KR101604649B1 - 혈액 내 순환 흑색종 세포의 자동화된 계산 및 특징화 - Google Patents

혈액 내 순환 흑색종 세포의 자동화된 계산 및 특징화 Download PDF

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Abstract

셀트랙스® 시스템 (CellTracks® System) 은 혈액 내 순환 흑색종 세포를 계산하는 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 상피 세포를 면역자기적으로 농축시키고, 상기 세포를 형광 표지하고, 순환 흑색종 세포를 규명 및 정량화한다. 말초 혈액 종양 덩어리 내에서 검출되는 순환 흑색종 세포의 절대수는, 부분적으로, 생존, 진행 시간, 및 치료법에 대한 반응성을 예측하는 인자이다. 흑색종의 진단 및 모니터링은 순환 흑색종 세포를 모니터링하지 못하는 능력에 의해 제한되어 왔다. 본 발명은 혈액 샘플 내 순환 흑색종 세포를 계산하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 기술은 흑색종 환자에서 질환 진행을 모니터링하는 수단 및 장치를 제공한다.

Description

혈액 내 순환 흑색종 세포의 자동화된 계산 및 특징화{Automated enumeration and characterization of circulating melanoma cells in blood}
발명자: Mark Connelly, Chandra Rao, 및 Leon W.M.M. Terstappen
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2007 년 11 월 27 일에 출원된, 미국 가출원 제 61/004,345 호를 우선권으로 주장하는 정식특허 출원이다. 전술한 출원은 본원에 참조로서 그 전체가 삽입된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 , 혈액에서의 형태학적으로 온전한 순환 흑색종 세포 (CMC) 의 존재를 바탕으로, 암환자에서 질환 진행을 모니터링하고 평가하는 것에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 환자에서 순환 흑색종 세포를 평가하기 위한 방법, 시약 및 장치가 기술되어 있다. 순환 흑색종 세포는 대략 5 내지 50 ㎖ 의 말초 혈액에서 1 또는 2 개의 순환 종양 세포를 단리하고 이미지화하도록 구축된 고도로 민감성인 방법론에 의해 측정된다. 종양 세포수의 수준 및 종양 세포수의 증가는 전이성 흑색종 환자를 모니터링하는 수단을 제공한다.
진행성 흑색종의 치료는 종양 진행 동안에 축적되는 외양 변화 및 종양의 이종성 조직병리학에 의해 복잡해진다. 전이성 유방암 또는 결장직장암 환자에서 순환 종양 세포를 계산하고 특징화하는 것은 임상적으로 유의한 독립적인 예후 및 예측 정보를 제공하는 것으로 나타났고, 환자 관리를 모니터링하는데 사용될 수 있다.
순환 종양 세포 (CTC) 는 치유 가능한 질환 단계인 원발성 암, 및 계속 진행되어 대부분의 악성종양에 있어서 사망의 주요 원인이 되는 전이성 질환 간에 중요한 연결점인 것으로 나타났다. 임상 연구는 CTC 가 전이성 유방암에서 강력한 예후 및 예측성 바이오마커임을 나타내었고, 유사한 발견이 전립선암 및 결장직장암에서 보고되었다. 이들 데이타는 CTC 가 전이성 암을 이끄는 기본 생물학의 대표임을 보여주고, 이들 세포의 추가의 세포 및 분자적 분석은 전이의 분자적 조절 및 치료법에 대한 반응성에 대한 새로운 관점을 드러낼 수 있음을 제시한다.
전이에 있어서의 CTC 의 역할, 및 약물동태학 및 약력학 연구에서 바이오마커로서의 이들의 용도의 확장에 대한 연구는 약물 개발의 임상상에 제한되어 왔다. 일반적으로, 대부분의 암환자는 원발성 종양에 의해서는 사망하지 않지만, 대신에 전이:원래의 종양에서 떨어져 나와 신체를 통해 종종 먼 곳까지 이동하는 악성 세포에 의해 구축되는 다발성의 광범위하게 퍼진 종양 콜로니로 인해 사망하는 것으로 받아들여진다. 가장 성공적인 암 치료 전략은 여전히 기관에 국한된 종양을 조기 발견하고 이를 수술적으로 제거하는 것이다. 조기 암 발견은 일부 암에 대해 실현가능한 것으로 증명되었는데, 특히, 자궁경부암에서 PAP 진 검사 (PAP smear), 유방암에서 유방조영술, 및 전립선암에서 혈청 전립선 특이적 항원 (PSA) 과 같이 적절한 진단 테스트가 존재하는 경우에 그러하다. 그러나, 초기 단계에서 발견된 많은 암은 수술적 절제 전에 미세전이를 구축하였다. 따라서, 암의 악성 잠재력을 조기에 그리고 정확하게 측정하는 것은 적절한 치료법의 선택에 있어서 중요하다.
