BRPI0819854B1 - Método para isolar, enriquecer e analisar células de melanoma circulantes em uma amostra de sangue - Google Patents

Método para isolar, enriquecer e analisar células de melanoma circulantes em uma amostra de sangue Download PDF

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Abstract

método para isolar, enriquecer e analisar células de melanoma circulantes em uma amostra de sangue a presente invenção refere-se a um sistema celltracks5 ® fornece um sistema para enumerar células de melanoma circulantes no sangue. o sistema concentra imunomagneticamente células epiteliais, rotula as células por fluorescência e identifica e quantifica células de melanoma circulantes. o número absoluto de células de melanoma circulantes detectado na carga tumoral de sangue periférico é, em parte, um fator na predição da sobrevivência, tempo de progressão, e resposta à terapia. o diagnóstico e o monitoramento de melanoma tem sido limitado pela incapacidade de monitorar células de melanoma circulantes. a presente invenção fornece um método para enumerar células de melanoma circulantes em amostras de sangue. consequentemente, esta tecnologia fornece um meio e dispositivo para monitorar a progressão da doença em pacientes com melanoma.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO
PARA ISOLAR, ENRIQUECER E ANALISAR CÉLULAS DE MELANOMA
CIRCULANTES EM UMA AMOSTRA DE SANGUE.
Referência Remissiva aos Pedidos de Depósito Correlatos
Este é um pedido não provisório que reivindica a prioridade aos Pedidos Provisórios U.S. 61/004.345, depositados em 27 de novembro de 2007. O pedido anteriormente mencionado está incorporado integralmente por referência na presente invenção.
Antecedentes
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se, em geral, ao monitoramento e avaliação da progressão de doença em paciente de câncer, com base na presença de células de melanoma circulantes (CMCs) morfologicamente intactas no sangue. Mais especificamente métodos, reagentes, e aparelhos são descritos para avaliar as células de melanoma circulantes em pacientes. Células de melanoma circulantes são determinadas por metodologias altamente sensíveis estabelecidas para isolamento e formação de imagens de 1 ou 2 células tumorais circulantes em aproximadamente 5 a 50 mL de sangue periférico. O nível de número de células tumorais e um aumento no número de células tumorais fornecem um meio de monitorar pacientes com melanoma metastático.
Antecedentes da Técnica
O tratamento de melanoma avançado é complicado por sua histopatologia heterogênea e alterações na compensação que acumula-se durante a progressão do tumor. A enumeração e caracterização de células tumorais circulantes em pacientes com câncer colorretal ou de mama metastático têm sido mostradas capazes de fornecer informação prognóstica e preditiva independente que seja clinicamente significativa e pode ser usada para monitorar o gerenciamento do paciente.
Tem sido mostrado que células tumorais circulantes (CTCs) são uma ligação crítica entre o câncer primário, um estágio da doença em que a cura é possível, e doença metastática, que continua a ser a causa principal
Petição 870180011089, de 09/02/2018, pág. 10/16 de morte para a maioria das malignidades. Estudos clínicos mostraram que as CTCs são um poderoso biomarcador para prognóstico e previsão do câncer de mama metastático, e descobertas similares têm sido relatadas em câncer de próstata e câncer colorretal. Esses dados mostram que as CTCs são representativas da biologia subjacente que leva ao câncer metastático e sugerem que análises celulares e moleculares adicionais dessas células podem revelar uma nova compreensão sobre a regulação molecular da metástase e a resposta à terapia.
