室温
２３ Ｈ－３４ ０．５％パラホルムアルデヒド、室温
２４ Ｈ－３４ ０％パラホルムアルデヒド、室温
結果は以下のとおりであった。

＜ＣＤ４＞
室温：ＰＦＡを最終濃度２～１％添加したものは全てＣＤ４の発現が確認できなかった。１％添加したものについても弱い発現しか確認されなかった。
４℃：ＰＦＡを最終濃度２～１％添加したものは全てＣＤ４の発現が確認できなかった。０.５％添加したものについても弱い発現しか確認されなかった。

＜ＣＸＣＲ３＞
室温：ＣＤ４が発現していなかったことからＣＸＣＲ３のはっきりとした二峰性の確認はできなかった。
４℃：二峰性にはなるがＰＦＡの濃度が２％から０.５％に最終濃度が下がっていくにつれて１％をピークにＣＸＣＲ３^＋の割合が上がっていく傾向にあり、発現が安定しなかった。

＜ＣＣＲ６＞
発現が確認できたサンプルの中でＰＦＡを添加したものについては、ＰＦＡ添加なしのＣＣＲ６^＋の発現が１０^３程度であったのに比べて、１０^４以上とかなり高い発現が確認され、発現が安定しなかった。

＜ＣＣＲ４＞
発現が確認できたサンプルの中でＰＦＡを添加したものについては、ＰＦＡ添加なしと比べると、発現範囲が狭まり、分離が悪くなった。

（２）ＢＤ Ｃｅｌｌ ＦＩＸ
被験体２名（Ｈ－１５、Ｈ－３４）から４ｍｌの採血管１本ずつ血液を得て、ヘパリンナトリウム処理した。それぞれを１ｍｌずつ４本に分注した。これにＢＤ Ｃｅｌｌ ＦＩＸ（ＢＤ、Ｃａｔ．３４０１８１：発売停止、現在はＳｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｆｉｘａｔｉｖｅ ３Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅとして販売）を２％ＦＢＳ／ＰＢＳで希釈した溶液を加え、最終希釈割合がｘ４、ｘ１０、ｘ２０、となるようにし、１本には何も加えなかった。これらを４°Ｃで、３日間放置した。
以後はパラホルムアルデヒドの場合と同様である。つまりＰＢＭＣを分離した。サンプル一覧は以下のとおりである。
Ｎｏ． 検体名 処理
２５ Ｈ－１５ Ｃｅｌｌ ＦＩＸなし， ４°Ｃ、３日間
２６ Ｈ－１５ ｘ４ Ｃｅｌｌ ＦＩＸ， ４°Ｃ、３日間
２７ Ｈ－１５ ｘ１０ Ｃｅｌｌ ＦＩＸ， ４°Ｃ、３日間
２８ Ｈ－１５ ｘ２０ Ｃｅｌｌ ＦＩＸ， ４°Ｃ、３日間
２９ Ｈ－３４ Ｃｅｌｌ ＦＩＸなし， ４°Ｃ、３日間
３０ Ｈ－３４ ｘ４ Ｃｅｌｌ ＦＩＸ， ４°Ｃ、３日間
３１ Ｈ－３４ ｘ１０ Ｃｅｌｌ ＦＩＸ， ４°Ｃ、３日間
３２ Ｈ－３４ ｘ２０ Ｃｅｌｌ ＦＩＸ ４°Ｃ、３日間
結果は以下のとおりであった。
４倍希釈：リンパ球リージョンが全く見えない。
１０倍希釈：かろうじてリンパ球リージョンは見える。
２０倍希釈：ＣＤ４の発現も見えるが、通常の発現位置よりも低く、ＣＸＣＲ３のカットオフも左へシフトしていて安定しなかった。

以上のとおり、抗凝固処理血液に安定化剤を加えて細胞を固定化した場合には特にＣＤ４やＣＸＣＲ３の検出に問題があったため、全血サンプルにおいて見いだされたＴｈ７Ｒの効率的な測定法が有利である。

本発明は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中の医学的に重要な細胞亜集団の相対量の測定のために使用され得る。

Claims (19)

1. 被験体由来のサンプル中のＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋細胞亜集団の相対量の決定方法であって、
   前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中のＣＸＣＲ３^－細胞亜集団を選択する工程と、
   前記ＣＸＣＲ３^－細胞亜集団において、ＣＣＲ４^－細胞亜集団とＣＣＲ４^＋細胞亜集団との境界を設定する工程と、
   前記境界を用いて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋細胞亜集団の相対量を測定する工程と
   を包含する、方法。
2. 前記サンプルは前記被験体の末梢血の全血サンプルまたは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）サンプルである、請求項１に記載の方法。
3. 前記サンプルは全血サンプルである、請求項２に記載の方法。
4. 前記サンプルは、前記被験体からの採取後１日以上保管されたものである、請求項３に記載の方法。
5. 前記サンプルは、前記被験体からの採取後１日～６日保管されたものである、請求項４に記載の方法。
6. 前記サンプルは、前記被験体からの採取後１日～３日保管されたものである、請求項４に記載の方法。
7. 前記サンプルは、約１０℃～約４０℃で保管されたものであり、「約」は後に続く数値の±１０％である、請求項４に記載の方法。
8. 前記サンプルは、約１２℃～約２５℃で保管されたものであり、「約」は後に続く数値の±１０％である、請求項４に記載の方法。
9. 前記サンプルは、約１０μｌ～約５００μｌであり、「約」は後に続く数値の±１０％である、請求項３に記載の方法。
10. 被験体由来のサンプル中のＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋細胞亜集団の相対量の決定方法であって、
    前記被験体の全血サンプルを用意する工程と、
    前記全血サンプルのＣＤ４^＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^＋細胞亜集団の相対量を測定する工程と
    を包含する、方法。
11. 前記サンプルは、前記被験体からの採取後１日以上保管されたものである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記サンプルは、前記被験体からの採取後１日～６日保管されたものである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記サンプルは、前記被験体からの採取後１日～３日保管されたものである、請求項１１に記載の方法。
14. 前記サンプルは、約１０℃～約４０℃で保管されたものであり、「約」は後に続く数値の±１０％である、請求項１１に記載の方法。
15. 前記サンプルは、約１２℃～約２５℃で保管されたものであり、「約」は後に続く数値の±１０％である、請求項１１に記載の方法。
16. 前記サンプルは、約１０μｌ～約５００μｌであり、「約」は後に続く数値の±１０％である、請求項１０に記載の方法。
17. ＣＤ４に対する検出剤、ＣＣＲ４に対する検出剤、およびＣＣＲ６に対する検出剤を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキット。
18. ＣＸＣＲ３に対する検出剤をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
19. 前記検出剤が抗体である、請求項１８に記載のキット。