원발성 종양이 충분히 조기에 발견된다면, 이는 종종 수술, 방사선요법, 또는 화학요법 또는 이들 치료법 중 일부의 병용에 의해 제거될 수 있다. 불행하게도, 전이성 콜로니는 검출 및 제거되기가 어렵고, 이들 모두를 성공적으로 치료하는 것은 종종 불가능하다. 따라서, 전이는 암의 자연스런 진행에 있어서 결정적인 사건인 것으로 간주될 수 있다. 더욱이, 전이 능력은 악성 종양을 독특하게 특징짓는 속성이다.
증가된 HER-2/neu 는 호르몬 치료에 대한 반응성을 감소시키고, 호르몬 수용체-양성 전이성 유방암에 대한 반응성을 예측하는데 있어서 유의한 예후 인자이다. 따라서, HER-2/neu 암유전자 생성물이 관련된 악성종양에서, 증가된 수준을 바탕으로 위험도를 평가하고 치료법을 모니터링하는 방법이 기술되었다 (US 5,876,712). 그러나, 차도 동안에, 또는 심지어 건강한 정상인에서 기본 수준이 상대적으로 높고, 환자에서 발견되는 농도와 중복될 수 있어서, 환자-의존적 기준선 및 컷-오프 수준을 구축하기 위해 여러 번 테스트하고 모니터링하는 것을 필요로 한다.
전립선암에서, 혈청 내 PSA 수준은 조기 발견에서 유용한 것으로 증명되었다. 후속한 신체적 검사 및 생검과 함께 사용되는 경우, PSA 테스트는 가장 잘 치료되는 때인 초기 단계에서의 전립선암의 발견을 향상시켰다.
혈액 내 온전한 종양 세포의 검출은 원발성 종양의 절제술을 받은 암환자에서 재발성 전이성 질환에의 직접적인 연결점을 제공한다. 불행하게도, 악성 세포가 동일하게 퍼지는 것이 계속되면, 통상의 종양 단계화 절차에 의해서 파악되지 못하게 된다. 최근의 연구에서, 암환자의 골수에 단일 암세포가 존재하는 것은 전이성 재발에 대한 독립적인 예후 인자인 것으로 나타났다 (Diel IJ, Kaufman M, Goerner R, Costa SD, Kaul S, Bastert G. 원발성 유방암 환자의 골수에서의 종양 세포의 검출: 원거리 전이에 대한 예후 인자. J Clin Oncol, 10:1534-1539, 1992). 그러나, 이들 침습성 기술은 혈액 내 파종성 상피 종양 세포의 검출과 비교해 일상적인 또는 복합적인 임상 어세이에 대해서는 바람직하지 못하거나 또는 허용가능하지 않는 것으로 생각된다.
대안의 접근법은 면역자기 분리 기술을 포함하고, 온전한 순환 암세포의 명확한 검출에 있어서 더 큰 민감성 및 특이성을 제공한다. 기술된 바와 같이, 이러한 간단하고 민감성인 진단 툴 (tool) (US6,365,362; US6,551,843; US6,623,982; US6,620,627; US6,645,731; WO 02/077604; WO03/065042; 및 WO 03/019141) 은, CTC 를 계산하는 예비임상 동물 모델을 제공하기 위해 본 발명에서 사용된다.
이러한 진단 툴을 사용해, 암환자의 혈액 샘플 (WO 03/018757) 을 자기 비드 (bead) 와 함께 인큐베이션하고, 예를 들어 EpCAM 과 같은 상피 세포 표면 항원에 대한 항체로 코팅한다. 항-EpCAM-코팅 자기 나노입자로 표지한 다음, 자기 표지된 세포를 자기 분리기를 사용해 단리한다. 면역자기학적으로 강화된 분획을 예를 들어, CellTracks® System (Veridex LLC, NJ) 에서 하류 면역세포화학 분석 또는 이미지 세포분석에 대해 추가로 평가한다. 자기 분획을 또한, 하류 면역세포화학 분석, RT-PCR, PCR, FISH, 유세포분석, 또는 기타 유형의 이미지 세포분석에 사용할 수 있다.