A pesquisa sobre o papel das CTCs na metástase e expansão de seu uso como um biomarcador em estudos farmacocinéticos e farmacodinâmicos têm sido limitada à fase clínica do desenvolvimento da droga. Tem aceitação geral a ideia de que a maioria dos pacientes de câncer não é morta por seu tumor primário, sucumbindo em vez disso a metástases: múltiplas colônias tumorais amplamente disseminadas, estabelecidas por células malignas que se desprendem do tumor original e viajam através do corpo, frequentemente para pontos distantes. A estratégia terapêutica de maior sucesso no tratamento do câncer é a detecção precoce e a remoção cirúrgica do tumor enquanto ainda está confinado a um determinado órgão. A detecção precoce do cancêr tem se provado exequível para alguns tipos de câncer, particularmente nos casos em que existem testes diagnósticos adequados, como Papanicolau para o câncer cervical, mamografia para o câncer de mama, e nível sérico de antígeno prostático específico (PSA) para o câncer de próstata. Entretanto, muitos cânceres detectados nos estágios iniciais já estabeleceram micrometástases antes da ressecção cirúrgica. Assim, a determinação precoce e precisa do potencial maligno de um câncer é importante para a seleção da terapia adequada.
Se um tumor primário é detectado suficientemente cedo, o mesmo pode frequentemente ser eliminado por cirurgia, radiação, quimioterapia ou por alguma combinação desses tratamentos. Infelizmente, as colônias metastáticas são de difícil detecção e eliminação, sendo frequentemente impossível tratar todas essas corretamente. Portanto, a metástase pode ser considerada o evento conclusivo na progressão natural do câncer. Além do mais, a capacidade para metastatização é uma propriedade que caracteriza de modo inequívoco um tumor maligno.
O aumento em HER-2/neu resulta em uma resposta diminuída à terapia hormonal, sendo um fator prognóstico significativo na previsão de respostas em câncer de mama metastático positivo para receptor de hormônio. Assim, em malignidades às quais está associado ao produto de oncogene HER-2/neu, foram descritos métodos para monitorar a terapia ou avaliar os riscos com base em níveis elevados (U.S. 5.876.712). Entretanto, os níveis de base durante a remissão, ou mesmo em níveis normais saudáveis, são relativamente altos e podem sobrepor-se a concentrações encontradas em pacientes, exigindo portanto testes e monitoramento múltiplos para estabelecer a linha de base dependente de paciente e níveis de valor de corte.
No câncer de próstata, os níveis séricos de PSA mostraram-se úteis para a detecção precoce. Quando usado com um exame físico de acompanhamento e biópsia, o teste de PSA tem aprimorado a detecção de câncer de próstata em estágio inicial, quando é mais tratável.
A detecção de células tumorais intactas no sangue oferece um elo direto com a doença metastática recorrente em pacientes de câncer que foram submetidos a ressecção de seu tumor primário. Infelizmente, a mesma disseminação de células malignas continua deixando de ser detectada pelos procedimentos convencionais para estadiamento de tumores. Estudos recentes têm mostrado que a presença de uma única célula de carcinoma na medula óssea de pacientes de câncer é um fator prognóstico independente para relapso metastático (Diel IJ, Kaufman M, Goerner R, Costa SD, Kaul S, Bastert G. Detection of tumor cells in bone marrow of patients with primary breast câncer: a prognostic factor for distant metastasis. J Clin Oncol, 10:1534 a 1539, 1992). Porém essas técnicas invasivas, são consideradas indesejáveis ou inaceitáveis para testes clínicos rotineiros ou múltiplos, em comparação à detecção de células tumorais epiteliais disseminadas no sangue.
Uma abordagem alternativa incorpora a tecnologia de separação imunomagnética, e proporciona maior sensibilidade e especificidade na detecção inequívoca de células cancerosas circulantes intactas. Essa ferramenta simples e sensível para diagnóstico, conforme descrita (U.S. 6.365.362, U.S. 6.551.843, U.S. 6.623.982, U.S. 6.620.627, U.S. 6.645.731, W.O. 02/077604, W.O. 03/065042 e W.O. 03/019141), é usada na presente invenção para fornecer um modelo animal pré-clínico para enumeração de CTCs.
Com o uso dessa ferramenta de diagnóstico, uma amostra sanguínea de um paciente com câncer (W.O. 03/018757) é incubada com microesferas magnéticas, revestidas com anticorpos direcionados contra um antígeno de superfície de célula epitelial como, por exemplo, EpCAM. Após a marcação por nanopartículas magnéticas revestidas com anti-EpCAM, as células magneticamente rotuladas são, então, isoladas com o uso de um separador magnético. A fração imunomagneticamente enriquecida é adicionalmente processada para análise imunocitoquímica a jusante ou citometria por imagem, por exemplo, no sistema CelITracks® (Veridex LLC, Nova Jersey, EUA). A fração magnética pode também ser usada para análise imunocitoquímica a jusante, RT-PCR, PCR, FISH, citometria de fluxo ou outros tipos de citometria por imagem.
O sistema CelITracks® usa seleção e separação imunomagnéticas para obter um alto enriquecimento e concentrar quaisquer células epiteliais presentes em amostras de sangue total. As células capturadas são rotuladas de maneira detectável com um marcador específico para leucócitos e com um ou mais anticorpos monoclonais fluorescentes específicos para células tumorais, para permitir a identificação e enumeração das CTCs capturadas, bem como uma diferenciação instrumental ou visual inequívoca de células contaminantes que não sejam alvo do teste. Esse teste permite a detecção de células tumorais mesmo nos estágios iniciais com baixa massa tumoral. A modalidade da presente invenção não se limita ao sistema CelITracks®, mas inclui qualquer protocolo de isolamento e formação de imagens com sensibilidade e especificidade comparáveis.
A tecnologia atualmente disponível não demonstrou ser um meio consistentemente confiável para monitoramento repetitivo de CMCs na avaliação de progressão de câncer melanoma metastático. Portanto, há uma clara necessidade de detecção precisa de células cancerosas com potencial metastático, não apenas no melanoma mas em cânceres metastáticos em geral. Além disso, essa necessidade é acentuada pela necessidade de selecionar a terapia mais eficaz para um determinado paciente.
A incapacidade de monitorar repetitivamente as CMCs em melanoma e outros cânceres tem restringido suas análises obtidas a partir de coletas de sangue. Consequentemente, os estudos das características de progressão da doença como alterações temporais nas CMCs durante a progressão do tumor e terapia relacionada não têm sido estabelecidas. Entretanto, o uso dessa tecnologia para teste de CMCs permitiría a integração de avaliações de CMC dentro em estudos pré-clínicos assim bem como em clínicos. A caracterização adicional de marcadores moleculares específicos nessas células permitiría o desenvolvimento precoce de testes de diagnóstico companheiros para determinadas terapias-alvo, o que aceleraria a conversão de novos protocolos de teste em testes clínicos em pacientes e, por fim, em prática clínica.
Sumário da Invenção
A presente invenção fornece um método automatizado para captura e detecção de células de melanoma circulantes (CMCs) no sangue de pacientes com melanoma, incorporando ferramentas de análise clínica como o sistema CelITracks®, com base no número absoluto, alteração, ou combinações de ambos em células epiteliais circulantes em pacientes com câncer metastático. O sistema concentra as células epiteliais de modo imunomagnético, rotula as células por meios fluorescentes, identifica e quantifica as CMCs para a enumeração positiva no melanoma.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1: perfil de análise fluorescente CelITracks® usado para confirmar objetos capturados como células tumorais humanas. As marcas assinaladas significam um resultado positivo para célula tumoral, com base na imagem composta. As imagens compostas são derivadas da seleção positiva para marcador de célula epitelial (EC-PE) e para o corante nuclear (NADYE). Uma seleção negativa também é necessária para o marcador de leucócitos (L-APC) e para o controle (CNTL).