CellTracks® System 은 전혈 샘플 내에 존재하는 임의의 상피 세포를 고도로 강화시키고 농축시키기 위해 면역자기 선별 및 분리를 이용한다. 포획된 세포를 백혈구 특이적 마커 및 하나 이상의 종양 세포 특이적 형광 모노클로날 항체로 검출가능하게 표지하여, 포획된 CTC 를 규명 및 계산할 수 있을뿐만 아니라, 오염성 비-표적 세포로부터 명확하게 기계적 또는 시각적으로 구분할 수 있다. 이러한 어세이는 종양 덩어리가 적은 초기 단계에서조차 종양 세포를 검출할 수 있게 한다. 본 발명의 구현예는 CellTracks® System 에 제한되지 않으나, 유사한 민감성 및 특이성을 갖는 임의의 단리 및 이미징 프로토콜을 포함한다.
현재 이용가능한 기술은 전이성 흑색종 암 진행을 평가하는데 있어서 CMC 를 반복적으로 모니터링하기 위한 일관되게 믿을만한 수단을 나타내지는 못하였다. 따라서, 흑색종에서뿐만 아니라 일반적인 전이성 암에서, 전이 능력이 있는 암세포를 정확하게 검출할 분명한 필요성이 있다. 더욱이, 상기 필요성은 해당 환자에 대한 가장 효과적인 치료법을 선택할 필요성에 의해 강조된다.
흑색종 및 기타 암에서 CMC 를 반복적으로 모니터링하는 것이 불가능한 점은 채혈에서 수득되는 이들의 분석을 제한하였다. 결과적으로, 종양 진행 및 관련 치료법 동안의 일시적인 CMC 변화와 같은 질환 진행 특징의 연구가 구축되지 못하였다. 그러나, CMC 를 어세이하는 이러한 기술을 사용하면, 예비임상뿐만 아니라 임상 연구에 CMC 평가를 통합할 수 있을 것이다. 이들 세포 상의 특이적 분자 마커를 추가로 특징화하면, 표적 치료법에 대한 "동반"진단 어세이의 조기 개발을 가능하게 할 것이고, 이는 신규 어세이 프로토콜을 환자에서의 임상 시도, 및 궁극적으로 임상 실행으로 옮기는 것을 가속화할 것이다.
발명의 개요
본 발명은 흑색종 환자의 혈액에서 순환 흑색종 세포 (CMC) 를 포획 및 검출하고, CellTracks® System 과 같은 임상 분석 툴을 포함하는 자동화된 방법을 제공하고, 전이성 암환자에서 순환 상피 세포의 절대수, 변화, 또는 이 둘 다의 조합을 바탕으로 한다. 상기 시스템은 상피 세포를 면역자기적으로 농축시키고, 상기 세포를 형광 표지하고, 흑색종에서 양성 계산에 대해 CMC 를 규명 및 정량화한다.
<도 1>
인간 종양 세포로서 포획된 대상을 확인하기 위해 사용되는 CellTracks® 형광 분석 프로파일. 체크 마크는 복합 이미지를 바탕으로 한 양성 종양 세포를 의미한다. 복합 이미지는 상피 세포 마커 (EC-PE) 및 핵 염료 (NADYE) 에 대한 양성 선별로부터 유도된다. 음성 선별은 또한, 백혈구 마커 (L-APC) 및 대조군 (CNTL) 에 필요하다.
혈액 내 CTC 를 단리, 강화, 및 분석하는 임의의 효과적인 기작이 적절한 한편, 순환 종양 세포를 수합하는 하나의 방법은 초기 채혈 후에 면역자기 강화 기술, 면역형광 표지 기술을 적절한 분석 플랫폼 (platform) 과 병용한다. 관련 테스트는, 전혈 샘플에서 이들 희귀 세포를 검출하고, 상피 기원의 악성 종양에서 질환의 임상 경과에 있어서의 이들 희귀 세포의 역할을 탐구하는 민감성 및 특이성을 갖는 것으로 나타났다. 전혈 샘플로부터, 희귀 세포는 민감성 및 특이성을 이용해 검출되어, 수합되고, 동물 모델에서 질환 진행을 모델링하는데 사용될 수 있게 된다.