Descrição Detalhada da Invenção
Embora qualquer mecanismo eficaz para isolar, enriquecer e analisar as CTCs no sangue seja adequado, um método para coleta de células tumorais circulantes combina tecnologia de enriquecimento imunomagnético e tecnologia de marcação por imunofluorescência com uma plataforma analítica adequada, após a extração inicial de sangue. O teste associado demonstrou ter a sensibilidade e a especificidade para detectar essas células raras em uma amostra de sangue total, bem como para investigar seu papel no curso clínico da doença em tumores malignos de origem epitelial. A partir de uma amostra de sangue total, células raras são detectadas com uma sensibilidade e uma especificidade que permite que as mesmas sejam coletadas e usadas na modelagem da progressão da doença em um modelo animal.
As células tumorais circulantes (CTCs) tiveram sua existência demonstrada no sangue, em quantidades detectáveis. Isso criou uma ferramenta para investigar a significância das células de origem epitelial na circulação periférica de pacientes de câncer (Racila E., Euhus D., Weiss A.J., Rao C., McConnell J., Terstappen LW.M.M. e Uhr J.W., Detection and characterízation of carcinoma cells in the blood, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95:4589 a 4594 (1998)). Este estudo demonstrou que essas células transportadas pelo sangue podem desempenhar um papel significativo na patofisiologia do câncer. Com uma sensibilidade para detecção de 1 célula epitelial por 5 ml de sangue do paciente, o teste incorporou enriquecimento imunomagnético de amostra e coloração fluorescente de anticorpo monoclonal, seguida de citometria de fluxo para uma análise rápida e sensível de uma amostra.
O CelISearch® System (Veridex LLC, NJ, EUA) foi usado anteriormente para isolar e enumerar células tumorais epiteliais circulantes a partir de amostras2 de sangue humano. Trata-se de um sistema automatizado que enriquece a amostra em células epiteliais com o uso de anticorpos para moléculas de adesão à célula epitelial, acoplados a microesferas magnéticas. As células isoladas são, então, coradas com o corante de ácido nucleico fluorescente dicloridrato de 4,2-diamidino-2-fenil indol (DAPI) para identificar as células nucleadas. As células recuperadas são, subsequentemente, coradas com anticorpos monoclonais fluorescentemente identificados para CD45 (canal APC) e citoqueratina 8, 18, 19 (canal PE), para distinguir células epiteliais de leucócitos. As células epiteliais nucleadas são, então, quantificadas como células tumorais circulantes. Há um canal de fluorescência adicional para FITC que não faz parte do teste CelISearch® padrão, e que pode ser usado para caracterização adicional das células tumorais.
Conforme mostrado no exemplo, o teste foi adicionalmente configurado para uma análise citométrica por imagem de modo que a amostra enriquecida imunomagneticamente seja analisada pelo sistema CelITracks®. Este é um sistema para análise de imagens com microscópio baseado em fluorescência que, em contraste com a análise citométrica de fluxo, permite a visualização de eventos e a avaliação das características morfológicas para identificar adicionalmente os objetos.
A CD146 (também conhecida como MUC18, MCAM, Mel-CAM e S-Endo-1) é uma glicoproteína transmembrana que possui uma distribuição de tecido limitada, incluindo células endoteliais, células de músculo liso, células dendríticas foliculares, células de melanoma, e uma subpopulação de linfócitos T ativados.
O Ki-67 (também conhecido como antígeno identificado por anticorpo monoclonal Ki-67 ou MK167 é um marcador celular para proliferação e é associado à proliferação celular. Durante a interfase, o antígeno Ki-67 pode ser detectado dentro do núcleo da célula, considerando que na mitose a maior parte da proteína é deslocada para a superfície dos cromossomos. A proteína Ki-67 está presente durante todas as fases ativas do ciclo celular (G1, S, G2, e mitose), mas está ausente no restante das células (Go). A mesma é usada em geral como marcador para determinar a fração de crescimento de uma população celular.