순환 종양 세포 (CTC) 는 혈액 내에 검출가능한 양으로 존재하는 것으로 나타났다. 이는, 암환자의 말초 순환에서 상피 기원의 세포의 유의성을 조사하기 위한 툴을 만들었다 (Racila E., Euhus D., Weiss A.J., Rao C., McConnell J., Terstappen L.W.M.M. and Uhr J.W., Detection and characterization of carcinoma cells in the blood, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4589-4594 (1998)). 본 연구는, 이들 혈액-생성 세포가 암의 병리생리학에서 유의한 역할을 가짐을 나타내었다. 환자 혈액 5 ㎖ 당 1 개의 상피 세포의 검출 민감성을 가져서, 상기 어세이는 샘플의 빠르고 민감성인 분석을 위해 면역자기 샘플 강화 및 형광 모노클로날 항체 염색, 및 이어서 유세포분석을 통합하였다.
셀서치™ 시스템 (CellSearch™ System) (Veridex LLC, NJ) 은 순환 상피 종양 세포를 인간 혈액 샘플로부터 단리하고 이의 수를 계산하는데 이미 사용되어 왔다. 이는 자기 비드에 결합된 상피-세포 부착 분자에의 항체를 사용해, 상피 세포를 강화하는 자동화된 시스템이다. 다음, 단리된 세포를 형광 핵산 염료 4,2-디아미디노-2-페닐린돌 디히드로클로라이드 (DAPI) 로 염색하여, 핵화된 (nucleated) 세포를 규명한다. 이어서, 백혈구로부터 상피 세포를 구별하기 위해, 회수한 세포를 CD45 (APC 채널) 및 사이토케라틴 8, 18, 19 (PE 채널) 에 대한 형광 표지된 모노클로날 항체로 염색한다. 다음, 핵화된 상피 세포를 순환 종양 세포로서 정량화한다. 표준 CellSearch™ 어세이의 일부가 아니면서 종양 세포의 추가적 특징화에 사용될 수 있는 FITC 에 대한 추가 형광 채널이 존재한다.
실시예에서 나타낸 바와 같이, 상기 어세이에는 면역자기적으로 강화된 샘플이 셀트랙스® 시스템 (CellTracks® System) 에 의해 분석되도록, 이미지 세포분석이 추가로 구성되었다 . 이는 형광-기재 현미경 이미지 분석 시스템으로서, 유세포 분석과는 달리 사건의 시각화 및 형태학적 특징의 평가를 가능하게 하여 대상을 추가로 규명한다.
CD146 (MUC18, MCAM, Mel-CAM 및 S-Endo-1 로도 알려져 있음) 은 내피 세포, 평활근 세포, 소포성 수지상 세포, 흑색종 세포, 및 활성화된 T 림프구 하위군을 포함하여, 제한된 조직 분포를 갖는 막관통 당단백질이다.
Ki-67 (모노클로날 항체 Ki-67 에 의해 규명되는 항원으로서도 알려져 있음) 또는 MK167 은 증식에 대한 세포성 마커이고, 세포 증식과 연관있다. 간기 동안에, Ki-67 항원은 세포핵 내에서 검출될 수 있으며, 반면, 유사분열에서, 대부분의 단백질은 염색체의 표면에 다시 위치한다. Ki-67 단백질은 세포 주기의 모든 활성 기 (G1, S, G2, 및 유사분열) 동안에 존재하나, 휴지기 (Go) 세포에는 존재하지 않는다. 이는 일반적으로 세포군의 성장 분율을 측정하기 위한 마커로서 사용된다.
셀트랙스® 오토프렙® 시스템 (CellTracks® AutoPrep® System) 및 셀트랙스® 애널라이저 II (CellTracks® Analyzer II) 를 사용하여, CMC 의 포획 및 검출을 완전히 자동화하였다. CMC 어세이에서, 흑색종 세포 부착 분자 (CD146) 에 특이적인 항체에 결합된 자기 입자를 사용하여, 7.5 ㎖ 의 혈액으로부터 흑색종 세포를 포획하였다. 다음, 강화된 CMC 를 핵산 염료 DAPI, 및 고분자량 흑색종 관련 항원에 특이적인 PE 에 결합된 모노클로날 항체로 염색한다. 상기 어세이는 또한, 함께-정제된 백혈구 및 순환 내피 세포 각각을 제외시키기 위해, CD45 및 CD34 에 대한 APC 결합 모노클로날 항체를 함유한다. 또한, FITC 표지 항-Ki67 을 첨가하여, 순환 동안에 세포 주기 (G1, S, G2 또는 M 기) 에서의 CMC 의 분율을 측정하였다. 강화 및 염색된 CMC 를 셀트랙스 (CellTracks) 카트리지 내에서 자기적으로 마운팅 (mounting) 하고, 셀트랙스 애널라이저 II 를 이용해 스캐닝하였다. 세포의 개별 이미지를 리뷰용 오퍼레이터 (operator) 상에 제시하였고, 형광 및 세포 형태학을 바탕으로 CMC 로서 등급매김 (scoring) 하였다. CMC 어세이는 >건강한 공여자의 혈액 7.5 ㎖ 에 섞였을 때 (spiked) 세포주 SK-MEL28 로부터 65%초과의 흑색종 세포를 일관되게 회수하였다. 상기 어세이는 1 내지 1200 개 흑색종 세포/7.5 ㎖ (r2 의 0.999, 경사 (slope) 0.74, 인터셉트 (intercept) 6.8) 의 테스트 범위에 걸쳐서 선형이었다. 상기 어세이는 건강한 공여자 (n=60) 및 전이성 흑색종 환자 (n=71) 혈액을 사용해 입증되었다. 정상 공여자의 7.5 ㎖ 혈액 내에, CMC 개수가 0 개인 경우는 60 명 중 57 명에서 검출되었다 (95%). 1 개의 세포가 60 명 중 3 명 (5%) 의 건강한 공여자에서 CMC 로서 염색되었으나, 이들 세포는 전형적으로 특징적인 내피 세포 형태학을 가졌고, Ki67 음성이었다. 흑색종 환자에서, CMC 범위는 7.5 ㎖ 혈액 당 0 내지 8000 개였다. 1 개 이상의 CMC 는 환자 중 39% 에서 검출되었고, > 2 개 초과는 25% 에서, > 5 개 초과는 8% 에서, > 10 개 초과는 4% 에서, 및 > 100 개 초과는 3% 에서 검출되었다. 놀랍게도, CMC 중 30 내지 100% (평균 84%) 는 Ki67 양성이었으며, 이는 혈액으로 흘려 들어간 흑색종 세포 중 높은 비율이 활성적으로 분열함을 제시한다. 이러한 자동화된 CMC 어세이는 전이성 흑색종 환자에 대한 유용한 모니터링 장치, 예후 평가 장치이거나, 또는 가능하게는 이러한 어렵고 진행성인 질환에서 바이오마커, 표적 및 강력한 치료법을 평가하기 위한 툴로서 유용하다.
실시예
순환 사이토케라틴 양성 세포의 계산
셀트랙스® 시스템은 혈액에서 단리된 세포를 자동적으로 계산하기 위한 자동화된 형광 현미경 시스템을 말한다. 상기 시스템에는, 통합 컴퓨터 제어 형광 현미경 및 자동화된 스테이지 (stage) 가 1 회용 샘플 카트리지를 고정할 자기 요크 (yoke) 조립체와 함께 들어있다. 자기 요크는 샘플 챔버 내 자성유체-표지 후보 종양 세포가 현미경 관찰용 샘플 카트리지의 상부 관찰 표면에 자기적으로 위치할 수 있도록 디자인된다. 소프트웨어는, 사이토케라틴에 대한 항체로 표지되고 상피 기원을 갖는 용의자 암세포를 최종 선별을 위한 오퍼레이터 (operator) 에 제시한다.