O CelITracks® AutoPrep® System e o CelITracks® Analyzer II foram usados para automatizar completamente a captura e detecção de CMCs. No teste CMC, partículas magnéticas conjugadas para o anticorpo específico para moléculas de adesão à célula de melanona (CD146) são usadas para capturar células de melanoma a partir de 7,5 mL de sangue. As CMCs enriquecidas são então coradas com corante de ácido nucleico DAPI, e um anticorpo monoclonal conjugado ao PE específico para o antígeno de alto peso molecular associado a melanoma. O teste também contém anticorpos monoclonais conjugados APC para CD45 e CD34 para excluir leucócitos copurificados e células endoteliais circulantes, respectivamente. Além disso, o FITC identificado como anti-Ki67 foi adicionado para determinar a proporção de CMC no ciclo celular (G1, S, G2 ou fase M) enquanto em circulação. As CMCs enriquecidas e coradas foram magneticamente colocadas dentro de um cartucho CelITracks e escaneadas com o uso do CelITracks Analyzer II. Imagens individuais das células foram apresentadas ao operador para análise, e classificadas como CMCs, à base de morfologia celular e fluorescência. O teste CMC recuperou consistentemente >65% das células de melanoma da linhagem de células SK-MEL28 quando inoculadas dentro de 7,5 mL de sangue de doadores saudáveis. O teste foi linear sobre a faixa testada de 1 a 1200 células de melanoma/7,5 mL (ride 0,999, coeficiente angular de 0,74, interceptação de 6,8). O teste foi validado com o uso de sangue de doadores saudáveis (n=60) e pacientes com melanoma metastático (n=71). Em 7,5 mL de sangue de doadores normais, 0 CMCs foram detectadas em 57/60 (95%). Uma célula foi corada como uma CMC em 3/60 (5%) doadores normais, mas essas células tiveram tipicamente uma morfologia celular endotelial característica, e foram negativas para Ki67. Em pacientes de melanoma, as CMCs situaram-se na faixa de 0 a 8000 /7,5 mL de sangue. Uma ou mais CMCs foram detectadas em 39% dos pacientes, £ 2 em 25%, > 5 em 8%, z 10 em 4% e £ 100 em 3%. Surpreendentemente, 30 a 100% (média de 84%) das CMCs foram positivas para Ki67 sugerindo que uma alta proporção de células de melanoma dispersas dentro do sangue estavam dividindo-se ativamente. O teste automatizado de CMC é um dispositivo de monitoramento útil para pacientes com melanoma metastático, avaliação de prognóstico, ou possivelmente como uma ferramenta para avaliar biomarcadores, alvos, e tratamentos potenciais nessa doença difícil e agressiva.
Exemplo
Enumeração de células circulantes positivas para citogueratina
O sistema CelITracks® refere-se a um sistema automatizado de microscópio por fluorescência para enumeração automatizada de células isoladas a partir de sangue. O sistema contém um microscópio de fluorescência integrado e controlado por computador, bem como uma platina automatizada com um conjunto de garfo magnético que prende um cartucho de amostra descartável. O garfo magnético é projetado para permitir que candidatas a células tumorais identificadas com ferrofluido contidas na câmara de amostra sejam magneticamente localizadas na superfície superior de visualização do cartucho de amostra, para visualização microscópica. O software apresenta ao operador, para seleção final, as células suspeitas de serem cancerosas, identificadas com anticorpos para citoqueratina e tendo origem epitelial.
Embora o isolamento de células tumorais para o sistema CelITracks® possa ser realizado por quaisquer meios conhecidos na técnica, uma modalidade usa enriquecimento imunomagnético para isolar células tumorais a partir de uma amostra biológica. As partículas magnéticas específicas para célula epitelial são adicionadas e incubadas durante 20 minutos. Após a separação magnética, as células ligadas aos anticorpos imunomagneticamente ligados são magneticamente mantidas na parede do tubo. A amostra não ligada é então aspirada, e uma solução isotônica é adicionada para ressuspender a amostra. Um corante para ácido nucleico, anticorpos monoclonais para citoqueratina (um marcador de células epiteliais) e CD 45 (um marcador de amplo espectro para leucócitos) são incubados com a amostra. Após a separação magnética, a fração não ligada é novamente aspirada, e as células ligadas e identificadas são ressuspensas em 0,2 ml de uma solução isotônica. A amostra é suspensa em uma câmara de apresentação celular, e colocada em um dispositivo magnético cujo campo orienta as células magneticamente identificadas para exame microscópico por fluorescência no sistema CelITracks®. As células são identificadas automaticamente no sistema CelITracks®, e as candidatas a células tumorais circulantes são apresentadas ao operador para enumeração em lista de verificação. Uma lista de verificação para enumeração consiste em critérios morfológidos predeterminados constituindo uma célula completa.
As células positivas para citoqueratina são isoladas mediante enriquecimento imunomagnético com o uso de uma amostra de 7,5 ml de sangue total de seres humanos. O fluido imunomagnético específico para célula epitelial é adicionado e incubado durante 20 minutos. Após a separação durante 20 minutos, as células ligadas aos anticorpos imunomagneticamente ligados são magneticamente mantidas na parede do tubo. A amostra não ligada é então aspirada, e uma solução isotônica é adicionada para ressuspender a amostra. Um corante para ácido nucleico, anticorpos monoclonais para citoqueratina (um marcador de células epiteliais) e CD 45 (um marcador de amplo espectro para leucócitos) são incubados com a amostra durante 15 minutos. Após a separação magnética, a fração não ligada é novamente aspirada, e as células ligadas e identificadas são ressuspensas em 0,2 ml de uma solução isotônica. A amostra é suspensa em uma câmara de apresentação celular, e colocada em um dispositivo magnético cujo campo orienta as células magneticamente identificadas para exame microscópico por fluorescência no sistema CelITracks®. As células são identificadas automaticamente no sistema CelITracks®, as células de controle são enumeradas pelo sistema, enquanto as candidatas a células tumorais circulantes são apresentadas ao operador para enumeração com o uso de uma lista de verificação, conforme mostrado na figura 1.
Embora certas modalidades preferenciais da presente invenção tenham sido descritas e especificamente exemplificadas acima, não há a intenção de que a invenção fique limitada a essas modalidades. Várias modificações podem ser feitas a mesma sem se afastar do espírito da 5 presente invenção, estando o escopo completo das otimizações delineado nas reivindicações apresentadas a seguir.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para isolar, enriquecer e analisar células de melanoma circulantes em uma amostra de sangue que compreende uma população de células misturadas suspeita de conter células de melanoma circulantes e que foram isoladas de um paciente com a doença melanoma metastático, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
    a) enriquecer uma fração da amostra usando partículas magnéticas conjugadas a um anticorpo para molécula de adesão de células de melanoma (CD146), a fração contendo as células de melanoma circulantes;
    b) confirmar a integridade estrutural das células de melanoma circulantes quanto a estarem intactas, em que a integridade estrutural é determinada pelo corante de ácido nucleico dihidrocloreto de 4,2-diamino-2fenilindol (DAPI) e anticorpo monoclonal para antígeno associado a melanoma de alto peso molecular conjugado à ficoeritrina (PE), em que a integridade estrutural é ainda confirmada pela exclusão de leucócitos coenriquecidos e células endoteliais cirulantes usando os anticorpos monoclonais para CD45 e CD34 conjugados à aloficocianina (APC); e
    c) adicionar anti-Ki67 marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) para determinar a proporção de células de melanoma circulantes em ciclo celular ativo.
BRPI0819854-3A 2007-11-27 2008-10-20 Método para isolar, enriquecer e analisar células de melanoma circulantes em uma amostra de sangue BRPI0819854B1 (pt)

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