셀트랙스® 시스템용 종양 세포를 단리하는 것은 당 기술분야에서 알려진 임의의 수단에 의해 달성될 수 있는 한편, 한 구현예는 생물 샘플로부터 종양 세포를 단리하기 위한 면역자기 강화를 이용한다. 상피 세포-특이적 자기 입자를 첨가하고, 20 분 동안 인큐베이션하였다. 자기 분리 후, 면역자기-연결 항체에 결합된 세포를 튜브 벽에 자기적으로 고정하였다. 다음, 비결합 샘플을 흡입하고, 등장성액을 첨가하여, 샘플을 재현탁하였다. 핵산 염료, 사이토케라틴 (상피 세포 마커) 및 CD 45 (광범위 백혈구 마커) 에 대한 모노클로날 항체를 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 자기 분리 후, 비결합 분획을 다시 흡입하고, 결합되고 표지된 세포를 0.2 ㎖ 의 등장성액 내에서 재현탁하였다. 상기 샘플을 세포 제시 챔버 내에서 현탁하고, 자기 장치 내에 위치시키는데, 이 자기장은 셀트랙스® 시스템에서의 형광 현미경 검사를 위해 자기적으로 표지된 세포를 적응시킨다. 셀트랙스® 시스템에서 세포를 자동적으로 규명하고, 후보 순환 종양 세포를 체크리스트 계산을 위한 오퍼레이터에 제시하였다. 계산 체크리스트는 완전한 세포를 구성하는 소정의 형태학적 기준으로 이루어진다.
7.5 ㎖ 의 전혈 인간 혈액을 사용한 면역자기 강화에 의해 사이토케라틴 양성 세포를 단리하였다. 상피 세포-특이적 면역자기 유체를 첨가하고, 20 분 동안 인큐베이션하였다. 20 분 동안의 자기 분리 후, 면역자기-연결 항체에 결합된 세포를 튜브벽에 자기적으로 고정하였다. 다음, 비결합 샘플을 흡입하고, 등장성액을 첨가하여, 샘플을 재현탁하였다. 핵산 염료, 사이토케라틴 (상피 세포 마커) 및 CD 45 (광범위 백혈구 마커) 에 대한 모노클로날 항체를 샘플과 함께 15 분 동안 인큐베이션하였다. 자기 분리 후, 비결합 분획을 다시 흡입하고, 결합되고 표지된 세포를 0.2 ㎖ 의 등장성액 내에서 재현탁하였다. 상기 샘플을 세포 제시 챔버 내에서 현탁하고, 자기 장치 내에 위치시키는데, 이 자기장은 셀트랙스® 시스템에서의 형광 현미경 검사를 위해 자기적으로 표지된 세포를 적응시킨다. 셀트랙스® 시스템에서 세포를 자동적으로 규명하였고; 대조군 세포를 상기 시스템에 의해 계산하고, 반면, 후보 순환 종양 세포를 도 1 에 나타낸 바와 같이, 체크리스트를 사용한 계산을 위한 오퍼레이터에 제시하였다.
본 발명의 바람직한 구현예 중 일부는 상기에 기술되었고 구체적으로 예시되었지만, 본 발명은 상기 구현예에 제한되는 것이 아니다. 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 본 발명에서 이루어질 수 있고, 향상의 전체 범주는 하기 청구항에 기술된다.

Claims (10)

  1. 순환 흑색종 세포를 함유하는 것으로 의심되는 혼합된 세포군을 포함하고, 전이성 흑색종 질환을 갖는 환자로부터 단리된 혈액 샘플에서 희귀 순환 흑색종 세포를 단리하고, 강화(enriching)시키고, 분석하기 위한 방법으로서, 상기 방법이,
    a) 상기 흑색종 세포의 부착 분자(CD146)에 결합된 자기 입자를 사용하여 상기 순환 흑색종 세포를 함유하는 샘플 분획을 강화시키는 단계,
    b) 상기 희귀 순환 흑색종 세포의 구조적 완전성이 온전한지를 확인하는 단계로서, 상기 구조적 완전성이 핵산 염료 4,2-디아미디노-2-페닐린돌 디히드로클로라이드 (DAPI), 및 고분자량 흑색종 관련 항원에 대한 피코에리트린(PE) 결합된 모노클로날 항체에 의해 측정되고 상기 구조적 완전성이 알로피코시아닌(APC) 결합된 모노클로날 CD45 및 CD34 항체를 사용하여 공동 강화된 백혈구 및 순환 내피 세포를 배제함에 의해 추가로 확인되는 단계, 및
    c) FITC 표지 항-Ki67을 부가하여 활성 세포 주기에서 순환 흑색종 세포의 비율을 측정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
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